PIBIC-UFU, CNPq & FAPEMIG Universidade Federal de Uberlndia Pr-Reitoria de Pesquisa e Ps-Graduao DIRETORIA DE PESQUISA

AVALIAO DA INATIVAO FOTODINMICA DE Staphylococcus epidermidis UTILIZANDO O EXTRATO BRUTO DE Bidens sulphurea
Renata Oliveira Santos1
Instituto de Qumica - Universidade Federal de Uberlndia - Avenida Joo Naves de vila, 2121 Uberlndia-MG renata_oliveirasantos@qui.ufu.br

Lucas Ferreira de Paula1

Instituto de Qumica - Universidade Federal de Uberlndia msc_lucasferreira@yahoo.com.br

Henrique Dantas de Menezes2

UNIPAC - Rua. Baro de Camargos, 695 - Centro - Uberlndia MG henriquedmenezes@gmail.com

Carlos Alberto de Oliveira3

Instituto de Qumica - Universidade Federal de Uberlndia oliveira@ufu.br

Resumo: Os microorganismos so os seres vivos mais numerosos de nosso planeta e frequentemente esto associados problemas de sade humana, animal e problemas de ordem econmica, quando afetam a agricultura e a produo de produtos de origem animal. A era dos antibiticos est prestes a entrar em colapso, devido ao uso indiscriminado de antibiticos, o que propicia o constante aparecimento de microorganismos resistentes. Desta forma, novos procedimentos de interveno devem ser desenvolvidos no sentido de promover inviabilizao do crescimento microbiano. A Inativao Fotodinmica (PDI, Photodynamic Inactivation) de microorganismos uma rea de pesquisa em expanso e envolve a combinao sinrgica de um fotossensitizador, oxignio molecular e luz de comprimento de onda adequado. Como o mecanismo de ao dos fotossensitizadores diferente dos exercidos pelos antibiticos, espera-se que este procedimento seja de uso mais generalizado, atuando contra diferentes tipos de membranas externas e sem aparecimento de microorganismos resistentes. Neste trabalho avaliamos a eficincia PDI in vitro de Staphylococcus epidermidis utilizando o extrato bruto de Bidens sulphurea como fotossensitizador. A emisso de luz foi efetuada por um equipamento emissor de radiao policromtica oriunda de uma lmpada halgena denominado PHLS Polichromatic Halogen Lamp System, ativando o fotossensitizador e com isso produzindo oxignio singlete. O extrato bruto de Bidens sulphurea foi eficiente na inativao fotodinmica desta bactria, demonstrando um grande efeito citotxico frente a mesma. Palavras-chave: Inativao fotodinmica, microorganismos no patognicos, Asteraceae. 1. INTRODUO Microrganismos tais como bactrias, fungos, leveduras e vrus podem ser mortos por luz visvel depois de tratamento comum fotossensitizador apropriado e luz, em um processo denominado Inativao Fotodinmica (PDI, Photodynamic Inactivation) ou Quimioterapia Fotodinmica Antimicrobiana (PACT, Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy). Apesar do considervel progresso que tem sido obtido nos tratamentos de infeces, preocupante o crescente nmero de bactrias patognicas resistentes a antibiticos no mundo todo, o que, segundo Hamblin e Hasan, pode levar ao fim de um extenso perodo chamado de era do antibitico(Maisch et al., 2005 e Hamblin et al., 2004). 1- Acadmicos do curso de Qumica; 2 Acadmico do curso de Biomedicina; 3 Orientador;

Desta forma, novos procedimentos de interveno devem ser desenvolvidos no sentido de promover inviabilizao do crescimento microbiano, e que no tenha associao com mecanismos de resistncia microbiana comumente observados com antibiticos. A utilizao de corantes (sensitizadores) como ferramentas para eliminao de microorganismos indesejveis bastante antiga, datando do sculo passado, mas que ficaram um pouco de lado, devido o advento da antibioticoterapia (Von Tappeiner, 1904). Colorantes (corantes e pigmentos) se caracterizam pela sua habilidade de absorver luz visvel. Nos ltimos 130 anos, cerca de 10.000 desses compostos qumicos coloridos vem sendo produzidos em escala industrial. Com respeito ao nmero e volume de produo dos corantes e pigmentos correntemente comercializados, os compostos azo so de longe, o maior grupo de corantes. Isso se deve simplicidade de sua sntese, ao geralmente alto coeficiente de extino molar, e sua considervel durabilidade (Bertoloni et al., 1990) Benefcios tanto quanto reaes adversas da luz solar tem sido conhecidos por muitos sculos. Luzes tm sempre sido usadas com propsitos teraputicos. A princpio, apenas radiao ultravioleta era aplicada com fins teraputicos em tratamentos de peles tuberculosas e debilitada (Bertoloni et al., 1990). Quando surgiram notificaes sobre as propriedades da luz e da fluorescncia de vrios corantes, tornou-se claro que corantes excitados por aplicao de luz teriam efeitos destrutivos em sistemas biolgicos (Bertoloni et al., 1992). Em funo do fato de absorverem luz com elevada eficincia, em alguma regio do espectro visvel, alguns desses compostos so capazes de induzir ou participar de certas reaes fotoqumicas especficas. No entanto, s algumas classes de corantes e pigmentos tm sido submetidas a um estudo fotoqumico sistemtico, visando conhecer com detalhes suas propriedades (Ackroyd et al., 2001). Recentemente tem se utilizado sensitizadores, na chamada Terapia Fotodinmica (TFD), para a eliminao de agentes microbianos no tratamento de infeces localizadas em reas acessveis luz (Maisch et al., 2005). A PDI de microorganismos uma rea de pesquisa em expanso e envolve a combinao sinrgica de um fotossensitizador, oxignio molecular e luz de comprimento de onda adequado. Durante o evento fotodinmico, so produzidas espcies reativas do oxignio (EROs) que inviabilizam molculas biolgicas presentes ao redor, promovendo efeitos bacteriostticos e bactericidas. A TFD baseada na utilizao de molculas sensveis luz. Estas molculas so chamadas de fotossensitizadores, e quando ativadas por luz de comprimento de onda adequado, produzem vrias espcies ativas do oxignio, sendo a principal, o oxignio singlete (figura 1). A formao desta e de outras espcies ativas na membrana celular e na membrana de organelas, resulta em inviabilizao e morte celular (Hamblim e Newman, 1994).

Figura 1: Reao entre um sensitizador e o oxignio molecular, formando o oxignio singlete. Fonte (Machado, 2000) A famlia Asteraceae, a maior do grupo das Angiospermas tem grande importncia econmica, pois inclui espcies que so utilizadas como ornamentais, na alimentao e como medicinais. Devido ao seu extraordinrio poder de adaptao ambiental, podem ser encontradas nos mais diversos hbitats e em diferentes regies climticas (tropicais, subtropicais e temperadas). Outro fator importante para seu sucesso biolgico sua grande capacidade de disperso, devido presena de ppus plumosos, apndices, estruturas de aderncia e metablitos secundrios (Venable e Levin, 1983).

As plantas desta famlia produzem compostos orgnicos que possuem inmeras atividades biolgicas, tais como atividade antiinflamatria, imunosupressiva, antitumoral, bactericida, etc (Chang et al., 2007). O gnero Bidens consta de cerca de 200 espcies de plantas herbceas e sub-arbustivas, anuais ou perenes, que ocorrem no mundo inteiro. A espcie Bidens sulphurea (figura 2), estudada em nosso trabalho, uma herbcea anual, ereta, muito ramificada, intensamente disseminada e naturalizada no territrio brasileiro. Popularmente conhecida como csmo-amarelo, pico-grande e ster-do-mxico, sendo considerada uma planta invasora (Lorenzi e Souza, 2001).

Figura 2: Bidens sulphurea (http://farm4.static.flickr.com/3264/2815453125_b8be10f667.jpg?v=0 Acesso em 07/01/2009) conhecido que bactrias gram-positivas so geralmente mais susceptveis PDI quando comparado com bactrias gram-negativas. Esta diferena atribuda diferenas estruturais na parede celular. Bactrias gram-negativas tm uma estrutura complexa da membrana externa formada por duas bicamadas lipdicas enquanto gram-positivas possuem uma nica bicamada e uma camada externa relativamente permevel, fungos so ainda mais resistentes PDI devido a presena de uma membrana nuclear que pode representar uma barreira adicional penetrao do fotossensitizador (Deminova e Hamblin, 2005).

Figura 3: Diferenas entre as membranas celulares das bactrias Gram-positivas e Gramnegativas. (http://pathmicro.med.sc.edu/Portuguese/bact-mem-port.jpg Acesso em 29/07/2009) O Staphylococcus epidermidis (Figura 4) o habitante normal da pele e mucosas, sendo considerado a espcie de estafilococos coagulase negativos de maior prevalncia e persistncia na pele humana, tendo um baixo potencial patognico.

Figura 4: Staphylococcus epidermidis. (http://www.sciencemuseum.org.uk/antenna/implantinfection/ Acesso em 27/07/2009) A extenso da morte celular microbiana dependente da concentrao empregada do fotossensitizador e do tempo de irradiao. Estes resultados enfatizam o uso da fotoinativao como um procedimento alternativo aos antimicrobianos tradicionais, permitindo uma eliminao do microorganismo de regies de pele infectadas ou de locais do corpo que possam veicular e disseminar estes microorganismos resistentes antibioticoterapia. A vantagem da fotoinativao de microorganismos que o efeito bactericida rpido, altamente localizado, no interferindo com a microflora de outros stios corpreos. Como o evento citotxico dependente da produo de oxignio singlete e radicais livres, o desenvolvimento de resistncia ao procedimento bem pouco provvel (Hamblin et al., 2004). 2. MATERIAIS E MTODOS 2.1 Equipamento PHLS A montagem do sistema de irradiao desenvolvido pelo nosso grupo de pesquisa foi feita da seguinte forma: uma lmpada halgena utilizada em retroprojetores (marca OSRAM, modelo ENH, potncia de 250W) foi acoplada uma caixa metlica proveniente de uma fonte de computador. Nessa estrutura foi inserido um cooler de fonte de alimentao de computadores. Uma lupa de leitura de vidro cristal 100% (marca DFV, modelo LL-P100, com 100 mm de dimetro, 175 mm de foco, armao plstica, aumento de 1,5 vezes) foi fixada uma distncia de 7 cm da lmpada. Em uma distncia de 22,5 cm, colocou-se uma cuba de vidro oca de formato retangular, com 5 cm de percurso. Nas extremidades laterais da cuba, foi soldado um bocal permitindo a fixao de mangueiras para circulao de gua em seu interior. Essa cuba permite a passagem de fluxo de gua visando a refrigerao da regio prxima amostra. A montagem completa exibida na Figura 5. O cooler alimentado por um transformador comum 12 V, enquanto a lmpada ligada diretamente na tenso alternada.

Figura 5: Equipamento PHLS, 1 Carcaa metlica com a lmpada e cooler acoplados, 2 Lente de aumento, 3 Cuba de vidro.
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A atividade fotodinmica do extrato bruto de Bidens sulphurea foi testada atravs da tcnica de diluio em tubo, esta tcnica amplamente usada pela comunidade cientfica e proporciona resultados mais rpidos e adequados quando um grande nmero de amostras est sendo testado (Pelczar Jr., Chan e Krieg, 1996). Diluies seriadas da substncia-teste foram feitas, tendo-se analisado as seguintes diluies:, 1 , 1 , 1 , 1 e 1 , sendo descartada a realizao do teste com o extrato puro, uma vez que a 2 4 8 16 32 morte celular seria causada pela alta concentrao alcolica do mesmo e no pelos componentes da planta. 2.2 Suspenso bacteriana de Staphylococcus epidermidis Retirou-se uma pequena quantidade de Staphylococcus epidermidis cultivado em gar CistinaLactose-Eletrolito-Deficiente CLED (Oxoid) para preparao da suspenso bacteriana em soro fisiolgico estril com turvao de aproximadamente 0,4 na escala de Mac Farland. 2.3 Incubao e irradiao Foram incubados, no escuro, por 20 minutos 100L de suspenso bacteriana e 100L da diluio de Bidens sulphurea. Esse ensaio se repetiu para cada uma das concentraes de Bidens sulphurea preparadas: 1 , 1 , 1 , 1 e 1 . Todos os ensaios foram realizados em triplicata, 2 4 8 16 32 sendo descartado o valor mais discrepante e tendo sido feita a mdia aritimtica dos demais valores. Aps o perodo de incubao, as amostras foram irradiadas, por 20 minutos, pelo equipamento emissor de radiao policromtica oriunda de uma lmpada halgena (PHLS) (figura 5), sem agitao, e subsequentemente transferiu-se 100L da suspenso para uma placa de petri contendo o meio de cultura fundido e mantido em estufa 35 C. O meio de cultura utilizado para crescimento de Staphylococcus epidermidis foi preparado na composio: 1,25% de extrato de carne lab lemco (Oxoid), 0,50% de triptona (Oxoid), 1,00% de peptona (Biobrs), 0,50% de cloreto de sdio (Vetec, 99%), 0,25% de fosfato dissdico heptahidratado (Cintica qumica, 99%) e 2,00% de D-glucose (Synth, 99,9%) e 2% de gar. Realizou-se a contagem de colnias, aps 24 horas de incubao, atravs de um contador de colnias PHOENIX (CP 602). O mesmo procedimento foi realizado na presena e na ausncia de irradiao luminosa, para que se pudesse ter certeza do potencial fotodinmico da substncia e no apenas de sua citotoxicidade. O plaqueamento tambm foi realizado para a soluo salina estril, a fim de se confirmar que no houve contaminao da mesma, e para a suspenso bacteriana. Ambos serviram de controles para o experimento. 3. RESULTADOS E DISCUSSO O espectro de absoro (Figura 7) do extrato de Bidens sulphurea em diferentes solventes nos mostra que o pico mximo de absoro varia de acordo com o solvente empregado. O pico de absoro mxima em etanol de aproximadamente 385 nm, este comprimento de onda caracterstico de luz ultravioleta. Portanto os resultados obtidos poderiam ter sidos melhores caso tivssemos disponvel uma fonte de irradiao cuja emisso fosse na regio do ultravioleta. Porm como o extrato de Bidens sulphurea tem uma leve absoro na regio da luz visvel os resultados ainda foram satisfatrios.

Figura 7: Espectro de absoro do extrato de Bidens sulphurea em diferentes solventes Nos ensaios com Staphylococcus epidermidis para as diluies 1 , 1 , 1 , 1 e 1 de 2 4 8 16 32 Bidens sulphurea obtivemos respectivamente a mdia de Unidades Formadoras de colnias por mililitros (UFCs/mL), com irradiao de luz 5,30x103, 7,16x103, 6,88x103, 6,36x103, 6,58x103 e sem a irradiao de luz obtivemos respectivamente 6,10x103, 6,50x103, 7,57x103, 8,41x103 e 8,58x103 UFCs/mL. No houve crescimento bacteriano na placa com soluo salina estril. J o plaqueamento da suspenso bacteriana (controle sem o extrato) resultou em uma mdia de 13,020x103 UFC/mL. Com estes resultados, pode-se afirmar que a emisso de luz fez com que houvesse uma inibio do crescimento bacteriano, j que na maioria das diluies as UFCs/mL foram menores quando a suspenso de extrato e bactria foi submetida a radiao luminosa. Assim, evidenciamos o potencial fotodinmico da Bidens sulphurea para a bactria Staphylococcus epidermidis. Nota-se, porm que para a diluio 1 no ocorreu diminuio das UFCs/mL e sim um aumento das 4 mesmas, alm do fato desta diluio ter sido a nica que no obedeceu ao crescimento linear de diminuio da concentrao de extrato versus aumento de UFC, este fato foi inusitado e requer maiores estudos sobre o comportamento desta diluio. Alm disso, pode-se afirmar que o extrato de Bidens sulphurea mostrou-se citotxico para a bactria Staphylococcus epidermidis, uma vez que mesmo nas menores concentraes do extrato a houve significante reduo do crescimento bacteriano se comparado suspenso sem a presena do mesmo; para a soluo mais diluda de Bidens sulphurea 1 , sem a presena de luz, houve uma 32 reduo de aproximadamente 34% das Unidades Formadoras de Colnias por mililitro, este resultado nos mostra o grande potencial desta planta para inibio do crescimento de bactrias, seja na presena de luz ou no. Atravs do grfico a seguir (Figura 8) possvel visualizar a inibio de crescimento bacteriano causado pelo extrato bruto de Bidens sulphurea. A inibio em presena de luz poderia ter sido maior caso a luz fornecida pelo sistema de irradiao tivesse o pico mximo de emisso exatamente no valor mximo de absoro do extrato bruto de Bidens sulphurea (com comprimento de onda de aproximadamente 385nm, regio do ultravioleta, como foi mostrado na figura 7).

Figura 8: Grfico da inibio de Staphylococcus epidermidis em diferentes concentraes do extrato bruto de Bidens sulphurea. 4. CONCLUSO O extrato bruto de Bidens sulphurea foi eficiente na fotoinativao da bactria Staphylococcus epidermidis, evidenciando que componentes desta planta podero ser caracterizados e isolados, obtendo um fotossensitizador que possa ser utilizado para fins teraputicos. necessrio um maior aprofundamento na toxicidade deste extrato, alm de estudos mais amplos sobre quais microorganismos podero ser tratados com o mesmo. Apesar da toxicidade do extrato ter se mostrado relativamente baixa, deve-se ainda pesquisar o comportamento dos princpios ativos da planta em extratos com diferentes solventes, alm do aprimoramento da fonte de irradiao luminosa, que deve ser construda de modo que a ativao dos compostos de Bidens sulphurea seja mais efetivamente. Uma vez que a Bidens sulphurea uma planta to pouco estudada pela comunidade cientfica, ainda h muito que se pesquisar sobre os compostos presentes na mesma, seja eles ativados pela luz ou no, sendo este trabalho apenas um pequeno comeo de uma vasta pesquisa cientfica. 5. AGRADECIMENTOS Ao Programa Institucional de Bolsas de Iniciao Cientfica (PIBIC/CNPq/UFU) pelo auxlio financeiro concedido e aos meus companheiros de LaBioFot pela amizade, ajuda e compreenso. 4. REFERNCIAS Ackroyd R, Kelty C, Brown N, Reed M. (2001): The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochem Photobiol, 74(5): 656-69 Bertoloni, G., Rossi, F., Valduga, G., Jori, G. E Van Lier, J.; FGMS Microbiol, Lett.1990, 71:149156 Bertoloni, G., Rossi, F., Valduga, G., Jori, G., Ali, H. E Van Lier, J.; Microbios. 1992, 71:33-46 Chang et al. Journal of Ethnopharmacology 2007 112 232236. Deminova, T. N.; Hamblin, M. R.; Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2005,vol 49(6): 2329-2335. Hamblim, R.M; Newman, E.L.; J. Photochem.Photobiol., 13, 3 (1994). Hamblin, M. R.; Hasan, T.; Photochem. Photobiol. Sci. 2004, 3, 436. Lorenzi, H.; Souza, H. M. Plantas Ornamentais no Brasil:Arbustivas, Herbceas e Trepadeiras, 2001, 3 ed., Inst. Plantarum, SP. Machado, A. E. H.; Qumica Nova, 23: 237 (2000).

Maisch, T.; Bosl, C.; Szeimies, R.-M.; Lehn, N.; Abels, C.; Antimicrob. Agents Chemother. 2005, 49, 1542. Pelczar Jr., J.M.; Chan, E. C. S.; Krieg, N. R. Microbiologia: conceitos e aplicaes. So Paulo: MAKRON Books, 1996. 517 p. volume II. Venable, D.L.; Levin, D.A. 1983. Morphological dispersal structures in relation to growth habit in the Compositae. Plant Systematic Evolution, 143:1-16. Von Tappeiner, J. A. (1904): H. (1900): Uber Wirkung der photodynaischen (fluoroieszierenden) Stoffe aufProtozoan und Enzyme. Disch. Arch Klin Med. 80: 427-8

EVALUATION OF PHOTODYNAMIC INATICTIVATION OF Staphylococcus epidermidis USING THE Bidens sulphurea CRUDE EXTRACT
Renata Oliveira Santos
Instituto de Qumica - Universidade Federal de Uberlndia - Avenue Joo Naves de vila, 2121 Uberlndia-MG. renata_oliveirasantos@qui.ufu.br

Lucas Ferreira de Paula

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Henrique Dantas de Menezes

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Carlos Alberto de Oliveira

Instituto de Qumica - Universidade Federal de Uberlndia oliveira@ufu.br

Abstract: The microorganisms are the most numerous living system of our planet and frequently they are associated to the problems of human health, animal and to problems of economical order, when they affect the agriculture and the production of animal origin products. The age of antibiotics is ready entering in collapse, due to the indiscriminate use of antibiotics, which favors the constant appearance of resistant microorganisms. In this way, new proceedings of intervention must be developed in the sense of promoting inviabilization of the microbial growth. The Photodynamic Inactivation of microorganisms is an area of research in expansion and involves the synergic combination of a photosensitizer, molecular oxygen and light of appropriate wavelength. As the mechanism of photosensitizer action is different from the practiced ones for the antibiotics, it is waited that this proceeding is of more generalized use, acting against different types of extern membranes and without appearance of resistant microorganisms. In this work we evaluated the PDI efficiency in vitro of Staphylococcus epidermidis using the Bidens sulphurea crude extract as photosensitizer. The light emission was effected by an equipment issuer polychromatic radiation come from a halogen lamp denominated PHLS "Polychromatic Halogen Lamp System", activating the photosensitizer and with this producing singlet oxygen. The Bidens sulphurea crude extract has been efficient in the photodynamic inactivation of this bacterium, demonstrating a great citotoxic effect in front of them. Keywords: Photodynamic inactivation, not pathogenic microorganisms, Asteraceae.