DOGMA CENTRAL Aplicao de marcadores moleculares na agricultura genes ambiente FENTIPO

Adriana Dantas acmdantas@cca.ufsc.br Florianpolis - SC

DNA armazena a informao

RNA transfere a informao

Protena executa a funo

GENOMA
COMO ESTUDAR?
Marcador molecular Polimorfismo Anlise de segrega o Mapa gentico Mapeamento de interesse (QRL QTL) Sequenciamento de DNA Bancos de sequencias Biblioteca genmica Genoma funcional

MARCADORES ? MARCAS ? GENES?

MARCADORES GENTICOS
Morfolgicos Bioqumicos DNA RNA

Expresso gnica - RNAm

Marcadores moleculares

MARCADORES ? MARCAS ? GENES?

MARCADORES GENTICOS
Identificam no indivduo as caracter sticas do fentipo, do gentipo ou de ambos; quantificvel, pode detectar variao seja na protena, ou em uma seqncia de DNA; Carter gentico pode no ter efeito observvel; Ligados a outros caracteres; Exige an lise de herana genmica.

MARCADORES GENTICOS
Morfolgicos
Bioqumicos DNA RNA

Marcadores moleculares

At 1960 Marcadores morfolgicos - Muito esforo e planejamento;

- Conhecimento prtico de cultivo; - Grande n mero de cruzamentos; - Nmero reduzido de marcadores; - Pouco cobertura genmica; - Polimorfismo limitado; -Influncia do ambiente e a o gnica; -Geralmente dominantes e recessivos.

Marcador molecular

Todo e qualquer fentipo molecular proveniente de um gene expresso, (isoenzimas, proteinas, RNAm) ou de um segmento especfico de DNA/RNA (regies expressas ou no do genoma).

APLICA APLICAES
- Organiza o da variabilidade gentica; - Escolha de genitores para a obteno de recombinantes nas prognies; - Mapeamento gentico; - Selecionar marcadores ligados a genes de interesse; - Seleo indireta de plantas em um estgio precoce e com reduo de custo e tempo; - Clonagem de genes de interesse agronmico.

MAPEAMENTO GEN TICO

- Estudos de importncia agronmica de caracter quantitativo e qualitativo; - QTLs rastreados e etiquetados, visando uma melhoria na eficincia da seleo de tipos;

Ferramentas da Biologia Molecular

Enzima de restrio

Ferramentas da Biologia Molecular

Enzima de restrio

Eletroforese

PCR Termociclador

Eletroforese

PCR Termociclador

DNA ligase
S CA R LA CO

DNA ligase
S CA R LA CO

CA S COLAR

CA S COLAR

A clivagem do DNA
Cortam o DNA em s tios especficos Endonucleases de restrio ou enzimas de restrio Clivam o DNA somente em determinadas seqncias de nucleotdeos, normalmente curtas, 4 8 pares de bases Cada enzima reconhece um s tio de clivagem especfico!!!
GENOMA

Enzimas de restrio
ENZIMA DE RESTRIO

fragmentos do genoma

Microrganismo
a) Clivagem no eixo de simetria b) Clivagem simtricamente situada ao redor do eixo de simetria
Escherichia coli Bacillus amyloliquefaciens H

Enzima
EcoRI BamHI BglII Hae II HindIII

Sequncia Alvo
G C A T A T T A T A C G

G C

G C

A T

T A

C G

C G

...TC GA... ...AG CT...

...GAA TTC... ...CTT AAG...

Bacillus globigii Haemophilus aegyptius Haemophilus aegyptius

A T

G C

A T

T A

C G

T A

Pu G C G C P i Py i C G C G P u

A T

A T

G C

C G

T A

T A

+
5 3 3 5

+
5 3

Providencia stuartii Streptococcus albus G Thermus aquaticus Brevibacterium albidium Haemophilus aegyptius

Pst I Sal I Taq I BalI Hae III

C G

T A

G C

C G

A T

G C

Molculas com extremidades abruptas

Molculas com extremidades coesivas

G C

T A

C G

G C

A T

C G

T A

C G

G C

A T

T A

G C

G C

C G

C G

A T

Figura 1. Dois tipos de clivagem feitas por enzimas de restri o. As setas indicam os s tios de clivagem. As linhas pontilhadas representam o centro de simet da sequncia. ria

A T

G C

G C

C G

C G

T A

Serratia marcescens

Sma I

C G

C G

C G

G C

G C

G C

Tabela 1. Algumas endonuclease de restrio: origem e stios de clivagem. A seta indica o local de clivagem. Pu e Pi referem-se, respectivamente, a qualquer purina e pirimidina.

Ferramentas da Biologia Molecular

Enzima de restrio

DNA ligase
S CA A R L CO

Eletroforese

PCR Termociclador

DNA ligase
S CA R LA CO

Liga o cDNA em vetores apropriados

CA S COLAR

Fragmento de DNA a ser clonado DNA vetor

CARTUCHO DE CLONAGEM - Polylinker

CA C O LS A R

Ligao catalisada pela DNA ligase

Ligao com vrias enzimas diferentes, vrios stios de clonagem

DNA recombinante Transformao

DNA recombinante Cromossomo bacteriano

A separao dos fragmentos da molcula de DNA em gel de eletroforese

Ferramentas da Biologia Molecular

Enzima de restrio

Eletroforese
Caractersticas do DNA
DNA ligase

PCR Termociclador

Separao por tamanho

Eletroforese (Michaelis, 1909) Gis Amido Agarose Acrilamida

Solues -tampes

CA S COLAR

S CA R LA CO

O princ p i o b sico envolvido na obteno e detec o de cada classe de marcador bioqu mico ou de DNA reside no uso de eletroforese. O termo eletroforese foi criado por Michaelis em 1909, para descrever migra o de col ides sob a influncia de um campo eltrico. Seu princ pio simples: molculas de carga negativa migram para o p lo positivo, e mol culas com carga positiva migram para o p lo negativo. A eletroforese visa separao de molculas em funo de suas cargas eltricas, de seus pesos moleculares e de suas conformaes, em suportes porosos (g is) e solu es -tampes (estabilizam o pH do meio e permitem o fluxo de corrente el trica).

+
O sentido e a velocidade de migrao determinado pelo tamanho e carga das molculas

Carregando o gel com as amostras

AGAROSE

Revelando gel de agarose em U.V. brometo de etdeo

Gel acrilamida

MARCADORES genticos? MARCAS ? GENES?

MARCADORES
Morfolgicos

Bioqumicos

DNA

RNA

Marcadores moleculares

Isoenzimas
Dcadas de 60 -70 Permitiram que muitas das dificuldades detectadas pelo uso dos marcadores morfolgicos fossem resolvidas. Scandalios (1975) - vantagens importantes sobre os marcadores morfolgicos convencionais. Shields e t al. (1983)- as prote nas so marcadores interessantes para o estudo gentico, porque elas so produto prim rio dos genes estruturais. Mudanas na seqncia de bases codificadoras, na maioria dos casos, resultaro em mudanas na estrutura primria da prote na correspondente. Kessel e Milchemore (1986) e Falco e Contel (1991) - abordam que as varia es proticas so de grande importncia nos estudos genticos como indicadores dos n veis de polimorfismo e relacionamento filogentico, bem como na identificao de ra as, espcies e popula es, representando, desse modo, uma valiosa ferramenta para estudos evolutivos e taxonmicos.

Eletroforese de isoenzimas
Isoenzimas - diferentes formas moleculares (variantes) de uma mesma enzima, apresentando funo idntica ou similar, presente num mesmo indiv duo (Markert & Moller, 1959).

6PGDH -CM

Co-dominncia

Gel de Araucaria angustifolia MANTOVANI, 2003

Natureza da variao isoenzimtica varia isoenzim As isoenzimas so diferentes firmas moleculares de uma enzima catalisando a mesma reao na clula. Quando as isoenzimas so controladas por alelos de um nico loco, elas so chamada de aloenzimas. Representam a conseqncia bioqumica da substituio, deleo ou adio de um ou mais aminocidos no polipeptdico, afetando sua carga eltrica e, conseqentemente, a sua mobilidade durante a eletroforese

Classificao das Enzimas:

o As enzimas podem ser classificadas de acordo com v rios crit rios. O mais importante foi estabelecido pela Unio Internacional de Bioqumica (IUB), e estabelece 6 classes:

1. Oxidorredutases : So enzimas que catalisam rea es de transferncia de el trons, ou seja: reaes de oxi - redu o. So as Desidrogenases e as Oxidases 2. Transferases : Enzimas que catalisam rea es de transferncia de grupamentos funcionais como grupos amina, fosfato, acil, carboxil, etc. Como exemplo temos as Quinases e as Transaminases 3. Hidrolases : Catalisam reaes de hidrlise de liga o covalente. Ex: As peptidades 4. Liases Catalisam a quebra de ligaes covalentes e a remo o de mol culas de gua, amnia e gs carbnico. As Dehidratases e as Descarboxilases so bons exemplos 5. Isomerases Catalisam reaes de interconverso entre ismeros pticos ou geomtricos. As Epimerases so exemplos. 6. Ligases Catalisam rea es de formao e novas mol culas a partir da ligao entre duas j existentes, sempre s custas de energia (ATP). So as Sintetases.

Propriedades das Enzimas: As enzimas : o So catalisadores biol gicos extremamente eficientes Aceleram em mdia 109 a 1012 vezes a velocidade da reao, transformando de 100 a 1000 molculas de substrato em produto por minuto de reao. o o o o o Atuam em concentraes muito baixas Atuam em condies suaves de temperatura e pH Possuem todas as caractersticas das prote nas Podem ter sua atividade regulada Esto quase sempre dentro da clula, e compartimentalizadas.

A estrutura quaternria ativa das isoenzimas podem ser de trs tipos:

1.- Monmeros: isoenzimas que possuem uma cadeia polipeptdica como estrutura quatern ria ativa.

2.- Dmeros: isoenzimas cuja estrutura quaternria ativa consiste na unio de dois polipeptdios.

3.- Tetrmeros: a estrutura quaternria ativa das isoenzimas constam de quatro polipeptdios.

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Depois de corrida a eletroforese, o gel tratado com o substrato especfico da enzima e uma substncia que reage com o produto da reao com a formao de uma substncia colorida. Com o emprego de gel de amido, para uma nica eletroforese podemos estudar diferentes enzimas pois esse tipo de gel permite seu fatiamento como abaixo:

A mobilidade da molcula atravs de um gel de eletroforese dependende seu peso molecular e da sua conformao. Aps a separao das isoenzimas por eletroforese, elas so identificadas por meio de rea es qumicas baseadas em suas atividades catalticas especificas.

Como as enzimas apresentam a propriedade de catalisar uma determinada reao qumica, isso propicia uma maneira de detectar a presena da prpria enzima. Na figura abaixo est esquematizado um mtodo de deteco de enzima que produz uma substncia colorida:

Fosfoglucomutase (PGM) monomrica

alelo 1

So marcadores co-dominantes, as aloenzimas permitem identificar diretamente os gentipos heterozigotos.

alelo 2 alelo 3
Resultado da presena de mais de um gene codificando cada uma das enzimas MANTOVANI, 2003 Padro isoenzim tico ou Zimograma, conjunto de bandas pertencentes ao mesmo sistema enzim tico que se observam na mesma esp cie.

Figura 1. Zimograma de PGM de couve. Incio na parte inferior, nodo no topo.1 = Ribeiro Pires 2620 com bandas na regio A e B: B, E, G, H; 2 = 1811 C, G; 3 = Roxa B, C, G, H; 4 = So Roque A, C, E, G, H; 5 = Gigante 915 C, D, F, G, H; 6 = 916 C, G, H; 7 = Cr espa Piracicaba A, E, G, H; 8 = Ribeiro Pires 2446 C, G, H; 9 = Crespa Capo Bonito C, E, G; 10 = Tupi B, G, H; 11 = Jundia C, F, I; 12 = Mococa C, E, I; 13 = So Jos C, G, H; 14 = Roxa Monte Alegre A, C, F, I; 15 = VerdeEscura A, C, E, F, -

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 Aplicaes Aplica
Cavalli-Molina (1984) destaca que numerosos estudos de locos enzimticos mostram a existncia de nveis significativos da variao gnica intra e interpopulacional em uma mesma espcie, alm de uma diferenciao considervel entre espcies no grau de heterogeneidade isoenzimtica intrapopulacional. possvel relacionar o nvel e a distribui o da variabilidade gentica com a historia natural das espcies. Influncia de caractersticas como disperso de sementes e propgulos, amplitude da distribui o geogrfica e estdio de sucesso em que a espcie se enquadra sobre a distribui o da variabilidade presente entre e dentro de populaes de plantas

Aplicaes

Anlise da variabilidade gentica

Os gis de eletroforese permite examinar vrios locos enzimaticos em uma nica corrida eletrofortica

Figura 2. Zimograma de PRX de couve. Incio na parte inferior, nodo no topo. 1 = Ribeiro Pires 2620 co m bandas na regio A: B1 Regio B com banda monom rfica ; 2 = 1811 B1; 3 = Roxa B1; 4 = So Roque A1 e B1; 5 = Gigante 915 A1; 6 = 916 B1; 7 = Crespa Piracicaba B1; 8 = Ribeiro Pires 2446 B1; 9 = Crespa Capo Bonito A1 e B1; 10 = Tupi B1; 11 = Jundia B1; 12 = Mococa B1; 13 = So Jos B1; 14 = Roxa Monte Alegre B1; 15 = Verde-Escura A1.

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Contribui Contribuio das aloenzimas :

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Sistemas de cruzamentos em plantas e seus efeitos sobre a estrutura gen tica estrutura e variabilidade em populaes popula Conseq ncias evolutivas da correla o entre alelos de diferentes locos correla (desequil (desequil brio de liga o) liga A diferencia o geogr fica de populaes dentro de esp cies diferencia popula Fatores ecol gicos que controlam o fluxo gnico dentro de populaes ecol popula Componentes da sele o natural durante o ciclo da vida da planta Rela o entre a variabilidade em aloenzimas e caracter sticas morfol gicas caracter morfol Caracteriza Caracteriza o de germoplasma Impacto da sele o e da deriva gen tica em programas de melhoramento e sele sele o Monitoramento de recursos in situ Rela es evolutivas entre esp cies, como a hibrida o, a introgresso e poliploidia Identifica o de clones e a caracteriza o de gen tipos parentais em cruzamentos

Tipos de marcadores genticos

? isoenzimas - bioqumico ? RFLP ? Minissatlites ? RAPD ? MICROSSATLITES - SSR ? AFLP ? RFLP-PCR ? cDNA+AFLP ? ESTs ? SNPs
Enzima de restrio

Ferramentas da Biologia Molecular

Radioatividade

Eletroforese

PCR Termociclador

Reao de polimerase em cadeia (PCR)

DNA ligase
S CA R LA CO

RNA
CA S COLAR

? Marcadores DNA organelas ? Marcadores especficos

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Reao de PCR

Reao de polimerase em cadeia (PCR) princ pio e aplicao da tcnica

T cnica usada para amplificar uma regio especfica de DNA em visando produzir quantidade de DNA suficiente

Como funciona MESMO?? Do que precisa???

Replicao do DNA

O que imita????

Temperatura

Amostra de DNA

100

Desnatura 94 o C

PCR

Taq DNA polimerase

50

Tempo
95 C
3 5 5 3

35 65 C

72 C

14

Temperatura

100

Desnatura 94 o C

Temperatura

PCR

100

Desnatura 94 o C

PCR
Anela Primers 50 o C Extende 72 o C

Desnatura 94 o C

50

50

Tempo
3 5 3

Tempo
5 5

Calor
5 5 3 5 3

Temperatura

100

Desnatura 94 o C

50

Anela Primers 50 o C

Extende 72 o C

Desnatura 94 o C

30x

Temperatura

PCR

100

Desnatura 94 o C

PCR
Anela Primers 50 o C Extende 72 o C

Desnatura 94 o C

30x

50

Tempo
3 5 3

Tempo
5 5 5

Calor
5 5 5 5 5

Calor
5 5 5 3 5 3

15

Temperatura

100

Desnatura 94 o C

Desnatura 94 o C

30x

Temperatura

PCR
Anela Primers 50 o C Extende 72 o C

100

Desnatura 94 o C

PCR
Anela Primers 50 o C Extende 72 o C

Desnatura 94 o C

30x

50

50

0
3 5 5

Tempo
5

Tempo
5 5 5

5 5 3 5

5 3

Calor
5 5 5 5 5

Calor
5 5 5

Temperatura

100

Desnatura 94 o C

PCR
Anela Primers 50 o C Exteno 72 o C

Denatura 94 o C

30x

DNA dobra a cada ciclo

Nmero de ciclos 2 4 8 16 32 64

50

0
3 5 5 5 3 5

Tempo
5 5

Fragmento de tamanho definido

0 Ciclos

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Constataes
Logo aps Kary Mullis ter descoberto a Polymerase Cadeia Reao (PCR) ele percebeu que primers curtos ligariam a v rios locais em um genoma e assim poderiam produzir fragmentos mltiplos Williams et al. (1990) desenvolveu Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) - uma tcnica que utiliza 10 primers de base muito curto para gerar fragmentos de DNAs
? RFLP

Tipos de marcadores genticos

? isoenzimas - bioqumico ? Minissatlites ? RAPD ? MICROSSATLITES - SSR ? AFLP ? RFLP-PCR ? cDNA+AFLP ? ESTs ? SNPs

Radioatividade

Reao de polimerase em cadeia (PCR)

Fragmentos de RAPD podem ser separados e usado como marcadores genticosou um tipo de impresso digital

RNA

? Marcadores DNA organelas ? Marcadores especficos

Extrao de DNA (Doyle e Doyle, 1987)

Sol. extratora

Quantifica o de DNA
Quantificao DNA (gel agarose 0,8%) 20 50 100

Adio de CIA
1.5
1.5

1.0 0.5

Centrifugao

1.0

0.5

Amostra

0.1

Adio de etanol

RNAse

1.5

1.0 0.5 0.1

pellet

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RAPDs
(Random Amplified Polymorphic DNA)

RAPD

DNA

A A B

?Primer se liga a muitos locais no DNA ?S quando primer locais que liga e m
direo oposta amplificao

RAPD

RAPD

DNA

DNA

> 2,000 bases

Primers encontram-se na mesma direo, amplificao NO acontecer

18

RAPD
Dominante

DNA

100 - 1,500 bases

Primers so separados em pouca distncia, fragmento AMPLIFICADO

RAPDs
5 TAGAACATAAGGCCTA ATCTTGTATTCCGGAT TAGAACATAAGGCCGG ATCTTGTATTCCGG CC GGAATGGCCATATGAT CCTTACCGGTATACTA GGAATGGCCATATGAT CCTTACCGGTATACTA

(Randomly Amplified Polymorphic DNA )

5 5

3- CCTTACCGGTATACTA -5

TAGAACATAAGGCCTA
5-TAGAACATAAGGCCTA-3

GGAATGGCCATATGAT

SIM

ATCTTGTATTCCGGAT

CCTTACCGGTATACTA

TAGAACATAAGGCCGG

GGAATGGCCATATGAT
3- CCTTACCGGTATACTA -5

NO

ATCTTGTATTCCGG CC 5-TAGAACATAAGGCCTA- 3

CCTTACCGGTATACTA

Amplificao de um segmento de DNA delimitado por dois iniciadores (ou primers, ou oligonucleotdeos), comumente com 10 pares de bases, que so complementares a dois stios de nucleotdeos, um em cada fita do DNA, posicionados inversamente a uma distncia geralmente no superior a 4kb.

19

Onde moram os marcadores???

Genoma
Genes e sequncias relacionadas DNA extragnico

DNA codificante

DNA no codificante

DNA repetitivo DNA repetitivo

RAPDs AFLPs outros

Introns Repeties e m Fragmentos de tandem genes

Repeties dispersas

Transposons Satlites Sequncias de insero Microssat lites Minissat lites

GGCTATCAAAGACCTGAAGAAGCCCAGTATAACCTTAGGAAAAGCTCCTGATTTGAATAAA GCATACAAATCAATTNTATCTGGCATGAATGCAGCCAAACTCGACCCTGATGATGTATGCT CTTATCTGGCTGCCGCGATGCAGTTCTTTGAGGGATCATGTCCTGAGGACTGGACTAGCTA TGGAATCCTGATAGCTCGGAAGGGAGACAAGATCACTCCGGATTCTCTTGTGGACATAAG ACGTACTGATGTGGAAGGGAATTGGGCTCTAACAGGGGGCATGGAGTTGACAAGGGACCC TACTGTTTCAGAGCATGCA TACTGTTTCAGAGCATGCATCTCTCTCTCTTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCGACCCTACTGTTTC CTCTCTCTCGACCCTACTGTTTC ATGTGCGCTAACTGGAGTACCATACCAAATTTCAGATTCCTGGCTGGGGCTATCAAAGACC TGAAGAAGCCCAGTATAACCTTAGGAAAAGCTCCTGATTTGAATAAAGCATACAAATCAAT TNTATCTGGCATGAATGCAGCCAAACTCGACCCTGATGATGTATGCTCTTATCTGGCTGCC CTGAGGACTG GCGATGCAGTTCTTTGAGGGATCATGTCCTGAGGACTGGACTAGCTATGGAATCCTGATA GCTCGGAAGGGAGACAAGATCACTCCGGATTCTCTTGTGGACATAAGACGTACTGATGTG CTGAGGACTG GAAGGGAATTGGGCTCTAACAGGGGGCATGGAGTTGACAAGGGACCCTACTGTTTCAGAG CATGCATCTCTGGTTGGCCTTCTCTTGAGTTTATATAGGTTGAGCAAAATCTCCGGGCAGA ATACCGGCAATTACAAGACAAACATCGCGGATACGAATAGAGCAGATTTTTGAGACAGCCC CCTTTGCAAAAATCGTAGAACATCATACTTTGATGACGACCCACAAAATGTGCGCTAACTG GAGTACCATACCAAATTTCAGATTCCTGGCTGGGGCTATCAAAGACCTGAAGAAGCCCAGT ATAACCTTAGGAAAAGCTCCTGATTTGAATAAAGCATACAAATCAATTNTATCTGGCATGA ATGCAGCCAAACTCGACCCTGATGATGTATGCTCTTATCTGGCTGCCGCGATGCAGTTCTT TGAGGGATCATGTC CTGAACTGTAGACTAGCTATGGAATCCTGATAGCTCGGAAGGGAGA CTGAGGACTG CAAGATCACTCCGGATTCTCTTGTGGACATAAGACGTACTGATGTGGAAGGGAATTGGGCT CTAACAGGGGGCATGGAGTTGACAAGGGACCCTACTGTTTCAGAGCATGCATCTCTGGTT GGCCTTCTCTTGAGTTTATATAGGTTGAGCAAAATCTCCGGGCAGAATACCGGCAATTACA AGACAAACATCGCGGATACGAATAGAGCAGATTTTTGAGACAGCCCCCTTTGCAAAAATCG TAGAACATCATACTTTGATGACGACCCACAAAATGTGCGCTAACTGGAGTACCATACCAA A

Consistem de pequenas seqncias (sequence motif) com 1 a 4 nucleotdeos de comprimento, repetidas em tandem.
Mononucleotdeos TGCATTG AAAAAAAAAAAAAAA CTGGATC Dinucleotdeos Trinucleotdeos TGCATTGT ATAT ATATAT ATATA CTGGATC TGCATTGT GATGATGAT GAT GACTGGATC

Tetranucleotdeos TGCATTGT GA CTGACT GA CTGACCTGGATC

20

Deteco de locos SSR

3
CACACACACA GTGTGTGTGT CACACACACA GTGTGTGTGT

Na recombina o dos alelos

CACACACACA GTGT Taq GTGTGTGTGT CACACACACA GTGTGTGTGT CACACACACA GTGTGTGTGT CACACA GTGTGT 5 3 5 3 5 3 5 3

CACACA
(CA)5 (CA)5

GTGTGT CACACACACA GTGTGTGTGT

(CA)3 (CA)5

CACACA GTGTGT CACACA GTGTGT

iniciador reverse iniciador forward

(CA)3 (CA)3

5 3 5 3 5 3 5

P1

Amostra 1

Amostra 2

Amostra 3
F1

P1

F1

P2

P2

3 5

CACACA GTGTGT

5 3

Caractersticas
M

homozigoto

Marcador co-dominante

heterozigoto

Marcador multiallico

21

MICROSSATLITES
SSR Simple Sequence Repeats Pequenas sequncias (sequence motif) com 1 a 4 nucleotdeos repetidos em tandem - Amplificados via PCR Classe de marcadores moleculares mais polim rficos Sinonimias SSR ( Simple Sequence Repeats); Repeats); STMS ( Sequence Tagged Microsatellites); Microsatellites); SSLP ( Single Sequence Length Polymorphisms); Polymorphisms);
Onde so encontrados ?? ?
Mamferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma) Plantas: (AT)n Mitocndrias

Microsatlites

Aplicaes dos Microssatlites

Genetic Characterization of Active Bank of Germoplasm of Pineapple Guava (Acca Sellowiana) by transfer of markers Microsatellites of Eucalyptus spp Karine Louise dos Santos1, Leocir Jos Welter1, Adriana Cibele de Mesquita Dantas1, Jean Pierre Ducroquet2 , Rubens Onofre Nodari1
1 Laboratrio

de Fisiologia do Desenvolvimento e Gentica Vegetal, CCA/UFSC, Florian polis, SC, Brasil Esta o Experimental de So Joaquim, Epagri, So Joaquim, SC, Brasil
2

Como os microsatlites so formados ?

Replicao
Fita nascente Fita molde Slippage

Modelos para explicar os processos mutacionais envolvidos na formao das repeties Escorreges da DNA polimerase Crossing over desigual

Misalignment

+1 repeat

-1 repeat

22

SEQUENCIAMENTO Se voc escolheu os microssatlites como marcador molecular para o seu estudo a primeira coisa a fazer verificar se j existem microsatlites para a sua espcie no GenBank. Se no, existem voc ter que desenvolve-los !
animao

Microsatlites em sequncias

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Zabeau (1993), Vos et al. (1995) O ensaio combina a especificidade, resolu o e poder de amostragem da digesto de enzimas de restrio com a velocidade e praticidade de deteco do polimorfismo via PCR Co-amplificao especfica de um grande nmero de fragmentos de restrio Tipicamente 40-100 fragmentos so amplificados e detectados em gel de poliacrilamida Esta caracter stica tambm chamada de ndice de multiplex do ensaio AFLP

23

5------GAATTC --------TTAA-----3 3------CTTAAG---------AATT -----5 EcoR I Digesto do DNA Mse I

5------GAATTC --------TTAA-----3 3------CTTAAG---------AATT -----5

AATTC --------T Liga Ligao de adaptadores

EcoR I adaptador

G---------AAT TTAA TA
Mse I adaptador

AATTC --------TTA TTAAG---------AAT Pr Pr - amplifica o

EcoR I primer E- A

AATTCA --------GTTA TTAA GT---------CAAT

Mse I primer M - C

Amplifica o
EcoR I primer E- ACA

AATTCAACA -----------GTGGTTA TTAA GTTGT------------CACCAAT

Mse I primer M - CAC

AFLP
Vantagem indiscutivel -Grande nmero de fragmentos -Nmero de marcadores simultneos analisados -Facilidade e rapidez com que realizado, -Alta resolu o e repetitivo

Desvantagem -Discriminar o heterozigoto dos homozigotos. (mas com exce o!)

24

Prote nas Atributos Isoenzimas de sementes RFLPs Nvel de baixo alto baixoalto Polimorfismo Estabilidade moderada alta alta ambiental Nmero de locos moderado (<50) baixo (<10) alto Expresso gentica co-dominate co -dominante co-dominante Nmero de alelos por 2-5 multiallico multiallico loco Distribuio no regies de cpia regies de cpia vrias genoma nica nica Acessibilidade muito alta muito alta mdia tecnolgica Aplicabilidade no rpido, rpido, lento, mel oramento h baixo custo baixo custo custo mdio Identificao de baixa gentipos Avalia o de mdia germoplasma Mapeamento baixa gentico Mapeamento de baixa regies espec ficas Mapeamento baixa comparativo Gentica de baixa Autgamas Gentica de mdia Algamas Anlise Filogentica mdia Adaptado de Gepts (1993) e Ferreira & baixa baixa muito baixa inadequado inadequado baixa baixa alta alta alta mdia muito alta mdia mdia

RAPDs baixo -alto alta alto dominante 2 ao acaso muito alta rpido, baixo custo muito alta alta media alta baixa alta alta mdia

Microssatlites muito alto alta alto co -dominante multiallico ao acaso muito baixa

AFLPs muito alto alta alto dominante 2 ao acaso mdia

Marcadores dominantes

lento, custo alto rpido, custo baixo muito alta alta muito alta mdia alta muito alta muito alta alta muito alta muito alta alta muito alta baixa muito alta muito alta mdia A1 A1 A1 A2 A2 A2

baixa muito alta Grattapaglia (1995).

Marcadores dominantes

Marcadores co-dominantes

01

02

03 04

05

06

07

08

09

10

Ind. 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10

L1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0

L2 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1

L3 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0

L4 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1

L5 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1

L6 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0

L7 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

L8 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 A 1A 1 A 1A 2 A 2A 2

L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8

25

O problema da dominncia

Marcadores co-dominantes

01

02

03

01

02

03

Ind. 01 02

L1 1/3 3/4 2/3 3/3 1/3 1/1 1/3 1/4 3/3 1/2

1 2
1/1 1/2 2/2

01

02

03 04

05

06

07

08 09

10

1/?

1/? 2/2

2 3 4

03 04 05 06 07 08 09 10

OQUE IMPORTANTE?

Combinar todos marcadores

840 marcadores: 475 AFLPs 235 RAPDs 129 SSRs

QUAIS AS MONOMRFICAS? QUAIS AS POLIMRFICAS?

QUAIS AS SEGREGANTES?

26

SCARs (Sequence characterized amplified RAPD) Desenvolvimento de um SCAR

1) identificao de um iniciador que confere polimorfismo a dois bulks de DNA com fentipos contrastantes, 2) o isolamento e a clonagem do fragmento amplificado em um vetor (plasmideo), 3) sequenciamento do fragmento isolado, 4) desenho dos iniciadores de tamanho maior que os decmeros 5) teste final (Paran e Michelmore, 1993).

Seleo de indivduos F expressando 1 o carater de resistncia

Seleo de indivduos F expressando 1 o carater de suscetibilidade

Extrao de DNA
Mistura equitativa de DNA

Extrao de DNA
Mistura equitativa de DNA

Bulk resistentes
Padro de banda dos Bulks 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Bulk suscet veis

P1 (Resistente)

P2 (Suscet vel)

DNA de indivduos da DNA de indivduos da populao que so resistentes populao que so suscet eis v (todos possuem a banda 3) (nenhum possui a banda)

An lise de RAPD dos indivduos e confirmao entre o marcador detectado nos bulks e a expresso do carater

Marcas segregantes
Prognie F1 (Santa Rosa x Chatard)
SCM

27

PCR-RFLP
gene DNA cromossmico

Alelo S-Rnases marcador especfico

Restrio com endonuclease (1 ou mais)

Separao por eletroforese

animao

Anlise das marcas especficas

Auto-incompatibilidade Gametoftica

Superfcie estigmtica

Estilete

CELSO L.DE ALBUQUERQUE JUNIOR(2004)

28

Compatibilidade Gametoftica

CELSO L.DE ALBUQUERQUE JUNIOR(2004)

RGAs (Resistance gene homologues)

N-terminal P- loop RNBS-A No TIR RNBS-A TIR Kinase -2 W/D GLPL RNBS-D No TIR C-terminal RNBS-D TIR

Motivos exclusivos TIR Motivos exclusivos no TIR Motivos TIR e no TIR

Primers Sense 39F1 P1a P3a LM638 1F P1c 3F2 2F OLE 1121 Primers antisense P1b P3d RNBS D 1R1 P3b 13R1 11R1 OLE 122 Motivos P-loop (n -terminal): P-Loop GLPL P-loop P-loop -GKTT P-loop -GKTT non TIR Arabidopsis kinase nbs-2 P-loop Motivos P-loop GLPL Sequencia 5- 3 TCATCAAGGACGAGCTGARWBNATGMA GGIATGCCIGGIIIIGGIAARACIAC AIITYIRIIR YIAGIGGYAA ICC GGI GGI GTI GGI AAI ACI AC GGCGGGGTGGGCAARACNACNHT GGICGICCIGGIIIIGGIAARACIA C GAGGTACTTCCTGGTGCTGGAYGAYRTBTG AACGGCTGCAGGATCATGRTBACHACHMG GGWATGGEGGWRTHGGWAARACHAC Sequencia 5- 3 GGIATGGGIGGIIIIGGIAARACIAC AIITYIRIIR YYAAIGGIAG ICC GGR AAI ARI SHR CAR TAI VIR AAR C CGTGCTGGGCCAGGGTNGTYTTNCC AIITYIRIIRYIAGIGGIAGICC CGGCCAAGTCGTGCAYVAKRTCRTGCA TCAGCTTGCCGATCCACTYDGGSAGBYT ARNWYYTTVARDGCVARWGGVARWCC

P-loop GLPL non TIR Arabidopsis GLPL C-terminal GLPl C-terminal GLPLAL

29

RGAs polimrficos

Sequenciamento e alinhamento dos motifs

39F1/1R1 F G Br Bs A

2F/13R1 F G Br Bs A

Aplicaes

30

Genes diferencialmente expressos

Genes exclusivos de uma forma

Por que?

Biblioteca de fruto resistente

Biblioteca de frruto suscetvel

Determinao da funo de um gene Caracterizao de um estdio de desenvolvimento ou fisiolgico Caracterizao de elementos regulatrios

Genes comuns

Determinando o perfil de expresso gnica e identificando genes diferencialmente expressos

Tcnicas disponveis
Seleo diferencial e hibridizao subtrativa (Sambrook et al., 1989) cDNA -AFLP
(Bachem et al.,1996)

ESTs (Expression Sequences Tags)

cDNA
AAAAAAAAA

Differential Display Reverse Transcription PCR - (DDRT-PCR)

(Liang and Pardee., 1992)

Extrao RNAm + Oligo (dT)

RT

TTTTTTTTT

PCR Clonagem

RFLP-coupled differential display (RC4D)

(Fischer et al., 1995)

Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) (Velculescu et al., 1995) Macroarrays

(Chen et al., 1998)

Seqenciamento

Microarrays (Schena et al., 1995)

31

Construo de bibliotecas Subtrativas

cDNA testercom adaptador 1 R cDNA Driver (em excesso) cDNAtester comadaptador2R

Tester RNA tecido A

Driver RNA tecido B

1 Hibridizao

Clone
cDNA

Sequenciamento

a b c d

RNA mensageiro

Digesto com Dpn II

2 Hibridizao: mistura de amostras, adio de Driver desnaturadoanelamento e a, b, c, d + e Preenchimento dos terminais

C5 C5 F6 C8 C9 D8 G8 E10

A10 A10 B10 C10 D10 E10 F10 H10

cDNA

Ligao ao oligoA

Ligao aooligoB

Digesto comRsaI

a b

Hibridizao com excesso deDriver PCR com a utilizao de iniciadores complementares ao oligo A
Adio de primers Amplificao por PCR

Ligao dos adaptadores

d e

Subtrao

Sequences producing significant alignments: hypothetical protein [Erwinia amylovora]. putative reverse transcriptase [Cicer arietinum] formate dehydrogenase beta-subunit [Methanococcus voltae].. Catalase class III chitinase [Sphenostylis stenocarpa]. Catalase Structural Analysis Of The Spiroplasma Virus IntI [Citrobacter freundii]
(a)

e value 3e-13 3e 1e
-10 -13

8e-06 7e -11 3e-40 3e-13 2e

(b)

-11

Amplificao seletiva dos cDNAs derivados do Tester

a e d - nenhuma amplificao b- b - nenhuma amplificao
5 e 3 3 5

c e

- amplificao linear -amplificao exponencial

Clonagem em vetores e montagem da biblioteca

Estacas enraizadas dos porta -enxertos: (a) Marubakaido (tolerante) e (b) M9 (sensvel) em Al3 +

cDNA-AFLP

cDNA-AFLP
Vantagens: Alta reprodutibilidade; Poucos falso positivos; Necessita de pequenas quantidades iniciais de RNA. Desvantagens: O cDNA precisa conter o stio de restrio da enzima utilizada.

32

DDRT-PCR
(Differential Display Reverse Transcription PCR)

SNPs

I.G. Gut, Automation in genotyping single nucleotide polymorphisms . Hum. Mutat. 17 (2001) 475 492.

(Single nucleotide polymorphisms)

Polimorfismo de um nico nucleotdeo
5 leader Coding sequence (exons) 3 end Poly-A

SNPs -

Princpio

detectar a variao de seqncia na janela de um alinhamento de ESTs de um mesmo gene, parcialmente sobrepostas

Seqnciamento 3 Seqnciamento 5

Variaes mais frequentes no genoma: 1 substitui o a cada 31 pb no codificadora e a cada 124 pb em regies codificadoras

33

Deteco e validao de SNPs

Princpio da genotipagem

SNP site 1. PCR amplifica o TTACGCATAACCTATCGAATTCCATCGCATCGA C

2. Restri o do produto PCR com a enzima adequada(ex: EcoRI , GAATTC) Se A est presente ocorre a restri o TAACCTATC GAATTCCATCG Se C est presente, no ocorre a restri o TAACCTATC GACTTCCATCG

Identificao Molecular

Anlise Molecular de OGMs

Anlise de DNA - PCR - Southern Blot - Real Time PCR - Arranjos Anlise de Protena Baseadas em imunologia - ELISA - Western blot - Proteoma

34

Southern Blot
Membrana de Nylon Gel Esponja Papel para Absoro

Anlise Molecular

1. Digesto do DNA com enzimas de restri o 2. Eletroforese DNA em Gel de Agarose

Retirada da membrana com o DNA

Soluo de transferncia

Southern blot

3. Transferncia do DNA para a membrana de nylon (Blotting )

Retirada das hibridizaes Hibridizao da membrana com sonda radioativa no especficas

PCR
Digesto com EcoRI e hibrida o com sonda especfica para sarcotoxin IA

4. Hibridizao da membrana com a sonda espec fica

5. Revelao do autoradiograma

Anlise da Expresso de Genes

Western blot Real Time PCR

Anlise do fentipo
Sintoma aos 25 dias ap s inoculao (104 CFU/ml)

Controle

stx-5

Resultados aps amplificao

35

Arranjos de DNA
Aumento do nmero de genes

chips de DNA
diferentes seqncias para detectar genes expressos ou introduzidos em plantas

Proteoma
Levantamento quantitativo de prote nas/pept deos em uma amostra para identificar mudanas de interesse Proteoma
Protenas e pept deos Dinmico Clulas e tecido especficos

Genoma
DNA Esttico Orgo especfico

36

Separa Separao e preparo de amostra

Digesto - tripsina

Peptdeo Separao

37