PCR: DEFINICIN, FUNDAMENTO, TCNICA, APLICACIONES DEFINICIN: Es la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa, introducida en los laboratorios en 1985.

ooEs introducida en los laboratorios en 1985, fue inventado y desarrollado por el qumico Kary B. Mullis premio nobel en Qumica en 1985. Fue inventado y desarrollado por el qumico Kary B. Mullis premio nobel en Qumica en 1985.

FUNDAMENTO: Se utiliza con el fin de amplificar (aumentar nmero de copias) un segmento de ADN in vitro a travs de una serie de ciclos repetitivos en un termociclador. El PCR es una sintess en vitro de secuencias especfica de ADN en la cual se obtienen millones de copias de una determinada secuencia donde todo este proceso se lleva acabo en un Termociclador El PCR es una sintess en vitro de secuencias especfica de ADN en la cual se obtienen millones de copias de una determinada secuencia donde todo este proceso se lleva acabo en un Termociclador El PCR es una sintess en vitro de secuencias especfica de ADN en la cual se obtienen millones de copias de una determinada secuencia donde todo este proceso se lleva acabo en un Termociclador El PCR es una sintess en vitro de secuencias especfica de ADN en la cual se obtienen millones de copias de una determinada secuencia donde todo este proceso se lleva acabo en un TermocicladorEl PCR es una sintess en vitro de secuencias especfica de ADN en la cual se obtienen millones de copias de una determinada secuencia donde todo este proceso se lleva acabo en un Termociclador El PCR es una sintess en vitro de secuencias especfica de ADN en la cual se obtienen millones de copias de una determinada secuencia donde todo este proceso se lleva acabo en un Termociclador El PCR es una sintess en vitro de secuencias especfica de ADN en la cual se obtienen millones de copias de una determinada secuencia donde todo este proceso se lleva acabo en un Termociclador El PCR es una sintess en vitro de secuencias especfica de ADN en la cual se obtienen millones de copias de una determinada secuencia donde todo este proceso se lleva acabo en un Termociclador El PCR es una sintess en vitro de secuencias especfica de ADN en la cual se obtienen millones de copias de una determinada secuencia donde todo este proceso se lleva acabo en un Termociclador El PCR es una sintess en vitro de secuencias especfica de ADN en la cual se obtienen millones de copias de una determinada secuencia donde todo este proceso se lleva acabo en un Termocicla Participa el ADN molde o plantilla, que es una secuencia de ADN de doble cadena, la cual va a ser amplificada y dos primers o cebadores (oligonucletidos de una sola cadena) que flanquean a este segmento en el extremo OH. Tambin participa la enzima que cataliza la amplificacin, una ADN polimerasa termoestable, los desoxirribonucletidos trifosfato (dNTPs), buffer y sales adecuadas(MgCl2) para el trabajo ptimo de la enzima y el termociclador.

Taq POLIMERASA EN FRASCOS

DESARROLLO DE LA TCNICA: La Tcnica consiste en tres pasos: EL PRIMERO es la desnaturalizacin por calor del ADN de la muestra biolgica (bacteria, virus, planta, animal o humano). La desnaturalizacin consiste en la separacin de las hebras de ADN, es decir separacin fsica de las dos cadenas mediante el incremento progresivo de temperaturas de 9397C. El SEGUNDO consiste en la hibridacin de ADN desnaturalizado y los oligonucletidos. Es la etapa en donde las hebras separadas permanecern en la solucin hasta que la reaccin sea enfriada a 35 40C para los primers pequeos pero esta temperatura puede ser elevada en el caso de primers grandes para loci especfico) para permitir que los primers (segmentos de ADN especficos y conocidos) realicen la hibridacin. Los primers se agregan en exceso en comparacin al ADN que va a ser amplificado; ellos se hibridan a las hebras opuestas del ADN y orientan con sus extremos 3 enfrentndolos uno al otro, de tal forma que el ADN polimerasa (que cataliza el crecimiento de las nuevas hebras en direccin 5 a 3 )los extienda sintetizando el segmento de ADN, ubicado entre ellos. Un ciclo de sntesis da como resultado nuevas hebras de longitud indeterminada que al igual que las hebras parentales pueden servir de molde. Estos productos nicos se acumulan aritmticamente con cada ciclo subsiguiente de desnaturalizacin, alineamiento y sntesis. El tercer paso consiste en la polimerizacin, elongacin o extensin del complejo mediante cambios cclicos de temperatura, repetidos un gran nmero de veces y por la accin de una enzima llamada Taq ADN polimerasa (obtenida de la bacteria termmfila Thermus aquaticus), la cual es termoestable y es la que en buena cuenta ha permitido la automatizacin del proceso del PCR en una forma relativamente sencilla. La bacteria Thermus aquaticus es una de las ms utilizadas por la produccin de enzima Taq polimerasa (termorresistente), polimeriza a 72C con un rango de pH 8,2 9,0 Otras bacterias con funcin similar, se tiene a : Pyrococcus furiosus (Pfu). Thermococcus litoralis (Vent), Thermus termofilus (Tth) Thermus flavus (Tf1).

BACTERIA Thermus aquaticus

La cantidad del producto (copias de ADN) por PCR crece exponencialmente, es decir, en cada ciclo de sntesis, desnaturalizacin y alineamiento se dobla la cantidad del

producto amplificado, de modo que en 32 ciclos se obtienen 230 copias (que viene a ser 1,073,741,824 copias).

AMPLIFICACIN DEL ADN EN FORMA DE PROGRESIN GEOMTRICA El producto del PCR se detecta luego normalmente haciendo corridos electroforticos en gel de agarosa o poliacrilamida para posteriormente visualizarlo generalmente con bromuro de etidio haciendo pasa la luz ultravioleta proveniente de una lmpara de UV o tambin con radioaactividad.

PREPARADO DEL CORRIDO ELECTROFORTICO

VISUALIZACIN DEL ADN

ESQUEMA DE SECUENCIA DE LOS CICLOS DEL PCR: 1. MEZCLA DE LA REACCIN (ADN de inters a amplificar; cebador; nucletidos A, C, G, T; ADN polimerasa)

TUBOS DE PCR QUE ALBERGAN LA MEZCLA EN UN VOLUMEN DE 100 ul 2. DESNATURALIZACIN DEL ADN O SEPARACIN DE LAS DOS HEBRAS DE ADN: 94C/90seg (90 a 95C x 1 min)

SEPARACIN DE HEBRAS DEL ADN A 94c por 1 min 3. Unin por enlaces de hidrgeno a cada hebra de ADN en su extremo OH a una molcula de cebador: 55C/2 min (50 a 55C x 45 seg a 2 min)

UNIN DE LOS CEBADORES EN EL EXTREMO DEL ADN BLANCO 4. Sntesis de la cadena complementaria de ADN (Extensin o elongacin)por la ADN polimerasa (Taq polimerasa)(sintetiza mil bases por min. en su temperatura ptima) partiendo desde el cebador en direccin 5a 3: 72C/3 min (70 a 72C x 2 a 3 min)

SINTESIS DE LA CADENA COMPLEMENTARIA POR LA ADN POLIMERASA

SINTESIS DE LA CADENA COMPLEMENTARIA POR LA ADN POLIMERASA

5.

Repeticin del ciclo y crecimiento exponencial del nmero de copias de ADN por ciclos sucesivos.

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

CARGADO DE LOS TUBOS DE ENSAYO(EPENDORF)

TERMOCICLADOR UTILIZADO EN EL PCR

CONTROL POSITIVO CONTROL NEGATIVO

LECTURA DE IZQUIERDA A DERECHA: TEMPERATURA, TIEMPO RESTANTE, NMERO DE CICLO,DESNATURALIZACIN, UNIN DE CEBADOR A ADN (ANILLADO), ELONGACIN (EXTENSIN)DE ADN COMPLEMENTARIO

LECTURA DURANTE EL PRIMER CICLO EN LA DESNATURALIZACIN DEL ADN

LECTURA DURANTE EL PRIMER CICLO EN LA UNIN DEL ADN A LOS CEBADORES

LECTURA DURANTE EL PRIMER CICLO EN EL ALARGAMIENTO DEL ADN COMPLEMENTARIO

LECTURA POSTERIOR AL PRIMER CICLO DESPU DE LA PRIMERA DUPLICACIN DEL ADN

TIPOS DE PCR: 1. PCR in situ. 2. PCR interna. 3. PCR inversa 4. PCR asimtrica. 5.PCR mltiple. 6.PCR arbitraria. PCR in situ:

PCR interna: El PCR interna mejora la especificidad cuando hay que amplificar muchos ciclos (60 y 80). Despus realizada la amplificacin se toma una alcuota y se realiza una segunda amplificacin con cebadores internos a los primeros y exclusivos a la regin amplificar. As se evita la amplificacin de fragmentos que pudiera haber en la primera reaccin de PCR.

PCR inversa:

Nos permite amplificar secuencias desconocidas de vecinas genmicas conocidas, por ejemplo aislar secuencias adyacentes al lugar donde un retrovirus se ha insertado. Se toma el ADN y se trata con enzimas de restriccin que va a permitir la formacin de crculos por complementariedad de los extremos cohesivos; siendo que los cebadores que se emplean son secuencias de la regin conocida, pero cuyos extremos 3 OH se dirigen hacia el exterior de la molcula conocida; posterior al uso de cebadores el ADN se trata con otra enzima de restriccin. PCR asimtrica:

El mtodo consiste en poner diferente proporcin de los dos oligocebadores de manera que uno a ste a concentracin limitante, es decir los primeros 25 ciclos sintetizan dos hebras pero al agotarse uno de los cebadores los 5 o 10 ciclos siguientes sern de cadena simple. PCR mltiple: Hace referencia a la posibilidad de amplificar ms de una secuencia o fragmento en nica reaccin (varios exones de un mismo gen). La amplificacin de dos o tres secuencias simultneas no requiere cambios en las condiciones de reaccin general, las dificultades surgen cuando el nmero de fragmentos se incrementan y se observan que algunos de ellos se amplifican con muchas ms eficacia que otros que aparecen fragmentos totalmente inespecficos. PCR arbitrario: Es un tipo de PCR mltiple en la que se utiliza como cebador un nico oligonucletido de banda simple cuya secuencia arbitraria, origina mltiples fragmentos annimos de DNA debido a la relajacin en las condiciones de hibridacin en los primeros ciclos.

APLICACIONES: En casi todos los trabajos de biologa molecular por su alta precisin, ser automatizable y de costo efectivo. Para identificar bacterias y virus: Chlamydia trachomatis, Pneumocystis carini, Helicobacter pilori, HIV, Hepatitis C, etc. En medicina forense, oncologa y medicina legal (en ste ultimo caso d de seguridad alrededor del 99% par la determinacin de la paternidad). Para diagnstico microbiolgico de enfermedades infecciosas no virales para detectar directamente en muestras patgenos tradicionalmente difciles de cultivar (Legionella, Clamidia, Micoplasma), o que requieren de largos perodos para su desarrollo in vitro y o que se encuentran en muy baja concentracin en los lquidos biolgicos (ejm. Mycobacterium tuberculosis). Para identificar agentes infecciosos virales independientemente de su respuesta serolgica (como aquellos que producen enfermedades en donde los anticuerpos aparecen luego de un largo perodo de infeccin, o cuando se quiere precisar si la presencia de anticuerpos es seal de infeccin antigua o activa por la cual se tiene que precisar si el virus est presente o ausente, o tambin cuando no se puede aplicar un diagnstico serolgico debido a que generalmente ste est enmascarado por la presencia de anticuerpos maternos circulantes.

Ha permitido la identificacin de los defectos genticos responsables de diferentes enfermedades como el de la distrofia muscular de Duchene y la fibrosis qustica ha travs de la identificacin del gen responsable. Para el estudio del complejo mayor de histocompatibilidad que son los antgenos HLA, con lo cual se puede realizar prubas de paternidad, identificacin de tejidos, mutagnesis in vitro, fingerprinting, anlisis estructural del RNA, etc. Conjuntamente con sus variantes (RAPDs, AFLPs, SSRs, SCARs...)puede ser aplicado a estudios relacionados a la caracterizacin de germoplasma, identificacin de caractersticas agronmicas importantes, estudios de filogenia, conservacin, mejoramiento molecular, etc.