UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL MEDIO AMBINTE INGENIERIA BIOTECNOLOGICA SANIDAD VEGETAL

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE Mycosphaerella fijiensis & SINTOMAS Y CONTROL DE LA SIGATOKA NEGRA A. Tatiana Rangel**. B. Dayana Vsquez**.
A. B.

Tatiana Rangel Rubio (1610458) e-mail: tatik_nenita@hotmail.com. Dayana Andrea Vsquez Barajas (1610457) e-mail: dayana900817@hotmail.com. ** Estudiantes de Ingeniera Biotecnolgica RESUMEN

El cultivo de banano es uno de los ms importantes a nivel mundial despus del arroz el trigo y el maz; estas plantas pueden sufrir diversas patologas pero estos cultivos son susceptibles a una enfermedad foliar ocasiona da por el hongo Mycosphaerella fijiensis denominada Sigatoka Negra. El desarrollo de la cual genera una marcada disminucin en la produccin bananera por maduracin precoz de frutos y reduccin de la capacidad fotosinttica de la planta debido a la destruccin del tejido foliar. La prdida de la produccin puede llegar hasta el 50 % (Robinson, 1996). Por ende se hace necesario el conocimiento de la misma para el manejo del cultivo y prevencin de la enfermedad antes de que se desarrolle la enfermedad. Palabras claves: Sigatoka negra, Mycosphaerella fijiensis, fotosinttica, enfermedad.

INTRODUCCION El pltano, banano, cambur o guineo agrupa a un gran nmero de plantas herbceas del genero Musa, tanto hbridos obtenidos horticulturalmente a partir de las especies silvestres del genero Musa acuminata y Musa balbisiana, o como cultivos genticamente puros de estas especies. Clasificado originalmente por Lineo como Musa paradisiaca en 1753, la especie tipo del gnero Musa, estudios posteriores han llevado a la conclusin de que la compleja taxonoma del gnero incluye numerosos hbridos, de variada composicin gentica, y se ha desarrollado un sistema estrictamente sui generis de clasificacin para dar cuenta de esta variacin. Sin embargo, de acuerdo a las reglas del Cdigo Internacional de Nomenclatura Botnica, el nombre linneano cuenta con prioridad, y sigue siendo usado para designar genricamente a estas variedades. Se trata de una falsa baya, de forma falcada o alongada, que crece en racimos de hasta cien unidades y 50 kg de peso; de color amarillo cuando est maduro, es dulce y carnoso, rico en carbohidratos, potasio, vitamina A y vitamina C. Es mucho ms rico en caloras que la mayora de las frutas por su gran contenido en fcula; de los 125 g que pesa en promedio, el 25% es materia seca, que aporta unas 120 caloras. Las hojas se cuentan entre las ms grandes del reino vegetal; son de color 1

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verde o amarillo verdoso claro, con los mrgenes lisos y las nervaduras pinnadas. Las hojas tienden a romperse espontneamente a lo largo de las nervaduras, dndoles un aspecto desaliado. El lapso que toma la hoja para abrirse es variable. La salida de la hoja da como resultado un crecimiento extraordinariamente rpido de la vaina de la hoja (4 m en 10 das para Gros Michel4). La hoja joven se desliza por el canal peciolarde la hoja anterior y es as como el desarrollo de una hoja corresponde a dos fenmenos sucesivos: el de crecimiento y el de apertura. [1]

Guatemala (1976), Costa Rica (1979), Mxico (1980), Panam (1981), Colombia (1981), Ecuador (1987), Cuba (1991), Venezuela (1993) y en Jamaica (1995). Al momento la Sigatoka negra no ha sido detectada en Puerto Rico. [2]

Figura N 1: Etapas de desarrollo de la hoja SIGATOKA NEGRA (Mycosphaerella fijiensis Morelet) La Sigatoka negra es ms agresiva y virulenta que la Sigatoka amarilla, causando la prdida rpida del follaje de las plantas, reduccin del rendimiento y maduracin prematura y dispareja de los frutos. En siembras comerciales su control es difcil ya que afecta variedades de pltano que son resistentes a la Sigatoka amarilla. Esta enfermedad se inform por primera vez en el Valle de Fiji en 1963, donde desplaz a la Sigatoka amarilla en muy poco tiempo. En el 1972 se inform en Honduras y luego se detect en los siguientes pases de Centro y Sur Amrica y el Caribe: Blize (1975), 3

4 SINTOMATOLOGIA Figura 2, 3 y 4: sigatoka negra en pltano Enfermedad que ataca inicialmente en el envs de las hojas formando lesiones necrticas o manchas con halos amarillos y centro gris claro, en grandes reas del tejido foliar. Afecta a la planta 2

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en las hojas ms jvenes y por lo tanto, ocasiona daos ms importantes en los tejidos fotosintticos. La mancha sigue avanzando en su desarrollo y evolucin; se hace ms grande y ancha de forma elptica y se rodea de un borde caf oscuro visible cuando la hoja esta mojada. Luego de este estado la mancha se seca en el centro, se torna gris y se deprime; la lesin se rodea de un borde angosto negro bien definido. Al unirse todas las lesiones la hoja se torna negra y muere en 3 o 4 semanas despus deasomar los primeros sntomas.

Figura N 5: Estadio de la Sigatoka Negra La Sigatoka Negra es una tpica enfermedad policiclica, en la que tanto conidios como ascosporas juegan su papel en la dispersin de la enfermedad. Los conidios aparecen en conidiforos sencillos y se forman en lesiones jvenes como estras (estadios 2 y 3) y en el primer estadio de mancha. Los conidios no son desprendidos por el viento, se dispersan por medio del salpique de la lluvia y el escurrimiento del agua por la superficie de las hojas. Son asociados a infecciones de corta distancia pero las ascosporas son la principal forma de dispersin a distancias mayores, por efecto del viento y son las responsables de la introduccin paulatina de la enfermedad en nuevas reas, sobretodo, durante periodos de alta precipitacin. Conidios como ascosporas requieren de una alta humedad relativa para germinar, aunque el rango ptimo para los conidios es ms amplio (92-100%)que para las ascosporas (98-100%).La temperatura tiene un efecto cuadrtico sobre la germinacin delos conidios y las ascosporas, diversos estudios han determinado que el rango optimo oscila entre 26,5 y 28 C.[3]

Tabla N 1: Sntomas de las manchas foliares de Sigatoka Negra asociados a los diferentes estadios de la enfermedad.

Figur a N 6: Ciclo de vida de Mycosphaerella fijiensis Morelet, agente causal de la Sigatoka negra del banano.

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CARACTERISTICAS Mycosphaerella fijiensis Morelet

DE

Mycosphaerella fijiensis Morelet (anamorfo Paracercospora fijiensis; Raya negra/Sigatoka negra). Mycosphaerella fijiensis, agente causal de Raya negra/Sigatoka negra, presenta pseudotecios, espermogonios y ascsporas indiferenciables morfolgicamente de los de M. musicola y M. eumusae. Los pseudotecios y espermogonios se forman en mucha mayor cantidad en las manchas maduras de M. fijiensis que en las de M. musicola donde predominan los esporodoquios y M. eumusae. Estos comienzan a diferenciarse a partir del estado 4 de la descripcin de los sntomas de Sigatoka negra de Four (1982). Son anfgenos, errumpentes, con dimetro variable entre 43 y 86,5 mm (promedio 56mm), con ascas bitunicadas hialinas sin parfisis, con dos hileras de ascsporas bicelulares con una clula anterior mayor y una constriccin marcada a nivel del septo, de 12 -18,4 x 2,5-5 mm. Los espermogonios son de forma globosa obpiriforme con paredes pardo claras, de 23-55 mm (media de 35,5mm), con un ostiolo ligeramente prominente que emerge por el estoma. Son ms abundantes en la cara inferior que en la superior. Estn frecuentemente asociados a conidiforos que emergen alrededor de estos y de hifas que se extienden por la superficie superior de la hoja. Presentan hileras de espermacios unicelulares baciliformes, hialinos, truncados por los extremos, de 2-4,5 x 1,5-3 mm. Los conidiforos aparecen en los estados 2 y 3 de la evolucin de los sntomas y en manchas maduras en estado 5. Se desarrollan sobre un pequeo agrupamiento de cuatro a seis clulas engrosadas que se forman en la cmara subestomtica y emergen a travs de la apertura de los estomas en fascculos de dos a cuatro conidiforos sin evidencia de la formacin de un

esporodoquio en estas etapas de los sntomas; de color pardo plido, con una clula basal ms ancha, con 0-5 septos y dimensiones entre 27-71 x 3-5 (56,4 x 4,5 ) y con una y en ocasiones hasta seis cicatrices bien marcadas, ya sean planas contra el extremo del pice o con un ligero hombro. En las manchas en estado 5 y 6 la presencia de esporodoquios. [4]

ps

Figura 7: pseudotecios de M. fijiensis

Figura 8: ascosporas de M. fijiensis

10 4

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1 1 Figura 9, 10 y 11: conidiforos y conidios de M. fijiensis DE Mycosphaerella AISLAMIENTO (Paracercospora fijiensis) fijiensis Para la obtencin de conidias de Paracercospora fijiensis, anamorfo de Mycosphaerella fijiensis, se utiliz la metodologa propuesta por Du Pont (s.f.), la cual consiste en recolectar en el campo 100 g de tejido foliar muerto por M. fijiensis; la recoleccin se realiz despus de dos o tres das sin lluvia para asegurar la presencia de inculo en el tejido foliar; los tejidos infectados de apariencia blanco-grisceo producen el mayor nmero de ascosporas (Stover, 1969 citado por Du Pont, 1982). El tejido foliar infectado por M. fijiensis se incub a temperatura ambiente (aproximadamente 18C), en cmara hmeda y en bolsas de plstico transparente durante 48 horas; posteriormente, con la ayuda de un estereoscopio, se marcaron reas de aproximadamente 2 cm2 que presentaban buenas poblaciones de peritecios, dentro de los cuales se hallan las ascosporas (Mateus et al., 1987). Cinco de estas reas se pegaron con grapas a crculos de papel filtro de 9 cm. de dimetro y se sumergieron en agua corriente por 5 min para colocarlas despus en las tapas de 10 cajas Petri, con el fin de permitir la descarga de ascosporas sobre una solucin de agaragua al 20%. Al cabo de dos horas se

retiraron las tapas de las cajas, se observaron en un microscopio compuesto, con el aumento 4X, se identificaron las zonas de descarga y con el aumento 10X y 40X se identificaron las ascosporas, las cuales son bicelulares, hialinas, elpticas y con una longitud aproximada de 14-19 y un dimetro de 4-6 (Du Pont, 1982).

Posteriormente, con ayuda de un atrapa-esporas que consiste de un anillo de aluminio con dos lados rectos y dos curvos, el cual se acopla al objetivo 10X y est provisto de un aro circular en el extremo a travs del cual pasa la luz del objetivo, se marc sobre el medio agar-agua el lugar en donde se hallaban ascosporas individuales. Cada una de las huellas hechas con el atrapa-esporas se separ y transfiri con la ayuda de una aguja de diseccin a una caja de
Petri con PDA (Papa Dextrosa Agar, 39g L-1 de agua). Los cultivos monoespricos se incubaron en completa oscuridad a 25C en una incubadora, durante 20 das para obtener micelio. Una vez obtenido el micelio, se retir del medio con un bistur y se coloc en un mortero estril con agua destilada estril, se macer durante 1 min para fragmentarlo y obtener una suspensin homognea de micelio. Usando una pipeta Pasteur, se transfirieron 0.5 mL de la suspensin y con una asa de transferencia estril se realiz un rayado sobre la superficie del medio de cultivo extracto hojas de pltano-avena-agar (PAA), que consisti de 60 g de hojas jvenes de Dominico hartn, las cuales se lavaron con agua corriente, se picaron, se licuaron durante 3 min en 500 mL de agua destilada estril a 2.800 rpm durante 3 min y se filtraron a travs de dos capas de gasa. Por otro lado, se mezclaron 20 g de harina de avena 5

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Quaker en 500 mL de agua destilada estril y se llevaron a coccin por 10 min. para luego filtrarlos tambin a travs de dos capas de gasa. Posteriormente, se mezclaron las dos soluciones en relacin volumtrica 1:1, se ajust el pH a 7.0 con KOH 1N, se adicion agar-agar al 1.5% y se esteriliz en autoclave a 121C durante 20 min. (Smith, 1971). Las siembras de la suspensin de micelio en medio PAA se colocaron a 25C en una incubadora, durante 15 das, y se expusieron a luz blanca continua para la produccin de conidias. La incubadora estaba provista de una lmpara de 20 watts ubicada a 15 cm. de la superficie donde se encontraban las cajas (Jacome & Schuh, 1993; Mourichon et al., 1987; Romero & Sutton, 1997). Para la identificacin de P. fijiensis se tomaron conidias del cultivo puro con una aguja de diseccin estril y se montaron sobre un portaobjetos con lactofenol (fenol 20 g, cido lctico 20 mL, glicerol 30 mL y agua destilada 20 mL) (Castao Zapata, 1998), con el fin de observar a travs de un microscopio compuesto en el objetivo 40X la presencia de la cicatriz (hilio) en el punto de unin de la conidia con el conidiforo, caracterstico de P. fijiensis (Mateus et al., 1987; Jones & Mourichon, 1993; Mourichon et al., 1987; Aguirre et al., 1998). [5]

Figura 13: Observacion a nivel microscpico de EXTRACION DEL ADN DEL HONGO conidioforos y conidios de M. fijiensis Para la extraccin del material gentico del hongo se utiliz como base el protocolo, para minipreparaciones, propuesto por Murray y Thompsom (1980). Se tomaban, aproximadamente, 0.03 g de micelio de hongo y se coloc en un tubo eppendorf de 1.5 ml, adicionando 100 L de buffer de extraccin 2X CTAB y se procedi a macerar fuertemente con un pistilo. Seguidamente se complet la totalidad del buffer de extraccin, de acuerdo con las cantidades que se iban a analizar y teniendo encuentras las de control. De cada una de las rplicas de los tratamientos, se extrajeron 6 porciones 6

Figura 12: Caractersticas morfolgicas a nivel macroscopicode M. fijiensis

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de hongo para probar las diferentes cantidades de buffer. A excepcin de una de las control, a cada muestra se le adicion una punta de esptula (2.5 mg aproximadamente) y se agit fuertemente en vortex. En la cmara extractora de gases se aadi 2 L de mercaptoetanol y se agit hasta homogenizar en vortex. Posteriormente se incubaron las muestras en un Bao Mara a 65 C por 60 minutos, transcurrido este perodo las muestras se dejan enfriar por 4 minutos, luego se adicionaron 400 L de una solucin 24:1 de cloroformo-isoamil alcohol a temperatura ambiente y se mezcl fuertemente con vortex. La muestra se centrifug a 10500 g por 5 minutos, luego se transfiri el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf y se repiti el paso anterior. Con la ayuda de una micropipeta de 1 ml se transfiri el sobrenadante a un otro tubo eppendorf y se adicion isopropanol (-20 C) para precipitar el ADN. Las muestras se dejaron reposar en el congelador durante toda una noche. Posteriormente, se centrifugaron los tubos a 10500 g por 5 minutos y se elimin el isopropanol. Se adicionaron 150 l de alcohol al 70% fro, se agit levemente y se centrfug a 10500 g por 10 minutos, invirtiendo el tubo se elimin el alcohol. Este paso se repiti, para luego dejar secar la muestra a temperatura ambiente. El ADN obtenido se resuspendi en 100 L de TE. ELECTROFORESIS AGAROSA AL 1% EN GELES DE

intercala entre el ADN y que fluorece a 302 nm en una lmpara ultra violeta. Para cargar los pozos del gel, se tomaron 5 l de la solucin de ADN, 5 l de loading buffer Bpb y 17 l de TE. Adems junto con las muestras se coloc un marcador de peso molecular, con el propsito de hacer una cuantificacin visual de las muestras de la concentracin de ADN en las muestras. Los geles se pusieron a migrar a 100 voltios constantes por un periodo de 1:45 h. [6] RECOMENDACIONES La evaluacin continua de la evolucin de la enfermedad es necesaria para lograr mantener una idea clara y precisa del estado sanitario de las plantaciones de musceas y poder prevenir daos severos al cultivo y su produccin, por lo cual deben hacerse evaluaciones peridicas, semanales o quincenales, sobre la severidad o incidencia de la Sigatoka Negra en cada finca. Por otro lado, para la obtencin de la informacin biolgica de la manchas foliares causadas por Mycosphaerella fijiensis M. es necesario conocer las etapas tanto del proceso de apertura de la hoja (Figura No 1), como tambin del desarrollo de los sntomas de la enfermedad. Para esto ltimo, se usa la metodologa de preaviso biolgico, la cual se basa en la observacin del desarrollo de la enfermedad, medida como: el ritmo de emisin foliar, la suma bruta y el estado de evolucin., Esta informacin es obtenida para cada planta de un total de 10 o 15 plantas seleccionadas, y a cada una se le hace seguimiento detallado cada semana. La incidencia es el nmero de hojas afectadas y la severidad es el rea foliar manchada por el ataque de Sigatoka Negra en el pltano. Para llevar a cabo tal evaluacin en necesario registrar los parmetros o variables que permiten dar 7

Para la electroforesis de las muestras se tomaron 30 l del ADN extrado y se disolvieron en 30 l de TE para obtener una dilucin de . Para la preparacin de los geles se pes 1 g de agarosa por cada 100 ml de buffer TBE 1X y se adicionaron 10 l bromuro de etidio (10 mM), reactivo que se

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una perspectiva clara de la enfermedad, para lo cual normalmente son registradas las siguientes variables: Fecha de la observacin o registro de la evaluacin de la infeccin. Total de hojas de las plantas estudiadas (TH). [7] CONTROLES Control de malezas. Existen reportes generales, en donde se seala que un buen control de malezas dentro de las plantaciones permite una aireacin adecuada y evita condiciones de alta humedad relativa que favorezcan el desarrollo del hongo. Asimismo, las malezas son nocivas al cultivo de banano y pltano, ya que compiten por agua, nutrientes, espacio y algunas son hospederas de plagas y Tropical Otras prcticas. Otras labores de cultivo que deben ser implementadas dentro de un programa de manejo integrado de la Sigatoka negra son: el deshije, que se utiliza para mantener una poblacin adecuada de plantas y de esta manera evitar el exceso de rea foliar y tener mejor cobertura y distribucin de los fungicidas aplicados, as como una buena ventilacin dentro de la plantacin (Stover, 1980; Marn et al., 2003). El combate de nematodos y del picudo, es importante para mantener buena sanidad en la parte subterrnea de las plantas (cormo y races). Los bananos son ms susceptibles a la Sigatoka negra cuando se incrementa la proporcin de races muertas (menor nmero de races funcionales) por daos de nematodos y rea daada del cormo por el picudo (Holderness et al., 1999). Estas labores, adems de mejorar las estrategias de manejo de Sigatoka negra, tambin optimizan las condiciones del cultivo del pltano.

La alta dependencia de fungicidas para el combate de Sigatoka negra en muchos cultivares de bananos y pltanos, hace necesaria la bsqueda de nuevas alternativas para un manejo integrado de la enfermedad. La evaluacin de bioproductos y fungicidas de origen orgnico, son lneas de investigacin prioritaria. Por otra parte, las prcticas de cultivo siguen siendo el componente ms importante (despus del control qumico) en el combate de Sigatoka negra, ya que reducen la fuente de inoculo, favorecen el crecimiento del cultivo y disminuyen las condiciones propicias para el desarrollo de la enfermedad. El deshoje, ciruga y poda temprana en sus diferentes modalidades son herramientas tiles para reducir la produccin de inoculo Aplicacin de urea y mini-compost para acelerar la descomposicin de la hojarasca depositada en el suelo. Drenaje y nutricin adecuada. Control de nematodos y plagas, entre otras prcticas ayudan a tener plantas vigorosas y menos susceptibles. En cada zona o regin bananera se requiere adaptar y adoptar un programa de prcticas culturales basado en el clima, cultivar y severidad de la Sigatoka negra. Para esto, es necesaria la realizacin de estudios continuos, con el objetivo de adoptar las prcticas culturales a la necesidad especfica de cada regin. [8] CONCLUSIONES La alta densidad de siembra de algunos cultivares de banano y pltano es una prctica factible de utilizarse para incrementar la produccin por unidad de superficie. La mayora de los estudios de densidad de plantacin, han tenido como objetivo principal el evaluar su influencia en el crecimiento y la productividad de estas musceas (lvarez & Beltrn, 8

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2003; Belalczar et al., 2003; Langdon et al., 2008). Ocasionalmente, se han considerado parmetros relacionados con la incidencia y severidad de Sigatoka negra. El uso de 3,000 plantas/ha de pltano Dominico-Harton (Musa AAB) en Colombia, increment en un 300% el rendimiento de fruta en comparacin al sistema tradicional de 1,000 plantas/ha. Asimismo, un beneficio adicional de este sistema de altas densidades de poblacin es la menor incidencia de Sigatoka negra (Belalczar et al., 2003). Resultados similares fueron obtenidos en Cuba con el banano FHIA 23 utilizando 4,000 plantas/ha. Con esta poblacin se duplica el rendimiento y disminuye la severidad de Sigatoka negra sin necesidad de hacer aplicaciones de fungicidas, en contraste con huertos comerciales, en donde generalmente se realizan cinco aspersiones de fungicidas (lvarez & Beltrn, 2003). La reduccin de la severidad de Sigatoka negra se atribuye a la modificacin de algunas condiciones ambientales dentro de la plantacin (principalmente humedad relativa y temperatura) que afectan la formacin de agua condensada sobre las hojas, indispensable para la germinacin de los propgulos del hongo. Del mismo modo, se reduce la cantidad de luz en el interior de la plantacin, lo cual disminuye la toxicidad de la toxina fotosensible Cercosporn (Belalczar et al., 2003). Contrariamente, en otros trabajos realizados en Cuba se report que el desarrollo de la enfermedad es ms intenso con el uso de 2,000 plantas de banano/ha en comparacin a 1,850 plantas, registrndose diferencias de hasta dos hojas ms sanas en las plantaciones con densidades bajas (Prez, 1998). Estos contrastes pueden

atribuirse al tipo de cultivar de banano o pltano y a las diferencias climticas en las zonas de estudio, o bien a diferentes microclimas dentro de la plantacin: temperatura, aireacin, formacin de roco, humedad relativa y radiacin solar. BIBLIOGRAFIA

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MURILLO.

Estudio

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