Vous êtes sur la page 1sur 2

Universit Abou Bekr Belkad 2006/2007 Facult des sciences

Dpartement de Biologie me 3 anne LMD option Biochimie. Nom: .............................. Examen : Contrle continu du deuxime semestre.

Anne

Prnom :.............................................

Une enzyme de masse molculaire 70000, prsente dans le cerveau de rat, est purifie en deux tapes de chromatographie, partir d'un extrait brut de 25 g de protines. Cet extrait prsente une activit enzymatique spcifique de 400 UE/g de protines. -Etape 1: La premire tape consiste en une chromatographie d'exclusion sur colonne : les 25 g de protines sont repris dans un tampon pH 7,4 puis dposs sur la colonne un temps zro. A partir de ce moment, on recueille en sortie de colonne des fractions lues de 5 ml dans lesquelles on dose l'activit enzymatique. Le rsultat des dosages est donn ci-dessous, ainsi que la concentration protique de chaque fraction :
n de la fraction : 1 2 3 4 5 6 7 AE (UE/ml) : 4 37 328 1256 216 23 2 concentration protique (mg/ml) : 420 540 480 570 420 280 250

AE : activit enzymatique. UE : nombre d'units enzymatiques.

Les trois fractions contenant majoritairement l'enzyme d'intrt sont recueillies et mlanges. -Etape 2 : Le mlange des trois fractions (pH 7,4) est dpos sur une colonne contenant une rsine changeuse d'ions, qui va permettre la deuxime tape de purification de l'enzyme (phi de l'enzyme = 9,6). Au cours de l'lution, des fractions de 5 ml sont rcoltes et l'activit enzymatique est dose dans chacune de ces fractions (voir tableau ci-aprs).
n de la fraction : 1 2 3 4 5 6 7 AE (UE/ml) : 1 3 2 2 8 982 12

La fraction n 6 est rcupre et la densit optique 260 nm est mesure sur cette fraction : DO260 nm = 0,740. La valeur du coefficient d'extinction molaire pour l'enzyme est : = 115 M-1 .cm-1. La longueur de la cuve est 1 cm. (On considrera pour les calculs que l'enzyme est pure.)

Questions: 1 - A l'issue de la chromatographie d'exclusion (tape 1), quelles sont les trois fractions que l'on mlange ? Calculer le nombre total d'UE recueilli, ainsi que la quantit totale de protines. Quel est le volume d'lution de l'enzyme ? -Fractions:

-Nombre total d'UE recueilli: - Quantit totale de protines : - Volume d'lution :

2 - Quel est le type d'ion que peut changer la rsine de l'tape 2 ? Justifier la rponse. Donner un exemple de groupement chimique pour une telle rsine. - Type d'changeur d'ions : - Exemple de groupement : 3 - A quel pH va tre ralise l'lution pour la chromatographie changeuse d'ions ? Justifier la rponse. Quel est le volume d'lution de l'enzyme ? - Volume d'lution : 4 - Dterminer le rendement de chacune des 2 tapes de purification, ainsi que le rendement global.

5 - Calculer la quantit de protines rcupre aprs l'tape 2 (chromatographie d'change d'ions). Quel est le taux de purification de l'enzyme l'issue de chaque tape chromatographique ? Conclusion ? (Pour rpondre aux questions 4 et 5, remplir le tableau ci-dessous :)
protines (g) : extrait : tape 1 : tape 2 : AE (UE) : rendement : taux de purification : :

-Rendement global : - Conclusion (utiliser le verso de la feuille, si ncessaire).