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Universit du Qubec Montral

Mthodes sparatives CHI2170 gr.040 Automne 2011




Exprience 5 :
Evaluation de diffrentes colonnes chromatographiques en
phase inverse utilises pour la HPLC analytique




Raliser par : Roger Hassrouty
Loubna Jalafa
Hanane Belil

Encadrer par : Dr. Rami Abdelhaq

Exprience ralise le : 10/11/2011
Rapport rendu le : 17/11/2011


I- But :

Le but de cette exprience est dtudier leffet des caractristiques de la phase stationnaire sur
lefficacit dune sparation dun mlange de tyrosine, acide benzoque et phnol par
chromatographie liquide haute performance (HPLC) en mode invers, en utilisant une phase mobile
(actonitrile/ 0,06%(v/v) acide trifluoroactique) et un dtecteur UV-Visible la longueur donde 250
nm.
Les caractristiques tudier et qui influencent les performances dune colonne sont :
- La longueur de la chane du groupement alkyl (C
4
, C
8
, C
18
).
- La longueur de la colonne (15 cm, 5cm).
- Le diamtre des particules de la phase stationnaire (3 m, 10 m).

II- Partie exprimentale :

y Conditions Chromatographiques :

Chromatographe : Varian 9010 avec dtecteur UV Hitachi 655A
Systme dinjection : Manuel boucle de 10 l
Colonne :
- Colonne 1 : Ace C
18
(15 cm 4,6 mm) contenant des particules greffes de C
18
.
Diamtre moyen des particules : 3 m.
- Colonne 2 : Ace C
18
(5 cm 4,6 mm) contenant des particules greffes de C
18
.
Diamtre moyen des particules : 3 m.
- Colonne 3 : Ace C
18
(15 cm 4,6 mm) contenant des particules greffes de C
18
.
Diamtre moyen des particules : 10 m.
- Colonne 4 : Ace C
8
(15 cm 4,6 mm) contenant des particules greffes de C
8
.
Diamtre moyen des particules : 3 m.
- Colonne 5 : Ace C
4
(15 cm 4,6 mm) contenant des particules greffes de C
4
.
Diamtre moyen des particules : 3 m.
Phase mobile :
- Solution A : 0,06 % (v/v) acide trifluoroactique (TFA) dans leau.
- Solution B : 100 % actonitrile.
Dbit : 1,0 mL/min
Longueur donde : fixe 250 nm.








y Composs analyser :

Tableau 1 : Formule chimique, structure des molcules et constante dacidit des
composs analyser [1]
Produit Formule
Chimique
Structure chimique pKa 25C
Acide benzoque C
7
H
6
O
2



4.204

Tyrosine C
9
H
11
NO
3


(-COOH) = 2.20
(- NH
3
+
) = 9.11
10.1
Phnol C
6
H
6
O


9.99

En premier lieu, il a t utilis la colonne 1 pour injecter le mlange des trois composs en mode
isocratique (80% A, 20%B). Il a t dtermin le gradient optimal de la phase mobile, puis il a t
inject les trois composs sparment.
Le gradient optimal obtenu a t utilis pour injecter le mlange avec les colonnes 2, 3,4, 5 et la
colonne inconnue.


III- Rsultats :

Il a t inject le mlange des trois composs en mode isocratique : 80% de A, 20% de B. Voir
chromatogramme 1.
Il a t effectu des injections du mlange afin de dterminer le gradient optimal. Voir
Chromatogramme 2, 3 et 4.
Le tableau suivant reprsente les gradients effectus et les chromatogrammes correspondants.

Tableau 2 : Gradients et chromatogrammes correspondants.
Gradient 1 Gradient 2 Gradient 3
% A % B
0 75 25
5 min 75 25
6 min 60 40
15 min 60 40
% A % B
0 70 30
15 min 50 50
20 min 50 50
% A % B
0 65 35
3 min 65 35
15 min 50 50
20 min 50 50
Chromatogramme 2 Chromatogramme 3 Chromatogramme 4

En utilisant le gradient 1, il a t inject les trois composs spars afin de les identifier. Voir
chromatogramme 5, 6 et 7.
Le mme gradient a t utilis pour analyser le mlange avec les colonnes 2, 3, 4, 5 et la colonne
inconnue. Voir chromatogramme 8, 9, 10, 11 et 12.
Le tableau suivant reprsente la pression pour chaque colonne avec les temps de rtention des
composs.

Tableau 3 : Pression dans chaque colonne et temps de rtention des composs
Pression
(bar)
Temps de Rtention (min)
Tyrosine Phnol Acide benzoque
Colonne 1 192 1,91 8,60 9,31
Colonne 2 73,0 0,75 3,30 4,40
Colonne 3 34,0 1,87 8,73 9,35
Colonne 4 181 2,02 8,44 9,22
Colonne 5 173 2,13 7,68 8,81
Colonne Inconnue 191 1,85 8,41 9,12

Il a t calcul le nombre dtage thorique pour chaque colonne en utilisant le temps de rtention
le plus long (temps de rtention de lacide benzoque. Il a t aussi calcul la rsolution Rs pour
chaque paire de produits.

Tableau 4 : Nombre dtages thoriques
Colonne 1 Colonne 2 Colonne 3 Colonne 4 Colonne 5 Colonne 6
Tyrosine
(min)
0,26 0,19 0,26 0,27 0,28 0,25
Phnol
(min)
0,21 0,38 0,24 0,28 0,48 0,32
Acide
benzoque
(min)
0,18 0,51 0,22 0,19 0,22 0,19
Nombre
dtage
thorique
42803 1191 28900 37677 25658 36864
: Largeur du pic la base en minutes







Tableau 5 : Rsolution entre chaque paire pour chaque colonne.
Colonne 1 Colonne 2 Colonne 3 Colonne 4 Colonne 5 Colonne 6
Rs entre
tyrosine et
phnol
28,4 8,95 27,4 23,5 14,5 22,6
Rs entre
phnol et
acide
benzoique
3,64 2,47 2,69 3,40 3,20 2,76



IV- Exemple de calcul

- Calcul de la largeur de pic la base :

Daprs les deux quations :


O :
N : Nombre dtage thorique.
tr

: Temps de rtention en minutes.

1/2
: Largeur du pic demi-hauteur en minutes.


:

Largeur du pic la base en minutes.

Par galit



On obtient : = 1,7
1/2

Daprs le chromatogramme 7 :

1/2
(acide benzoque) = 6,4 s

= 0,18 min

- Calcul du Nombre dtages thoriques :


ti


O :
N : Nombre dtage thorique.
tr

: Temps de rtention en minutes.


:

Largeur du pic la base en minutes.

Daprs le chromatogramme 7 :

t
R
(Acide benzoque) = 9,31 min

= 42 803


- Calcul de la rsolution Rs :

tRB tRA
A B


Daprs le chromatogramme 9 :
t
R
(phnol) = 8,73 min et t
R
(acide benzoque) = 9,35 min
(phnol) = 0,24 min et (acide benzoque) = 0,22 min


= 2,69


V- Discussion

La chromatographie liquide haute performance permet de sparer et danalyser
les constituants dun mlange par diffrence de migration entre une phase stationnaire
et une phase mobile. On peut distinguer deux types diffrents selon la polarit de la fonction
chimique de la phase stationnaire qui est le gel de silice greff et celle de la phase mobile.[4]
- Chromatographie en phase normale :
La phase stationnaire est trs polaire (greffons NH
2
, CN, CH
2
, CHOH) et la phase mobile non
polaire (hexane, ther isopropylique).
Les substances sont alors lus en sens inverse de leur polarit, les composs peu polaires ont
une grande affinit pour la phase mobile et sont donc lus rapidement. Inversement
les soluts polaires ont une plus grande affinit pour la phase stationnaire et sont lus
lentement.
Laugmentation de la polarit de la phase mobile permet llution des composs les plus
retenus et donc diminution du temps de rtention. [2][4]
- Chromatographie en phase invers :
La phase stationnaire est souvent constitu dun hydrocarbure (C8 : octylsillyle,
C18 : octadcylsillyle) qui non polaire tandis que la phase mobile est un solvant relativement
polaire, come leau, le mthanol ou lactonitrile.
Les substances sont alors lus dans le sens de leur polarit. Les composants polaires ont une
grande affinit pour la phase mobile et sont donc lus rapidement. Inversement les soluts
peu polaires ont une plus grande affinit pour la phase stationnaire et sont lus lentement.
La diminution de la polarit de la phase mobile permet llution des composs les plus
retenus. [2][4]
- Optimisation du gradient :

Loptimisation du gradient de la phase mobile a t faite laide du chromatogramme (N1)
du mlange inject en mode isocratique (composition de la phase mobile est fixe).
La programmation dun gradient dlution se fait afin de modifier la polarit de la phase
mobile au cours danalyse pour obtenir la meilleure sparation possible dans un temps
danalyse raisonnable.
Le mode isocratique "chromatogramme 1" prsente une bonne rsolution des trois composs
toutefois le temps dlution est trs long.
Il a t constat que le premier compos prsente une lution rapide (interfrence avec le pic du
solvant temps mort ). Ceci est du au fait que le compos est polaire, (plus daffinit pour la phase
mobile, moins daffinit pour la phase stationnaire).
Il a t dcid de travailler avec un mode gradient, trois gradients ont t effectus.

Gradient N1 :
Le compos 1 nest pas retenu pas la phase stationnaire, il a t dcid de diminuer lgrement la
polarit de la phase mobile en augmentant le pourcentage de lactonitrile (25%) durant les
premires 5 minutes, aprs la 5
ime
minutes le gradient passe graduellement 40% actonitrile.
Les deux composs restant luer sont apolaire en ayant une phase mobile polaire (pourcentage
TFA/Eau lev) les composs ont tendance passer plus de temps dans la colonne, mais en
augmentant le pourcentage de lactonitrile les composs vont avoir moins daffinit vers la phase
mobile, c'est--dire quils vont passer moins de temps dans la colonne. Ceci va se reflter sur les
temps de rtention qui seront plus faible par rapport au mode isocratique.
Daprs le chromatogramme 2 il a t constat que pour les deux derniers composs (phnol, acide
benzoque), la dmonstration du gradient avanc ci-dessus a t vrifie. Par contre pour le premier
compos (tyrosine) et contrairement ce qui a t expliqu, le compos interfre toujours avec le
solvant et donne un temps de rtention (1,94 min) encore moins que celui en mode isocratique
(2,18min).

Gradient N2 :
Dans le gradient 2 le pourcentage dactonitrile a t augmenter pour diminuer la polarit de la
phase mobile et ceci pour retarder llution du compos N1. Pour les N2 et 3 la polarit de la phase
mobile a t diminu (Pourcentage actonitrile 50 %) afin davoir un temps dlution moins que celui
du gradient N1.
Daprs le chromatogramme N3, il a t remarqu que pour les composs N2 et 3, les temps de
rtentions ont diminu par rapport ceux du gradient N1. Par contre le compos N1 est toujours
en interfrence avec le pic du solvant.

Gradient N3 :
Il a t ralis un 3
ime
gradient en augmentant encore plus le pourcentage de lactonitrile (35%),
dans le but dessayer toujours de retarder le temps dlution du compos N1, mais daprs le
chromatogramme 4, le compos N1 est toujours en interfrence avec le pic du solvant. Pour les
composs N2 et 3, il a t remarqu un chevauchement des deux pics (lution rapide).
Daprs les gradients quon a faisait, il a t constat que le premier gradient prsente
la meilleure rsolution dans un temps danalyse raisonnable.

Lordre relatif croissant des polarits des principales fonctions est le suivant :
R < F < Cl < NO2 < CHO < O-CO-CH3 < OH < CO-R < NH2 < COOH < CO-NH2
Pour les groupes alkyles, cest la longueur de chane ou la surface pour les cycles qui fixe la polarit,
plus les chanes ou les surfaces seront importantes et plus la polarit sera faible.
Quand un compos comporte plusieurs fonctions [4], on considre en premier lieu sa fonction la plus
plaire, donc lordre dlution quon devrait avoir est :
1- acide benzoque 2- tyrosine 3-phnol
Par contre lordre dlution obtenue est :
1- tyrosine 2- phnol 3- acide benzoque
Cet ordre dlution est expliqu par le faite quon travaille en chromatographie de paires ioniques,
qui est un type de chromatographie de partage en mode invers qui permet de sparer des espces
ioniques ou trs polaires, On diminuant leur caractre ionique par modification du pH de la phase
mobile. [2]
Lacide trifluoroactique (TFA) est un compos trs utilis en chromatographie de paires ioniques
dans le cas de composs ayant une fonction acide, car il est volatil et ne cause pas la formation de
dpts de cristaux dans le systme, aiguise les pics et amliore la rsolution.
Il a t utilis pour acidifi la phase mobile afin de sparer les composs sous la forme neutre et non
pas ionis (pH
phase mobile
<pKa
compos
; forme neutre, pH
phase mobile
>pKa
compos
;
forme ionis), donc lordre dlution se fait selon le pKa. [2]
Lespce ionique prsente une plus grande affinit avec la phase polaire et lespce neutre une plus
grande affinit pour la phase apolaire.
Plus le pH est faible et plus lespce neutre est prsente en grande quantit cela traduit par une
augmentation sensible des temps de rtention.
Plus le pH est lev et plus lespce ionique est prsente, ce qui diminue les temps de rtention. Si la
forme ionique est trop largement majoritaire le compos ne sera pas du tout retenu par la colonne
et sortira au temps mort, ce qui est le cas pour la tyrosine (temps de rtention interfre avec le
temps mort dans tous les gradients). [2]


Dans notre exprience on a utilis qui se diffre par leur longueur, leur diamtre moyen des
particules et la composition de la phase greffe; et chacun de ses paramtres a une influence directe
sur la qualit de la colonne utilises.
La valeur leve de la rsolution et du nombre du plateau thorique quon a obtenue pour la
colonne 1 nous a permit de conclure quil est la meilleure colonne a utilis parmi tout les colonnes
quon a test.
Dpres la relation

, plus le nombre de plateaux thorique (N) augmente plus le hteur des


plateaux thoriques diminues, donc plus defficacit de sparation.
La pression au dpart pour chaque colonne est diffrentes est ceci est due au plusieurs facteurs, et
lexpression suivante permet de calculer la perte de charge (P) entre lentr et la sortie :





0 : Facteur de rsistance lcoulement dpendant du remplissage de la colonne.
H : La viscosit de la phase mobile.
L : la longueur de la colonne.
u : la vitesse moyenne de la phase mobile (directement lie son dbit)

: Diamtre des particules remplissant la colonne. [3]



La viscosit et la vitesse de la phase mobile sont constante pour toutes les colonnes, et les facteurs
qui changes sont 0, L, et dp.
Plus la longueur de la colonne augmente plus la pression augmente puisquelle est directement
proportionnelle a la pression; et cest le cas des deux colonnes 1 et 2qui se diffre par la longueur de
la colonne. La colonne 1 de longueur 15 cm a une pression de 192 bars tandis que la colonne 2 de
longueur 5 cm a une pression de 73 bars.
Plus le diamtre moyenne de la particule augmente plus la pression au dpart de la colonne diminue
un dbit identique, car le diamtre moyenne de la particule est inversement proportionnel a la
pression, et cest le cas des colonnes 1 et 3 qui se diffrent par leur diamtre moyenne de leur
particules (dp). La colonne 1 de dp = 3m a une pression de 192 bars, tandis que la colonne 3 a une
pression de 34 bars.
La longueur de la chaine du groupement alkyl de la phase greffe a un grand effet sur la performance
de la colonne en mode invers de faon que la polarit de la phase stationnaire diminue lorsque
longueur de la chaine alkyle augmente, ce qui permet de sparer, en fonction de la longueur de la
chaine, des molcules apolaire, de polarit moyenne, ou trs polaires. Dans la colonne 4 et 5 on voit
que le temps de rtention a diminue peu lorsquon dans les colonnes 1, 4 et 5 qui se diffre juste par
la composition de la phase stationnaire.

Lasymtrie au niveau des pics est gnralement caus par la saturation de la phase stationnaire, les
pics obtenus pour les diffrentes colonnes sont symtriques mme dans le cas des pics largis
(chromatogramme N8). [2]

- Colonne inconnue :
Daprs la comparaison des pressions, il a t constat que la colonne inconnue a la mme pression
(191 bar) que la colonne N1 (192 bar). Les temps de rtentions sont aussi proche, colonne inconnue
avec (1,85 ; 8,41 ; 9,12 min), colonne N1 (1,91 ; 8,60 ; 9,31 min).
Donc notre colonne inconnue est une colonne C
18
(15 cm 4,6 mm), avec un diamtre moyen des
particules 3 m.




VI- Conclusion
La chromatographie liquide haute performance est trs utilise dans tous les domaines de la chimie
analytique. Son succs est du au fait quil est possible de modifier la rsolution en jouant sur la
composition de la phase mobile.

La mise au point dune sparation consiste dterminer les meilleures conditions exprimentales qui
permettent lanalyse quantitative dun mlange dans un temps le plus court possible do le recourt
dans notre exprience au mode gradient.

La mthode utilise, chromatographie de paires dions permet de sparer les substances ionisables
sous la forme neutre, chose qui na pas t ralis pour la tyrosine (temps de rtention = temps
mort). Pour amliorer la mthode, il est recommand de vrifier le pH de la phase mobile de tel sorte
que la forme ionis ne soit pas majoritaire voire inexistante.

Lefficacit dune colonne dpend de :
- Sa gomtrie : plus la colonne est longue, plus elle sera efficace.
- Son garnissage : plus les particules de silice seront fines, plus la colonne sera efficace.
- Sa chane de groupement alkyle : plus la chane alkyle est longue, plus la capacit de
rtention est leve.
Il est recommand de travailler avec des colonnes de longues chanes dans les cas des mlanges
complexes.


VII- Bibliographies

[1] CRC Handbook of chemistry and physics. Boca Raton, Flor. CRC press 1999.
[2] A. Rami,Notes de cours CHI 2170, 2011.
[3] F.Rouessac, A. Rouessac, Analyse chimique, Mthode et techniques instrumentales
modernes, 4
me
dition
[4] D.A. Skoog Douglas, F. James Holler et T.A. Nieman. Principe danalyse instrumentale,
de boeck, 5
e
edition, Paris(2003), p727-740-741.