Universidad Autnoma de Nuevo Len Facultad de Ciencias Qumicas Qumico Farmacutico Bilogo

Terapia Gnica
Catedrtico: Dr. Alberto Gmez Trevio

Alumnos: Esparza Ramrez Melissa Guzmn Cerda Marisol Martnez Armenta Carlos

San Nicols de los Garza, N.L. 13 de mayo del 2011

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Conceptos bsicos
En un sentido estricto, por terapia gnica humana (TG) se entiende la "administracin deliberada de material gentico en un paciente humano con la intencin de corregir un defecto gentico especfico". Otra definicin ms amplia considera la terapia gnica como una tcnica teraputica mediante la cual se inserta un gen funcional en las clulas de un paciente humano para corregir un defecto gentico o para dotar a las clulas de una nueva funcin . En 1984, French Anderson defini cinco requisitos necesarios para llevar a cabo la terapia gnica en humanos. y y y y y Para poder modificar un gen relacionado con alguna enfermedad, lo primero es identificarlo y clonarlo mediante la tecnologa del DNA recombinante. La siguiente etapa es la transferencia y expresin del gen teraputico en las clulas receptoras. La accesibilidad del tejido o las clulas que requieren ser transfectados con el gen de inters. Que el procedimiento no resulte daino para el paciente. El procedimiento de terapia gnica utilizado debe mejorar de modo sustancial la salud del paciente.

La TG se puede utilizar para curar enfermedades hereditarias o enfermedades adquiridas. Originalmente, la TG trataba simplemente de corregir la deficiencia gentica introduciendo en las clulas genes normales que realicen la funcin que no pueden llevar a cabo los genes defectuosos. Sin embargo, posteriormente se desarroll otra modalidad de TG consistente en introducir en las clulas del paciente un gen especialmente diseado para suministrar una nueva propiedad a las clulas. Tal es, por ejemplo, el caso de la aplicacin de la TG para el tratamiento de pacientes infectados con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) causante del SIDA. Se trata de introducir en las clulas sanguneas del paciente copias de un gen que obstaculiza la replicacin del virus, frenando as el progreso de la enfermedad. La TG se puede llevar a cabo en clulas somticas (terapia gnica somtica) o en clulas de la lnea germinal (espermatozoides, vulos o las clulas que las originan) en cuyo caso se denomina terapia gnica germinal. Es evidente que las alteraciones genticas producidas en las clulas somticas no se transmiten a la descendencia mientras que las modificaciones de las clulas germinales pueden transmitirse a las generaciones posteriores.

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Terminologa utilizada: y Terapia celular (terapia genmica): Transferencia de clulas intactas, que no se han modificado de manera gentica, en un paciente con la idea de que las clulas transferidas mejoren las condiciones de la persona. Transgen: Elemento gentico nuevo que se introduce de manera artificial en clulas. En experimentos de terapia gnica representa la versin normal de un gen que se transfiere a clulas especficas. Gen reportero: Gen que se utiliza para evaluar la eficiencia de la transferencia gnica; por ejemplo, el gen de luciferaza, gelactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa y protena verde fluorecente. Vector de transferencia de genes: Sistema biolgico utilizado para inducir un gen dentro de las clulas. Eficiencia de transferencia: Porcentaje de clulas que expresa el transgen.

En funcin del tipo celular diana, existen dos modalidades de terapia gnica: 1) Terapia gnica de clulas germinales: aquella dirigida a modificar la dotacin gentica de las clulas implicadas en la formacin de vulos y espermatozoides y, por tanto, transmisible a la descendencia. Este tipo de terapia gnica sera la indicada para corregir de forma definitiva las enfermedades congnitas, una vez que la tcnica sea eficaz y segura, situacin que no parece darse en el momento actual. La terapia gnica de la lnea germinal humana no ha sido practicada debido a las limitaciones de la tecnologa de manipulacin de las clulas germinales y a considerandos ticos, en especial el peligro de la modificacin del acervo gentico de la especie humana, y el riesgo de potenciacin gentica, que derivara en prcticas de eugenesia por seleccin artificial de genes que confiriesen caracteres ventajosos para el individuo. 2) Terapia gnica somtica: aquella dirigida a modificarla dotacin gentica de clulas no germinales, es decir, de las clulas somticas o constituyentes del organismo. La modificacin gentica no puede transmitirse a la descendencia. Por consenso general entre los investigadores y con la legislacin actual, basada en motivos ticos y de seguridad, solamente se llevan a cabo protocolos clnicos en este tipo de terapia gnica. En principio, la terapia gnica somtica no ha sido motivo de reservas ticas, salvo las relacionadas con su posible aplicacin a la ingeniera gentica de potenciacin, es decir, toda manipulacin gentica

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cuyo objetivo sea potenciar algn carcter, como la altura, sin pretender tratar enfermedad alguna. Por otra parte, y en funcin de la estrategia aplicada, la terapia gnica tambin puede clasificarse en: Ex vivo: cuando la correccin del defecto gentico se realiza en el laboratorio en las clulas extradas del paciente y que posteriormente son reintegradas dentro del organismo (por ejemplo, el sndrome de inmunodeficiencia combinada severa producida por deficiencia de la adenosindesaminasa, ADA, en los llamados nios burbuja )

Modelo de transferencia gnica ex vivo: introduccin del gen que codifica el receptor de LDL en el tratamiento de la hipercolesterolemia familiar monognica. In situ: cuando la modificacin gentica de las clulas del paciente se realiza introduciendo el ADN (los genes teraputicos) directamente en el propio rgano defectuoso del individuo (por ejemplo, en el caso de la fibrosis qustica, la distrofia muscular de Duchenne o la supresin de tumores por suicidio celular).

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In vivo: cuando se hace llegar en vectores adecuados los genes teraputicos a las clulas defectuosas a corregir a travs del torrente circulatorio (por ejemplo, por inyeccin intravenosa). Otra posibilidad sera la de utilizar las clulas de la piel con un propsito bien distinto: la sntesis y secrecin de protenas que son producidas normalmente en un tipo de clulas pero que son transportadas en el plasma sanguneo para uso de otras clulas. As, en principio, implantes de clulas de la piel podran corregir enfermedades tales como la hemofilia o las enfermedades de Alzheimer o de Parkinson.

Modelo de transferencia gnica in vivo mediado por liposomas catinicos: introduccin del gen que codifica el regulador transmembrana de la fibrosis qustica (CFTR).

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Vectores de Transferencia
Los vectores son aquellos mecanismos que llevan a cabo el proceso de trasferencia de un material gnico a una clula y los que aseguran su biodisponibilidad intracelular para que ste ejerza una funcin biolgica. Teniendo en cuenta que el papel de un vector es destinar, entregar y expresar un gen, el vector ideal sera aquel que reuniera las siguientes caractersticas:--------------------------------------------I) Una alta especificidad de destino celular a un rgano o tejido.-----------------------------------------II) Proteccin del DNA frente a degradaciones enzimticas en su transporte hasta la clula.----III) Facilidad para introducir el DNA en la clula y mantener una alta biodisponibilidad.----------IV) Alta eficacia de expresin del material gentico.---------------------------------------------------------V) Baja inmunogenicidad.--------------------------------------------------------------------------------------------VI) Ningn efecto secundario adverso grave ni moderado.-------------------------------------------------VII) Muy pocos efectos secundarios leves. .. VIII) Muy alta relacin beneficio/riesgo para el paciente. Se ha utilizado una gran variedad de vectores con fines experimentales, pero todos ellos pueden ser clasificados en: vectores virales y vectores no-virales. Los vectores virales ofrecen como ventajas la especial capacidad de los virus para infectar clulas y facilitar la expresin de genes exgenos pero presentan como desventajas la respuesta inflamatoria y anti viral del sistema inmunitario, lo cual constituye un riesgo para el paciente y una limitacin para el tratamiento con dosis mltiples. Los vectores no-virales son menos efectivos como sistemas de transferencia gnica pero ofrecen como principal ventaja la seguridad. Adems, permiten que los genes puedan ser formulados como medicamentos, ser estudiados farmacolgicamente y administrados al paciente de una forma dosis-dependiente. La mayor parte de los ensayos clnicos en terapia gnica, dirigidos principalmente a corregir desrdenes hereditarios o al tratamiento del cncer, han utilizado como vectores virales los retrovirus o adenovirus y como vectores no-virales los complejos DNA-liposoma. VECTOR RETROVIRAL (RVV) Los retrovirus son virus cuyo genoma (aprox. 9.7 kb) est constituido por una cadena simple de RNA y que replican mediante la formacin de una cadena doble de DNA (provirus) como intermediario. En el ciclo vital del virus existe una etapa obligatoria en la cual la doble cadena de DNA se inserta en el genoma de la clula husped (merced a las secuencias LTR del virus), llegando as a formar parte del material gentico de la clula que infecta. Los vectores retrovirales utilizados en terapia gnica humana, pierden su capacidad de replicacin al eliminar del virus las secuencias gag, pol y env que codifican nucleoprotenas, protenas

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responsables de la sntesis o recombinacin de los cidos nucleicos y componentes de la envoltura de la partcula viral, respectivamente. En contrapartida, al genoma viral se le incorpora una nueva secuencia gnica conteniendo el gen teraputico. El vector retroviral, deficiente en replicacin, se amplifica mediante crecimiento en una lnea celular especial (cculasempaquetadoras) que contienen en su genoma las secuencias gag, pol y env necesarias para la replicacin y empaquetamiento del virus. El vector conteniendo el gen teraputico infecta a la clula diana, utilizando receptores especficos y una vez en el citoplasma, la trascriptasa inversa (transportada por el vector) convierte el vector RNA en el DNA proviral el cual es integrado al azar en el genoma de la clula infectada y desde donde el gen expresar su producto teraputico.

- ARN de cadena sencilla como genoma viral (huesped x TI ADN) - tres genes que codifican: - gag, el grupo especfico de antgenos, protena de la cpsida y de la matriz - pol , la transcriptasa inversa, proteasa, integrasa. - env , protenas de la envoltura del virus - LTRspromotor viral - El genoma tambin incluye secuencias: empaquetamiento del ARN vrico corte y empalme entre donador y aceptor ARNs mensajeros envueltos de forma separada.

RETROVIRUS

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VECTOR ADENOVIRAL (AdVV) Los adenovirus son virus cuyo genoma (aprox .36 Kb) est constituido por una doble cadena linear de DNA. Existe una amplia variedad de adenovirus pero los serotipos 2 5 son los utilizados para construir vectores. El genoma de los adenovirus se divide en genes tempranos (E1 a E4) y genes tardos (L1 a L5). Puesto que la capacidad del genoma adenoviralpara dirigir la produccin de adenovirus reside en las secuencias ubicadas en E1, las estrategias para producir vectores adenovirales consisten en eliminar dichas secuencias e incorporar en su lugar el gen teraputico, generando as un vector adenoviral sin capacidad de replicacin. El posterior crecimiento y amplificacin del vector se lleva a cabo utilizando una lnea celular complementaria, conteniendo la secuencia E1 en su genoma. Por ltimo, el vector adenoviral conteniendo el gen teraputico, se une a la clula diana mediante interaccin de la fibra y el pentndel adenovirus con receptores especficos de la clula. El vector es internalizado por un mecanismo mediado por receptor y una vez en el endosomase produce la lisis del mismo. El DNA viral conteniendo el gen teraputico es liberado al citoplasma desde donde alcanza el ncleo y donde permanece como un DNA extracromosmico (episoma) dirigiendo la expresin del gen teraputico.

-E1 rescata clulas de la quiescencia, dejndolas capaces de sintetizar ADN vrico y protenas, usando predominantemente las funciones del cdigo del hospedador.

ADENOVIRUS

- E2 :replicacin del ADN. - E3 :detener los mecanismos de defensa de la clula hospedadora: anular los efectos de (TNF) en clulas infectadas bloquear el transporte de MHC I, reduce la presentacin de pptidos vricos. - E4 regula fase primaria y secundaria del ciclo de vida vrico.

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VECTORES ADENOASOCIADOS (AAV) Los virus adenoasociados son unos virus muy pequeos y muy simples que no son autnomos. Contienen DNA lineal de cadena sencilla y requieren la coinfeccin con un adenovirus u otro virus para replicarse y a diferencia de los adenovirus si se integran en el genoma celular. No se asocian con ninguna enfermedad en humanos. Su genoma es extremadamente simple, presentando slo dos genes, el gen rep, que codifica una familia de protenas superpuestas implicadas en la replicacin e integracin, y el gen cap, que codifica una familia de tres protenas que determinan la estructura del virus. Los extremos del genoma presentan repeticiones terminales, denominadas TR de unos 145 nucletidos. OTROS VECTORES VIRALES Otros vectores son los basados en herpes virus y en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o lentivirus. Estos dos tipos de vectores solventan algunos de los problemas que se dan con los anteriores como es el tamao del gen teraputico, que en el caso de los herpes virus permiten introducir fragmentos muy grandes, y la capacidad de los lentivirus, conservando las ventajas de los retrovirus, de replicarse en clulas ya estn o no en divisin. En la siguiente tabla se detallan algunas de las caractersticas diferenciales entre los vectores virales ms utilizados. En primer lugar, los riesgos derivados de la utilizacin de un vector viral de transferencia se relacionan con su capacidad de integracin en el genoma de la clula diana. As, los retrovirus, los virus adenoasiciados y los lentivirus se ntegran en el genoma celular por lo que existe un riesgo de mitagnesisinsercional. No sucede esto con los vectores adenovirales ya que su mecanismo de actuacin no incluye la etapa de integracin. En contrapartida es un vector muy inmunognico que estimula enormemente una respuesta inmunolgica que inactiva al vector y es capaz de producir importantes reacciones anafilcticas a veces de consecuencias fetales para el paciente. En cuanto a la capacidad para albergar al gen teraputico los adenovirus son los que ofrecen ms flexibilidad. Por ltimo, a diferencia de los retrovirus, el resto pueden transfectar clulas tanto en divisin como en reposo. Tabla: Algunas caractersticas diferenciales entre algunos vectores virales
Vector Viral Retrovirus (RNA) Adenovirus (DNA) Adenoasociados (DNA) Lentivirus (RNA) Riesgos Mutagnesis Inmunogenicidad Mutagnesis Mutagnesis Integracin S No S S Capacidad (Kb) < 4-6 36 <4 < 4-8 Estado de las clulas diana En divisin En divisin/no-divisin En divisin/no-divisin En divisin/no-divisin

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VECTOR NO-VIRAL: COMPLEJO DNA-LIPOSOMA (Lpidos Catinicos) El transporte de genes mediado por liposomas est basado en la asociacin del DNA plasmdico a vesculas formadas por autoensamblaje de bicapas de lpidos. Comparados con los vectores virales as como con otros vectores no-virales tales como los complejos DNA-polilisina, los liposomas son vectores de baja toxicidad que inducen una escasa o nula respuesta inmunitaria cuando se administran in vivo, pero cuya eficacia de transfeccin es baja. Existen dos principales clases de liposomas, basados en su composicin y/o carga neta final: liposomas aninicos y catinicos. Habitualmente, los primeros han sido preparados para encapsular el DNA en el liposoma, mientras que los liposomas catinicos han sido formulados como complejos DNA-liposoma, para la transferencia de genes. La carga positiva del lpido facilita la interaccin del liposoma tanto con el DNA como con la superficie celular, conduciendo a una relativamente eficaz entrada a la clula diana. Aunque la mayor parte del material gentico transportado es secuestrado y/o degradado en los endosomas, una pequea proporcin alcanza el ncleo en donde permanece en su mayor parte (sino en toda) en forma de un epicromosoma, permitiendo la expresin del gen teraputico. Este tipo de liposoma es el nico vector no-viral que ha demostrado ser suficientemente eficaz y seguro como para iniciar ensayos clnicos.

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LIPOSOMA: funcionamiento en base a propiedades de carga elctrica. -ADN a insertar (-) X fostatos de la doble hlice -lpidos catinicos o liposoma (vector) (+) -clula (-) X cido silico presente en su superficie Lpidos (+) + ADN (-)

Liposoma con ADN (+) + membrana celular(-)

cel

Penetra ADN dentro del liposoma, el vector se une a los fosfolpidos de membrana y se libera el ADN

Esquema donde se muestra diversos tipos de lpidos catinicos utilizados como vectores en la Terapia Gnica.

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FOSFATO CLCICO La utilizacin del fosfato de calcio se basa en la capacidad que presentan los iones calcio para precipitar el ADN provocando que la clula, mediante endocitosis, introduzca el ADN en su interior. No es una tcnica que provoque toxicidad en las clulas, pero la expresin del transgn es transitoria y con una eficacia de transfeccin cercana al 10%. Su utilizacin se ve reducida a cultivos celulares en aplicaciones ex vivo. TRANSFERENCIA DE GENES MEDIANTE RECEPTORES La insercin de molculas que sern reconocidas por receptores presentes en el tipo celular elegido al vector del material gnico, hace de esta tcnica un mtodo direccionable, al ser posible establecer una interaccin vector/ clula muy especfica. La naturaleza de los ligandos es muy variada y comprende azcares, pptidos y hormonas. Hoy da, se utilizan ligandos capaces de desestabilizar las membranas de los endosomas slo a pH cidos, con lo que se evita la degradacin de los vectores por los complejos enzimticos del lisosoma. ADN + ligantes
clula

ADN penetra X endocitosis

L R

unin endosoma + lisosoma evitada por fusigenos

L

ADN entra al ncleo durante la divisin celular

DISPARO DE PARTCULAS, BIOLSTICA O BOMBARDEO DE MICROPROYECTILES. En l, el plsmido de ADN a transferir es situado sobre la superficie de pequeas gotas de 1 a 3 micras de dimetro de oro o tungsteno que posteriormente son aceleradas, disparadas bien mediante una descarga elctrica o por un pulso de gas, hacia la clula diana. La fuerza fsica del impacto supera la barrera de la membrana celular. An as, la capacidad de penetracin es limitada y se utilizan con frecuencia en cultivos de lneas celulares, epidermis, msculo e hgado. Los microproyectiles constituyen un mtodo efectivo de transferir genes en modelos tanto in vitro como in vivo. Entre las ventajas que presenta este mtodo, y que le confieren un potencial

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de aplicabilidad general, destacan su fcil manejo y que un nico disparo puede producir integraciones mltiples. Sin embargo, presenta algunas desventajas, como que en la zona de descarga se produce muerte celular; adems, dependiendo de la rigidez de los tejidos, la procedencia del ADN extrao y la capacidad de transcripcin intrnseca aparecen grandes variaciones en la eficiencia de la expresin de los genes. As, la expresin conseguida suele ser transitoria y con una frecuencia relativamente baja, cercana a 10 4, tan slo se logra la integracin efectiva en el genoma 10-8 de las clulas expuestas, lo que hace que se requieran grandes dosis para alcanzar el xito. Este hecho limita la biobalstica en la aplicacin de la terapia gnica. Sin embargo, ensayos con animales muestran que podra ser aplicado de forma directa como parte de protocolos de vacunacin. Adems, presenta una utilizacin potencial en la transformacin de clulas vegetales, en la creacin de plantas transgnicas tanto monocotiledneas (maz, arroz, trigo, avena y caa de azcar) como en dicotiledneas (soja, tabaco y algodn). MICROINYECCIN El ADN es introducido por inyeccin directamente en el ncleo de las clulas gracias a la ayuda de un micromanipulador, evitando de este modo la degradacin citoplasmtica y lisosomal. Las clulas que sobreviven este dao y han insertado el material gentico presentan una alta eficacia de su expresin. Esta tcnica es muy laboriosa y necesita clulas aisladas para su realizacin. Se suele utilizar con frecuencia en estudios ex vivo, aunque tambin en la terapia gnica germinal, un mtodo in vivo donde se lleva a cabo la microinyeccin directa de ADN desnudo en los proncleos del vulo recin fecundado o en el citoplasma. En vertebrados inferiores e invertebrados es la tcnica de transferencia de genes ms utilizada y en mamferos ha resultado exitosa. Los embriones suelen tolerar la microinyeccin de genes para, posteriormente, ser cultivados in vitro hasta un estado de desarrollo ms avanzado, blastocito, y ser transferidos en las hembras adoptivas. Aunque los primeros individuos transgnicos obtenidos mediante este mtodo fueron ratones, se realiza con xito en vacunos, ovejas, cabras, conejos y cerdos. La eficiencia inicial de integracin gnica obtenida fue tan slo de un 2%, aunque hoy da se alcanzan niveles cercanos al 30% del total de embriones tratados. ADN DESNUDO Cuando se lleva a cabo la inyeccin directa de la parte codificadora a un tejido se conoce como tcnica ADN desnudo. En ella, el ADN es vehiculizado en una solucin salina o srica y normalmente administrado mediante inyeccin intramuscular. El mecanismo por el que entra en la clula diana permanece siendo un enigma. Esta tcnica presenta un porcentaje bajo de transfeccin y no se logra la integracin en el genoma. Se utiliza en la terapia gnica in vivo, aunque los calores y persistencia de la expresin de genes son probablemente demasiado cortos (das). Entre sus ventajas destacan el ser un mtodo directo, simple, econmico y con

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una baja toxicidad. El ADN desnudo est siendo utilizado como procedimiento de vacunacin, ya que aunque el valor de expresin de los genes es bajo, resulta suficiente para alcanzar una respuesta inmunolgica.

ELECTROPORACIN La aplicacin de una corriente elctrica a clulas es capaz de abrir poros en la membrana celular que permiten la entrada del gen en su interior. Entre sus ventajas se encuentran que las clulas pueden ser aisladas del organismo y sometidas a un control de calidad en el que se realiza una seleccin de las mejores clulas que son cultivadas en el laboratorio antes de ser implantadas en el paciente. Entre sus desventajas est el hecho de que muchas clulas mueren al no soportar el choque elctrico, por lo que no es la forma ms indicada en algunos tipos celulares, aunque s en clulas con una alta tasa de proliferacin.

SISTEMAS BASADOS EN POLI (L-LISINA) (PLL). Los PLL han sido ampliamente usados como acarreadores no virales desde que se conoce la formacin de un complejo entre PLL y DNA. Los grupos primarios amina de la lisina PLL, los cuales estn protonados en el medioambiente fisiolgico, actan electrostticamente con los grupos fosfato cargados negativamente del DNA para formar nano partculas con un complejo de los poli-electrolitos. PLL que tienen un peso molecular de menos de 3000 podran no formar complejos estables con DNA, sugiriendo que el nmero de aminas primarias en la cadena de PLL es importante para la formacin del complejo. Aunque los PLL con alto peso molecular tienen algunas propiedades para ser acarreadores de genes, los complejos PLL/DNA mostraron relativamente alta citotoxicidad y una tendencia a agregarse y precipitar dependiendo de la fuerza inica. y PLL-PEG. El contacto celular de los complejos PLL-DNA esta mediado por interacciones inicas, las caractersticas catinicas de la superficie del complejo pueden ser la causa de la citotoxicidad. Adems la superficie cargada puede inducir la adsorcin no especfica de protenas sricas resultando en una rpida eliminacin del complejo del torrente sanguneo. Por eso se ha conjugado con polietilenglicol PEG para prevenir la agregacin interparticular de los complejos y para incrementar la estabilidad del complejo en presencia de protenas sricas. Se han adicionado molculas que actan como anclas especficas para ciertos tejidos, entre ellas azucares, anticuerpos, pptidos y folato.

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y Polmeros tipo peine (PEG-g-PLL). stos fueron sintetizados originalmente por Choi etal. Todos los polmeros pudieron formar eficientemente complejos con un plsmido de DNA y mostraron mucha mayor eficiencia en la transfeccin que los PLL. PEG-g-PLL tambin mostraron mucha menor citotoxicidad en clulas HepG2 comparado con PLL. En un estudio con diferentes proporciones de insercin de PEG (10, 15 y 20% mol), 10% mol PEG-g-PLL demostr la mayor eficiencia en proteccin del DNA de degradacin enzimtica y la mayor eficiencia de transfeccin, sugiriendo que el contenido de PEG insertado podra ser un factor importante para las propiedades del copolmero/complejo DNA. PLL-conjugados. En contraste a los sistemas de liberacin virales, los acarreadores no virales no presentan una selectividad inherente de unin a superficie celular e internalizacin, por lo que para resolver sta limitacin, han sido conjugados varios ligandos para clulas especficas o tejidos a los acarreadores no virales. Los ligandos ms empleados en la conjugacin son: PLLazucares, de los cuales los ms empleados son lactosa y galactosa, PLL-AWBP (Arterial-wall binding peptide), donde el pptido que se enlaza a la pared arterial (AWBP) contiene el segmento que se une a pared arterial (1000 1016 amino cidos) de la protena apoB-100, un componente protenico principal de las LDL, PLL-AB (Antibody), PLL-folato y PLL-LDL (Terplex) Complejos de PLL con lipoprotenas de baja densidad.

Estructuras qumicas de acarreadores de genes basados en poli(L-Lisina) (PLL). PEG, polietilenglicol; AWBP, protena que se une a pared arterial; LDL, lipoprotena de baja densidad.

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Enfermedades blanco
Terapia gnica de las enfermedades monognicas La terapia gnica fue inicialmente concebida como una forma de tratamiento de enfermedades genticas causadas por mutacin de un slo gen (monognicas), de las que se conocen aproximadamente 4.000. Las enfermedades hereditarias comprenden trastornos de muy diversa ndole, en los que un gen defectuoso determina que no se sintetice una protena especfica, o bien que se elabore una protena anormal. En ambos casos, la ausencia de la protena normal puede ocasionar muy diversas manifestaciones clnicas, segn la funcin estructural o enzimtica que normalmente ejerce dicha protena en las clulas. As, los cuadros varan desde leves, que no necesitan tratamiento (como el daltonismo), hasta enfermedades graves (como la fibrosis qustica y la hemofilia). En trminos generales se trata de enfermedades en las que la farmacoterapia convencional resulta poco eficaz. Slo para algunos de estos trastornos se han desarrollado y aplicado tratamientos basados en la restitucin de la protena defectuosa o deficitaria (como sera el factor VIII en el caso de la hemofilia A, o la enzima adenosina desaminasa en el sndrome de inmunodeficiencia combinada grave); pero adems, dichos tratamientos slo tienen una efectividad parcial para paliar las manifestaciones de la enfermedad y pueden conllevar graves complicaciones. En pocas enfermedadades de origen gentico es pues factible suministrar la protena deficitaria en una forma farmacutica efectiva, dada su naturaleza lbil y compleja, y la necesidad de hacerla llegar a un dominio subcelular especfico. En ciertos casos se recurre a transplantar el rgano afectado, pero esta tcnica tambin tiene graves limitaciones: la disponibilidad de rganos y las consecuencias adversas que se derivan de la inmunosupresin requerida para evitar el rechazo del nuevo tejido. El problema podra resolverse si se suministrara una copia normal del gen defectuoso a los tejidos afectados; as la protena podra ser sintetizada dentro de las clulas utilizando las vas celulares habituales. Es importante sealar que el gen defectuoso est en todas las clulas de la persona afectada por el trastorno hereditario, pero su expresin en los diferentes rganos y tejidos es variable. Los defectos en genes que se expresan en todas las clulas del organismo suelen causar anomalas tan graves que no son compatibles con el desarrollo embrionario. No obstante, el limitado nmero de tejidos afectados en casi todos los trastornos hereditarios simplifica las exigencias de la terapia gnica, puesto que se necesita introducir una copia funcional del gen slo en aquellos tejidos que realmente lo requieren. Si puede mantenerse la

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adecuada expresin del gen durante un periodo de tiempo prolongado, entonces la enfermedad puede ser curada, o cuanto menos, paliada. El tratamiento definitivo de una enfermedad gentica slo es posible mediante la correccin del defecto gentico del gen mutado. La terapia gnica permite la introduccin en el organismo del gen normal, el cual debe corregir la alteracin gentica del organismo receptor. Los criterios para seleccionar una enfermedad mediante terapia gnica son: humana como candidata al tratamiento

La enfermedad ha de amenazar gravemente la vida del paciente. Los rganos, tejidos y tipos celulares afectados por la enfermedad han de estar bien caracterizados. La versin normal del gen defectuoso debe haber sido aislada y clonada. El gen normal ha de poder ser introducido en una fraccin significativa de clulas del tejido afectado, o bien la introduccin del gen en un tejido accesible, como la mdula sea, puede beneficiar indirectamente el curso de la enfermedad en el tejido afectado. El gen debe poderse expresar adecuadamente, generando una cantidad suficiente de protena normal. Enfermedades monognicas en las que se estn experimentando diversos protocolos de terapia gnica; slo en algunas de ellas se dispone ya de suficientes datos y de experiencia contrastada en humanos, ya que en muchos casos los estudios todava se encuentran en fase preclnica o de experimentacin animal.

Enfermedades monognicas en las que se aplican protocolos clnicos de terapia gnica.

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Revisin de casos
Gene Therapy Halts Two Cases Of Melanoma
Los cientficos en el Instituto Nacional del Cncer Instituto estn encontrando el xito en el tratamiento del cncer con terapia gnica, con la esperanza de encontrar un tratamiento eficaz ms que la quimioterapia o la radiacin. Mecanizando las mismas clulas blancas de los pacientes para reconocer y atacar las clulas cancergenas. Se espera que este xito se lleve a tratar a un nmero de cnceres comunes: linfocitos autlogos las clulas blancas de una persona - se han utilizado previamente para tratar el melanoma metastsico. En un proceso llamado transferencia de clulas adoptivas, los linfocitos se eliminan primero de los pacientes con melanoma avanzado. A continuacin, las clulas ms agresivas matar el tumor se aslan, se multiplicaron en el laboratorio, y luego reintroducido a los pacientes que se han agotado todos los linfocitos de los restantes. Mientras que un xito razonable, este mtodo slo se puede utilizar para los pacientes con melanoma y slo para aquellos que ya tienen una poblacin de linfocitos especializados que reconocen los tumores las clulas anormales. As, los investigadores del NCI, dirigida por Steven A. Rosenberg, MD, Ph.D., busc una forma efectiva para convertir los linfocitos normales en el laboratorio en el cncer de clulas que combaten. Para ello, se estableci una pequea muestra de sangre que contiene los linfocitos normales de pacientes y las clulas infectadas con un retrovirus en el laboratorio. Los actos retrovirus como una paloma mensajera para introducir genes que codifican protenas especficas, llamadas receptores de clulas T (TCR), en las clulas. Cuando los genes se activan, TCR se hacen y las protenas del receptor de decorar la superficie externa de los linfocitos. El acto TCR como dispositivos de recalada en que se reconocen y se unen a ciertas molculas que se encuentran en la superficie de las clulas tumorales. El TCR a continuacin, activar los linfocitos para destruir el cncer de las clulas. En este estudio, los linfocitos de nueva ingeniera fueron infundidos en 17 pacientes con melanoma metastsico avanzado. Haba tres grupos de pacientes en este estudio. Dos pacientes presentaron cncer de regresin, haban sufrido altos niveles de linfocitos alterados genticamente, y se mantuvo libre de enfermedad ms de un ao.

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Terapia Gnica
A patient with anemia cured by gene therapy
Hombre que sufra de una enfermedad gentica grave de la sangre, la talasemia. Tres aos despus del tratamiento, el paciente, que vive en Francia y de edad que ahora tiene 21 aos, ya no necesita recibir transfusiones de sangre. Los resultados publicados hoy en la revista britnica Nature son el resultado de una colaboracin entre varios equipos de Francia (CEA, Asistencia pblica, la Universidad Paris-Sud, Paris Descartes y Diderot de Pars), las universidades estadounidenses de Pensilvania, la compaa Bluebird, con el apoyo de Teletn y la Asociacin Francesa contra la Distrofia Muscular de control. "El joven francs, vietnamita y tailandesa cuyo gen de correccin se haba administrado a la edad de 18 aos tiene una forma de la enfermedad - llamada beta-E/beta-0 - comn en el sudeste de Asia", dice el Prof. Marina Cavazzana-Calvo ( Hospital Necker, Pars). Este defecto gentico causa una deformacin de los glbulos rojos, que conduce a su destruccin precoz, anemia y trastornos diversos causado por una sobrecarga de hierro en el cuerpo como consecuencia de transfusiones repetidas. El equipo del profesor Philippe Leboulch (CEPA) ha hecho casi diez aos atrs, la primera correccin de la anemia gen en ratones mediante terapia gnica. Todava tard muchos aos en desarrollar un protocolo para los seres humanos. Bsicamente, fue necesario desarrollar un lentivirus que contiene el gen corregido y totalmente inofensivo para los seres humanos. El paciente inicialmente se sometio a un trasplante de mdula sea de clulas madre que se habian extrado. Estas clulas madre fueron cultivadas con los lentivirus modificados para que el nuevo gen fuera insertado en el corazn de las clulas madre. Por ltimo, el paciente recibi quimioterapia para destruir su propia mdula sea enferma. Y 48 horas ms tarde, las clulas madre modificadas han sido reinfundidas por va intravenosa. "El paciente se ha mantenido alrededor de un mes en el hospital," dice la Dra. Eliane Gluckman, pionero en la mdula sea (Hospital Saint-Louis, Pars). Despus de once meses, ya no necesitaba transfusiones, seala el Prof. Marina Cavazzana-Calvo. Es un gran paso hacia adelante, pero deben ser confirmados con otros pacientes. " Hemoglobinopatas (anemia falciforme y la talasemia beta) son las enfermedades hereditarias ms comunes. Ellos se deben a defectos en el gen que controla la produccin del gen de la beta-globina, un componente esencial de la hemoglobina que transporta el oxgeno en los glbulos rojos. En casos severos, los pacientes sobreviven transfusin de anemia y el tratamiento para eliminar el exceso de hierro que se acumula debido a las transfusiones repetidas.

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Ashanti de Silva
El 14 de septiembre de 1990 en los Institutos Nacionales de Salud en Bethesda, EE.UU., una nia de 4 aos se convirti en el primero conocido ser humano a ser tratado con terapia gnica. El primer caso exitoso de terapia gnica se produjo en la dcada de 1990 sobre una joven llamada Ashanti DeSilva, vctima del sndrome metablico trastorno recesivo, la deficiencia de ADA, que hizo su sistema inmunolgico dbil y vulnerable a casi todos los virus. Ella careca de capacidad para producir una enzima clave que finalmente conducira a la muerte a una edad temprana. Despus de dos aos de terapia, esta joven fue capaz de asistir a la escuela normalmente. Lo que parece un milagro, es un ejemplo de cmo la investigacin bsica en gentica y biologa molecular puede a la larga, curar algunas de las plagas de la humanidad. El gen de la ADA es un gen que es esencial para la funcin de las clulas T, glbulos blancos que son la piedra angular de nuestro sistema inmunolgico. Las clulas T tienen una vida corta y, como las clulas rojas de la sangre, se hacen continuamente por la divisin de las clulas en la mdula sea. Las clulas T son fciles de cultivar fuera del cuerpo, en el laboratorio y as Culver, Blaese y Anderson tom algunas de estas clulas de la nia, creci y luego los transform con el ADN que contiene una copia normal del gen de la ADA. Comprobaron que las clulas normales ya contena el gen de la ADA y que las clulas estaban usando este gen para hacer ARNm. Despus inyectaron transforma las clulas T de nuevo en la nia afectada. Este procedimiento debe repetirse peridicamente. El xito de esta estrategia se bas en por lo menos tres cosas. En primer lugar, el gen a preocuparse haba sido clonado. En segundo lugar, el nivel de utilizacin del gen de la ADA no es etico. El sistema inmunolgico funcione de nuevo como en una persona normal, si el gen normal de trabajo en slo una dcima parte del nivel normal o menos 50 veces el nivel normal.

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Jesse Gelsinger
Vctima de un tratamiento de Terapia gnica que fue terriblemente mal. Para la totalidad de su vida, Gelsinger sufra de una rara enfermedad metablica llamada OTC, o deficiencia de ornitina transcarbamilasa. A fin de mantener los sntomas de su trastorno bajo control, Gelsinger se mantuvo con una dieta de baja protena y tom 32 medicamentos todos los das. Fue el deseo Gelsinger para ayudar a encontrar una cura para la venta libre para las generaciones futuras, por lo que se ofreci como voluntario para someterse gen tratamiento de terapia experimental, a sabiendas de que probablemente no personalmente lo beneficiar. Sin embargo, a sabiendas de que este tratamiento prospectivo existido, Gelsinger dio hop que una da en que se poda curar. Irnicamente, antes de su tratamiento se produjo en Penn Hospital Philedelphia, dijo a un amigo, "Qu es lo peor que le puede pasar a m?" . Sin embargo, este tratamiento result fatal para Gelsinger. Muri el 17 de septiembre de 1999, se document la primera muerte como resultado de la terapia gnica. La terapia gnica tratamiento Gelsinger se compone de una combinacin de adenovirus (diluido virus de la gripe), que sirvi como un vector, y el reemplazo de genes sanos para sus seres mal funcionamiento. Como resultado de su tratamiento, Gelsinger la que sufri los sntomas que nunca se haba visto en otros ensayos clnicos que se haban realizado (Penn haba realizado pruebas similares a Gelsinger, sobre los babuinos, monos, ratones y humanos otra. No vieron sntomas similares a los que Gelsinger sufrido). Los mdicos todava no estn seguros exactamente lo que sucedi, pero se sospecha que fue a travs de una reaccin inflamatoria extrema en respuesta a los vectores que recibi. l desarroll ictericia y un trastorno de la coagulacin de la sangre, con el tiempo que tiene el rin, los pulmones y el cerebro pierde la funcin. Como resultado de este caso, la familia demand a Gelsinger Penn y el gobierno suspendi todas las investigaciones de terapia gnica otros que estaba pasando en Penn.

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Terapias anti-sentido
El trmino antisentido se aplica a secuencias cortas de ADN o ARN (oligonucletidos) diseadas para ser complementarias de secuencias gnicas especficas, con el fin de interferir el flujo de informacin gentica. Los agentes teraputicos antisentido inhiben la sntesis proteica al interferir los procesos de transcripcin y/o traduccin. Existen tres clases principales: y Secuencias antisentido: derivan de cidos nucleicos que se unen (hibridan) con hebras de ARNm citoslicas (hebras con sentido: portadoras de la informacin necesaria para la sntesis de protenas en los ribosomas) o de ARNhn (precursor nuclear del ARNm), a travs de puentes de hidrgeno, por complementariedad de las bases correspondientes del cido nucleico. Normalmente, las secuencias antisentido son secuencias cortas de cido nucleico, por lo que habitualmente se les denomina oligonucletidos antisentido. Secuencias antign: de forma similar a las secuencias antisentido, las secuencias antign se hibridan al ADN de doble hebra localizado en el ncleo, creando secuenciasen triple hlice que bloquean la transcripcin del gen correspondiente, bien directamente o bien interfiriendo en la unin de protenas a secuencias especficas del ADN. Ribozimas: los ARN antisentido pueden catalizar enzimticamente la hidrlisis de secuencias especficas de ARNm. Estos ARN catalticos se denominan ribozimas, y actan sobre sustratos naturales concretos, pero en el caso de la terapia antisentido se disean de forman que combinen dicha actividad cataltica con la posibilidad, aportada por el apareamiento de bases, de reconocer especficamente diversas secuencias de ARN diana.

Pueden seguirse dos enfoques en terapia antisentido: 1) La administracin directa de oligonucletidos. 2) La expresin de los oligonucletidos tras la transfeccin de determinadas clulas. En el primer caso, adems de la microinyeccin directa, se han investigado diversos mtodos de liberacin in vitro como son la formacin de complejos con lpidos cargados positivamente, la incorporacin en el interior de liposomas y la electroporacin. En cuanto a la expresin de nucletidos, se han utilizado vectores como adenovirus o retrovirus; en tal caso, el vector es administrado al paciente, cuyas clulas sern las encargadas de generar el oligonucletido antisentido. La expresin de oligonucletidos presenta ciertas ventajas y desventajas con respecto a la administracin directa de los mismos:

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1) La produccin directa a nivel nuclear permite mecanismos adicionales, ya que el oligonucletido puede interferir en el transporte del ARNmal citoplasma, puede tambin inducir una actividad nuclear del tipo ribonucleasa H, y puede interferir en el proceso de transcripcin de la hebra de ADN complementaria. 2) Los ARN antisentido expresados son de mayor longitud, lo que ofrece ms posibilidades de interaccin con el ARNm diana, aunque esto tambin puede favorecer la formacin de interacciones no especficas y facilitar la formacin de estructuras secundarias que interfieran en el proceso de hibridacin.

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Clulas madre
La modificacin gnica de diferentes tipos celulares, en particular de las clulas madre, est abriendo la posibilidad de desarrollar aplicaciones teraputicas de estas clulas en reas como la autoinmunidad, las lesiones del sistema nervioso central, las enfermedades seas o articulares, el cncer o el infarto de miocardio. Buen ejemplo de ello son las distrofias musculares, enfermedades que carecen actualmente de cura. Para stas, los resultados con vectores virales adenoasociados son los ms prometedores. Asimismo, la administracin sistmica de oligonucletidos antisentido ha tenido un gran xito induciendo la expresin de distrofina y la exclusin de exones ha mejorado la patologa muscular en modelos caninos de distrofia. El msculo distrfico tambin ha mostrado una importante mejora bioqumica y funcional al transplantar clulas madre miognica modificadas genticamente. Del mismo modo, la inyeccin intravenosa de clulas precursoras mieloides derivadas de mdula sea, en las que se haba introducido el gen receptor TREM2, disminuy la destruccin tisular y facilit la reparacin del sistema nervioso central en un modelo murino de esclerosis mltiple, mejorando los sntomas clnicos mediante la reduccin del dao axonal y previniendo una desmielinizacin posterior. Las clulas madre derivadas de msculo son aplicables en la regeneracin del cartlago articular, hueso y msculo esqueltico. Estas clulas pueden modificarse genticamente para secretar factores de crecimiento importantes en la reparacin de tejidos, actuando por tanto como reservorios impantables de larga duracin de estas molculas. Estas evidencias sugieren que las clulas madre derivadas de msculo son apropiadas para la terapia gnica y su aplicacin en patologas musculoesquelticas. Esta poblacin de clulas multipotenciales, aislada tambin a partir de tejido adiposo y mdula sea, ha demostrado que las clulas madre adultas modificadas con genes osteognicos permiten reparar fracturas y favorecer una rpida formacin de hueso in vivo, probablemente debido a una accin tanto autocrina como paracrina en las clulas del husped, que potencia el efecto osteognico. La porfiriaeritropoytica congnita es una enfermedad autosmica recesiva severa caracterizada por la deficiencia de la enzima uroporfiringeno III sintasa (UROS), perteneciente a la ruta biosinttica del grupo hemo. Recientemente se ha desarrollado un modelo murino en el que la aplicacin de clula madre hematopoyticas transfectadas con el cDNA del gen UROS humano mediante lentivirus, permiti una correccin completa de la enfermedad a nivel fenotpico, metablico y enzimtico de larga duracin. En esta misma lnea se han utilizado clulas epiteliales amniticas humanas inmortalizadas, en las que se introdujo mediante un vector adenoviral el gen de la beta-glucuronidasa, para tratar la mucopolisacaridosis tipo VII murinos.

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Las clulas madre mesenquimales (MSCs) Tmbin pueden ser modificadas gnticamente para aplicarlas en el tratamiento del cncer y en inmunomodulacin. Bajo una estimulacin apropiada, las MSCs pueden comportarse como potentes clulas presentadoras de antgeno, y se estn llevando a cabo estudios acerca de la produccin de IL2 por estas clulas como agente anticancergeno. Los tumores cerebrales son muy agresivos y su tratamiento es difcil debido a su localizacin, pero en los ltimos aos, se estn logrando esperanzadores avances mediante el trasplante de clulas madre neurales modificadas genticamente para producir molculas antitumurales, y que tienen la capacidad de migrar hacia el tumor, reduciendo su volumen. La terapia con clulas modificadas genticamente se ha aplicado tambin a las ptologas cardiacas, como el infarto de miocardio. Por ejemplo, la infusin intravenosa de clulas madre mesenquimalestransfectadas con vectores retrovirales, que sobre expresen la quimioquina CXCR4, se ha utilizado para promover la llegada de clulas progenitoras a los tejidos isqumicos y, por tanto, la reparacin tisular. El modelo, desarrollado en ratas, muestra una estrategia teraputica til, segura y no invasiva para el tratamiento postinfarto. De forma similar, el trasplante de clulas madre neurales humanas que sobre expresan VEGF en modelos murinos de hemorragia intracerebral, constituye un posible tratamiento para este tipo de accidente cerebrovascular, al favorecer la angiognesis en el cerebro husped y la recuperacin funcional en estos animales.

Crohn s Disease Cured By Stem Cell Therapy

La terapia del trasplante de clulas madre ha conseguido curar pacientes con enfermedad de Crohn, una enfermedad terrible que afecta a unas 600.000 personas en Norteamrica y millones ms en todo el mundo. El xito en el tratamiento de la enfermedad de Crohn es slo uno de una serie de recientes xitos de clulas madre y terapias relacionadas. El futuro de decenas de millones de personas sufren en todo el mundo se ve ms brillante cada da como una explosin en los tratamientos y curas para las enfermedades no ve signos de disminuir. La enfermedad de Crohn es una enfermedad autoinmune en la que el cuerpo propio sistema inmune ataca el tracto gastrointestinal, dando lugar a toda una vida de diarrea grave y dolor de estmago de sus vctimas. Grave es un eufemismo: para los que ms sufren la enfermedad de Crohn puede significar 20 a 30 visitas diarrea dolorosa y embarazosa para el bao todos los das. El tratamiento es a veces eficaz para los casos leves de la enfermedad, pero para las opciones de los casos ms graves el tratamiento son muy limitadas. Ahora con el reciente desarrollo de una cura trasplante de clulas madre, ms de 20 personas con la forma ms severa de la enfermedad han visto a sus sntomas ya sea totalmente o casi totalmente erradicado.

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Al igual que otros tratamientos que se han cubierto, por ejemplo, que de nio burbuja de la enfermedad, el tratamiento se centra en el "restablecimiento" del paciente del sistema inmunolgico funciona mal mediante su sustitucin por uno nuevo. Las clulas madre sanas de la mdula sea primero se extraen del paciente, seguido por la quimioterapia que destruye por completo de sistema inmunolgico del paciente. Despus las clulas madre extradas son reimplantado en el individuo en el que, naturalmente, proliferar y diferenciarse en un nuevo, buen funcionamiento del sistema inmunolgico. Billy Tytaneck, el primer canadiense para someterse al tratamiento, ha escrito un relato de primera mano de su experiencia con el procedimiento. El propio primer xito en el tratamiento de la enfermedad de Crohn se realiz en Joy Weiss hace ocho aos en 2001, y varios otros individuos han sido sometidos al tratamiento desde entonces. En un reciente comunicado de prensa de la Clnica Hospital en Espaa, la nueva informacin se public acerca de la situacin mundial de los tratamientos de trasplante de clulas madre para la enfermedad de Crohn. Desde el lanzamiento nos enteramos de que el procedimiento se ha realizado en 12 pacientes en los EE.UU., 4 pacientes en Italia, y ahora 6 pacientes en Espaa. Segn se informa el 80% de los casos han sido testigos de la remisin total y el restante 20% de los casos han sido testigos de una mejora considerable en la calidad de vida. La realidad es que la terapia de trasplante de clulas madre es un procedimiento muy grave que los pacientes deciden continuar slo despus de una cuidadosa consideracin y despus de todas las dems opciones han fracasado. En tratamiento de quimioterapia no es una broma. Esto conlleva un pequeo riesgo, pero inevitable de cncer y es una merma importante en el cuerpo del paciente. Por otra parte, en sustitucin de nuestro sistema inmunitario es una tcnica nueva y poco entendida, cuyas ramificaciones a largo plazo estn an en estudio. Aunque los pacientes han estado en remisin durante un mximo de 7 u 8 aos y contando, que an no se ha visto la eficacia de la terapia es de 10 o 20 aos en el camino.

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Referencias
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