Rev.Int.Contam.Ambient.

20(2)6975,2004

AISLAMIENTO, IDENTIFICACINY EVALUACIN DE UN CULTIVO MIXTO DE MICROORGANISMOS CON CAPACIDAD PARA DEGRADAR DDT

Esther CARRILLOPREZ,Arturo RUIZMANRQUEZ y HaydeYEOMANSREINA

Departamento de Ingeniera Qumica y Metalurgia, Universidad de Sonora, Hermosillo 83000, Sonora, Mxico, jhyeomans@iq.uson.mx

(Recibido agosto 2002, aceptado marzo 2004)

Palabrasclave:aislamiento,biodegradacin,cinticadecrecimiento,DDT
RESUMEN SeaisluncultivomixtodebacteriasconcapacidadparadegradarDDTapartirdeunamezcla de muestras deagua,suelo ysedimentocontaminadosde laregin delValledelYaquien Sonora,Mxico.Elcultivofuepropagadoenformaintermitente,enunmediodesalesminerales con133ppmdeDDTcomercialcentrifugadoeincubadoa28Cy150rpm.Elcrecimientofue evaluadomidiendoelincrementodeprotenaporelmtododeLowrycorrelacionadoconel aumentoenpesosecodebiomasa.Elcultivotuvounavelocidadespecficadecrecimientode 0.072/hyuntiempodegeneracinde9.62h.ElDDTresidualsedeterminporcromatografade gases.ElcrecimientofuesustentadoporelDDTdisponiblecomonicafuentedecarbonoy fuecompletamenteasimiladoenlasprimeras40h.LosmetabolitosDDDyDDEpresentesenel DDTcomercialfueroncompletamentedegradadossinobservarseelevacindesuconcentra cinduranteelcultivo.Laidentificacindemicroorganismossugiriuncultivoconformado principalmente por bacilos Gram negativos pertenecientes a los gneros Pseudomonas, Neisseria,Moraxella y Acinetobacter.

Keywords:isolation,biodegradation,growthkinetics,DDT
ABSTRACT AmixedculturecapableofdegradingDDTwasisolatedfromamixtureofsamplestakenfrom contaminatedwater,soil,andsedimentsfromtheYaquiValleyinSonora,Mxico.Theculture wasgrownintermitentlyinamineralsaltsmediumsuplementedwith133ppmofcentrifuged commercialDDTandincubatedat28Cand150rpm.Growthwasevaluatedmeassuring proteinincreaseusingtheLowrymethod.Theproteincontaintwascorrelatedtoincreaseof drymassweight.Theculturehadaspecificgrowthrateof0.072/handagenerationtimeof9.62 h.TheresidualDDTwasdeterminatedbygaschromatogrphy.Thegrowthwassustainedby DDTasasolesourceofcarbonandwascompletelyconsumedinthefirst40h.Themetabolites DDDandDDEalsopresentincommercialDDTwerecompletelydegradedwithoutshowingan increaseinconcentrationthroughouttheculturing.Themicrobiologicalidentificationofthis culturesuggestedthatitwasformedmainlybyaGramnegativebacilli.Thesebacilliwere identifiedasmembersofthegenera Pseudomonas,Neisseria,Moraxella and Acinetobacter.

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INTRODUCCI N El desarrollo de las sociedades contemporneas en las ltimasdcadashaestadoasociadoalusodecompues tos sintticos conocidos como xenobiticos, los cuales entrandirectaoindirectamentealambiente,contaminn doloygenerandoproblemasseverosalasaluddelhom bre, adems ponen en riesgo la estabilidad de muchas especies.Agentesxenobiticoscomolosplaguicidas,sin negarsucontribucinalincrementodelaproductividad agrcolaanivelmundial(Derache1990),hancontamina doelambiente,afectandoprincipalmentecuerposdeagua debidoalusoindiscriminadoeinadecuadodeellos,sobre todoenpasesendesarrollo(Ortegaetal.1994).Tales el caso del Valle delYaqui, en el noroeste de Mxico, dondelaaplicacinintensadeplaguicidashasidoseala dacomolacausaprincipaldelacontaminacindeaguas superficiales y subterrneas (OrtizHernndez et al. 1997).Algunosdeellosyahansidoprohibidosenotros pasesporsurecalcitranciaytoxicidad.Sehadetectado la presenciade plaguicidas en pozos utilizados para el abastecimientodeaguapotableascomoenmuestrasde fluidoshumanos enhabitantesdepoblaciones delValle delYaqui(GarcaBauelosyMezaMontenegro1991). CmaraDurn(1992),reportaladeteccindeplaguicidas enlosprincipalesdrenajescolectoresdeaguasresiduales del Valle del Yaqui. La mayora de los plaguicidas detectados son organoclorados y algunos de ellos presentan concentraciones que rebasan las normas mexicanasdelacalidaddelaguaparaconsumohumano. Lacapacidadmetablicadelosmicroorganismospara degradarestoscontaminantes,hasidoconsideradacomo unaalternativapotencialparacontribuiraladisminucin desusnivelesenelambiente(Alexander1981,Nadeau etal.1994,Park etal.2003).Lahabilidaddelosmicroor ganismos para degradar compuestos persistentes como DDT y sus metabolitos presentes en agua, aguas resi duales,sedimentoyambientesmarinoshasidofrecuen temente documentada (Wedemeyer 1967, Pfaender y Alexander 1972, Bumpus yAust 1987,Aislabieet al. 1999,Foght et al. 2001).La presencia de estetipo de organismosensuelocontaminadoascomolaposibilidad de favorecer su desarrollo puede ser muy conveniente cuandosepiensaenlabiodegradacincomounaopcin paraeltratamientodesitioscontaminados.Elobjetivode estetrabajofueevaluarlacapacidadparadegradarDDT deuncultivobacterianomixtoaisladodehabitatsdelValle delYaquiascomollevaracabolaidentificacinpresuntiva delosmicroorganismosqueconformandichocultivo. MATERIALESY MTODOS React ivos LosestndaresdeDDT[1,1,tricloro2,2bis(pclo

rofenil) etano] (98%) DDD [1,1dicloro2,2bis(p clorofenil)etano (98 %) y DDE [1,1dicloro2,2 bis(p clorofenil)etileno(99%)fueronadquiridosdeSupelcoCo. elDDTcomercialal75%seobtuvoatravsdelaSe cretaradeSaludPblicalaalbminadesuerodebovi no(BSA),K HPO ,KH PO ,NH SO MgSO 7H O, 2 4 2 4 4 4, 4 2 CaCl 2H2O, MnSO4H2O, FeSO47H2O, NaOH, 2 Na SO anhidro, hexano (grado cromatogrfico), ter 2 4 etlico(gradocromatogrfico)yacetonafueronadquiri dosdeSIGMA. Aislamiento Lasmuestrasdesuelo,sedimentoyaguasresiduales fueroncolectadasdesitiosconunhistorialdecontami nacinomanejodeplaguicidasentre15a25aos,situa dos en la regin delValle delYaqui, en el noroeste de Mxico.Setomaron500gdemuestrasdesedimentoy sueloaunaprofundidadde4a10cmdelasuperficiey sealmacenaronenbolsasdeplstico.Adicionalmentese recolectaronmuestrasdeaguasresidualesysealmace naronenfrascosdenalgeneestriles.Lastemperaturas delossitiosdemuestreofluctuaronentre31y39C. Todas las muestras fueron procesadas antes de las 48horas,colocandoenunvasodeprecipitados250gde lamezclahomogneadesueloysedimento,250mLde lamuestradeaguaresidualy700mLdeaguadestilada. Sehomogeneizlamezcla,semidielpHysedetermi nelcontenidodeDDT,DDDyDDEparaloscualesse obtuvieronvaloresde46ppb,11ppby37ppb,respecti vamente.Una alcuotadelsobrenadantede laprepara cinanteriorseutilizcomoinculo. Se prepar una solucin de sales minerales con la siguientecomposicineng/L:K HPO ,1.73 KH PO , 2 4 2 4 0.68 NH SO , 1.0 MgSO 7 H O, 0.1 CaCl2 H O, 4 4 4 2 2 0.02MnSO H O,0.03yFeSO 7H O,0.03,lacualse 4 2 4 2 esteriliza121Cpor15minutos(StanlakeyFinn1982). Se distribuyeron 25 mL de esta solucin en matraces Erlenmeyerde250mL,previamentedosificadoscon133 ppm de DDT comercial disuelto en acetona y centrifugado.Enestemediodecultivo,conDDTcomo nicafuentedecarbono,seinocularonlosmatracescon 5%(v/v)delsobrenadanteyseincubarona28Cy150 rpmenunaincubadoraconagitacinhastaobservarcre cimiento. Los microorganismos fueron aislados por la tcnicadecultivodeenriquecimiento. Secosechelpaquetecelularporcentrifugacindel caldo de cultivo a 14,000 x g por 15min se lav tres vecesconsolucinamortiguadoradefosfatosdepH7.0 (HunterCervera et al. 1986). Posteriormente se trans firiatubosdeensayeestriles,seresuspendien3ml desolucindesalesmineralesysealmacenenrefrige racin. Mtodos analticos

Determinacindeprotena.Seutilizelmtodode

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Lowry adaptado para el anlisis de microorganismos (Herbertetal.1969).Aunaalcuotade0.5mldesus pensin de microorganismos se adicionaron 0.5 ml de NaOH1.0N,secolocen unbaodeaguahirviendo por5minutosyseenfriconaguafra.Seaadieron2.5 mLdeunamezcladereactivosrecinpreparada:50mL Na CO al5%,2mLdeCuSO 5HOal0.5%entartrato 2 3 4 2 depotasioal1%ysedejreposar10minutos.Seagre garon0.5mLdelreactivodeFolinCiocalteu1.0N,se agitinmediatamenteeltuboysedejreposar30minu tos paradesarrollodecolor.Semidilaabsorbanciaa 750nmenunespectrofotmetropreviamentecalibrado conunblancodereactivos.Cadapuntodemuestreose analizportriplicadoysecalcullacantidaddeprotena conbaseenunacurvadecalibracinempleandoalbmi na de suero de bovino como protena estndar, la cual recibielmismotratamientoquelasmuestrasdecultivo. Determinacin de peso seco. Para la determina cindepesosecodelpaquetecelularseutilizunaserie dematracesErlenmeyerde500mLporduplicado.Los matracescon50mLdemediodecultivoseinocularon conuncultivoencrecimientoexponencialyseincuba rona28Cy150rpm.Serealizaronmuestreosperidi cos durante el crecimiento, sacrificando matraces. Se cosech el paquete celular por centrifugacin, usando tubosdenalgenede50mL,previamentetaradosyman tenidos en un desecador. Se descart el sobrenadante de cada tubo y se secaron las clulas a 50 C hasta obtenerpesoconstante(Mallete1971). Lasdeterminacionesdeprotenaypesosecoserea lizaronsimultneamenteylacorrelacinentreellasfue analizadaporregresinlinealutilizandoelpaqueteSigma Plott2.0 Determinacin de DDT, DDD y DDE. Para eva luarelcontenidodeDDTresidualsesiguieronlasreco mendacionesdelmtodooficial608delaEPA(1984). Enunembudodeseparacinde30mLseextrajeron 10mLdelcultivocon10mLdeunamezcladehexano teretlico3:1(v/v),acidificandoconunagotadeH SO 2 4 concentrado. Se hicieron dos extracciones sucesivas a cadamuestra,agitandopor5minutosydejandoreposar hasta lograr la separacin de las fases. Se elimin el contenidodeaguadelafaseorgnicadelextractoaa diendo0.5gdesulfatode sodioanhidro(activadopor calentamientoa400Cenunamuflapor4horas).El extracto se concentr en un rotavapor, se llev hasta sequedadenunacampanadeextraccinyseguarden refrigeracinhastasuanlisis. Los extractos fueron diluidos apropiadamente en hexanoyanalizadosenuncromatgrafodegasesVarian 3800equipadocondetectordecapturadeelectrones.Para laseparacindeloscompuestos seutilizunacolumna TM DB 5de30mdelargo,0.25mmdedimetrointerno yespesordepelculade0.25 mm.Las temperaturas del inyectorydetectorfueronde250Cy300C,respectiva

mente. Lacolumna fueoperadademanera programada iniciandoconunatemperaturade140Cmantenidadu rante1minutounarampade140Chasta240Carazn de20C/min,mantenidapor1minyunasegundarampa de240Chasta265Caraznde10C/min,mantenida por2min.Seutiliznitrgenocomogasacarreadoraun flujoconstantede1.7mL/min.Lasinyeccionesfueronde 1 mLmanejadasenmodosindivisin.Lacuantificacin se hizo mediante calibracin con estndar externo las concentracionesde DDT,DDDyDDEfuerondetermi nadasporduplicado,conbaseenunacurvadecalibra cinylosdatosfueronprocesadosempleandoelprogra maStartWorkstationversin5.3.Laidentificacindelos plaguicidassehizoporcomparacindeloscorrespondientes tiemposderetencinconrespectoalosestndarespuros. Paraelanlisisderegresinylaconstruccindegrficas seuselpaqueteSigmaPlott2.01. Estudios de biodegr adacin Paraevaluarelcrecimientoyla biodegradacindel DDTsecultivarondemaneraintermitenteunaseriede matracesErlenmeyerde125mLporduplicadoconsu respectivo testigo sin inoculacin. Cada uno de los matracessepreparcon10mLdemediodecultivo,se inocularonconuncultivoencrecimientoexponencialajus tandolaconcentracincelulariniciala46 mg/mLdepro tenayseincubarona28Cy150rpm.Serealizaron muestreos a diferentes intervalos duranteelcrecimien to, sacrificando matraces para el anlisis de protena, DDT,DDDyDDEresidual.Lavelocidadespecficade crecimiento()fuecalculadautilizandolasiguienteecua cinderivadadelbalancedemasaenunreactorinter mitente:Ln(X /X )= (t t ).Deesta mismaecuacin 2 1 2 1 secalculeltiempodedobladoconsiderandoenlacur vade crecimiento el puntoen queX = 2X ,donde X 2 1 representalaconcentracincelulardentrodelreactory teltiempotranscurrido. Identificacin de micr oor ganismos Apartirdelcultivomixtosehicieronaislamientosde cepaspuras pordilucinseriada.Lasplacas conagar, salesmineralesy133ppmdeDDTseinocularoneincu barona28Chasta observarcrecimiento.Sehicieron resiembras sucesivas de las colonias aisladas para lo grarsupurificacinenagarnutritivoy133ppmdeDDT. Sedescribilamorfologadelascoloniasaisladasy sepracticlatincindeGramparaobservarlamorfolo gacelular. A las cepas puras se les practicaron las pruebas bioqumicasconvencionalesdeidentificacintalescomo catalasa,oxidasa,oxidacinyfermentacindeglucosa, crecimientoenaerobiosisyanaerobiosis,movilidad,prue basdeornitinayfenilalanina,reduccindenitrato,licue faccindegelatinaascomoproduccindecidosulfh drico(MacFaddin1991).

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RESULTADOS
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Identificacin de micr oor ganismos Seaisluncultivomixtodebacteriasenmediodesa lesmineralescon133ppmdeDDTcomercialcomoni cafuentedecarbn.Apartirdelcultivomixtoselograron aislarcepaspuras,cuyascoloniasfueronfcilmenteob servablesasimplevistaenlasprimerasetapasdepurifi cacinenlasresiembrassucesivaselcrecimientosehizo lentoyeltamaodelasmismasdisminuy,dificultndose suapreciacin porlasimilituddelcolordestas conel medio.ElusodeagarnutritivosuplementadoconDDTen lassubsecuentesetapasdepurificacinmejorlaforma cindecoloniasyfacilitsudiferenciacin.Fueronob servadosalmicroscopiosegmentosdehifasyagrupacio nesbacilaresramificadasGrampositivas,presumiblemente deactinomicetossinembargo,stosnopudieronserais lados. La mayora de las cepas aisladas fueron bacilos Gramnegativos,loscualesformaroncoloniasconvexas, decolorcremaoblanco,consistenciacremosa,demr genesenterosydeundimetroquevaride0.5a2mm, exceptounacepadecocobacilosGramnegativoforman docoloniasblancasumbonadasde2mmdedimetro. Laspruebasbioqumicasynutricionalespracticadas acadaunadelascepasqueconformaronelcultivomix to permitier on la identificacin de los gneros Pseudomonas, Neisseria, Moraxella yAcinetobacter. Cintica de cr ecimiento y biodegr adacin Lacurvadecrecimientodelcultivoserealizenel mismomedioutilizadoparaelaislamiento.Ladetermi nacindeprotenatotalresultunbuenmtododeesti macindelcrecimientodadalaheterogeneidaddelculti vo. El coeficiente de correlacin entre el contenido de protenayelpesosecodebiomasafuede0.98.Delan lisisdelafasedecrecimientoexponencialdelcultivose obtuvounvalordevelocidadespecficadecrecimiento de0.072/hyuntiempodegeneracinde9.62h.Lama yorpartedelDDTdisponiblefueasimiladoenlasprime ras 40horasyelcrecimientocontinuhastaalrededor delas80horas.LaconcentracindeDDTeneltestigo sin inocular novari duranteel tiempode incubacin. Estosresultadospuedenobservarseenlafigur a1. Lasmuestrasanalizadasparalaobtencindelacur vadebiodegradacindeDDTfuerontomadasdelcaldo decultivolibredepaquetecelular,enelcualsedetermi nuncontenidode40ppmdeDDTdisponiblealinicio delcultivo. Cuandolacinticadebiodegradacinsesigui,inclu yendoelpaquetecelularenlasdeterminaciones,seen contrque57%delDDTsuministradonofueasimilado porelcultivomixto(Fig.2). DDD y DDE que son productos de la degradacin deDDTtambinfuerondegradadoscompletamentedu rantelasprimerashorasdecultivo(Fig.3).

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Fig.1. Degradacin de DDT por un cultivo bacteriano mixto. Crecimientoa28Censalesmineralesy133ppmdeDDT comercialcomonicafuentedecarbono.DDT()sereporta como porcentaje de la concentracin de DDT inicial. Crecimientocelular ( D ) se reportacomoconcentracin de protenaenelpaquetecelularTestigo(o ),mediosininocular

DISCUSIN Alexander(1981)yGrady(1985)sugirieronlacon veniencia de buscarmicroorganismos degradadores en sitiospreviamente expuestosalcompuestoxenobitico deintersparatenermayorprobabilidaddexitoenlos aislamientos. La evidencia durante la primera semana decrecimientodelcultivoyhaberseleccionadounsitio demuestreoadecuadohacenquelosresultadosdeeste trabajo concuerden con lo establecido por los autores referidos.AuncuandoelDDTesdifcildedegradar,la exposicinprolongadademicroorganismos aste pro vocaquesegenereunapresinselectivaquepermitela seleccindeorganismosdegradadores,obieneltiempo en que los microorganismos presentes en el hbitat muestreadoestuvieronexpuestos posiblementeles per mitievolucionarhaciaeldesarrollodeenzimas ensu metabolismocapacesdeactuarsobrel.Algunasdelas cepas que se lograron aislar e identificar ya han sido reportadascomodegradadorasdeplaguicidas(Kobayashi yRittmann1982,CmaraDurn1992,Kiyofumi etal. 1996,Karpouzas etal.2000,Shimazu etal. 2001) LadegradacindeDDTporelcultivomixtoascomo elcrecimientoseiniciaronsinunafaselagdeinduccin, caractersticadeuncultivoquealmomentodeinocularlo estactivoyenfaseexponencialdecrecimiento,locual esconvenientecuandoseexponelapoblacincelulara uncompuestotxicodelmedio(Fig.1).

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Fig.2. Degradacin delDDTresidual determinadoenunasuspen sincelulardeuncultivobacterianomixto.Crecimientoa28 Cen salesmineralesy133 ppmdeDDTcomercial.DDT ()sereportacomoporcentajedelDDTinicial.Testigo( o ), mediosininocular

Lafigur a2muestraquecuandoseconsideraenlas muestrasanalizadaselpaquetecelular,soloel43%del DDTesutilizadoenelcrecimientoyelrestante57%no queda disponible, debido probablemente a su baja solubilidadenelmedioacuoso.Otraposibilidadesque elDDTseadsorbaalasparedesdelasclulasdificul tandosu degradacin este comportamiento yaha sido reportadoeneltrabajodeBumpus yAust(1987),yel mismopatrndedegradacinhasidoindicadoporMass etal.(1989).Tambinsehapropuestoquelainterrup cindeladegradacinpuedadeberseaunfenmenode inhibicinporacumulacindealgnmetabolitotxicoy/o agotamientodealgnfactoresencialparaelcrecimien to.Lascondicionesbajolascualesseobtuvieronlosda tos mostrados enla figur a2sugierenqueelDDTno disponibleseencuentraasociadoal paquetecelular la adsorcin de metabolitos a las par edes de los microorganismosyahasidoestablecidacomocausade laindisponibilidaddelsustrato(JuengstyAlexander1976). SegnlodescritoporYou etal. (1996)estaadsorcinse debealasolubilizacindelDDTenloslpidosdelapa redcelularmismosqueseencuentranenmayorpropor cinenlosorganismosGramnegativos.You etal. (1996) tambinsugierenquelossurfactantespodrancompetir conloslpidosdelmicroorganismoporelDDThacin dolodisponibleparalasreaccionesdebiotransformacin. Elestudiodelfenmenodeadsorcinresultapotencial menteinteresantedebidoalagrancontribucinquesig nificaraenelprocesodeseparacindelDDT.

Labiodegradacinde43%delDDTdosificado,la cualsedioen80horasdecultivoresultaatractivacom parndolaconlosresultadosobtenidosporMass etal. (1989)quienesreportandegradacindel50%delsustrato en 9 das en 30 das como lo mencionan Bumpus y Aust(1987)parauncultivodehongos. Algunos delos metabolitosdelDDTcomo DDDy DDE,fuerondetectadoscomoimpurezas delDDTco mercial.Sin embargo,stos fueroncompletamente de gradados porelcultivo,comosepuedeobservarenla figur a3.Duranteeltiempoquedurelcrecimientono sedetectincrementodeestos metabolitosenelmedio lo que hace suponer que si estos fueron formados du ranteladegradacindelDDT,elcultivotuvolacapaci dad metablica de degradarlos. Esto es importante ya que se hadescrito queDDD yDDEresultan ser tam bintxicosyrelativamenteestables(Laws1993,You etal.1996). Durante la experimentacin para evaluar la biodegradacin, el contenido de DDT en el testigo sin inocularnovaridemostrandoqueladegradacinabitica noocurri.Ancuandoenlaliteraturaexisteneviden ciasdedegradacinabiticadeDDTalparecerporre acciones fotoqumicas (Patil et al. 1972, Juengst y Alexander1976),ladegradacinmicrobianatambines sealada como la principal causa de degradacin (PfanderyAlexander1972). Muchos estudios han demostrado que poblaciones mixtasdemicroorganismospuedendegradarDDTbajo

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Fig.3. Degradacin de DDT (), DDD ( ) y DDE ( ) por un cultivobacterianomixto.Crecimientoa28Censalesmine rales y 133 ppm de DDT comercialcomo nica fuente de carbono.Testigo ( o ),medio sininocular

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condicionesanaerbicasgenerandoDDDcomoproducto deladesclorinacinreductoradel mismo,dondeesre movidounclorodelapartealifticadelamolcula.Este a su vez puede seguir degradndose bajo condiciones reductorasyoxidanteshastaformardiclorobenzofenona. Esms,algunosdelosintermediariospuedensufrirmeta fisindelanilloaromticohabindoseidentificadocido pclorofenilacticocomoproductofinal.Sinembargo,son poco los estudios que demuestran la degradacin aerbicadeDDTelcual,bajoestascondiciones,forma principalmenteDDE. CONCLUSIONES Seaislconrelativafacilidaduncultivobacteriano mixtoconformadoporcepasautctonasdelosgneros Pseudomonas, Neisseria, Moraxella y Acinetobacter, con capacidad para degradar hasta 43 % del DDT dosificadocuandocrecibajocondiciones aerbicas,a 28 C en un medio de sales minerales y 133 ppm de DDT como nica fuente de carbono. La degradacin ocurri enun tiempo relativamente corto de 80 horas, tiempoenelcuallosmetabolitosDDEyDDDpresen tesenelmedioogeneradosduranteelprocesotambin fuerondegradados.Sinembargoel57%delsustratono fuemetabolizadoquedandoasociadoalpaquetecelular. En este sentido, el empleo de sistemas biolgicos autctonos se presenta como una alternativa para la biorremediacindesitioscontaminadosconestetipode compuestos. AGRADECIMIE NTOS SeagradecealaSecretaradeEducacinSuperiore InvestigacinCientfica(SESICSEP)elapoyalpro yectoPROADU200026001027paralarealizacinde este estudio. REFERENCIAS
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