Universidad Andrs Bello Facultad de Ciencias Biolgicas Departamento de Ciencias Biolgicas

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS MICROBIOLOGIA GENERAL BIO 253

CARRERA: QUMICA Y FARMACIA

PROFESOR: DR. CRISTBAL MUJICA TRONCOSO

(cr.mujica@uandresbello.edu)

ALEJANDRO GONZLEZ CANDA

(a.gonzalez.c@uandresbello.edu)

NDICE
CONTENIDO PGINAS

INTRODUCCIN AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

03 09

N1 TCNICAS BSICAS DE MICROBIOLOGA Y MORFOLOGA BACTERIANA N2 FLORA NORMAL Y FISIOTAXONOMA GRAM POSITIVO. ANTIMICROBIANOS N3 FISIOTAXONOMA ANTIMICROBIANOS N4 BACTERIAS ANAEROBIAS Y FASTIDIOSAS. FLORA NORMAL
DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO. DE BACTERIAS

10 32

33 51

52 67

68 74

N5 HONGOS UNICELULARES Y FILAMENTOSOS

75 84

INTRODUCCIN AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

1.1 BIOSEGURIDAD
Un laboratorio de microbiologa debe contar con la infraestructura necesaria para manipular un microorganismo de acuerdo a su riesgo biolgico cumpliendo con los procedimientos del nivel de bioseguridad correspondiente (niveles del 1 al 4). Nivel de Bioseguridad 1 En este nivel se trabaja con agentes que presentan un peligro mnimo para el personal del laboratorio y para el ambiente. El acceso al laboratorio no es restringido y el trabajo se realiza por lo regular en mesas estndar de laboratorio. En este nivel no se requiere equipo especial ni tampoco un diseo especfico de las instalaciones. El personal de estos laboratorios es generalmente supervisado por un cientfico con entrenamiento en microbiologa. Nivel de Bioseguridad 2 Es similar al nivel 1 y en l se manejan agentes de peligro moderado hacia el personal y el ambiente, pero difiere del nivel 1 en las siguientes caractersticas: 1. El personal de laboratorio tiene entrenamiento especfico en el manejo de agentes patgenos 2. El acceso al laboratorio es restringido cuando se est realizando algn trabajo 3. Se toman precauciones extremas con instrumentos punzocortantes contaminados 4. Ciertos procedimientos en los cuales pueden salpicar los agentes o aerosoles se llevan a cabo en gabinetes de trabajo biolgico Nivel de Bioseguridad 3 Este nivel es el que se encuentra en los laboratorios clnicos, de diagnstico, algunos laboratorios universitarios y tambin de investigacin, en el cual se realiza trabajo con agentes exticos o que pueden causar un dao serio y potencialmente mortal como resultado de la inhalacin o exposicin a los mismos (por ejemplo, el Carbunco). El laboratorio cuenta con un diseo y con caractersticas especiales y todos los materiales son manipulados utilizando vestimenta y equipo de proteccin. 3

Sin embargo, se reconoce que no todos los laboratorios llegan a cumplir con las normas recomendadas para este nivel de bioseguiridad. En estas circunstancias, es aceptable el realizar las siguientes prcticas para poder seguir operando de una manera segura: 1. Ventilar el aire del laboratorio al exterior 2. La ventilacin del laboratorio se tiene que hacer con un flujo de aire direccional controlado 3. El acceso al laboratorio est restringido 4. Seguir el estndar de prcticas microbiolgicas y equipamiento de seguridad impuesto para el nivel de bioseguridad 2. Nivel de Bioseguridad 4 Este nivel es el que se utiliza para trabajar con agentes biolgicos que representan un alto riesgo individual de contagio y que adems son un riesgo para la vida. Los agentes nuevos que tienen un cierto parecido con los antgenos de los agentes conocidos que operan en el nivel 4, son confinados a este nivel hasta que se tiene suficiente informacin para confirmar que pertenecen a este nivel o bien pasarlos al nivel adecuado. El personal de estos laboratorios cuenta con entrenamiento especfico y extensivo en el manejo de agentes infecciosos y cuentan con entrenamiento para trabajar en el ambiente estril y controlado de los mismos. Por lo regular los cientficos que trabajan aqu, utilizan trajes especiales que cubren la totalidad de sus cuerpos y que adems tienen una leve sobrepresin para evitar que entren partculas infecciosas al mismo si es que ste llega a desgarrarse. Los laboratorios se mantienen con una presin de aire negativa, lo cual ayuda a impedir que los agentes nocivos escapen al ambiente. Nuestro trabajo en el laboratorio involucra microorganismos no patgenos, siendo nuestro nivel de Bioseguridad de tipo 2. Es decir, se requiere de un espacio diseado especialmente para la manipulacin del microorganismo y otros espacios para la preparacin del material estril y la eliminacin o esterilizacin del material contaminado. Adems se deben seguir normas que permitan una manipulacin libre de contaminacin para el microorganismo, el experimentador y para el medio ambiente. 4

1.2 MATERIALES PRESENTES EN UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

Es esencial que posea: microscopios, refrigeradores, cmaras de cultivo, balanzas, centrfugas y destiladores de agua. En muchas ocasiones las cmaras de cultivo y refrigeradores se ubican en una sala especial, o bien algunos de estos equipos son de uso comn para varios laboratorios. MICROSCOPIO OPTICO COMPUESTO:

Sistema ptico
o

OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo. OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta. CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin. CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular. REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que consigue el enfoque correcto.

o o

Sistema mecnico
o

o o

Figura N1: Microscopio de luz.

1.2 OTROS MATERIALES UTILIZADOS SON:

a) De vidrio: placas de Petri, matraces Erlenmeyer, tubos de ensayo, pipetas Pasteur, embudos, matraces aforados, pipetas graduadas, buretas, probetas, cristalizadores, portaobjetos, cubreobjetos, desecadores, frascos (diferentes capacidades, transparentes o color mbar), vasos de precipitado, frascos cuenta gotas, etc. b) Otros: algodn, papel filtro, papel indicador de pH, papel de envolver, pinzas, bistures, asas con hilos de platino, colorantes, reactivos diversos, etc. Para realizar siembras y/o repiques, se utilizan asas con hilos de platino o de tungsteno. La utilizacin de estos metales se debe a que son resistentes a la oxidacin y porque una vez esterilizados a la llama, se enfran rpidamente sin riesgo de provocar la muerte de los microorganismos con que se est trabajando. Adems, estos hilos son muy maleables pudiendo ser transformados en un asa o en esptula, permitiendo repicar o resembrar desde un medio lquido o slido.

Asa nquel-cromo

Placa de Petri

Placa de Petri con medio slido

Matraz Erlenmeyer

Pipeta Pasteur

INCUBADORA (Rango temperatura 5-100C, microprocesador regula la T +/- 0.5C.)

AUTOCLAVE
En trminos de Fsica experimental se define el punto de ebullicin de un lquido como la temperatura a la cual se iguala el valor de la presin de vapor del fluido con el que corresponde a la presin atmosfrica. El autoclave est formado por una vasija cilndrica de hierro forjado, de paredes gruesas y con una tapa resistente que se cierra hermticamente mediante la accin o giro de un tornillo conectado a una abrazadera. En un comienzo, antes de que se alcance la temperatura de 100C, se elimina la presin del vapor de agua (Flowing steam), de modo que suba la temperatura junto con la presin, sin alcanzar el punto de ebullicin del agua. Este procedimiento aplicado sobre material resistente a la temperatura elimina las bacterias, virus y esporas, es decir, queda estril.

1.4 Precauciones en el laboratorio y durante el trabajo prctico

- Para evitar posibles contaminaciones, es esencial la limpieza y el orden en el laboratorio. - Antes de comenzar a trabajar se debe limpiar el mesn con un algodn embebido en alcohol etlico 70%. - Se recomienda trabajar en forma cmoda en un mesn material sinttico duro y no inflamable. Este mesn debe estar ubicado en un sitio con menor corriente de aire (las ventanas deben estar cerradas), alejado de las zonas de circulacin de otras personas y debe contar con un mechero. - Los tubos de ensayo o matraces que contengan medios de cultivos o cultivos de microorganismos, nunca deben abrirse en posicin vertical, sino lo ms horizontalmente posible (inclinados) y para quitar el tapn de algodn se mantendrn inclinados con una mano y se abrirn con la otra, la que sostendr a su vez el asa (con el dedo meique, se retira el tapn de algodn que obtura el tubo). Una vez abierto de la forma sealada, se flamea por algunos segundos el orificio, repitiendo dicha operacin una vez realizada la siembra (el tapn nunca debe dejarse sobre el mesn). - Antes de utilizar las asas con hilos de platino, que sirven para las siembras y/o repiques, stas deben flamearse al rojo en posicin vertical bajo la accin de la llama. Antes de efectuar la siembra y/o repique debe esperarse algunos segundos a que se enfren, pudiendo enfriarse tambin en el borde de la placa de Petri que contiene el medio de cultivo. Inmediatamente despus de haberlas utilizado, deben flamearse nuevamente, evitando diseminar el microorganismo en el medio ambiente.

Partes de la llama 1.- Cono fro: no llega oxgeno 2.- Cono de reduccin: poco oxgeno 3.- Cono de oxidacin: abundancia de oxgeno 4.- Zona de fusin: alcanza los 1500 C (Zona que esteriliza por calor) El asa se flamea en la zona 4, hasta lograr la Incandescencia.

Las placas de Petri deben abrirse mantenindolas en lo posible en posicin vertical. El material de vidrio destinado a esterilizacin debe prepararse previamente (placas de Petri envueltas en papel, etc.), estar bien lavado y seco. El lavado se realiza con detergentes y/o soluciones especiales, luego debe enjuagarse con H2O corriente y posteriormente con H2O destilada.

Las observaciones microscpicas, tinciones y las diferentes pruebas bioqumicas deben realizarse en el momento oportuno.

1.5 NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

a) Dejar la ropa innecesaria en las perchas del laboratorio y usar delantal (blanco). b) Nunca deben llevarse a la boca lpices, etiquetas o cualquier otro material. c) Los mesones del laboratorio deben limpiarse antes y al final de cada laboratorio con un desinfectante apropiado. d) Las asas con los hilos de platino deben esterilizarse a la llama del mechero en toda su extensin antes y despus de su uso. El salpicado se evita sosteniendo el hilo alrededor de la llama antes de flamearlo. e) No se distraiga conversando mientras trabaja, as evitar quemarse con el mechero o sufrir otros accidentes.

10

f) Si se derrama un cultivo en el mesn o piso, cubrir el rea con un desinfectante y notificar al Instructor. g) Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del laboratorio. h) Los medios inoculados deben colocarse en las cmaras de cultivo con su identificacin respectiva, ej.: nombre, naturaleza del espcimen, sustrato del cual se asla, fecha, identificacin del manipulador. i) Cuando no se utilizan los mecheros, stos deben guardarse y se debe estar seguro que se les ha apagado al final de cada laboratorio. j) Oculares, objetivos, como tambin otras partes del microscopio, debern limpiarse antes despus de su uso. Los lentes deben limpiarse con papel especial para lentes o un pao de batista. k) Todos los reactivos y equipos deben dejarse en su lugar de origen al trmino de cada laboratorio. l) Todos los tubos, placas de Petri, pipetas, portaobjetos, etc., deben dejarse en los recipientes adecuados una vez terminado el laboratorio. m) Todos los materiales de desecho como trozos de papel, algodn, etc., deben colocarse en los basureros adecuados y no en los mesones o suelo. n) Accidentes personales, tales como derrame de reactivos, cortes y quemaduras, deben comunicarse inmediatamente al Instructor. o) Todos los estudiantes deberan lavarse las manos con jabn o con un desinfectante si es necesario, antes de dejar el laboratorio. EVITE ACCIDENTES TRABAJANDO ORDENADAMENTE Y CON

PRECAUCION. Si en forma accidental entra en contacto con este material, avise inmediatamente a su Instructor indicndole el origen de la contaminacin

11

TRABAJO PRCTICO N1 TCNICAS BSICAS DE MICROBIOLOGA

OBJETIVOS GENERALES
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Identificar material bsico empleado durante la prctica bacteriolgica. Adquirir la destreza para manipular materiales y cultivos bacterianos. Adquirir la destreza y el cuidado para trabajar en esterilidad. Conocer los diferentes medios de cultivo. Conocer la utilidad de los medios de cultivo ms usados. Conocer el concepto de siembra y aislamiento de bacterias. Practicar diferentes tipos de siembra. Practicar aislamiento bacteriano. Conocer distintos tipos de tinciones y la utilidad de stas.

El primer trabajo prctico tiene como objetivo principal que el alumno adquiera los conocimientos bsicos en lo que respecta a la manipulacin de cultivos bacterianos poniendo nfasis en los conceptos de esterilidad, siembra en medios lquidos y slidos (diferenciales, selectivos y enriquecidos) y manejo de microorganismos aerbicos. El Laboratorio de Microbiologa cumple la misin de identificar el agente etiolgico de una determinada patologa. Para lograr esto, es fundamental la obtencin de un CULTIVO PURO, ya que por lo general la muestra que contiene al patgeno ha evaluar viene contaminada con bacterias de la flora normal. Por otra parte, luego de la identificacin del microorganismo, el Laboratorio de Microbiologa puede orientar respecto al tratamiento antibitico a seguir, si este corresponde, ya que se puede evaluar la susceptibilidad del patgeno a diferentes agentes antimicrobianos. Como primera actividad prctica el alumno(a) debe concentrarse en realizar los procedimientos microbiolgicos bsicos de manera adecuada, manteniendo siempre las condiciones de esterilidad necesarias para un buen anlisis. Por lo tanto, como primeras actividades el alumno deber familiarizarse con el material ESTRIL con el que trabajar (Tabla N1) y los procedimiento de siembra y aislamiento de microorganismos desde diferentes muestras. 12

La siembra implica proporcionar a los microorganismos un ambiente que contenga todos los nutrientes necesarios para su desarrollo y multiplicacin. En el laboratorio este medio ambiente lo constituyen los medios de cultivo, cuyas caractersticas varan de acuerdo a los requerimientos de los microorganismos o a los procedimientos experimentales que sea necesario realizar a lo largo de su proceso de identificacin. Debido a que el cuerpo humano es un lugar donde cohabitan un sin nmero de microorganismos distintos, generalmente las muestras contienen una flora mixta, la que se manifiesta por el desarrollo de distintas especies bacterianas. Por este motivo es de suma importancia obtener una cepa bacteriana aislada para poder estudiar sus caractersticas morfolgicas y bioqumicas y as lograr una identificacin correcta (Figura N2). Por lo tanto, en una primera instancia, para obtener un cultivo puro se debe lograr primero el AISLAMIENTO de UNA COLONIA en medio slido, puesto que por definicin una colonia proviene de una sola bacteria y por ende correspondera a un cultivo puro. En el caso de los medios lquidos, una vez obtenido el crecimiento bacteriano (enturbiamiento), se debe realizar el aislamiento de UNA gota a un medio slido para obtener colonias aisladas y puras. Colonia A

Colonias A y B se encuentran mezcladas

Colonia B

. Figura N 2: Aislamiento por estras o en cuadrantes en placa de agar MacConkey.

13

Tabla N 1 : Material de uso comn en el Laboratorio de Microbiologa Esterilizacin Material Asa de platino Pipetas aforadas de vidrio* Pipetas aforadas de plstico Pipetas Pasteur de vidrio* Tubos estriles** Placas Petri de vidrio Puntas de Papel Absorbente Placas Petri de plstico Tipo esterilizacin Antes de ser utilizada Directo a la llama del mechero Directo a la llama del mechero Qumica Autoclave Autoclave Boca del tubo en la llama del Mechero Autoclave Autoclave Qumica S S No No Si Si No No Despus de ser utilizada S S No Si Si Si No Si Re-utilizable Re-utilizable Desechable Desechable Re-utilizable Re-utilizable Desechable Desechable Tipo de material

* Este material se pueden encontrar en cilindros metlicos o envueltas en papel, ya estriles. En el primer caso, se debe poner el cilindro en forma horizontal, destaparlo y sacar una pipeta sin tocar con los dedos las otras, en el segundo caso se debe desenvolver la pipeta, de manera de no tocar su extremo inferior. ** Cada vez que se destape un tubo estril, se debe flamear su boca y repetir la operacin inmediatamente antes de volver a cerrarlo. Este procedimiento pretende evitar la entrada de microorganismos del aire al interior del tubo.

14

Una vez que se obtienen colonias aisladas se puede realizar la identificacin de la especie bacteriana a la cual pertenece. Debemos recordar que cada colonia corresponde en su origen a UNA sola bacteria que se ha desarrollado en un medio de cultivo slido, hasta formar una poblacin que se observa como una colonia visible. Por lo tanto, la morfologa de esta colonia estar determinada por millones de bacterias idnticas y ser propia de cada tipo de bacteria. Es importante tener en cuenta que la morfologa de colonia tambin depender del medio de cultivo en el cual se propague la bacteria, ya que su metabolismo depende de la disponibilidad de nutrientes y tanto la calidad como cantidad de stos vara en los diferentes medios de cultivo. La morfologa macroscpica de las colonias (anlisis macroscpico) permite evaluar caractersticas como forma, elevacin, margen, superficie, brillo, color y hemlisis (en agar sangre) (Figura 3). Es importante destacar que el crecimiento de las bacterias en medios lquidos no da origen a la formacin de colonias, sino que se evidencia mediante la turbidez del caldo, sedimento y otras caractersticas. Debido a que muchas especies bacterianas presentan colonias que son muy parecidas se hace imposible diferenciarlas slo con la observacin MACROSCPICA de stas. Por esta razn adems se hace necesario realizar una observacin MICROSCPICA de las clulas que conforman cada colonia. La suma de los datos obtenidos de la descripcin macroscpica y microscpica proporcionan una orientacin sobre las pruebas bioqumicas a realizar para la identificacin definitiva de las bacterias que conforman la colonia.

15

Figura N 3: Criterios macroscpicos para la descripcin de una colonia bacteriana.

16

Por otra parte, la observacin al microscopio de las bacterias permite conocer una serie de caractersticas complementarias a la morfologa de la colonia entre las que encontramos: forma, disposicin o agrupacin, presencia o ausencia de estructuras (cpsulas, esporas, flagelos), movilidad, etc. Existen numerosas tcnicas para la observacin microscpica de los microorganismos (Tabla N 2), dentro de las cuales encontramos: 1. Observacin de bacterias vivas: Para observar las bacterias vivas, sin teir, se utiliza el microscopio de fase contrastada. Este tipo de microscopio se desarroll para hacer posible observar clulas pequeas sin teir. Se basa en utilizar y aumentar la pequea diferencia de ndice de refraccin que existe entre las clulas y el medio que las circunda. Esta diferencia puede ser usada para crear una imagen con mucho mayor contraste que la que se obtiene en el microscopio de campo claro. Este microscopio usa un lente objetivo especial y en el condensador se inserta un diafragma especial; adems para aumentar el contraste se insertan filtros verdes o azules. a. Al fresco: Este mtodo de examen permite observar el microorganismo vivo y evita las deformaciones artificiales de su morfologa que producen las tcnicas de coloracin. Su aplicacin ms importante se refiere al estudio de la movilidad de los microorganismos. b. Con fondo oscuro: Se basa en el fenmeno de Tyndall, de reflexin luminosa. Para la observacin se sustituye el condensador de Abb por el condensador de fondo oscuro, o de ultra. Se ilumina la preparacin en forma oblicua, incidiendo los rayos luminosos directamente sobre los microorganismos sin penetrar en el objetivo del microscopio. Se le emplea para la observacin de bacterias muy pequeas o de aquellas que difcilmente se observan al microscopio de campo claro por su falta de contraste con el medio. c. Gota colgante: Consiste en suspender el microorganismo a observar en un lquido y depositar una gota de la suspensin sobre un cubreobjeto, luego se procede a la observacin microscpica.

17

2. Observacin de bacterias muertas: a. Tinciones simples: Se utiliza un slo colorante para revelar la presencia de microorganismos y su forma en general. Son de poco uso en bacteriologa. b. Tincin negativa: Se tie el fondo mientras que las clulas permanecen sin teir (transparentes), observndose como entidades claras sobre un fondo oscuro. Ejemplo de este tipo de tincin es la tincin de cpsula en la que se usa tinta china. c. Tinciones especiales: Se utilizan para observar alguna estructura en particular como el nucleoide, flagelo, esporas, etc. d. Tinciones diferenciales: Las bacterias son diferentes entre s, tanto en su estructura fsica como en su composicin qumica, de modo que reaccionan en forma diferente frente a los colorantes. Estas tinciones se utilizan para diferenciar los distintos grupos de bacterias. La Tincin de Gram es la tincin diferencial ms importante usada en bacteriologa. Otra muy utilizada es la Tincin cido resistente o tincin de Ziehl Neelsen. Otras estructuras bacterianas que tambin pueden ser diferenciadas por mtodos de tincin son las esporas y la cpsula: a. Observacin de esporas: Esta tincin es un ejemplo de una tincin especial. Algunos gneros bacterianos como Bacillus y Clostridium, producen endosporas como una forma de resistencia a condiciones ambientales adversas, por ejemplo sequedad o falta de nutrientes. Las endosporas o esporas se caracterizan por ser altamente resistentes al calor, a las radiaciones y a la desecacin. La resistencia de la espora se debe a la estructura proteica (rica en aminocidos azufrados) de sus capas externas, lo que tambin las hace resistentes a tincin. Por este motivo las esporas se tien en caliente. b. Observacin cpsula: se trata de una tincin negativa, usando tinta china, que permite determinar la presencia de cpsulas polisacardicas. Por lo tanto el estudio macro y microscpico de una muestra bacteriana permite obtener una orientacin preliminar de su identidad y dirige el desarrollo de pruebas bioqumicas especificas que permitan una buena identificacin.

18

TINCIN DE GRAM
La tcnica de mayor importancia en el rea de la microbiologa, es la tincin de Gram (Figura N 4), pues divide a la mayora de las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivo y Gram negativo. Adems permite diferenciar forma (cocos, bacilos) y disposicin bacteriana (diplos, cadenas, racimos). La tincin Gram consiste en teir un frotis (bacterias muertas que se encuentras adheridas al portaobjeto por desecacin) de bacterias con Cristal Violeta, y luego tratarlas con una solucin mordiente (fijadora) de Iodo/Ioduro (Lugol). Todas las bacterias se tien en estas condiciones, sin embargo, slo algunas son capaces de retener el colorante al tratarlas con un agente decolorante como etanol o una solucin decolorante de Etanol Acetona. Las bacterias que retienen el colorante son denominadas Gram positivo y las que se decoloran son conocidas como Gram negativo que para observarse debern teirse con un colorante de contraste (Safranina). Por lo tanto, las Gram positivo se vern de color azul/violeta y las Gram negativo de color rojo o rosado. La diferencia en la reaccin frente a la tincin de Gram se debe a la composicin qumica de las estructuras externas de las bacterias. Las bacterias Gram positivo tienen una capa gruesa de peptidoglicn o murena, mientras que las Gram negativo tienen menor cantidad de peptidoglicn y tienen una membrana externa (adems de la membrana citoplasmtica). La explicacin ms aceptada es que, luego de la accin de la solucin decolorante, las bacterias Gram positivo son capaces de retener el colorante gracias al peptidoglicn que se deshidrata. En cambio las Gram negativo, pierden parte de los lpidos de su membrana externa por accin del decolorante (un solvente orgnico como por ejemplo alcohol), lo que sumado a la menor cantidad de peptidoglicn, hace que se decoloren. Es importante destacar que la etapa crtica en la tincin es la decoloracin, por lo que se debe tener especial cuidado en realizarla en forma adecuada.

19

Figura N 4: Tcnica Tincin Gram.

20

TABLA N 2: Cuadro Resumen Tipo de Tinciones TINCIN Gram Tincin de esporas Kinyoun REACTIVOS Cristal Violeta, Lugol, Alcohol Acetona, Safranina Verde de malaquita, Safranina PRINCIPIO Gram positivo retienen cristal violeta (azul) Gram negativo se tien con contraste (rojo) Tie la espora (verde) UTILIDAD Clasificacin bacteriana clsica: Gram Positivo y Negativo Esporas de bacilos Gram Positivo Nocardia (BAA lbiles) Bacterias Gram lbiles Bartonella spp, corpsculo elemental de Chlamydia Micobacterias (BAAR*) Micobacterias (mayor sensibilidad que Ziehl Neelsen)

Fucsina, Acido Sulfrico, Azul de Unin cido resistente de fucsina a escasos Metileno Naranja de Acridina (fluorescencia) Fucsina, Verde de Malaquita cidos miclicos de la pared (fucsia) Tie el DNA bacteriano (fluorescencia naranja) Tie la pared de Bartonella (fucsia)

Anaranjado de acridina

Gimnez

Ziehl-Neelsen

Fucsina, Alcohol Acido, Azul de Unin cido-alcohol resistente de fucsina a Metileno Auramina Rodamina Permanganato de Potasio cidos miclicos de pared (fucsia) Unin de auramina-rodamina al cido miclico de la pared (fluorescencia amarilla)

Auramina / rodamina

21

Tambin es importante sealar que las bacterias Gram positivo pueden observarse como Gram negativo en algunas condiciones: en cultivos viejos (de ms de 24 48 horas), a pH cido y en condiciones de decoloracin muy prolongada. Un gnero bacteriano que representa una excepcin a la tincin de Gram (no posee una pared gruesa de peptidoglicn ni una membrana externa) es Mycobacterium (bacilos cido alcohol resistentes), cuyas especies como M. tuberculosis (Bacilo de Koch) y M. leprae (Bacilo de Hansen) deben ser teidos con la tincin de Ziehl Neelsen. Son bacterias que se tien con dificultad, pero que una vez teidas, el colorante no se libera, an por accin de decolorantes enrgicos como una solucin de alcohol y cido clorhdrico. Esta resistencia se debe a la gran cantidad de lpidos que tienen en su cubierta, incluyendo cidos grasos de alto peso molecular que constituyen entre el 20 y el 40% del peso seco de la bacteria. Este contenido inusualmente alto en lpidos le confieren a este grupo propiedades como: hidrofobicidad (las bacterias tienden a formar grumos en medio lquido), resistencia a la accin de anticuerpos y el complemento y, crecimiento lento debido a la dificultad de absorcin de nutrientes a travs de esta pared celular lipdica.

22

ACTIVIDADES PRCTICAS
SIEMBRAS
1. De medios Slidos a medios Slidos. 1.1. Desde medio de cultivo slido en placa Petri a medio de cultivo slido en placa de Petri:
a. Flamear el asa para su esterilizacin. b. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias. c. Tomar una muestra con el asa desde el medio slido con la bacteria en estudio (Con slo tocar la colonia estar tomando la cantidad de bacterias suficiente para poder sembrar). d. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estras, para ello: i. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig zag en un pequeo sector de la placa. Flamear el asa, para eliminar las bacterias. ii. Con el asa estril, deslizarla desde el sector ya sembrado hacia el sector contrario de la placa nuevamente en forma de zig zag. Nuevamente flamear el asa, para eliminar las bacterias. iii. Con el asa estril, a partir de las ltimas lneas realizadas deslizarla hacia el sector contrario de la placa en forma de zig-zag. Nuevamente flamear el asa. e. Con el asa estril, repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener cuidado de que la ltima estra no tome contacto con el lugar donde se realiz el primer sembrado. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilizacin. f. Incubar la placa recin sembrada a la temperatura adecuada.

Figura N 5: Siembra desde agar en placa petri a agar en placa de petri.

23

2. De medios Slidos a medios Lquidos. 2.1. Desde medio de cultivo slido en placa Petri a tubo con medio de cultivo lquido:
a. Rotular el tubo de caldo con los datos correspondientes (Nombre Microorganismo, Grupo, Fecha). b. Flamear el asa para su esterilizacin. c. Enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias. d. Tomar una muestra con el asa desde el medio slido con la bacteria en estudio (Con slo tocar la colonia estar tomando la cantidad de bacteria suficiente para poder sembrar). e. Flamear la boca del tubo con medio lquido estril. f. Introducir el asa dentro del tubo con caldo y agitar vigorosamente. g. Flamear la boca del tubo y el asa para su esterilizacin. h. Tapar el tubo e incubar a la temperatura adecuada.

18 24 Hrs.

Figura N 6: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con caldo de cultivo. 24

3. De medios Lquidos a medios Slidos 3.1. Desde tubo con cultivo bacteriano lquido a medio de cultivo slido en placa de Petri:
a. Rotular la placa en el reverso (donde se encuentra el agar) con los datos correspondientes. b. Homogenizar el tubo con la muestra por agitacin. c. Flamear el asa para su esterilizacin. d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el asa en las paredes de este. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego retirarla. e. Flamear y tapar la boca del tubo. f. Seleccionar el medio adecuado y poner la placa boca abajo cerca del mechero. (Recuerde que no debe alejarse del mechero con la placa abierta para no perder la esterilidad del medio) g. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estras, para ello: iv. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig zag en un pequeo sector de la placa. Flamear el asa, para eliminar las bacterias. v. Con el asa estril, deslizarla desde el sector ya sembrado hacia el sector contrario de la placa nuevamente en forma de zig zag. Nuevamente flamear el asa, para eliminar las bacterias. vi. Con el asa estril, a partir de las ltimas lneas realizadas deslizarla hacia el sector contrario de la placa en forma de zig-zag. Nuevamente flamear el asa. vii. Con el asa estril, repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener cuidado de que la ltima estra no tome contacto con el lugar donde se realiz el primer sembrado. h. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilizacin. i. Incubar la placa a la temperatura adecuada.

18 24 hrs.

Figura N 7: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a agar en placa Petri. 25

3.2. Desde tubo con cultivo bacteriano lquido a tubo con medio slido (Por picadura).
a. b. c. d. Rotular el tubo con los datos correspondientes. Homogenizar el tubo con la muestra por agitacin. Flamear el asa en punta para su esterilizacin. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el asa en las paredes de ste. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego retirarla. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano. Efectuar la siembra del tubo con el cultivo bacteriano al tubo con el medio estril; para ello: i.- Destapar el tubo estril e introducir el asa cargada sin tocar las paredes, picando el medio de cultivo al centro sin llegar al fondo del mismo. ii.- Retirar el asa con precaucin para producir el menor desgarro posible. Flamear la boca del tubo y taparlo. Flamear el asa para su esterilizacin. Incubar el tubo sembrado a la temperatura adecuada.

e. f.

g. h. i.

Figura N 8: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a Tubo con medio slido 26

3.3. Desde tubo con cultivo bacteriano lquido a tubo con medio slido inclinado (Zig Zag superficie).
a. Rotular el tubo con los datos correspondientes. b. Homogenizar el tubo con la muestra por agitacin. c. Flamear el asa para su esterilizacin. d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el asa en las paredes de ste. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego retirarla. e. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano. f. Destapar el tubo con agar tendido y flamear la boca del tubo. g. Introduzca el asa hasta el fondo. Posteriormente, en un slo movimiento, deslizar el asa con movimientos en zig zag ascendentes por la superficie del medio de cultivo. h. Flamear y tapar la boca del tubo. i. Flamear el asa para su esterilizacin. j. Incubar el tubo recin sembrado a la temperatura adecuada.

Figura N 9: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a tubo con medio de cultivo slido inclinado o tendido. 27

4. Desde medios Lquidos a medios Lquidos. 4.1. Desde tubo con cultivo bacteriano lquido a tubo con medio de cultivo lquido.
a. b. c. d. Rotular el tubo con los datos correspondientes. Homogenizar el tubo problema por agitacin. Flamear el asa para su esterilizacin. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el asa en las paredes de ste. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego retirarla. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano. Destapar el tubo con medio de cultivo estril e introducir el asa cargada sin tocar las paredes, agitar en el medio de cultivo y retirar con cuidado. Flamear la boca del tubo y taparlo. Flamear el asa para su esterilizacin. Incubar el tubo sembrado a la temperatura adecuada.

e. f. g. h. i.

C 18 - 24 hrs.

Figura N 10: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a tubo con medio de cultivo.

28

Tabla N3: Cuadro Resumen Actividad Tcnicas de Siembra. Desde Medio Tipo A Medio Tipo Slido Slido Lquido Toma de muestra desde Siembra en Medio slido en placa Petri Tubo con Medio de cultivo Medio slido en placa Petri Slido Lquido Tubo con cultivo lquido Tubo con medio slido. Tipo Siembra Aislamiento en cuadrantes Agitacin con asa Aislamiento en cuadrantes Pinchadura

Cultivo en medio slido en placa Petri

Tubo con medio slido inclinado o Zig-Zag superficie tendido Lquido Tubo con cultivo lquido Tubo con Medio de cultivo lquido Agitacin con asa

29

5. Tcnicas de Esterilizacin 5.2. Flameado

a. Dividir una placa de agar nutritivo por la mitad y rotularla con los datos correspondientes. b. Homogenizar el tubo con el cultivo bacteriano por agitacin. c. Flamear el asa para su esterilizacin. d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el asa en las paredes de ste. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego retirarla. e. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano. f. Deslizar el asa suavemente por una mitad del agar. Cerrar la placa. g. Luego, flamear el asa para su esterilizacin, enfrela en la tapa y deslcela suavemente por la otra mitad del agar. h. Cerrar la placa. i. Incubar la placa a 37C.

6. Desinfeccin y Asepsia 6.2. Cloro

a. Dividir una placa de agar nutritivo por la mitad y rotularla con los datos correspondientes. b. Tomar una trula estril y humedecerla en suero fisiolgico c. Luego con esta misma deslizarla por alguna superficie fuera del laboratorio de amplia exposicin (baranda de la escalera, manillas de las puertas, etc.). d. Una vez tomada la muestra, pasar la trula suavemente sobre una mitad de la placa de agar nutritivo. e. A continuacin, para comprobar la capacidad de desinfeccin del cloro, limpiar varias veces la superficie analizada anteriormente con un algodn con cloro y deslizar una trula estril. f. Pasar la trula por la otra mitad del agar. g. Incubar la placa a 37C.

6.2. Yodo
a. Dividir una placa de agar nutritivo por la mitad y rotularla con los datos correspondientes. b. Por una mitad del agar, deslizar suavemente uno de sus dedos. c. Tome un trozo de algodn con yodo y limpie la yema del dedo que utiliz, espere unos segundos. d. Pasar el dedo suavemente por la otra mitad de la placa. e. Incubar la placa a 37C.

30

6.2. Alcohol
a. Dividir una placa de agar nutritivo por la mitad y rotularla con los datos correspondientes. b. Tomar una trula estril y humedecerla en suero fisiolgico c. Luego con esta misma deslizarla por otra superficie fuera del laboratorio de amplia exposicin (baranda de la escalera, manillas de las puertas, etc.). d. Una vez tomada la muestra, pasar la trula suavemente sobre una mitad de la placa de agar nutritivo. e. A continuacin, para comprobar la capacidad de desinfeccin del alcohol, limpiar varias veces la superficie analizada anteriormente con un algodn con alcohol y deslizar una trula estril. f. Pasar la trula por la otra mitad del agar. g. Incubar la placa a 37C.

CARACTERSTICAS MACROSCPICAS Y MICROSCPICAS

1. Anlisis Macroscpico.
Realice la observacin de sus aislamientos en las placas de petri sembradas previamente, segn los parmetros presentes en la tabla, recuerde que debe analizar una sola colonia aislada del cultivo (la ms representativa del cultivo).

2. Anlisis Microscpicos.
Realice tincin Gram a las colonias que tiene disponibles y observe al microscopio, caracterizando afinidad tintorial, forma y agrupacin bacteriana. Tincin Gram: Preparacin frotis bacteriano a partir de colonia. a. Colocar una gota de agua en el centro de la lmina (aprox. 0,5 cm de dimetro). b. Flamear el asa para su esterilizacin. c. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias. d. Obtener una pequea muestra desde la placa. e. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto. f. Fijar el frotis exponindolo a la llama del mechero hasta que se seque (sin hervir). Preparacin frotis bacteriano a partir de caldo de cultivo. a. Flamear el asa para su esterilizacin. b. Enfre el asa en las paredes internas del tubo. c. Tome un inculo del tubo problema procurando que quede una pelcula en el asa. d. Esparcir la gota por la superficie del portaobjeto. 31

e. Fijar el frotis exponindolo a la llama del mechero hasta que se seque (sin hervir). Tincin frotis a. Verificar, con el dorso de la mano, que el vidrio no est demasiado caliente. b. Cubrir el frotis completamente con cristal violeta e incubar por 3 min. c. Dejar escurrir el cristal violeta y agregar sobre la muestra una solucin de Lugol. Dejar con Lugol por 2 min. d. Lavar el lugol alternando alcohol-acetona y agua dejando escurrir, hasta que se decolore completamente. Nota : Debe primero lavar con el decolorante alcohol acetona y luego con agua. De otra manera retirara el colorante de la muestra y no podr observar las bacterias. e. Cubrir con colorante de contraste, Safranina al 1%, por 1 min. f. Lavar con agua, dejar escurrir y secar suavemente con papel absorbente. g. Observar en el microscopio ptico con inmersin (objetivo 100X). Utilizar el microscopio, anotar y fotografiar lo que observe.

3. Tincin de Esporas.
Procedimiento : a. Limpiar una lmina portaobjeto con alcohol. b. Con el asa colocar una gota de agua en el centro de la lmina (aprox. 0,5 cm de dimetro). c. Flamear el asa para su esterilizacin. d. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias. e. Obtener una pequea muestra desde la placa de Bacillus spp. f. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto. g. Fijar en el mechero hasta que se seque completamente (sin hervir). h. No olvidar esterilizar el asa despus de usarla. i. Cortar papel absorbente en forma rectangular, de manera que cubra el frotis con bacteria, pero que no sobresalga a los bordes de la lamina del portaobjeto. j. Poner 4 capas de papel sobre el frotis y a continuacin agregar solucin colorante Verde de Malaquita. Debe fijarse que el colorante tiene que atravesar las 4 capas de papel y ponerse en contacto con el frotis bacteriano. k. Como esta tincin se realiza en caliente: para ello con una pinza de madera debe colocar la muestra encima de la llama del mechero hasta observar emisin de vapor durante 5 min. No sobrecaliente para evitar que se queme su muestra o se rompa el portaobjeto. l. Una vez que se observa emisin de vapor desde la muestra, se debe reponer el colorante nuevamente. Debe repetir 3 veces este proceso. m. Lavar con agua de tal manera que escurra suavemente todo el colorante Verde de Malaquita. 32

n. Posteriormente cubra el frotis con el colorante de contraste Safranina, durante 2 min. o. Lavar con agua y secar cuidadosamente con papel absorbente y observar con lente de inmersin. NOTA: Las bacterias se observan rosadas mientras que las esporas (de menor tamao que las bacterias) son pequeas esferas verdes. Es posible observar esporas libres y esporas intracelulares. En estas ltimas es posible determinar si se encuentran al centro o hacia un extremo de la clula y, si la espora deforma o no al bacilo. Una vez observada la muestra desechar la lmina en los frascos con DESINFECTANTE ubicados en cada mesn.

Papel Absorbente

Verde Malaquita

G
Safranina

Figura N 11: Procedimiento Tincin de Esporas.

Localizacin y morfologa de las esporas en Bacillus

33

4. Tincin de Cpsula.
Procedimiento: a. Limpiar una lmina portaobjeto con alcohol. b. En una esquina de la lmina portaobjeto colocar una gota de Tinta China del tamao de una arveja. c. Flamear el asa para su esterilizacin. d. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias. e. Obtener una pequea muestra desde la placa de Klebsiella spp. f. Mezclar la muestra con la gota de tinta, esterilizar el asa y repetir 3 o 4 veces (slo agregar la bacteria). La Tinta China impide ver si la solucin tiene o no suficiente bacteria, por lo mismo es necesario mezclar con suficiente cultivo. g. Tenga cuidado de no ensuciar su cultivo bacteriano con tinta china, asegurarse de esterilizar el asa previamente y de enfriar sta. h. Realizar un frotis de la suspensin de manera que quede una capa delgada. Esto se realiza tomando un cubreobjeto y esparciendo la mezcla a lo largo del portaobjeto que contiene la mezcla Tinta ChinaBacteria (Figura 12). i. Fijar suavemente en el mechero. j. Durante 2 min cubra completamente con colorante de contraste, Fucsina. k. Lave con agua, seque con papel absorbente y observe con lente inmersin.

E
Fucsina

Bacterias Cpsula Figura N 12: Procedimiento Tincin de Cpsula.

34

TRABAJO PRCTICO N 2: FLORA NORMAL Y FISIOTAXONOMA DE BACTERIAS GRAM POSITIVO OBJETIVOS GENERALES
1. 2. 3. Realizar pruebas bioqumicas para la identificacin de cocceas Gram positivo. Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de productos intermediarios, debido a la accin bacteriana. Identificar cepas bacterianas Gram positivo, provenientes de muestras de mucosa bucal y nasofarngea. Como en la mayora de los animales, en el organismo humano existen lugares que deben mantenerse estriles y otros donde de forma natural cohabitan una gran diversidad de microorganismos, an en las personas ms sanas. La sangre, el lquido cefalorraqudeo, la mdula sea y las vas areas inferiores (bronquios y alvolos), entre muchos otros, carecen de microorganismos debido a los mecanismos de defensa que presentan. Pero en la boca, faringe, intestinos, vagina, odos, piel, nariz o conjuntivas residen diversos microorganismos que conforman la FLORA NORMAL del ser humano. Algunos de los microorganismos aislados con mayor frecuencia desde las diferentes regiones del cuerpo y que se consideran integrantes de la flora normal son: Staphylococcus epidermidis, S. aureus (portadores), Streptococcus mitis, S. salivarius, Streptococcus del grupo mutans, bacterias coliformes como Escherichia coli, lactobacilos, entre otros. Innumerables bacterias son filtradas a medida que el aire que los transporta pasa a travs de la nasofaringe, la trquea y los bronquios; la mayora de estos microorganismos son atrapados en la secreciones mucosas y deglutidos. As, los senos nasales, la trquea, los bronquios y los pulmones son habitualmente estriles. La nasofaringe es el hbitat natural de bacterias y virus patgenos comunes que causan infecciones en la nariz, garganta, bronquios y pulmones. Algunas personas se convierten en portadores nasales de estreptococos y estafilococos y descargan estos microorganismos en grandes cantidades desde la nariz hacia el aire.

35

Las bacterias con las que convivimos diariamente pueden representar un riesgo para nuestra salud cuando el ecosistema cuerpo humano-bacteria se ve afectado, ya sea por alteracin del ecosistema bacteriano o por factores del hospedero, como una disminucin en las defensas, que permitan que las bacterias normales invadan o ataquen al ser humano. Es en estos casos que el diagnstico de los organismos responsables es de suma importancia para poder elaborar tratamientos adecuados. Por este motivo, el Laboratorio de Microbiologa cumple un rol fundamental en la identificacin de bacterias en una muestra determinada. En el laboratorio de Microbiologa el anlisis de una muestra sigue por lo general, la siguiente secuencia:

a. Siembra y obtencin del microorganismo aislado (cultivo puro) b. Observacin de morfologa macroscpica c. Tincin y observacin de morfologa y agrupacin microscpica. d. Identificacin fisiotaxonmica (reacciones metablicas especficas) e. Estudios de sensibilidad a agentes antimicrobianos.
La fisiologa bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas a travs de las alteraciones que producen en el medio de cultivo. Estas alteraciones estn determinadas por el metabolismo de cada bacteria, por lo tanto ha sido posible establecer diferencias entre ellas, las que han sido utilizadas en su clasificacin en diferentes gneros y especies. Las tcnicas de identificacin bioqumica de las bacterias diferencian gneros y especies bacterianas en base a la deteccin de: a. Utilizacin de fuentes de carbono: Glucosa, Sorbitol, Citrato. b. Formacin de productos finales o intermediarios del metabolismo microbiano: Indol, CO2 Acido sulfhdrico (H2S), Acetilmetilcarbinol, etc. c. Presencia de enzimas: Catalasa, Ureasa, Oxidasa, Coagulasa, etc. d. Sensibilidad a algunas compuestos qumicos o antibiticos: Bacitracina, Optoquina, Novobiocina, etc. En general, para cocceas Gram positivo se utilizan fundamentalmente los dos ltimos mtodos, en cambio para bacilos Gram negativo se emplean los tres primeros. Lactosa, Sacarosa, Manitol,

36

Estos test se pueden realizar mediante bateras en tubos convencionales o mediante sistemas comerciales ms fciles de manipular (API). En este trabajo se analizaran dos de las Familias de Bacterias Gram positivo ms importantes, como son la Micrococcaceae y Streptococcaceae.

Familia Micrococcaceae
La Familia Micrococcaceae comprende los gneros Micrococcus, Staphylococcus y Planococcus. Son bacterias Gram positivo, esfricas (cocos) agrupadas en racimo. Son catalasa positivo, reaccin caracterstica de la Familia Micrococcaceae y que permite diferenciara la de otros cocos Gram positivos como por ejemplo Streptococcus.

Figura N 13: Agrupacin de algunas cocceas Gram Positivo Las especies del gnero Micrococcus son saprfitas, se encuentran habitualmente en la piel de mamferos, en el suelo y el agua. Tienen metabolismo estrictamente aerobio, a diferencia de las especies del gnero Staphylococcus que son anaerobios facultativos. Otra caracterstica que diferencia ambos gneros, es la propiedad de Staphylococcus de fermentar glucosa en anaerobiosis, no as Micrococcus. Las principales especies del gnero Staphylococcus son: Staphylococcus aureus. Staphylococcus epidermidis. Staphylococcus aureus es patgeno para el hombre. Produce una variedad de factores responsables de su patogenicidad, algunos de estos se describen en las Tablas N 1 y 2. 37

Tabla N 1: Algunas enzimas producidos por Staphylococcus aureus. Enzimas Accin en la clula blanco Rompe el cemento celular facilitando la invasin de los Hialuronidasa tejidos por las bacterias. Disgrega cogulos de fibrina. Fibrinolisina Coagulan el plasma y, se pueden encontrar secretadas al Coagulasa medio extracelular y otras que estn unidas a membranas. Nucleasas Hidrolizan DNA. Tabla N 2: Algunas toxinas producidos por Staphylococcus aureus. Toxinas Alfa toxina Leucocidina* Exfoliatina Accin en la clula blanco Es una hemolisina que produce lisis total de los glbulos rojos. Es una protena antignica de peso molecular 30.000 D. Causa degranulacin de los leucocitos y macrfagos.

Algunas cepas producen esta toxina, la que causa el sndrome de piel quemada. Algunas cepas producen estas toxinas que causan intoxicaciones Enterotoxinas alimentaras. * Tambin es conocida como toxina de Panton - Valentine. Las toxinas producidas por Staphylococcus aureus son causantes de los sntomas de las enfermedades estafiloccicas.

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN
El medio de cultivo utilizado para el aislamiento de S. aureus depender del origen de la muestra. Para el aislamiento de S. aureus de muestras CLNICAS como pus, heridas, secreciones, etc. se utiliza: A) AGAR SANGRE: ste es un medio enriquecido que contiene sangre desfibrinada de cordero o de conejo. Permite el desarrollo abundante de las especies de Staphylococcus y adems permite visualizar la produccin de hemlisis por lisis de los glbulos rojos alrededor de las colonias. S. aureus : produce halos de hemlisis completa alrededor de las colonias, producida por la alfa toxina. S. epidermidis : no produce hemlisis o lo hace dbilmente. Micrococcus : no produce hemlisis.

38

Figura N 14: Tipos de hemlisis B) AGAR MANITOL SALADO O MEDIO DE CHAPMAN: Es un medio selectivo que contiene Manitol, NaCl al 7,5% y el indicador de pH Rojo de Fenol. Micrococcus y Staphylococcus son halotolerantes, es decir, son capaces de crecer en esta concentracin de NaCl. En este medio adems se evidencia la fermentacin de Manitol, la que se observa por el viraje del indicador a amarillo. S. aureus: Genera colonias amarillas cremosas rodeadas de una zona amarilla (producto de la fermentacin) S. epidermidis : Generalmente no fermenta el manitol Micrococcus: No fermenta el manitol.

39

TABLA DE IDENTIFICACIN DE BACTERIAS GRAM POSITIVO

Cocaceas Catalasa Positivo Test de Bacitracina R Test de Coagulasa (+) Staphylococcus aureus (-) Staphylococcus Coagulasa negativo Test de Novobiocina S S. Coagulasa negativo No saprophyticus R Staphylococcus saprophyticus Streptococcus grupo viridans Streptococcus pneumoniae Optoquina resistente S Micrococcus Hemlisis Alfa Observar Hemlisis Hemlisis Beta Test de Latex Optoquina sensible Hemlisis Gamma Bilis Esculina NaCl 6,5 % Enterococcus Listeria Bacilo en empalizada Corynebacterium sp Bilis positivo NaCl positivo Bacilos Grandes Esporulados Bordes netos Bacillus sp Bacilos finos Negativo Streptococcus Bacilos Catalasa positivo Aspecto Tincin Gram

Streptococcus Grupo A, B, C, D, F, G

Enterococcus

40

En los dos medios (Agar Sangre y Agar Manitol Salado) se debe confirmar mediante tincin de Gram la presencia de cocos Gram positivo en racimo, ya que otras especies pueden dar colonias semejantes. Una vez confirmada la presencia de cocos Gram positivo en racimo se realizan pruebas bioqumicas para confirmar el diagnstico. Una vez aisladas las colonias y habiendo observado su aspecto y caractersticas en medios selectivos se realizan las pruebas bioqumicas. Prueba de la Catalasa: Busca la presencia de la enzima catalasa, que descompone el H2O2. H2O2
Enzima Catalasa

H2O + O2

La enzima se encuentra en la mayora de las bacterias que contienen citocromo. La excepcin es Streptococcus que no puede descomponer el H2O2. El test permite diferenciar Staphylococcus, Micrococcus y Listeria (catalasa positivo) de Streptococcus (catalasa negativo). Para realizar esta prueba se debe colocar una gota de perxido de hidrgeno en un portaobjetos, sobre la cual se agrega la colonia en estudio. La aparicin rpida y sostenida de burbujas (antes de 5 segundos) indica test positivo. Precauciones: no tocar el agar sangre al tomar la colonia ni usar asas de platino ya que estas sustancias dan falsos positivos.

Si se sospecha que la colonia corresponde a Staphylococcus aureus, se realiza la prueba de la COAGULASA. Coagulasa: Es una prueba de PATOGENICIDAD que busca la presencia de la enzima coagulasa producida por Staphylococcus aureus.

41

La enzima es un activador del fibringeno a fibrina, adems, la pared de Staphylococcus aureus posee receptor de fibringeno lo que permite la formacin de puentes entre bacteria y bacteria, formndose un cogulo. Diferencia Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus coagulasa negativo. Esta prueba se puede realizar de dos formas: a) Tcnica en tubo: consiste en incubar plasma de conejo con gotas de cultivo lquido de Staphylococcus. La reaccin positiva se observa como la aparicin de un cogulo a las 4 horas. Esta tcnica detecta la coagulasa libre. b) Tcnica en portaobjeto: a partir de un cultivo de Staphylococcus en medio slido, se hace una suspensin abundante sobre una gota de agua. Esta suspensin debe ser lo ms homognea posible. Sobre sta se coloca una o dos gotas de plasma de conejo y se homogeniza. La reaccin positiva se observa como aglutinacin de las bacterias a los 20 segundos. Esta tcnica detecta la coagulasa unida a membrana. c) Otra prueba que sirve para diferenciar Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus es un test comercial de aglutinacin a travs de partculas de latex. La metodologa consiste en poner una gota del reactivo latex sobre un crculo de la tarjeta, a continuacin se emulsiona sobre la gota la colonia sospechosa, se agita durante unos segundos y si hay formacin de grumos visibles se considera positiva. Siempre se debe realizar un control negativo que est incluido en el kit. El fundamento de la tcnica de aglutinacin con partculas de latex se muestra en la siguiente figura.

Partculas de latex con anticuerpos Anticuerpo (Antgeno especfico) = reconocen el antgeno bacteriano. Bacterias Aglutinacin de las partculas

42

Familia Streptococcaceae
El Gnero Streptococcus corresponde a cocos Gram positivo, anaerobios facultativos que se disponen en pares o en cadenas y son catalasa negativo. Bajo ciertas condiciones de cultivo las clulas son ovoides o alargadas. Se encuentran en diferentes superficies y mucosas del hombre y de algunos animales como cavidad oral, faringe, piel, tracto intestinal. Algunas especies son utilizadas en la industria lechera para la elaboracin de quesos, leches fermentadas y yoghurt (Streptococcus lactis). Los miembros del gnero Streptococcus se clasifican de acuerdo a: 1.- ACTIVIDAD HEMOLTICA: segn el tipo de hemlisis que presenten al ser cultivadas en placas de agar sangre de conejo o de cordero. a) Beta hemoltico: producen halos limpios de hemlisis alrededor de las colonias. b) Alfa hemoltico: producen halos de hemlisis incompleta de color verdoso (viridans) alrededor de las colonias. c) Gama hemoltico: no producen hemlisis 2.- SEGN CONSTITUCIN ANTIGNICA DE LA PARED CELULAR O CLASIFICACIN DE LANCEFIELD: Se basa en la composicin qumica y antignica de un hidrato de carbono presente en la pared celular y permite clasificar a los estreptococos en grupos serolgicos que van desde la A hasta la U. Ambas clasificaciones se asocian entre s, as tenemos por ejemplo estreptococos beta hemolticos del grupo A como Streptococcus pyogenes, que corresponde al ms patgeno del gnero. Streptococcus pyogenes produce varias toxinas y enzimas responsables de su poder patgeno. Es el agente causal de infecciones locales purulentas como amigdalitis, faringitis, otitis, etc. Adems provoca enfermedades sistmicas como fiebre puerperal y escarlatina. Streptococcus pneumoniae o pneumococo es otra especie importante de este gnero, agente causante de neumona lobar en el hombre. Es un diplococo no perfectamente esfrico, tiene forma de cabeza de lanza (lanceolado). Su forma virulenta se encuentra rodeada por una cpsula. Es habitante normal de la faringe del hombre. Para su aislamiento las placas deben incubarse en un ambiente con 10% de CO2. En agar sangre S. pneumoniae presenta alfa hemlisis y las colonias son planas con formas de fichas de damas. 43

Estreptococos fecales o enterococos (por ejemplo Enterococcus faecalis). Existen otras especies de Streptococcus que habitan el intestino del hombre y animales y se les conoce con el nombre de estreptococos fecales o enterococos. Se caracterizan porque generalmente son no hemolticos y pueden crecer en condiciones de alta salinidad (NaCl 6,5%), pH bsico (pH 9,6) y en presencia sales biliares en que otros estreptococos no pueden hacerlo. Su presencia en alimentos o agua indica contaminacin fecal.

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN
El aislamiento de Streptococcus pyogenes se efecta sembrando la muestra sobre una placa de agar sangre. Streptococcus pyogenes presenta las siguientes caractersticas: 1. Hemlisis en placa de agar sangre. Se observa hemlisis limpia alrededor de las colonias, las cuales son muy pequeas. Se debe confirmar mediante tincin de Gram la presencia de cocos Gram positivo en cadena, ya que otras especies pueden dar colonias semejantes, por ejemplo Staphylococcus. Una vez confirmada su presencia se realizan pruebas adicionales para confirmar el diagnstico. a) Prueba de sensibilidad a Bacitracina. Los estreptococos beta hemolticos del grupo A (Streptococcus pyogenes) son sensibles a Bacitracina (se realiza en forma similar a un antibiograma). Otros estreptococos tambin son sensibles, sin embargo no son beta hemoltico. b) Pruebas serolgicas. El diagnstico de Streptococcus pyogenes se debe confirmar mediante reacciones serolgicas con antisueros especficos para el antgeno superficial. c) Bilis/Esculina, NaCl 6,5%. Los Enterococos crecen en presencia de NaCl 6,5%, toleran las sales biliares y pueden hidrolizar la esculina. Estas propiedades se pueden usar para distinguir los Enterococos de otros cocos Gram Positivo catalasanegativos. En la prueba positiva, el tubo donde est el medio se torna de color chocolate oscuro, caracterstico al desdoblar la bilis esculina.

44

NOTA:

Lea el procedimiento por completo antes de comenzar a trabajar.

RECUERDE EN TODO MOMENTO TRABAJAR CON TCNICA ASPTICA PARA EVITAR LA CONTAMINACIN QUE CONDUCIR A RESULTADOS ERRNEOS. RECUERDE QUE EST TRABAJANDO CON MUESTRAS BIOLGICAS Y MICROORGANISMOS POTENCIALMENTE PATGENOS, POR LO QUE DEBE APLICAR LAS MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD APRENDIDAS CON

45

ACTIVIDADES PRCTICAS
1. Observe las placas sembradas y describa las colonias bacterianas. Describa si se trata de cultivos puros. 2. Realizar una tincin de Gram a su muestra problema. Observe al microscopio. 3. Realizar un aislamiento de colonia en los siguientes tipos de agar. a. Agar Corriente. b. Agar Sangre. 4. Realizar las pruebas bioqumicas correspondientes segn la tabla Para el estudio de bacterias Gram positivo, se utilizan bsicamente la deteccin de enzimas y la sensibilidad a compuestos qumicos o antibiticos. Ante esto, se estudiara la presencia de enzimas como catalasa y coagulasa. La sensibilidad a antibiticos se ver ms adelante. Procedimiento Prueba de Catalasa: a. Tome una colonia desde el agar con un mondadientes o varilla de plstico estril (sin sacar agar). b. Poner la bacteria sobre un portaobjeto. c. Poner sobre el portaobjeto con la bacteria una gota de H2O2 y observe. Anote lo observado y compare con su resultado del Gram. Procedimiento Prueba de Coagulasa: a. Tomar una tira reactiva y agregue una gota de cada reactivo en las zonas marcadas. b. Con una varilla de plstico o un mondadientes tome varias colonias desde el agar. c. Mezclar con la solucin de anticuerpos del Test de aglutinacin (plasma de conejo). d. Esperar unos minutos agitando constantemente. e. Si existe la presencia de cogulos (como leche cortada), la reaccin es positiva. Si se ve siempre homogneo, la reaccin es negativa. Anote lo observado y compare con su resultado del Gram.

46

Procedimiento Prueba Bilis / Esculina: a. b. c. d. Rotular el tubo con agar Bilis / Esculina con los datos correspondientes. Flamear el asa para su esterilizacin. Tomar un inculo del tubo con cultivo bacteriano. Efectuar la siembra de la siguiente manera: i. Destapar el tubo con agar Bilis / Esculina e introducir el asa cargada sin tocar las paredes, picando el medio de cultivo al centro sin llegar al fondo del mismo. ii. Retirar el asa con precaucin para producir el menor desgarro posible. e. Flamear la boca del tubo y taparlo. f. Flamear el asa para su esterilizacin g. Incubar el tubo sembrado a la temperatura adecuada.

Test de CAMP para Streptococcus La sigla CAMP proviene de Christie, Atkins, Munch y Petersen, los descubridores del fenmeno. Este procedimiento se utiliza para confirmar la presencia de Streptococcus tipo B por la produccin de una zona de hemlisis caracterstica cuando crece en la proximidad de Staphylococcus aureus, lo que se denomina punta de lanza (Ver figura adjunta)

Procedimiento: a.- Sobre una placa de agar Sangre realice con el asa una nica estra en el centro a partir de un cultivo de Staphylococcus aureus. b.- Perpendicular a la estra original, realice con el asa una o ms estras con el cultivo de Streptococcus. c.- Incubar a la temperatura adecuada.

47

5.

Procedimiento toma de muestra desde mucosas. a. Tomar una placa de Agar Sangre, una placa de Agar Corriente y dividirla en 5 partes iguales. No olvidar rotular la placa en el reverso (por donde se encuentra el agar) con los datos correspondientes. b. A continuacin tomar una trula estril y humedecerla en suero fisilogico. c. Deslizar la trula por una de las siguientes mucosas: i. Mucosa yugal derecha o mejilla derecha. ii. Mucosa yugal izquierda o mejilla izquierda. iii. Mucosa vestibular iv. Paladar Duro v. Paladar Blando d. Tomar la placa por su base y realizar la siembra en una de las zonas demarcadas. e. Repetir el procedimiento hasta haber sembrado una muestra de cada una de las mucosas.

6.

Siembre una muestra de la zona buconasofaringea y una nasal de su compaero, de la misma forma que en la actividad anterior, en: a. Agar Corriente b. Agar Sangre

48

TEST DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS AGENTES ANTIMICROBIANOS MTODO DE DIFUSIN EN AGAR O KIRBY-BAUER

Una metodologa comn para el estudio de la sensibilidad a antimicrobianos es la difusin en agar. Este mtodo cualitativo se basa en la inoculacin del microorganismo sobre una placa de agar donde se colocan discos de papel filtro estriles impregnados con una concentracin conocida de antibitico. El antibitico en los discos difunde radialmente durante el tiempo de incubacin de tal manera que a medida que se aleja del disco, la concentracin disminuye. En un punto determinado, la concentracin del antibitico no podr inhibir el crecimiento del microorganismo, producindose entonces una zona circular de inhibicin (o halo de inhibicin) alrededor del disco. El dimetro del rea de inhibicin puede ser convertido a las categoras de susceptible, intermedio o resistente de acuerdo a las tablas publicadas por el National Committee for Clinical Laboratories Standars (NCCLS).

Antibiograma mediante la tcnica de difusin con discos

Interpretacin de los halos de Inhibicin para Staphylococcus spp (Agar Mueller Hinton)
DROGA CONTENIDO DEL DISCO SENSIBLE (Halo en mm) INTERMEDIA (Halo en mm) RESISTENTE (Halo en mm)

Penicilina Cefotaxima Ceftazidima Oxacilina Gentamicina Tetraciclina Ciprofloxaxino Eritromicina Clindamicina

10 U 30 g 30 g 1 g 10 g 30 g 5 g 15 g 2 g

29 23 18 13 15 19 21 23 21

15 22 15 17 11 12 13 14 15 18 16 20 14 22 15 20

28 14 14 10 12 14 15 13 14 49

Vancomicina Cloranfenicol Novobiocina Amoxicilina / A. Clavulnico Ampicilina / Sulbactam

30 g 30 g 5 g 20 / 10 g 10 / 10 g

15 18 16 20 15

13 17 12 14

12 16 19 11

Interpretacin de los halos de Inhibicin para Streptococcus -hemolticos (Mueller-Hinton con sangre de cordero)
DROGA CONTENIDO DEL DISCO SENSIBLE (Halo en mm) INTERMEDIA (Halo en mm) RESISTENTE (Halo en mm)

Penicilina Ampicilina Cefotaxima Eritromicina Tetraciclina Cloranfenicol Claritromicina Clindamicina Vancomicina

10 unidades 10 g 30 g 15 g 30 g 15 g 15 g 2 g 30 g

24 24 24 21 23 21 21 19 17

16 20 19 22 18 20 17 20 16 18 -

15 18 17 16 15 -

Interpretacin de los halos de Inhibicin para Streptococcus pneumoniae (MuellerHinton con sangre de cordero)
DROGA CONTENIDO DEL DISCO SENSIBLE (Halo en mm) INTERMEDIA (Halo en mm) RESISTENTE (Halo en mm)

Penicilina 1 g de oxacilina Tetraciclina 30 g Cloranfenicol 30 g Clindamicina 2 g Eritromicina 15 g Trimet/sulfame 1.25 / 25.75 g Vancomicina 30 g

20 23 21 19 21 21 17

19 22 16 18 16 20 16 20 -

18 20 15 15 15 -

Interpretacin de los halos de Inhibicin para Streptococcus spp. del grupo Viridans -hemoltico (Mueller-Hinton con sangre de cordero)
DROGA CONTENIDO DEL DISCO SENSIBLE (Halo en mm) INTERMEDIA (Halo en mm) RESISTENTE (Halo en mm)

Tetraciclina Cefotaxima Cloranfenicol Clindamicina Eritromicina Vancomicina

30 g 30 g 30 g 2 g 15 g 30 g

23 28 21 19 21 17

19 22 26 27 18 20 16 18 16 20 -

18 25 17 15 15 -

50

Bacitracina: Detecta si el desarrollo bacteriano es inhibido por este antibitico. Se debe diseminar en una placa de agar sangre una colonia con la precaucin de una siembra homognea y total de la placa. Luego se coloca un disco de bacitracina, se incuba 16-24 horas y despus se mide el tamao del halo. Se considera sensible cuando existe un halo de inhibicin a 10 mm de dimetro. Se considera resistente cuando el halo de resistencia es de < 10 mm de dimetro. Micrococcus son sensibles a bacitracina. Staphylococcus, son resistentes a bacitracina. Optoquina: es un compuesto qumico que pone a prueba la fragilidad de la membrana celular de la bacteria y que a bajas concentraciones (5g/ml) permite diferenciar Streptococcus pneumoniae que es sensible de otros Streptococcus hemolticos. Se utiliza un disco de optoquina que se deposita en una placa de agar sangre cordero luego de haber diseminado la colonia sospechosa. Se incuba la placa a 37C por 24 horas y despus se mide el halo de inhibicin. Si el halo es de 14 mm, corresponde a Streptococcus pneumoniae. Novobiocina: es un antibitico activo por va oral. Se utiliza para el tratamiento de infecciones por S. aureus y para el tratamiento de infecciones urinarias resistentes a otros frmacos. La novobiocina es bacteriosttica e interfiere con la sntesis de la pared bacteriana. Este frmaco se utiliza muy poco debido a que su uso est asociado a una alta incidencia de reacciones adversas y a que frecuentemente emergen cepas resistentes Amoxicilina / cido Clavulnico: La asociacin amoxicilina/cido clavulnico est indicado para el tratamiento a corto plazo de las infecciones bacterianas y cuando se sospecha que estn causadas por cepas resistentes a amoxicilina productoras de betalactamasas. En otras situaciones, debera considerarse la amoxicilina sola. Este tratamiento se recomienda parea las siguientes infecciones

Infecciones del tracto respiratorio superior, en particular sinusitis, otitis media, amigdalitis recurrente: Estas infecciones son a menudo producidas por Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis y Streptococcus pyogenes.

51

Infecciones del tracto respiratorio inferior, en particular exacerbaciones agudas de bronquitis crnicas (especialmente si se consideran graves), bronconeumona. Estas infecciones son a menudo producidas por Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis.

Infecciones del tracto genitourinaro e infecciones abdominales, en particular cistitis (especialmente cuando sea recurrente o complicada excluyendo prostatitis), aborto sptico, sepsis plvica o puerperal y sepsis intraabdominal, las cuales son a menudo producidas por Enterobacterias (principalmente Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticus spp. y Enterococcus spp.)

Infecciones de la piel y tejidos blandos, en particular celulitis, mordeduras de animales y abscesos dentales con celulitis diseminada que son a menudo producidas por Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Bacteroides spp. Algunas cepas bacterianas producen beta-lactamasas, lo cual hace que no sean sensibles a amoxicilina sola.

52

ACTIVIDADES PRCTICAS
7. Realice el Test de difusin por disco (Sensidisco) a) Ud. cuenta con una placa de agar sangre donde se encuentra la bacteria en estudio. b) Con el asa, tomar una colonia desde la placa y sembrarla en el tubo de agua estril hasta que quede turbio (McFarland 0,5). c) Tomar una trula estril y (SIN FLAMEARLA!!!!) sumrjala en el caldo recin inoculado. Flamear la boca del tubo y cerrar. d) Tomar la trula mojada y deslizarla sobre toda la superficie del agar MllerHinton. Una vez terminado, eliminar la trula. e) Tomar una pinza estril y flamear brevemente. Tomar con cuidado cada uno de los sensidiscos y distribuirlos homogneamente en la placa, cuidando de que no queden demasiado cerca del borde de la placa ni demasiado cerca entre si.

Nota: Asegrese de flamear las pinzas cada vez que tome un sensidisco y enfre en la tapa de la placa antes de sacar uno. Trate de no tocar el agar al poner los discos, slo djelos caer desde cerca y presinelos suavemente contra el agar con la pinza (sin hundirlos!!!)

53

Interpretacin del Test de Sensidiscos (2 sesin). Observe los halos de inhibicin y mida el dimetro de estos para determinar si la bacteria es susceptible, intermedio o resistente con respecto a los antibiticos dispuestos en el agar. Compare con la Tabla adjunta. Tipos de zonas que pueden desarrollarse alrededor de los discos: a. Resistentes: No hay zona de inhibicin o si existe es muy estrecha. b. Intermedio: Hay una estrecha zona libre de crecimiento bacteriano alrededor del disco. c. Sensible: Hay una amplia zona libre de crecimiento bacteriano alrededor del disco.

54

TRABAJO PRCTICO N3: FISIOTAXONOMA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO

OBJETIVOS
1. Realizar pruebas bioqumicas convencionales para la identificacin de bacterias Gram negativo. 2. 3. 4. Realizar Test de Deteccin Comerciales para la identificacin de bacterias Gram negativo (API 10E API 20E API 32A - API 10S). Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de productos intermediarios, debido a la accin bacteriana. Realizar prueba de susceptibilidad antimicrobiana por difusin en agar. En el laboratorio de Microbiologa el anlisis de una muestra sigue por lo general, la siguiente secuencia: a) Siembra y obtencin del microorganismo aislado (cultivo puro) b) Observacin de morfologa macroscpica c) Tinciones y observacin de morfologa y agrupacin microscpica. d) Identificacin fisiotaxonmica (reacciones metablicas especficas) e) Estudios de sensibilidad a agentes antimicrobianos. Los trabajos prcticos anteriores se han centrando en los primeros tres puntos (a, b y c), por lo que el presente se tratar la fisiotaxonoma bacteriana y sensibilidad a antibiticos de bacterias Gram negativo. Como se vio en el trabajo prctico sobre bacterias Gram positivo, la fisiotaxonoma bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas frente a distintos medios de cultivo a travs de las alteraciones que producen en estos medios. Estas alteraciones, son producidas por enzimas especficas de las diferentes bacterias, ya que no todos los microorganismos poseen los mismos requerimientos nutricionales o poseen las mismas rutas metablicas. De este modo esta tcnica taxonmica se basa principalmente en la deteccin de: a) Utilizacin de distintas fuentes de carbono. b) Presencia de enzimas. c) Sensibilidad a productos qumicos o antibiticos. 55

La identificacin de un bacteriana aislada puede realizarse utilizando diferentes ensayos bioqumicos que generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como la presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o va metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. Estas pruebas no significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. A la determinacin de la especie se puede llegar segn diversos sistemas (manuales de identificacin, comerciales, etc.). Los sistemas comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioqumicas convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel filtro impregnadas con reactivos o pequeos compartimentos con medios listos para sembrar. En todos los casos se emplean cdigos numricos para la interpretacin de resultados. La batera con la cual trabajaremos en el laboratorio consta de 6 tubos con medio estril: 1. Agar tendido corriente: Es un medio slido nutritivo, que permite observar posible pigmentacin en las colonias. 2. Agar Urea: Es un medio slido en l que se puede observar la produccin de la enzima Ureasa ya que contiene adems de nutrientes bsicos: Triptona. Urea. Indicador de pH fenolftaleina. Esta prueba se basa en la capacidad de algunas bacterias que poseen la enzima ureasa y pueden degradar urea a amonaco y CO2. Esta reaccin es fcilmente evidenciable por que el pH vara hacia alcalino debido al efecto del amonaco. El cambio de pH se observa por viraje de un indicador de pH como la fenolftalena.

56

3. Agar Citrato: Este medio de cultivo contiene adems de sales minerales: Fosfato de amonio. Citrato de sodio, como nica fuente de carbono. Indicador de pH azul de bromo timol (verde a pH neutro, azul a pH alcalino). Este medio contiene como nica fuente de carbono el citrato y solamente pueden desarrollarse aquellas bacterias que posean la enzima Citrato Permeasa la que les permite transportar el citrato a travs de la membrana citoplasmtica. Una vez en el interior de la clula el in citrato es metabolizado a travs del ciclo de los cidos tricarboxlicos.

57

4. Agar TSI: Las bacterias pueden utilizar azcares (hidratos de carbono) a travs de varias rutas metablicas. Los productos finales de estas reacciones dependern de la bacteria de que se trate, del azcar utilizado y de la ruta metablica. En general estos productos sern cidos (frmico, pirvico, lctico, etc.) y gases (CO2, H2). Existen muchos medios de cultivo que se han diseado con el objeto de detectar la produccin de cidos y de gas a partir de distintos azcares. El Agar TSI (Triple Sugar Iron) es un medio rico que contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento de las bacterias y que permite visualizar la utilizacin de azcares. Contiene adems de nutrientes como extracto de carne, extracto de levadura, peptona, etc: Glucosa al 0,1% Lactosa al 1,0% Sacarosa al 1,0% Citrato de amonio. Hierro. Indicador de pH rojo de fenol (Amarillo pH cido; Rojo pH alcalino). La bacteria primero usar glucosa, como la concentracin es baja, se agota rpidamente. Si la bacteria fermenta solamente la glucosa, en el fondo del tubo se producirn cidos y el indicador de pH virar a amarillo. En cambio, en la superficie inclinada por efecto del metabolismo oxidativo de los aminocidos presentes en el medio de cultivo, se producirn aminas, por lo que el indicador en la superficie virar a rojo. Si la bacteria fermenta adems de la glucosa, la lactosa (que est en mayor concentracin) todo el tubo virar a amarillo por la produccin de cidos, pues no se alcanza a consumir toda la lactosa presente. Si se produce gas se observar como quiebres en el agar o separacin de la columna de agar del fondo del tubo. Si la bacteria produce H2S, este reacciona con la sal de hierro dando sulfato ferroso, un compuesto insoluble de color negro. Este medio permite diferenciar a los microorganismos que fermentan glucosa y/o lactosa de los que no. Siempre hay que asegurarse que exista desarrollo bacteriano.

58

Tubo 1 2 3 4 4A 5 C

Desaminacin de aminocidos positiva positiva positiva positiva positiva

Fermentacin Glucosa Lactosa y Sacarosa negativa positiva positiva positiva positiva negativo negativa negativa positiva positiva

Produccin de H2S negativo negativo positivo negativa positiva

Control negativo

5. Agar LIA : Las distintas bacterias poseen enzimas inducibles que pueden actuar sobre algunos aminocidos, desaminndolos o decarboxilndolos. Ejemplo de estas reacciones enzimticas son: la decarboxilacin de la lisina (Figura 1) y la desaminacin de la lisina.

Figura N 1: Esquema de descarboxilacin de la Lisina

59

Otro efecto de las bacterias sobre aminocidos azufrados es la remocin del grupo -SH2, produciendo H2S (reaccin que se observa tambin en el medio TSI). Este medio contiene adems de nutrientes como peptona y extracto de levadura: Aminocido lisina Aminocidos azufrados Glucosa Citrato de hierro y amonio Indicador de pH prpura de bromocresol (Amarillo a pH cido, Morado a pH alcalino). La bacteria primero utiliza la glucosa produciendo cido por lo que el pH baja y el indicador vira a amarillo. Si la bacteria NO PRODUCE lisina decarboxilasa se mantendr esta coloracin amarilla (Reaccin K/A, negativa). Si la bacteria PRODUCE la enzima lisina decarboxilasa, la cual remueve el grupo COOH de la lisina dando como producto CO2 y una diamina (alcalina), entonces el indicador vira nuevamente hacia el lado alcalino y se revierte el viraje de amarillo a morado (Reaccin K/K, positiva) Si la bacteria produce H2S ste reacciona con la sal de hierro formando sulfuro ferroso (negro). Si la bacteria es capaz de desaminar a la lisina, la superficie se ver roja y el fondo amarillo (Reaccin R/A)

6. Medio MIO: Permite observar motilidad, donde la reaccin ser positiva cuando el crecimiento bacteriano se observe como el enturbamiento completo del medio. Si 60

slo se limita al pinchazo, es negativa. Tambin es posible observar la presencia de la enzima ornitina descarboxilasa, que participa en el metabolismo de varios aminocidos en algunas bacterias. La reaccin positiva se observa por el color morado del tubo en cambio la reaccin negativa el medio se torna amarillo (puede ponerse morado el fondo). Adems, se puede observar la presencia de indol, para lo cual hay que agregar una gota de reactivo de Kovacs. En este caso, la reaccin positiva ser la aparicin de un aro rojo sobre la superficie del medio.

En la figura, los pares estn organizados sin y con reactivos de Kovacs, respectivamente. 1. Motilidad negativa, ornitina descarboxilasa negativa, indol positivo (con reactivo de Kovacs se observa anillo fucsia) 2. Motilidad positiva, ornitina descarboxilasa positiva, indol negativo (con reactivo de Kovacs se observa anillo amarillo) 3. Motilidad positiva, ornitina descarboxilasa positiva, indol positivo. Otra prueba que complementa la determinacin de una especie bacteriana desconocida es la susceptibilidad a antibiticos. Los antibiticos son agentes teraputicos producidos por organismos vivos, que inhiben o destruyen a los agentes infecciosos. Los ensayos de susceptibilidad estn indicados para apoyar la quimioterapia antimicrobiana de tratamiento en procesos infecciosos por bacterias en las que la identidad del microorganismo no es suficiente para predecir en forma confiable su susceptibilidad. Estos ensayos son a menudo indicados cuando se piensa que el

61

organismo causante pertenece a una especie capaz de mostrar resistencia a los agentes antimicrobianos ms comnmente usados. Los mtodos de susceptibilidad antimicrobiana o antibiogramas son mtodos que determinan in vitro la sensibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos bajo condiciones especficas y estandarizadas. 7. Prueba de la Oxidasa El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa. Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e-. Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a prpura. Procedimiento: Con un pequeo papel de filtro aadimos reactivo de Kovacs, lo impregnamos y a partir del tubo con la bacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el papel. Tras unos 30 segundos, observamos si ha ocurrido algn cambio. Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo. Se considera positva esta prueba cuando toma un color prpura la muestra. Resultados: (+) Pseudomonas aeruginosa ( - ) Escherichia coli NOTA PARA LA PRUEBA DE LABORATORIO: NO es necesario que Ud. se aprenda de memoria cada una de las reacciones bioqumicas que se describieron. Slo debe ser capaz de manejar los conceptos generales, como por ejemplo: "el medio MIO sirve para ver si la bacteria es mvil o no".

ACTIVIDADES PRCTICAS
1. Observe las placas sembradas y describa las colonias bacterianas. Describa si se trata de cultivos puros. 2. Realizar una tincin de Gram a su muestra problema. Observe al microscopio.

62

3. Siembra de Batera Bioqumica Convencional. Cada grupo contara con una batera convencional compuesta por 6 pruebas bioqumicas dispuestas en 6 tubos. Para sembrar la batera se deben seguir las siguientes indicaciones: a. Flamear el asa para su esterilizacin. b. Tomar una colonia aislada de la placa de agar Mac Conkey con la muestra a estudiar. c. Flamear la boca del tubo con caldo estril o suero fisiolgico, sumergir el asa con cuidado y agitar. d. Flamear el asa para su esterilizacin. El caldo recin sembrado ser utilizado como inculo para sembrar toda la batera. e. Esterilizar el asa, enfriar en las paredes internas del tubo recin sembrado y sumergirla en el caldo. f. Usar este inculo para sembrar todos los tubos de la batera. g. Antes de empezar, anotar los colores de los distintos medios. Esto le servir para hacer una comparacin con el resultado final. h. Para cada tubo de la batera el asa debe ser esterilizada previamente y enfriada en las paredes del tubo antes de sumergirla en el caldo inoculado. Posteriormente siembre en los medio teniendo en cuenta que: 1. Los medios semitendidos (Agar TSI, Urea y LIA) se deben sembrar en profundidad y en superficie, es decir, atravesndolos hasta el fondo con el asa en punta, y luego en zig-zag por la superficie. 2. Los medios tendidos (Agar Citrato y Corriente) se siembran slo en la superficie, es decir, se realiza un zig-zag con un asa convencional (en argolla). 3. Los caldos se siembran agitando el asa con el inculo dentro del tubo con el medio. 4. Los medios semislidos (agar MIO) se siembran slo en profundidad con un asa en punta, pinchando el agar hasta la mitad del tubo aproximadamente. Lectura e interpretacin de la Batera. Una vez que la batera es sembrada, se incuba a 37C para que los microorganismos crezcan y produzcan los cambios en los distintos medios. Posteriormente los resultados se leen y se comparan con la Tabla de Resultados adjunta. 4. Siembra de Tira Reactiva Comercial para la identificacin de bacterias Gram negativo (API 10S). Procedimiento: a. Preparar una cmara de incubacin y rellenar con agua corriente lo pocillos para Ello mantener un ambiente hmedo. Que NO qued un exceso. b. Anotar en la lengeta de la tapa, en la parte lateral, el nombre de la bacteria y el de un integrante del grupo. 63

c. Coloque la galera de reacciones sobre la cmara de incubacin. d. Tome con el asa una colonia desde el agar y siembre en el tubo de suero estril hasta una medida de densidad igual 0.5 Mc Farland (Estndar) e. Con una pipeta Pasteur estril, inocule cada una de las celdas de la galera hasta el menisco, tal y como se muestra en la figura adjunta (lnea azul).

f. Llenar las pruebas CIT hasta la cpula (ver figura) g. En las pruebas LDC, ODC, URE y H2S coloque, despus de inocular, una gota de aceite mineral, para crea un ambiente microaeroflico. h. Incubar a 37C i. Lea la tira de acuerdo a la Tabla anexa y luego agregue los reactivos abajo mencionados: j. Para la produccin de Indol: Coloque una gota del reactivo de James en la prueba IND (esperar un par de minutos). Coloracin rosa indica positivo. k. Para la produccin de Nitritos: Coloque una gota del reactivo de NIT1 y NIT2 en la prueba GLU. Esperar unos minutos. Coloracin roja indica positivo. l. Para la deteccin de triptofano desaminasa: Coloque una gota de FeCl3 (TDA) en la prueba TDA (Marrn es positivo) m. Lea y compare sus resultados con la Tabla adjunta. n. Rellene la cartilla de resultados segn como detalle la profesora. o. Compare su cdigo numrico con los catlogos que tiene la profesora. Anote el resultado en la cartilla y gurdelo para pegarlo en su informe.

64

Test ONPG GLU ARA LDC ODC CIT H2S URE

Reacciones Beta galactosidasa Fermentacin /oxidacin glucosa Fermentacin /oxidacin glucosa Enzima lisina descarboxilasa Enzima ornitina descarboxilasa Utilizacin del citrato Produccin de H2S Enzima ureasa

Positivo Amarillo Amarillo, Amarillo/Gris Amarillo Naranja Rojo/Naranja Azul/Verde, Azul Depsito/lnea negra Rojo/Naranja

Negativo Incoloro Azul, Azul/Verdoso Azul, Azul/Verdoso Amarillo Amarillo Verde plido/ Amarillo Incoloro/Gris Amarillo

5. Test de difusin por disco (sensidiscos) a. Tomar una trula estril y (sin flamearla!!) sumergirla en el caldo con el inoculo. Flamear la boca del tubo y cierre. b. Deslizar la trula mojada sobre toda la superficie del agar Mller Hinton. Una vez que termine, eliminar la trula. c. Dejar secar la placa con la tapa ligeramente entreabierta. d. Tomar la pinza y flamear brevemente. Tomar con cuidado cada uno de los sensidiscos y distribuirlos homogneamente en la placa, cuidando de que no queden demasiado cerca del borde de la placa ni demasiado cerca entre si. e. Incubar a 37C durante 16 hrs. f. Observar y medir el dimetro del halo formado alrededor de los sensidiscos.

65

Determine sensibilidad o resistencia al antibitico segn NCCLS. NOTA: Los diversos tamaos de los halos de inhibicin producidos por antibiticos diferentes para una misma especie bacteriana NO PUEDEN SER COMPARADOS ENTRE SI. Por ejemplo: un halo de inhibicin de 30 mm. para Penicilina no indica mayor sensibilidad que un halo de 20 mm. para Tetraciclina.

66

LECTURA BATERA BIOQUMICA

Agar Urea Reaccin positiva Reaccin negativa Agar Citrato Reaccin positiva Reaccin negativa : El agar se torna fucsia. : El agar no cambia de color. : Viraje del indicador de pH a color azul (alcalino). : El agar permanece de color verde (neutro).

Agar TSI Utilizacin de glucosa : Superficie roja (pH alcalino). Se anota K Fondo amarillo (pH cido). Se anota A Utilizacin de lactosa : Fondo y superficie amarilla (pH cido). Se anota A/A Produccin de gas : Ruptura de la columna de agar : Ennegrecimiento del agar. Produccin de H2S Reaccin negativa : El tubo no vara de color. Se anota K/K. Agar LIA Decarboxilacin de lisina positivo : todo el tubo morado (alcalino). Se anota K/K Decarboxilacin de lisina negativo : superficie morada (alcalina). Se anota como K fondo amarillo (cido). Se anota como A Desaminacin de lisina positivo : superficie roja. Se anota R fondo amarillo. Se anota A Desaminacin de lisina negativo : no hay cambio. Se anota A/A Produccin de H2S : ennegrecimiento del agar Medio MIO Reaccin positiva Reaccin negativa : El medio se observa de color morado. : El medio se torna amarillo (puede ponerse morado el fondo).

Presencia de indol Reaccin positiva ser la aparicin de un aro rojo sobre la superficie del medio al agregar una gota de reactivo de Kovacs.

67

Interpretacin de los halos de Inhibicin para Enterobacterias (Mueller-Hinton)

DROGA CONTENIDO DEL DISCO SENSIBLE (Halo en mm) INTERMEDIA (Halo en mm) RESISTENTE (Halo en mm)

Ampicilina Gentamicina Cloranfenicol Ciprofloxacino Cefotaxima Tetraciclina Ceftazidima Amoxicilina / c. Clavulanico

Carbenicillin para Especies de Proteus E. coli Carbenicillin para P. aeruginosa Ceftazidima para P. aeruginosa Clindamicina Ciprofloxacino

10 g 10 g 20 g 5 g 30 g 30 g 30 g 20 / 10 g
100 g 100 g 30 g 2 g 5 g

17 15 18 21 26 15 21 18
17 13 14 14 15

14 16 13 14 13 17 16 20 23 25 12 14 18 20 14 17
18 22 14 16 15 17 15 20 16 20

13 12 12 15 22 11 17 13
23 17 18 21 21

68

RESULTADOS MAS FRECUENTES DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE

Glucosa Escherichia coli Shigella flexneri Shigella dispar Salmonella Typha Salmonella paratyphi A Salmonella paratyphi B Salmonella gallinarum Citrobacter freundii Klebsiella pneumoniae Enterobacter aerogenes Enterobacter hafniae Serratia marcescens Serratia rubidae Proteus vulgaris Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa* Alcaligenes faecalis* AG A A AG AG A AG AG AG AG V AV AV AG Lactosa + V + + + V + Sacarosa V V +/+ + V + + + V Manitol + V + + + + + + + + + + Sorbitol + + + + + + + + + Gelatina -/+ + + + + + Citrato V + + + + + V + + V (+) + V H2S + + +/+/+ + Motilidad +/+ + + + + + + +/+ + + + Indol + + + + V-P + + +/+ + -/+ R-M + + + + + + + + -/+ -/+ -/+ + + Pigmento + + + Urea V V + + -

* No pertenecen a la familia Enterobacteriaceae AG V (+) +/-/+ = Acido Gas (utilizacin del substrato y produccin de gas) = Variable = Positivo despus de 3 4 das = Generalmente positivo = Generalmente negativo

69

TABLA I Fermentacin de Glucosa Positivo Fermentacin de Lactosa Positivo Lisina Desaminasa Negativo Produccin de H2S Positivo Indol Negativo Lisina Descarboxilasa Positivo Salmonella Arizonaa Negativo Citrobacter freundii Positivo Escherichia coli Negativo Lisina Descarboxilasa Positivob Indol Negativo Enterobacter spp. Klebsiella spp.

Nota : Todos producen gas de glucosa. Todos son Citrato positivo. Excepto E. coli Todos son Ureasa negativo. Excepto Klebsiella, que puede dar positivo al 2do o 3er da a : ciertas especies de S. Arizona Fermentan la Lactosa lentamente b : ciertas especies de E. coli son Lisina Descarboxilasa negativo.
70

TABLA II Fermentacin de Glucosa Positivo Fermentacin de Lactosa Negativo Lisina Desaminasa Negativo Produccin de H2S

Positiva Lisina Descarboxilasa Negativo Indol

Negativo Lisina Descarboxilasa Negativo Indol Positivo Citrato

Positivo Proteus vulgaris

Negativo Proteus mirabilis

Negativo Proteus morganii

Positivo Proteus rettgeri Providencia spp.

Nota : P. vulgaris y P. mirabilis pueden o no utilizar Citrato Todos producen un poco de gas de Glucosa Todos son Ureasa positivo. Excepto Providencia

71

TABLA III Fermentacin de Glucosa Positivo Fermentacin de Lactosa Negativo Lisina Desaminasa Negativo
Produccin de H2S Positiva Lisina Descarboxilasa Positivo Indol Positivo Citrato Negativo Negativo Edwarsiella Salmonella Typhi Salmonella Arizona Salmonella Paratyphi B Negativo Citrato Positivo Negativo Citrato Positivo Citrobactera Serratia Negativo Salmonella Paratyphi A Shigella spp. Positivo Shigella spp. Yersinia enterocolitica Positivo Indol Negativo Citrato Positivo Negativa Lisina Descarboxilasa Negativo Citrato Negativo Indol

Nota : Todos son Ureasa Negativo. Excepto algunas cepas de Yersinia enterocolitica. No producen gas de Glucosa Shigella, Serratia, Salmonella Typhi y Yersinia enterocolitica. El resto produce gas de Glucosa. a: Ciertas especies de Citrobacter son Lactosa Negativo y pueden ser Indol Positivo o Negativo 72

TRABAJO PRCTICO N4: BACTERIAS ANAEROBIAS Y FASTIDIOSAS. FLORA NORMAL

OBJETIVOS
1. Conocer la importancia de una buena muestra para un cultivo anaerobio 2. Conocer y practicar el procesamiento microbiolgico de bacterias anaerobias y con requerimientos especiales de cultivo aisladas a partir de muestras de flora normal de la boca. 3. Conocer algunos cuadros clnicos relevantes causados por microorganismos de este tipo.

INTRODUCCIN
Las bacterias anaerobias estrictas son microorganismos incapaces de multiplicarse en presencia de oxgeno (el metabolismo del oxigeno genera radicales txicos) ya que no tienen los sistemas de citocromos para el metabolismo del oxgeno, ni las enzimas superoxido dismutasa (SOD) y catalasa para eliminar estos radicales. Para su desarrollo in Vitro stas requieren medios de cultivo enriquecidos y un ambiente anaerbico. En el hombre las bacterias anaerbicas predominan normalmente en la cavidad oral alrededor de los dientes, en el tracto gastrointestinal, en los orificios del tracto genitourinario y en la piel. La mayora de estos hbitats tienen una baja tensin de oxgeno y bajo potencial de oxidorreduccin. Si enfocamos nuestra atencin en la cavidad oral, es posible observar que existen diversos ecosistemas donde se encuentran diferencias significativas dependiendo si el rea de estudio es la flora de dientes, la lengua, la mucosa yugal o el crvice gingival. La flora oral es de tipo mixto, con asociacin de microorganismos facultativos y anaerobios que se adhieren a la superficie dental, en primera instancia gracias a la pelcula adquirida y luego entre si a travs de diferentes polisacridos de origen bacteriano (biopelcula). Los dientes corresponden a la nica superficie de nuestro cuerpo que NO sufre recambio lo que facilita enormemente la formacin de esta biopelcula.

73

En esta cavidad predominan diferentes especies de Streptococcus hemolticos (Grupo viridans). Streptococcus mutans y Streptococcus sanguis que se encuentran a en la placa dental; Streptococcus mitis que se adhiere tanto a los dientes como a las mucosas y S. salivarius que predomina en la mucosa lingual. Entre los microorganismos anaerobios Gram positivo puede encontrase Actinomyces spp. a nivel de la placa y en menor cantidad algunas especies de Lactobacillus. Tambin es posible encontrar espiroquetas del gnero Treponema distintas de T. pallidum. Los cocos Gram positivo anaerobios pertenecen a los gneros Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus entre otros. Pueden adems aislarse especies de Mycoplasma y levaduras del gnero Candida. Por otro lado, la mayora de los Gram negativos presentes en la boca son anaerobios estrictos como Bacteroidales y especies del gnero Fusobacterium. La flora de la cavidad oral est involucrada en enfermedades como la caries y periodontitis. Por una parte, en el desarrollo de la caries dental intervienen no slo las bacterias sino tambin factores externos como el pH cido resultante de la descomposicin de hidratos de carbono de la dieta, etc. Por otra parte, la periodontitis resulta de la agresin de la flora normal a los tejidos de soporte del diente (infeccin endgena) en individuos susceptibles. Los microorganismos de la boca tambin causan otras infecciones bucales como abscesos periapicales y estomatitis y ms importante an, pueden causar una serie de infecciones extraorales. Por ejemplo, pacientes con vlvulas cardacas patolgicas pueden desarrollar endocarditis bacteriana en la que estn implicados Streptococcus hemolticos. Las actinomicosis crvico-facial, pulmonar, gstrica son un grupo de infecciones que tienen como agente etiolgico especies de Actinomyces, las que provienen exclusivamente de la boca Las infecciones de importancia mdica por bacterias anaerobias son comunes. Estas son frecuentemente polimicrobianas, es decir, las bacterias anaerobias en general producen infecciones mezcladas con otros anaerobios, con anaerobios facultativos y con aerobios, las infecciones se producen cuando los anaerobios y otras bacterias de la flora normal contaminan sitios del cuerpo normalmente estriles Las infecciones producidas por anaerobios pueden dividirse segn su origen en:

74

a) Endgenas: abcesos, endocarditis, infecciones pleurales y pulmonares, bacteremia, infecciones peridontales, peritonitis, sinusitis crnica, gingivitis necrotizante, colitis pseudomembranosa. b) Exgenos: intoxicaciones alimentarias, botulismo, ttanos, colitis

pseudomembranosa.

AISLAMIENTO DE BACTERIAS ANAERBICAS

A fin de obtener resultados ptimos se debe actuar segn los siguientes principios generales: Correcta recoleccin y transporte de la muestra clnica Procesamiento de muestras con mnima exposicin al oxgeno atmosfrico Uso de medios frescos y prerreducidos Empleo correcto del sistema anaerbico, con inclusin de un catalizador activo para permitir la eliminacin del oxgeno presente Existen diferentes sistemas que son satisfactorios para el cultivo de bacterias anaerbicas. Uno de los ms utilizados es el Sistema GASPAK, este consta de un soporte para placas incluido en una cubeta transparente con tapa hermtica (Figura 1). Para crear la atmsfera anaerbica se utiliza un sobre comercial con catalizador que contiene una tableta de borohidrato sdico y otra de bicarbonato sdico y cido ctrico. Las placas y los tubos sembrados en el interior de la jarra, obtendrn un ambiente de anaerobiosis, al reaccionar el catalizador con 10 mL de agua destilada estril que se adiciona al sistema, de esta manera se produce la reduccin del oxgeno segn la siguiente reaccin. 2H2+ O2

2H2O

Por otra parte la reaccin del catalizador con el agua libera CO2. Este CO2 es utilizado para confirmar el ambiente anaerobio, para ello se utiliza un papel indicador (azul de metileno) que vira de color (de azul a blanco) en presencia de CO2.

75

Figura 1: Sistema GASPAK para crecimiento de bacterias anaerbicas

BACTERIAS FASTIDIOSAS
Las bacterias fastidiosas, corresponden a aquellas que no crecen en medios de cultivo convencionales (agar nutriente, agar sangre) y requieren medios suplementados con vitaminas, aminocidos, factores de crecimiento, etc. Adems pueden requerir condiciones especiales de cultivo como por ejemplo mayor tiempo de incubacin, condiciones anaerbicas o de CO2 (bacterias capnoflicas). Un medio utilizado para el crecimiento de bacterias anaerbicas fastidiosa es el agar sangre suplementado con hemina-menadiona, la menadiona es una tipo de vitamina K y la hemina es un producto de la descomposicin de la hemoglobina, la gran cantidad de nutrientes de este medio permite el crecimiento de bacterias metablicamente exigentes. Las bacterias capnoflicas son aquellas que requieren de una concentracin de CO2 para su proliferacin. En la cavidad oral se pueden encontrar un sin nmero de estas bacterias, particularmente las involucradas con el desarrollo de las caries. Un medio propicio para el aislamiento de estas bacterias es el agar Mitis salivarius, este es un medio selectivo para el aislamiento de Streptococcus oralis, Streptococcus salivarius y Enterococcus (ver recuadro) y se utiliza para estudios microbiolgicos de la placa dental y caries producidas por bacterias presentes en la saliva.

76

Este medio esta compuesto por cristal violeta, telurito de potasio y azul de tripan, que son agentes que inhiben la mayora de los bacilos Gram Negativos y bacterias Gram positivo a excepcin de Streptococcus.

Streptococcus salivarius en agar Mitis-salivarius

Streptococcus oralis en agar Mitis salivarus

Enterococcus en agar Mitis-salivarius

77

ACTIVIDADES PRCTICAS
I.- Flora anaerobia facultativa 1.- Tincin directa de muestras del diente: Para esto el alumno con un mondadientes estril tomar muestras de al menos una superficie dental que le parezca ms interesante. Las muestras tomadas se fijarn y teirn con tincin de Gram para observar los microorganismos adheridos a la superficie celular. Tincin Gram: 1) Preparar un frotis con la bacteria de la siguiente manera: a.- Colocar una gota de agua en el centro del portaobjeto b.- Obtener una pequea muestra desde la mucosa oral a estudiar. c.- Mezclar la muestra con la gota de agua. d.- Fijar el frotis exponindolo a la llama del mechero hasta que se seque. 2) Teir el frotis de manera habitual, observar al microscopio, anotar y dibujar lo que observe 2.- Siembra de saliva en agar sangre y en agar Mitis-Salivarius (Streptococcus mutans) 1) El alumno deber obtener una muestra de saliva en un tubo de ensayo estril (aprox. 3 mL) 2) Se realizarn dos diluciones seriadas 1/10 de la muestra de saliva obtenida en el punto anterior y se sembrar 0,1 mL de cada dilucin en placas Mitis-salivarius. Con la misma saliva realizar un aislamiento en placas de agar sangre. 3) Incubar las placas en un ambiente con 5% de CO2, que se logra en un tarro con una vela 4) Realizar anlisis macroscpico de colonias en agar sangre y contar colonias azules y negras en agar Mitis-Salivarius. Las colonias azules corresponden a Streptococcus mutans que juegan un rol en cariognesis y son uno de los principales agentes causales de bacteremias continuas y endocarditis. Las colonias negras corresponden a Enterococcus, que pueden ser causantes de infecciones urinarias, bacteremias, abscesos y endocarditis. 5) Realizar anlisis microscpico mediante tincin de Gram. 78

II.- Anlisis de la microflora anaerobia de la lengua. Siembra en placa de muestras tomadas de la lengua e incubadas en presencia y ausencia de oxgeno. 1) Con un limpiador lingual (asa de plstico) el alumno tomar muestras del dorso de la lengua. Desde la secrecin remanente en el limpiador realizar 2 aislamientos en placa con asa en loop e incubar una de las placas (agar sangre suplementado con hemina y menadiona) en anaerobiosis y otra (agar sangre) en aerobiosis. Adems, observar directamente las bacterias, para lo cual se fijarn y teirn con tincin de Gram para analizar la microflora adherida a la superficie de la lengua. Para el cultivo en anaerobiosis la placa debe ser debidamente rotulada e incubada en una jarra de anaerobiosis (GASPAK). 2) Realizar anlisis macroscpico de colonias observando principalmente la variedad de colonias distintas. Aquellas colonias pigmentadas de negro en la placa de agar sangre H-M se relacionan con el nivel de halitosis. Algunas de estos gneros bacterianos tambin son causantes de endocarditis. 3) Realizar anlisis microscpico mediante tincin de Gram.

79

TRABAJO PRCTICO N5: HONGOS UNICELULARES Y FILAMENTOSOS

INTRODUCCIN
Los hongos son organismos eucariontes que tienen la capacidad de infectar al ser humano. La mayora tolera esta exposicin sin secuelas, pero algunos desarrollan una hipersensibilidad alrgica. Esto porque un individuo sano tiene una resistencia innata a la colonizacin de hongos y porque la virulencia inherente en estos microorganismo es muy baja. Sin embargo, en individuos inmunosuprimidos, la infeccin puede desencadenar enfermedades que, si no son debidamente controladas, pueden conllevar a un resultado fatal para el hospedero. A los hongos que se aprovechan de la debilidad del hospedero se les denominan hongos oportunistas. arrhizus) son ejemplos de ellos. TALO (Cuerpo macroscpico) Hongos como Candida (Candida albicans), Aspergillus (Aspergillus fumigatus) y varios Zigomicetos (Rhizopus

Unicelular

Pluricelular Micelio

Levaduras

Colonias semejantes a las bacterianas

Sifonado

Septado

Colonias algodonosas, lanosas, aterciopeladas

80

Hongos unicelulares (Levaduras) Las levaduras son organismos fngicos unicelulares que generalmente se reproducen asexualmente por gemacin. Los criterios usados para el diagnstico son fundamentalmente morfolgicos (macroscpicos y microscpicos). Las levaduras normalmente prosperan en hbitat con abundante azcar, tales como frutas, flores e incluso la corteza de los rboles. Algunas de ellas viven en simbiosis con animales, especialmente insectos. Las levaduras ms importantes desde el punto de vista comercial son las cepas cerveceras y panaderas de la especie Sacharomiyces cerevisiae. Candida spp.: En ciertas condiciones C. albicans, C. tropicalis, C. kefyr, y otras,

son parte de la flora normal de los humanos. Pueden aislarse de las superficies mucosas sanas de la cavidad oral, vagina, tracto gastrointestinal y rea rectal. Sin embargo, cuando se rompe la barrera mucosa, los microorganismos pueden llegar a la sangre e invadir pulmones, bazo, riones, hgado, corazn y cerebro. Este gnero se caracteriza por un aspecto macroscpico de su colonia opaco, de color cremoso y consistencia pastosa (Figura 1)

Figura 1: Observacin microscpica de una muestra de esputo en que se ponen en manifiesto las levaduras en gemacin y las pseudohifas de las especies de Candida.

81

Hongos Filamentosos: Estos pueden ser sifonados (aseptados) o septados. Los hongos sifonados son generalmente multinucleares (ej. Mucoral) y los hongos septados presentan hifas con tabiques que son prolongaciones de la membrana citoplasmtica (ej. Aspergillus, Dermatophytos). 1) Hongos septados Estos hongos pueden presentarse como contaminantes ambientales (ej. Penicillium), como patgenos oportunistas (ej. Aspergillus) y como patgenos (ej.

Dermatophytos). Aspergillus spp.: Los microorganismos que pertenecen a ste gnero son extremadamente frecuentes en el medio ambiente y de crecimiento rpido (48 h). En contraste con la mayora de las infecciones producidas por Candida, la aspergilosis se adquiere de fuentes exgenas. Estos microorganismo se identifican por sus Microscpicamente caractersticas morfolgicas presentando colonias aterciopeladas, algodonosas o pulvurentas, coloreadas (crema, verde, caf y negras). presentan hifas septadas de la que nace una prolongacin no septada (conidforo), el cual se dilata en su extremo distal (vesculas) rodendose all de clulas conidiognicas (filides). Las filides producen conidios los que se disponen en forma de cadenas. El conjunto vescula, filide y conidios se conoce como cabeza aspergilar. Ver Figura 2. De las aproximadamente 900 especies de Aspergillus descritas, A. Fumigatus y A. Flavus son las que con mayor frecuencia se asocian a enfermedad invasiva. Son ubiquitarios en el ambiente y no forman parte de la flora normal del ser humano, aunque pueden producirse colonizaciones transitorias. un segmento pulmonar. La aspergilosis est asociada con problemas respiratorios como la dilatacin crnica de la va area hasta un colapso de

82

Figura 2: Estructura microscpica de especies de Aspergillus. Penicillium: Estos microorganismo son ubicuitarios en el medio ambiente y suelen aislarse en muestras de aire y como contaminantes en los cultivos de laboratorio, desarrollndose en 3-4 das. En 1929, Sir Alexander Fleming observ que una especie de Penicillium haba contaminado su cultivo de Staphylococcus aureus, destruyendo las bacterias que se encontraban inmediatamente en contacto con el hongo. observacin casual llev al descubrimiento de la penicilina. Los hongos que petenecen a este gnero se caracterizan por la produccin de conodiforos en el extremo de hifas septadas ramificantes. Cuando se alojan en superficies, como una placa de agar, germinan y crecen rpidamente produciendo colonias con aspecto polvoriento, de color verde azulado. P. marnefeii es la nica especie patgena de Penicillium y es causa de infecciones espontneas del sistema retculoendotelial, afectando vasos linfticos, pulmn, hgado, bazo y hueso. Ver figura 3. Esta

83

Figura 3: Aspecto microscpico de Penicillium. 2) Hongos sifonados. Zigomicetos: Especies de Rhyzopus, Mucor y Absidia han sido implicados en cuadros de zigomicosis. Macroscpicamente presentan un micelio algodonoso. Microscpicamente, forman hifas aceptadas y se reproducen asexualmente produciendo esporangios en los que se desarrollan esporas (Ver figura 4). Las enfermedades asociadas a estos microorganismos son usualmente la mucormicosis rinocerebral. Esta infeccin se origina en los senos paranasales y puede afectar rbita y el paladar, extendindose hacia el cerebro. En pacientes inmunodeprimidos puede afectar el pulmn, el tracto gastrointestinal y los tejidos subcutneos.

84

Figura 4: Aspecto microscpico de hongos sifonados. Tanto las levaduras como los hongos filamentosos se siembran en agar Sabouraud, cuyo contenido en glucosa es mayor que el de otros medios de cultivo y el pH es cido (pH 5,6) para impedir la contaminacin bacteriana. Generalmente se incuban a 25-30C por un tiempo que depende de la especie fngica (levaduras y hongos ambientales, 48 h aprox, hongos dermatofitos, 15-30 das). Nota: -Recuerde el principal criterio para la identificacin de estos microorganimos es el morfolgico, por lo tanto, es importante que trabaje con cuidado. -Recuerde que est trabajando con patgenos oportunistas: Trabaje siempre cerca del mechero y no se acerque demasiado a los medios que contienen los hongos. As mismo, ante cualquier posibilidad de contaminacin, lvese de inmediato.

85

ACTIVIDADES PRCTICAS
1.- Observacin y descripcin de cultivos de levadura. 1.1.- Procedimientos. a) Examen macroscpico: Describa, tal como lo haca para colonias bacterianas, forma, color, aspecto de la superficie, borde, elevacin y brillo de las colonias. Anote lo que observe. b) Examen microscpico: Realice una tincin Gram tradicional. Es decir, realice un frotis con la colonia de levaduras en una gota de agua y contine con el protocolo por usted conocido. Observe con inmersin y dibuje lo que observa.

Nota: La tincin Gram es slo una tcnica de tincin. Las levaduras no son Gram + ni Gram -. Recuerde que la caracterstica de ser Gram+ o Gram- est relacionada con propiedades que pertenecen a las membranas bacterianas.
c) Tincin de cpsula en levadura Cryptococcus: 1. Coloque en un portaobjeto limpio una gota de agua y una gota de tinta china. 2. Emulsione una colonia de Cryptococcus y extienda la preparacin con otro portaobjeto. 3. Seque suavemente en la llama del mechero 4. Cubra con fucsina y deje reposar 2-3 minutos. 5. Lave con agua, seque y observe al microscopio con aceite de inmersin en 100X.

86

2.- Observacin, y descripcin de hongos filamentosos. 2.1.- Procedimientos. a) Examen macroscpico: Color y aspecto (aterciopelada, algodonosa, polvorienta, lanosa) en anverso y reverso. Anote lo que observe. b) Examen microscpico: Para esto se realizar un examen al fresco. Examen al Fresco: 1.- Coloque una gota de azul de lactofenol sobre un portaobjeto. 2.- Flamee un asa, enfre cerca del mechero y obtenga un pequeo trozo del hongo (sin sacar agar). DEBE USAR MASCARILLA. 3.- Mezcle el fragmento del hongo con el azul de lactofenol y cubra con un cubreobjeto. 4.- Observe con aumento de 40X (sin inmersin, ni aplastando la muestra). 5.- Reconozca las estructuras microscpicas reproductivas de cada especie y dibuje. Recuerde: el principal criterio para la identificacin de estos microorganismos es el morfolgico, por lo tanto, es importante que trabaje con cuidado. Recuerde que est trabajando con patgenos oportunistas: Trabaje siempre cerca del mechero y no se acerque demasiado a los medios que contienen los hongos. Asimismo, ante cualquier posibilidad de contaminacin, lvese de inmediato.

87

88

89

El camino al xito, comienza con el recorrido de nuestros esfuerzos

90