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Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, Departamento de Biologia Celular e Molecular

Tcnicas de anlise de DNA aplicadas a diagnstico

Porto, 18 de Abril de 2005 Ana Carrapa, turma 3 Ana Zo, turma 3 Joana Coelho, turma 9 Joo Santos, turma 9 Sara Pedrosa, turma 9

INTRODUO
A histria da gentica mdica foi revolucionada pelo trabalho de Watson e Crick, em 1953, onde foi proposta a estrutura de dupla hlice de DNA. Durante os ltimos 20 anos a tecnologia do DNA recombinante tem vindo a desenvolver tcnicas muito poderosas e sensveis que so usadas no estudo e na identificao de anomalias moleculares. O objectivo deste trabalho abordar algumas dessas tcnicas de anlise de DNA, nomeadamente: Polymerase Chain Reaction (PCR), Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), Restriction Fragment Length Polymorfism (RFLP), Hibridao in situ e Variable Numbers of Tadem Repeats (VNTR), que permitam, de certa forma, a identificao de genes relacionados com doenas genticas especficas, abrindo a possibilidade de diagnstico. As principais reas de aplicao destas tcnicas moleculares de diagnstico reflectem-se ao nvel das doenas infecciosas, do cancro, das doenas genticas, dos transplantes e da patologia clnica.

TCNICAS DE ANLISE DE DNA


PCR
O que a PCR? A PCR (Reaco de Polimerizao em Cadeia) uma metodologia que se baseia na amplificao exponencial selectiva de uma quantidade reduzida de DNA de uma nica clula. Esta tcnica revolucionou o mundo cientfico e as suas aplicaes so imensas: usada no diagnstico mdico, mapeamento gentico, deteco de doenas hereditrias, clonagem de genes, testes de paternidade, identificao de impresses digitais genticas De facto, a PCR revolucionou vrias reas como a Biologia Molecular, Patologia, Farmcia, Botnica, Medicina Forense e valeu o prmio Nobel, em 1993, a Kary Mullis. Objectivo O objectivo da PCR produzir uma quantidade aprecivel de um segmento especfico de DNA a partir de uma quantidade mnima. O DNA molde sofre uma amplificao controlada por enzimas, obtendo-se milhes de cpias do fragmento de DNA de interesse. O molde pode ser qualquer forma de DNA de cadeia 2

dupla, como o DNA genmico: pode usar-se uma gota de sangue, um fio de cabelo, uma clula do epitlio oral, um blastmero Em que consiste um ciclo de PCR? Um ciclo de PCR (Fig.1) consiste em trs fases: desnaturao do DNA molde (a 95C), ligao (annealing) dos primers (a 64C) e polimerizao do DNA (a 72C). Na 1 etapa faz-se a separao das cadeias de dupla hlice de DNA atravs do calor. Esta separao essencial para que, na 2 fase, dois primers de oligonucletidos se liguem s sequncias dos pares de bases complementares da cadeia molde.
Fig. 1 Ciclo do PCR.

Estes primers so desenhados e sintetizados de modo a ligarem-se s extremidades opostas de cada uma das cadeias de DNA molde que se pretende amplificar. Os primers servem, portanto, de ponto de partida para a replicao de DNA e, na ltima etapa, faz-se a sua extenso. A enzima responsvel por esta polimerizao a DNA polimerase termo-estvel (Taq), tendo sido isolada a partir da bactria termoflica Thermus aquaticus que vive em elevadas temperaturas. essencial que a enzima usada seja estvel ao calor, uma vez que os ciclos de PCR tm lugar a temperaturas situadas entre os 64C e 95C. Para executar este ciclo usa-se um termociclador, que faz variar de forma rigorosa o tempo e a temperatura ao longo do ciclo. Normalmente so repetidos cerca de 30 ciclos, o que demora apenas algumas horas. Assim, duas novas cadeias so sintetizadas a partir da cadeia molde em cada ciclo completo de PCR logo d-se um crescimento exponencial, havendo ao fim de n ciclos 2n vezes mais cpias do que no incio. Vantagens e limitaes O segredo do sucesso da PCR reside na capacidade que ela tem de amplificar uma sequncia precisa de DNA aliada sua simplicidade, rigor, elevada sensibilidade e especificidade. No necessrio isolar o DNA que se pretende amplificar (mesmo que se encontre misturado com DNA de outras espcies), uma vez que a especificidade da PCR dada pelos primers. uma tcnica rpida, barata e segura. Contudo, a PCR tambm tem limitaes, como a necessidade de conhecer a sequncia de DNA a amplificar para que possam ser sintetizados primers especficos. Outras desvantagens so a relativa 3

facilidade com que ocorre contaminao da amostra por DNA estranho (uma vez que se trata de uma tcnica muito sensvel) e a limitada extenso da sequncia que possvel amplificar ( difcil aplicar a PCR a sequncias maiores do que 5kb). Pode tambm ocorrer incorporao errnea de bases durante a replicao. Aplicaes Os resultados da PCR so teis no diagnstico, prognstico, determinao da terapia a ser utilizada, e at mesmo na avaliao da susceptibilidade a doenas. A PCR frequentemente utilizada na deteco de polimorfismos, mutaes pontuais e infeco por microorganismos bacterianos ou virais antes da exteriorizao patolgica da sua presena. particularmente importante na deteco do SIDA, pois consegue detectar o vrus HIV nas primeiras semanas aps a infeco e mais rapidamente do que o mtodo normalmente utilizado, o teste ELISA. A PCR procura directamente pelo DNA do vrus enquanto que o teste ELISA mais indirecto, pois procura anticorpos que o organismo possa ter produzido contra o vrus. Outro exemplo de aplicao da PCR no DPI (diagnstico pr-implantatrio) e no DPN (diagnstico pr-natal). A PCR pode ser usada em DPN em idades gestacionais to precoces como as 9 semanas, permitindo, por exemplo, a deteco de clulas de um feto masculino em circulao no sangue materno, ainda que exista em quantidades muito reduzidas, e averiguar a compatibilidade entre o grupo sanguneo da me e do feto. Permite ainda a deteco de vrias anormalidades cromossmicas como a trissomia 21. Este exame ao diagnosticar previamente certas doenas, possibilita que os pais e equipa de sade decidam antecipadamente a melhor atitude a tomar em relao a cada caso.

DGGE
O que a DGGE? A electroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) um mtodo de separao electrofortico baseado em diferenas no comportamento de desnaturao de fragmentos de DNA de cadeia dupla. Importncia da DGGE A DGGE uma poderosa tcnica de anlise gentica que pode ser usada para detectar directamente modificaes de uma nica base e polimorfismos em DNA genmico, DNA clonal e DNA amplificado por PCR. 4

Como se processa? As molculas do DNA desnaturam em segmentos especficos designados domnios de desnaturao, quando a temperatura ou a concentrao do desnaturante se elevam (Fig. 2). A temperatura de fuso de uma cadeia dupla
Fig. 2 A ligao de DNA em domnios discretos.

de DNA influenciada simultaneamente pelas

pontes de hidrognio que se estabelecem entre pares de bases complementares e pela atraco entre bases adjacentes da mesma cadeia. Inicialmente, envolve a mistura de uma sonda de DNA de cadeia simples marcada radioactivamente com a cadeia dupla de DNA a ser examinado, sendo a ltima previamente aquecida de modo a tornar-se de cadeia simples. O DNA que idntico com a sonda de DNA formar um homoduplex, o qual, sob as condies desnaturantes do gel, permanecer hibridizado. Utilizando um gel de poliacrilamida, que contm um gradiente linear de desnaturante (ureia ou formamida) possvel distinguir os homoduplex mutantes dos normais devido s diferentes propriedades de fuso das molculas de DNA. Assim, qualquer m combinao do DNA em estudo com a sonda de DNA resultar no aparecimento de um heteroduplex, o qual, medida que atravessa o gradiente desnaturante do gel, se desagregar, tornando-se de cadeia simples num dado ponto. Daqui resulta uma estrutura ramificada que apresenta menor mobilidade quando comparada com a do homoduplex, o que pode ser detectado por colorao ou por autorradiografia. A separao completa da cadeia impedida pela presena de um domnio de fuso elevado, que geralmente criado artificialmente numa extremidade da molcula pela incorporao de uma braadeira-GC, que nunca desnatura nas circunstncias escolhidas para a experincia. Isto realizado durante a amplificao de PCR usando um primer de PCR com uma extremidade 5' que consiste numa sequncia de GC-40. Vantagens 1) Taxa e sensibilidade de deteco elevadas. 2) A metodologia simples e usa-se um mtodo de deteco no radioactivo. 3) Os fragmentos de PCR podem ser isolados a partir do gel e ser usados em reaces de sequenciao.

Limitaes 1) Ao elaborar a DGGE desde o zero exige-se a anlise por computador bem como experincias prvias. 2) requerida a compra de equipamento especfico. 3) Os primers so mais caros devido ao GC-40. Primers adicionais podem ser teis na sequenciao. 4) A anlise de fragmentos PCR com mais de 400pb menos bem sucedida. 5) Os genes excepcionalmente ricos em GC no so analisados fcilmente por DGGE. 6) O mtodo envolve o uso do formamida. Aplicaes Algumas das mais valiosas utilidades da DGGE na gentica humana so a deteco directa de mutaes numa nica base causadoras de doena, a deteco de polimorfismos com sondas de DNA e a descoberta dos pontos de desnaturao de fragmentos de DNA. So conhecidos casos em que a DGGE, associada a outras tcnicas como a PCR, foi o tipo de anlise mutacional directa utilizado na avaliao de fetos em risco de apresentarem deficincia na enzima reductase da dihidropteridina (DHPR). Esta uma doena hereditria autossmica recessiva causada por mutaes no gene QDRP e resulta em hiperfenilalaninmia e deficincia em diversos neurotransmissores no SNC, sendo imprescindvel o diagnstico pr-natal nas famlias afectadas. A DGGE tambm um dos mtodos de pesquisa gentica de mutaes responsveis pela sndrome de neoplasia endcrina mltipla tipo1 (MEN1), uma doena autossmica dominante, caracterizada por tumores endcrinos da glndula pituitria anterior, glndulas para-tiroides e pncreas. Esta doena provocada por mutaes do gene MEN1, um gene supressor tumoral. Uma mutao de clulas germinativas j conhecida no gene da protena precursora amilide bem como mutaes novas no gene PS-1 foram detectadas por DGGE em pacientes com doena de Alzheimer.

RFLP
O que o RFLP? RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) uma tcnica em que os organismos podem ser diferenciados pela anlise de padres derivados da clivagem do seu DNA. Se dois organismos diferirem na distncia entre os stios de clivagem de uma endonuclease de restrio, o comprimento dos fragmentos produzidos vai diferir quando o DNA for digerido com uma enzima de restrio. 6

Metodologia Para a deteco de RFLPs, pode ser usada a metodologia de Shouthern Blotting, descrita em 1975 por Edmund Southern. Aps restrio enzimtica os fragmentos de DNA genmico so sujeitos a electroforese em gel e posteriormente transferidos para um suporte slido de nitrocelulose atravs do arrastamento por capilaridade. Aps hibridizao com sondas radioactivas este processo possibilita a identificao, entre milhares de fragmentos de restrio obtidos, de sequncias bem determinadas. Aplicaes Com o aumento da informao da sequncia gentica um grande nmero de doenas genticas podem ser determinadas atravs da anlise do RFLP: 1) A anemia falciforme uma doena gentica em que ambos os genes no paciente substituem um T por um A na posio do meio do codo 6. Isto converte o codo GAG (para o glutamato) ao codo GTG (para a valina) e elimina e
Fig. 3 - Linhagem de uma famlia em que o filho o nico a possuir anemia falciforme.

sequncia reconhecida (CTGAGG que comum aos codes 5, 6 e 7) e cortada por uma das enzimas de restrio.

Quando o gene normal (beta a) digerido com uma enzima de restrio e os fragmentos so separados por electroforese a sonda liga-se a um pequeno fragmento (entre as setas vermelhas). Quando o gene doente (beta s) a enzima no pode cort-lo neste stio, ento a sonda liga-se a um fragmento muito maior (Fig. 3). Neste exemplo, uma mudana de um nico nucleotdio produz o RFLP. Isto uma causa comum de RFLPs e estes polimorfismos so actualmente referidos como SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). 2) A fibrose cstica (FC) uma doena hereditria que faz certas glndulas produzirem secrees anormais, resultando disso vrios sintomas, os mais importantes afectando o trato digestivo e os pulmes. A FC uma doena recessiva, pelo que qualquer pessoa com FC deve ser homozigtica para os alelos da doena. Se os progenitores requererem aconselhamento gentico recorre-se anlise de RFLP que realizada ao seu DNA. Os RFLPs para a FC so conhecidos, portanto fcil determinar se uma pessoa homozigtica normal, heterozigtica portadora ou homozigtica com FC (Fig. 4). 7
Fig.4 Anlise do RFLP para a FC.

Limitaes 1) As mutaes que causam a maior parte das doenas genticas humanas so mais variadas do que a nica mutao associada anemia falciforme. 2) Existem muitas doenas que resultam de vrios genes mutantes trabalhando juntos para produzir o fentipo da doena. 3) Ainda existem doenas genticas para as quais o gene ainda no foi descoberto. At o gene poder ser localizado, clonado e sequenciado nenhuma sonda pode ser feita para o detectar directamente.

Hibridao in situ
O que a hibridao in situ? A hibridao in situ um mtodo que permite identificar o locus cromossmico onde se localiza uma determinada sequncia de DNA previamente clonada. Este mtodo tem como princpio a complementaridade das bases que reage a organizao de DNA. Como funciona? O DNA de um esfregao metafsico e o DNA de uma sonda so transformados em sequncias monocatenares atravs da desnaturao e posteriormente so postos em contacto em condies de hibridao. Assim a sonda vai hibridar com a sequncia cromossmica onde se localizam as bases complementares. Visto que a sonda previamente marcada (com um fluorocromo), o local de ligao tornase visvel o que permite identificar especificamente o local do cromossoma onde se localiza o gene ou a sequncia no codificadora em causa. A realizao desta tcnica pode ser feita usando uma nica sonda ou at mesmo vrias sondas, cada uma marcada com um fluorocromo diferente. Esta ltima tcnica chama-se FISH multiplex. Os padres de bandas de um cromossoma so diversos e depende da tcnica usada e do corante. Poder de resoluo O poder de resoluo de FISH limitado a cerca de 2 a 3 Mpb, em cromossomas metafsicos. Porm, em cromossomas interfsicos, a resoluo possvel para valores acima de 50 Kpb. Se os cromossomas interfsicos forem tratados de forma a libertar fibras cromossomas das molculas proteicas associadas os limites de resoluo pode aumentar at valores da ordem de 5 Kpb. 8

Aplicaes a diagnstico A tcnica FISH permite detectar deleces de um locus autossmico especfico, em clulas interfsicas. tambm uma tcnica muito til para deteco rpida de alteraes numricas dos cromossomas em clulas interfsicas, recorrendo a sondas centromtricas. Com FISH multiplex e cariotipagem espectral possvel detectar rearranjos cromossmicos complexos. Hibridao genmica comparativa A tcnica assenta na hibridao competitiva de uma mistura equimolar de dois tipos de DNA marcados com fluorocromos diferentes. Permite detectar deleces ou duplicaes de regies cromossmicas especficas. No detecta anomalias estruturais equilibradas como translocaes reciprocas, inverses ou inseres.

VNTR
O que o VNTR? O VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) uma metodologia que se baseia na existncia de uma sequncia repetitiva especfica activa em diferentes indivduos de uma populao ou nos dois homlogos diferentes do cromossoma num indivduo diplide. Uma repetio em srie (tandem repeat) uma sequncia curta do DNA que repetido na forma de head-to-tail num locus cromossmico especfico. As repeties em srie so evidenciadas ao longo de todo o genoma humano; sendo que algumas sequncias so encontradas em somente um local um nico locus e o nmero de unidades repetidas varia entre indivduos. Tais loci so denominados VNTRs. Um VNTR nos seres humanos uma sequncia de 17 pb do DNA repetida entre 70 e 450 vezes no genoma. O nmero total de pares de bases neste locus pode variar de 1190 a 7650. Importncia 1) Permite auxiliar no diagnstico de determinadas doenas, nomeadamente: diabetes tipo I, fenilquetonria, cancro, entre outras. 2) Constitui um contributo na investigao forense na anlise de impresses digitais.

Aplicao 1. (Fig.5) A) Nesta anlise encontram-se sequncias de DNA repetidas, tal como,

CACACA, as quais se localizam em vrias posies (loci) no genoma humano. O nmero de repeties em cada srie pode ser altamente varivel na populao, nomeadamente, de 4 a 40 em diferentes indivduos. A srie de nucleotdeos repetidos deste tipo geralmente denominada como sequncia microsatlite hipervarivel (hypervariable
Fig. 5 Anlise de impresses digitais na investigao forense.

microsatellite sequence), tambm conhecido como sequncia VNTR. Devido variabilidade nesta sequncia em cada

locus, os indivduos herdam diferenciadamente dos seus pais e das suas mes de tal modo que dois indivduos diferentes nunca contm o mesmo par de sequncias. Uma anlise de DNA utilizando primers que ladeiam o locus produz um par de bandas de DNA amplificado de cada indivduo, uma banda a representar a varivel materna e outra a varivel paterna. A extenso do DNA amplificado e a posio das bandas que esse produz aps electroforese depende do nmero exacto de repeties no locus. B) O exemplo esquemtico ilustrado evidencia que os mesmos trs loci VNTR so analisados (requerendo trs pares diferentes de primers oligonucleotdeos seleccionados especialmente) provenientes de trs sujeitos (indivduos A, B e C) produzindo seis bandas de DNA por cada pessoa depois de realizada a electroforese em gel de poliacrilamida. Embora alguns indivduos tenha algumas bandas em comum, a maior parte dos moldes so distintos. As bandas referidas podem servir como impresso digital para identificar minuciosamente cada indivduo como nico. O quarto caso (F) contm o produto da mesma reaco levada a cabo por uma amostra forense. O material de anlise para a realizao do PCR pode ser um simples fio de cabelo ou uma gota de sangue. Quando analisada a variabilidade de 5 a 10 loci VNTR diferentes, a probabilidade de dois indivduos diferentes possurem os mesmos moldes genticos , aproximadamente, 1 em 10 bilies. Deste modo, analisando os resultados evidenciados possvel concluir que os indivduos A e C podem ser eliminados da lista de suspeitos; enquanto o indivduo B possivelmente cometeu o crime. 10

Uma abordagem semelhante , nos dias correntes, frequentemente utilizada para testes de paternidade. 2. Para identificar alguns dos factores genticos que contribuem para a obesidade nas crianas da Europa Central e do Norte de frica foi estudada a relao entre a transmisso de alelos no locus da insulina e o incio precoce da obesidade. O polimorfismo no VNTR do gene da insulina est associado a variaes na expresso deste gene. Assim, crianas que receberam um alelo classe I dos seus pais (e no das suas mes) tinham um risco relativo de ser precocemente obesas de 65-70%, sendo possvel concluir que a transmisso paternal do alelo VNTR classe I INS (gene da insulina) predispe a obesidade infantil.

CONCLUSO
A tecnologia de anlise de DNA possibilitou o diagnstico de inmeras doenas genticas. Neste momento, desempenha um papel crescente na pesquisa e diagnstico deste tipo de patologias. Muitas vezes, o diagnstico de uma doena no requer somente o uso de uma tcnica, mas sim a conjugao de vrias, visto existir complementaridade entre elas. O aumento de conhecimento e o desenvolvimento da tcnica tm vindo a ser explorados e rapidamente transferidos para os laboratrios clnicos. Porm, a difuso e a transferncia destas formas de tecnologia necessitam do desenvolvimento de protocolos e da equao dos problemas ticos associados.

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