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Licence 3 SV -Biotech GAAW Par des techniques d’extraction , séparation, isolation et recombinaison d’ADN,

Licence 3 SV -Biotech

GAAW

Par des techniques d’extraction, séparation, isolation et recombinaison d’ADN, nous voulons réaliser le clonage d’une petite séquence nucléotidique (que l’on appelle pour plus de facilité Gène d’Intérêt) et qui code pour l’ARN de la petite sous unité ribosomale Cryptospridium parvum, qui est un parasite intestinal.

L’intérêt du clonage est de permettre l’accès facilité au gène en question mais aussi au produit de son expression en vue d’études postérieures…

Pour ce faire on commence par extraire le gène d’intérêt de tissus de mammifères infectés par le parasite. On purifie puis amplifie ce gène. Puis on l’intègre dans un plasmide et le plasmide est transformé dans une bactérie qui va permettre de cloner notre gène d’intérêt.

Extraction & Purification de l’ADN à partir de tissus bovins

& Purification de l’ADN à partir de tissus bovins PCR => Permet de sélectionner le gène
& Purification de l’ADN à partir de tissus bovins PCR => Permet de sélectionner le gène
PCR => Permet de sélectionner le gène voulu et de l’amplifier afin d’en avoir assez
PCR
=> Permet de sélectionner le gène voulu et de
l’amplifier afin d’en avoir assez pour le travailler
confortablement
Électrophorèse sur gel
d’agarose
confortablement Électrophorèse sur gel d’agarose (Procédé de vérification) Ligation du gène d’intérêt
confortablement Électrophorèse sur gel d’agarose (Procédé de vérification) Ligation du gène d’intérêt

(Procédé de vérification)

Ligation du gène d’intérêt sur le plasmide & Transformation bactérienne Ensemencement sur gélose nutritive
Ligation du gène d’intérêt sur le
plasmide & Transformation
bactérienne
Ensemencement sur gélose
nutritive et sélective (Antibiotique)
sur gélose nutritive et sélective (Antibiotique) Repiquage de colonies bleues et blanches en milieu liquide
Repiquage de colonies bleues et blanches en milieu liquide
Repiquage de colonies bleues
et blanches en milieu liquide
Repiquage de colonies bleues et blanches en milieu liquide = > Mise en culture permettant vue

=> Mise en culture permettant vue de sélection Blanc Bleu

=> Clonage à proprement parler

Extraction de l’ADN plasmidique
Extraction de l’ADN
plasmidique
à proprement parler Extraction de l’ADN plasmidique = > Permet de récupérer les copies de gène

=> Permet de récupérer les copies de gène cloné

=> (Procédé de vérification)

RFLP : digestion enzymatique et visualisation Par électrophorèse du résultat de l’électrophorèse
RFLP : digestion enzymatique et
visualisation Par électrophorèse du
résultat de l’électrophorèse
Extraction, et Purification de l’ADN.
Extraction, et Purification de l’ADN.
Extraction :Il faut récupérer l’ADN du parasite qui se trouve parmi les tissus de l’hôte.
Extraction :Il faut récupérer l’ADN du parasite qui se trouve parmi les tissus de l’hôte.
=> « Broyage » mécanique et Protéase K pour avoir un Homogénat contenant l’ADN en solution.
Purification : Il s’agit ici de ne travailler que sur de l’ADN : il faut se débarrasser de tout ce qui n’en est
pas.
=> Précipitation sélective des acides nucléiques => filtration (Le précipité reste sur le filtre) =>
Resolubilisation (Les acides nucléiques traversent le filtre)
PCR et Électrophorèse
PCR et Électrophorèse
PCR => Obtention rapide d’un grand nombre de copies d’une séquence ciblée sur l’ADN de
PCR => Obtention rapide d’un grand nombre de copies d’une séquence ciblée sur l’ADN de départ à l’aide
d’amorces spécifiques.
 Amplicons du Gène D’Intérêt
Électrophorèse : Permet de contrôler que nous avons bien réussi à isoler le gène d’intérêt, de vérifier sa
pureté.
Ligation et Transformation
Ligation et Transformation
Ligation : Insertion du GI dans le plasmide (dans Lac Z permet la sélection blanc/
Ligation : Insertion du GI dans le plasmide (dans Lac Z permet la sélection blanc/ bleu
=> On se sert d’une ADN ligase afin de sceller les réappariements dus aux bouts collants plasmide / GI
Transformation :
principe
général :
processus
naturel
chez
les
bactéries
Gram+
qui
consiste
en
l’incorporation de matériel génétique exogène. MAIS Chez les bactéries Gram- , il faut les rendre
compétentes pour que cela se produise.
 TRANSFORMATION PAR CHOC THERMIQUE
Extraction de l’ADN plasmidique
Extraction de l’ADN plasmidique
MISE EN CULTURE Clonage de GI => Première sélection = Mort des bactéries non transformée
MISE EN CULTURE
Clonage de GI
=> Première sélection = Mort des bactéries non transformée du fait de l’antibiotique
=> Deuxième sélection= on sait quelles sont les clones bactériens qui on transformé un
plasmide recombinant (BLANC)… et ceux qui on un non recombinant (BLEU)
(Colonies blanches seulement)
LYSE DES CELLULES
=> simplement en lysant les bactéries et en faisant sédimenter les membranes par
centrifugation on récupère l’ADN plasmidique (le chromosome bactérien est lié à la
paroi)
PURIFICATION
=> on précipite le surnagent dans un nouveau tube puis on le nettoie à l’éthanol et on le
resolubilise => afin d’éviter toute contamination éventuelle (protéine par ex)
PCR - RFLP : Random fragment lenght polymorphism. Précédé d’une PCR
PCR - RFLP : Random fragment lenght polymorphism. Précédé d’une PCR
PCR => pour amplifier la quantité d’ADN => pas d’hybridation de sondes marquées par Blotting.
PCR
=> pour amplifier la quantité d’ADN => pas d’hybridation de sondes marquées par Blotting.
=> Révélation aux UV par le BET.
RFLP => Mise en évidence d’un polymorphisme des plasmides entre les colonies blanches et bleues
au
niveau du site de restriction (dans Lax Z).
L’Électrophorèse consécutive à la RFLP met en évidence ce polymorphisme («génotype et phénotype » =>blanc / bleu) :
 pour les plasmides recombinants :
2 bandes donc 2 fragments
=
GI + plasmide
 Pour les plasmides non recombinés : 1 seule bande donc 1 seul fragment
= plasmide seul