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DETERMINACION DE LA HEMOGLOBINA GLICOSILADA INTRODUCCION La hemoglobina es una protena que se encuentra en los glbulos rojos de la sangre (hemates) y sirve

para aprovisionar de oxgeno al resto de nuestras clulas y tejidos. Esta protena se une a la glucosa circulante por el torrente sanguneo. El porcentaje de protena unida a la glucosa es lo que se denomina hemoglobina glicosilada (HbA1). Esto sucede tambin en las personas sin diabetes. Cuanto mayor es la cantidad de glucosa en sangre, ms se une a las protenas y su porcentaje de unin indica cual ha sido la cantidad media o promedio de glucosa circulante durante el tiempo de vida de la hemoglobina. La hemoglobina glicosilada tiene varias fracciones ( HbA1a, HbA1b, y Hb1Ac) y, de ellas, la ms estable, la que tiene una unin con la glucosa ms especfica es la fraccin HbA1c. Por lo tanto, la prueba de HbA1c mide la cantidad de glucosa adherida a los glbulos rojos. El resultado es expresado en porcentaje (%) e indica el promedio de glucemias mantenido durante el trimestre anterior a la prueba. (El valor normal depender sin embargo, del mtodo utilizado en el laboratorio). El porcentaje de glicosilacin es proporcional al tiempo y a la concentracin de glucosa; en otras palabras, los glbulos sanguneos ms viejos tendrn un mayor porcentaje de hemoglobina glicosilada y aquellas personas mal controlados (con perodos de altas concentraciones de glucosa sangunea tendrn un mayor porcentaje en su resultado. Por el contrario, aquellas personas que han mantenido un buen control metablico, vigilado y controlado tendrn un porcentaje de hemoglobina glicosilada en valores ms cerca a los normales. Tiene muchas utilidades, entre ellas:
y y y y y y y

Valorar el tratamiento de un diabtico , en cuanto a dosificacin o cumplimiento. Comparar los tratamientos y pautas utilizadas. Medir los aumentos de glucemia en los diabticos recin diagnosticados. Valorar los cambios de la glucemia en diabticos leves. Individualizar los tratamientos en los diabticos. Valoracin de diabticos lbiles o con grandes variaciones de su glucemia. Para diferenciar la hiperglucemia de los diabticos de otras causas agudas (estrs, infarto).

OBJETIVOS Realizar la determinacin y cuantificacin de hemoglobina glicosilada en sangre total, utilizando resinas de intercambio catinico. FUNDAMENTO El presente procedimiento utiliza una resina de intercambio inico, se mezcla un hemolizado de sangre total con una resina de intercambio ionico para la separacin rpida de la hemoglobina glicosilada A1c del resto de hemoglobinas. Despus de preparar el hemolizado de la sangre total la muestra se mezcla durante 5 minutos, las hemoglobinas son retenidas por la resina de intercambio inico. Durante este tiempo, la HbA0 se une a la resina. La HbA0 contiene todas las hemoglobinas excepto la A1c, que permanece en solucin. Despus del perodo de mezcla, un filtro separa el sobrenadante

que contiene la A1c de la resina. La estimacin del porcentaje del la Hb A1c se realiza por lectura de la absorbancia a 415 nm. Los resultados son expresados como HbA1 tambin se puede convertir o reportar como HbA1c usando un factor de conversin cuando se use un valor de HbA1c para el estndar

PROCEDIMIENTO A. EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS NECESARIOS REACTIVOS Los reactivos que a continuacin se mencionan deben ser grado analtico, cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada. y Resina de intercambio inico de hemoglobina glicosilada (tubos). y Reactivo de lisis de hemoglobina glicosilada. y Agua destilada MATERIALES y y y y y y y y y y Tubos primarios al vaco con anticoagulante EDTA. Torundas. Torniquete. Agujas para extraccin sangunea mltiple. Tubos de ensaye de 13X100. Pipeta automtica de 10-100 L. Pipeta automtica de 100-1000 L. Puntas amarillas para pipeta automtica. Puntas azules para pipeta automtica. Celdas para espectrofotmetro.

MATERIAL BIOLOGICO y Sangre total con EDTA

APARATOS E INSTRUMENTOS Los aparatos que a continuacin se indican deben estar calibrados y ser ajustados antes de su operacin: y Espectrofotmetro.

B. DESARROLLO DE LA PRACTICA Preparacion de la muestra 1. Extraccin de una muestra de sangre venosa. a. El paciente deber estar en ayunas para poder realizar la extraccin de una muestra de sangre total por puncin venosa en un tubo con anticoagulante EDTA. Esta muestra ser el tubo primario.

b. Una vez extrada la muestra mezclar inmediatamente para conseguir una anticoagulacin efectiva. PROCEDIMIENTO Preparacion de hemolizado 1. Pipetear 500 L del reactivo de lisis en los tubos previamente marcados. 2. Agregar 100 L de la muestra de sangre mezclada en los tubos apropiados y mezcle vigorosamente. 3. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente para completar la hemolisis. Determinacion de la hemoglobina glicosilada 1. Rotular los tubos de resina a utilizar. 2. Agregar 100 L del preparado hemolizado dentro de los tubos de resina marcados apropiadamente. 3. Colocar el separador de resina en el tubo de manera que el manguito de plstico quede aproximadamente 1-2 cm por arriba del liquido. 4. Mezclar suavemente los tubos por 5 minutos aproximadamente. 5. Al final del mezclado empujar el separador de resina dentro del tubo para separar la fraccin HbA1. 6. Leer la absorbancia a 415 nm, ajustar a cero con el blanco de agua destilada. Determinacion de la absorbancia para la hemoglobina total. 1. Pipetear 5 ml de agua destilada en 2 tubos previamente rotulados. 2. Aadir 20 L del hemolizado a cada tubo. Homogenizar perfectamente. 3. Leer la absorbancia a 415 nm, configurar el a cero con el blanco de agua destilada.

C. EXPRESION DE RESULTADOS E INFORMES DE LA PRUEBA METODO DE CALCULO Para calcular la concentracin de la muestra calcular el rango de absorbancia de la hemoglobina glicosilada y de la absorbancia de la hemoglobina total como sigue: R = Absorbancia (hemoglobina glicosilada) Absorbancia (hemoglobina total) Hemoglobina glicosilada (%) = R (muestra) x Concentracin del estndar de Hb. glic R (estndar) INFORME DE LA PRUEBA INTERPRETACION Y CONCLUSIONES

ANEXOS CUESTIONARIO 1. Que otros mtodos existen para determinar la hemoglobina glicosilada? La determinacin colorimtrica de Fluckger y col. Se trata la sangre fresca recogida con EDTA, que puede conservarse hasta 2 das en el refrigerador (2-10), y se le adiciona cido oxlico; de esta manera se origina 5-hidroximetilfurfural que se revela por el cido 2tiobarbitrico, dando una coloracin que se valora fotocolorimetricamente. Las pruebas inmunoquimicas, Se basa en la reaccin especifica de antisuero de oveja desarrollado contra HbA1c humana. Sin embargo tiene el inconveniente de dar reaccin cruzada con HbA1cb, HbA1a y HbA1b, (inespecifidad). La cromatografa liquida de alta presin Se realiza la separacin de los componentes con el empleo de columnas de resina de intercambio inico inyectando el efluente a altas presiones. Asi tambin como la cromatografa de intercambio ionico, electroforesis, cromatografa de afinidad al boronato, 2. Por qu razn se mide la fraccin HbA1 para cuantificar la hemoglobina glicosilada? El porcentaje de protena unida a glucosa es lo que se denomina hemoglobina glicosilada o glicosilatada (HbA1). La hemoglobina glicosilada tiene varias fracciones y de ellas, la ms estable, la que tiene una unin con la glucosa ms especfica es la fraccin HbA1C. La hemoglobina A1c es la ms importante, dado que su molcula de azcar es la glucosa covalentemente enlazada al terminal amino de la cadena beta. Como las concentraciones normales de glucohemoglobina excluyen marcadas fluctuaciones de la glucosa sangunea durante las 3 o 4 semanas precedentes, la concentracin de hemoglobina A glicosilada representa el ndice ms confiable de la media de la glucosa sangunea durante un largo perodo de tiempo. La HbA1c no se ve alterada por cambios agudos o recientes de las glucemias y depende de la concentracin de glucosa del entorno y de la vida media de los glbulos rojos en el organismo. Como la vida media de estos hemates es aproximadamente de 90-120 das, conocer como estn marcados por la glucosa que circula junto con ellos nos indica como ha sido el control metablico durante ese periodo de tiempo. Si bien el 50% aproximado del resultado depende de las concentraciones de glucosa durante las ltimas 4-6 semanas