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Examen cytochimique et bactriologique dun liquide cphalo-rachidien (LCR)


Plan du chapitre

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2 Les objectifs
* Ensemencer systmatiquement durgence les milieux de culture permettant la croissance des bactries les plus souvent responsables de mningites. Mningites communautaires Adultes et enfants > 5 ans - S. pneumoniae - N. meningitidis - Listeria monocytogenes Nourrissons et enfant < 5 ans - S. pneumoniae - N. meningitidis - H. influenzae Nouveau-n - Streptococcus agalactiae - Escherichia coli - Listeria monocytogenes Mningites neuro-chirurgicales - Staphylococcus aureus ou epidermidis - Streptococcus pneumoniae - Enterobacteriaceae - Pseudomonas et apparents * Classer le LCR en fonction de la cytochimie. Cela permet de reconnatre les catgories suivantes : LCR normal, purulent, lymphocytaire, panach, hmorragique et dorienter vers une tiologie bactrienne ou virale. Pour cela, procder lexamen macroscopique, cytologique et biochimique du LCR. Il est noter que la formule leucocytaire est irralisable en dessous de 10 lments cellulaires par mm3 et difficilement ralisable en dessous de 20. LCR normal - Aspect macroscopique : eau de roche - Moins de 5 lments/mm 3 - Protinorachie et glycorachie normales. La protinorachie est normalement infrieure 0,4 g/l. La glycorachie est normalement suprieure 60 % de la glycmie. Le dosage de la chlorurorachie, peu informatif, tend tre abandonn.

1 Contextes 2 Objectifs
1-Ensemencer durgence systmatiquement 2- Classer le LCR en fonction de la cytochimie 3-Donner une orientation tiologique rapide 4-Ensemencer les milieux de cultures complmentaires 5-Interprter les rsultats de culture 6- Raliser dans un second temps certains examens complmentaires

3 Mthodes microbiologiques
1- Le prlvement 2- Ralisation des cultures 3- Examen cytologique 4- Identification et tude de la sensibilit

1 Les contextes conduisant lexamen dun LCR


En raison de limportance de la prcocit du diagnostic et du traitement dune mningite aigu, toute suspicion de mningite doit faire procder sans dlai lexamen du LCR. Lexamen cytochimique du LCR permet de reconnatre ou de suspecter une tiologie bactrienne justifiant un traitement antibiotique immdiat. Schmatiquement, les mningites peuvent tre classes en mningites communautaires et en mningites nosocomiales. Au cours des mningites communautaires, la frquence respective des diffrentes espces bactriennes est fonction de lge. Trois tranches d'ge sont distinguer : Adultes et enfants de plus de 5 ans Nourrissons et enfants de moins de 5 ans Nouveau-ns Les mningites nosocomiales peuvent survenir chez des malades immunodprims ou des malades de neurochirurgie et tre en relation avec un traumatisme ou un acte technique. Lexamen dun LCR en relation avec une maladie neurologique inflammatoire ou une hmopathie ne sera pas envisag.

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NB : chez le nouveau-n : 10 30 lments / mm3 (50 % de polynuclaires neutrophiles). LCR purulent Laspect macroscopique du LCR peut orienter demble vers une mningite purulente lorsque le liquide est trouble ; ce caractre apparat partir de 200 globules blancs par mm3. - Plus de 10 lments/mm3 dont plus de 50 % de polynuclaires. - Protinorachie > 0,40 g/l. - Hypoglycorachie < 40 % de la glycmie. La mningite est considrer comme bactrienne. LCR lymphocytaire - Plus de 10 lments/mm3 dont plus de 50 % de lymphocytes. - Protinorachie suprieure 0,4 g/l. - Si hypoglycorachie < 40 % de la glycmie : tiologie bactrienne probable (Listeria, BK accompagn d'une hypochlorurorachie). - Si normoglycorachie > 50 % de la glycmie et moins de 100 lments/mm3 : tiologie virale probable. LCR panach - Plus de 10 lments/mm 3 ; galit polynuclaires/lymphocytes. - Protinorachie et glycorachie normales. Ce peut tre : une listriose, une mningite purulente ou une mningite lymphocytaire au dbut, un abcs crbral. LCR hmorragique La contamination du LCR par des globules rouges fait discuter un traumatisme lors de la ponction lombaire ou une hmorragie sousarachnodienne (associe une pliocytose et parfois une hypoglycorachie). La protinorachie devient alors difficilement interprtable puisque la prsence de 1000 globules rouges augmente la protinorachie de 0,1 g/l. Une diminution progressive des globules rouges constate sur un compte squentiel des cellules dans 3 tubes de LCR est en faveur dun traumatisme vasculaire lors du prlvement.

* Donner une orientation tiologique rapide. Elle est en fonction de la morphologie des microorganismes mis en vidence par lexamen microscopique aprs coloration de Gram et ventuellement la dtection dantignes solubles. Selon les auteurs, entre 60 et 90 % des examens directs sont positifs au Gram en labsence de traitement antibiotique pralable. Du fait de la plus grande densit bactrienne, le pourcentage dexamens directs positifs au Gram serait plus important pour S. pneumoniae et H. influenzae, plus faible pour N. meningitidis, et surtout pour L. monocytogenes. Lexamen direct permet de prciser la prsence ou labsence de bactries, leur aspect (cocci ou bacilles, Gram positif ou ngatif), la prsence ventuelle dune capsule, la situation intra ou extra leucocytaire. Nanmoins, cette caractrisation peut savrer difficile, soit du fait du faible nombre de bactries, soit en raison de leur aspect polymorphe. Devant ces situations, il peut tre utile pour confirmer lorientation diagnostique obtenue par examen microscopique et coloration de Gram dun LCR pathologique, de rechercher des antignes solubles dans le LCR. La technique dagglutination de particules de latex sensibilises est gnralement utilise. Les antignes recherchs sont choisis en fonction de lorientation diagnostique. Mningite communautaire de ladulte ou de lenfant - Cocci Gram positif : S. pneumoniae - Bacilles Gram ngatif : H. influenzae - Cocci Gram ngatif : N. meningitidis Mningite du nouveau-n - Cocci Gram positif : S. agalactiae - Bacilles Gram ngatif : E. coli K1 Mningite lymphocytaire de limmunodprim (SIDA) - Cryptococcus neoformans Les rsultats de ces examens microscopiques, biochimiques et ventuellement la dtection dantignes solubles sont transmis immdiatement au clinicien. Lobservation de bactries aprs coloration de Gram permet de raliser directement un antibiogramme partir du LCR sil est en quantit suffisante. Ces rsultats obtenus en 18 h seront ensuite confirms par un antibiogramme selon la mthode classique.

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* Ensemencer les milieux de cultures complmentaires appropris. Un LCR lymphocytaire (cellularit modre de 10 500 lments/mm3) avec hyperprotinorachie, hypoglycorachie et hypochlorurachie doit faire voquer une mningite tuberculeuse. Il convient : - de rechercher des BAAR par examen microscopique (recherche pratiquement toujours ngative) - densemencer les milieux de culture permettant la croissance de M. tuberculosis - ventuellement de mettre en uvre une technique damplification gnique. * Interprter les rsultats des cultures. Dans le cas dun LCR hypercellulaire avec majorit de polynuclaires, la croissance dune bactrie pathogne sur les milieux de cultures vient tayer le diagnostic. Mais la culture peut rester ngative. On parle alors de mningite purulente aseptique. Il peut sagir : - dune mningite bactrienne dcapite par un traitement antibiotique pralable - dune mningite due une bactrie fragile ou difficile mettre en vidence. Dans le cas dune cytologie et dune biochimie normales, la prsence de quelques colonies isoles de cocci Gram positif suggre fortement une contamination du LCR au moment du prlvement. Nanmoins, les colonies seront identifies mais leur faible nombre signal. Linterprtation des rsultats tiendra compte de la prsence ventuelle dun shunt de drivation du LCR favorisant linfection par des bactries opportunistes, y compris anarobies (Propionibacterium ). * Raliser dans un second temps ou sur indications cliniques certains examens complmentaires - La recherche damibes libres (Naegleria fowleri) se fait en microscopie contraste de phase ou aprs coloration de Giemsa. - Lexamen ltat frais lencre de Chine permet la mise en vidence de la capsule de Cryptococcus neoformans. - Dtection par amplification gnique de bactries croissance lente ou difficile : M. tuberculosis, Leptospira, Borrelia. Le LCR est adresser directement du lit du malade au laboratoire de microbiologie.

Lexamen virologique du LCR est moins sensible que lexamen virologique du sang, de la gorge ou des selles. Ltude des lactates et des diffrentes activits enzymatiques du LCR ne sont pas des examens usuels.

3 Mthodes microbiologiques
1- Le prlvement

La ponction lombaire est ralise avec une asepsie rigoureuse. La quantit moyenne de LCR suffisante pour la majorit des examens raliser est de 3 ml, recueillie dans 3 tubes striles numrots 1, 2, 3 servant respectivement lexamen biochimique, microbiologique et cytologique. Lacheminement du LCR vers le laboratoire doit se faire sans dlai (moins de 30 minutes) en raison de la lyse rapide des polynuclaires (jusqu 50 % en 2 heures), et labri du froid en raison de la fragilit de certaines bactries, notamment les mningocoques. Un minimum de renseignements cliniques, (en particulier lge, la prsomption diagnostique, les traitements antibiotiques antrieurement reus par le malade), doit tre transmis au laboratoire.
2- Ralisation des cultures

Cest le premier temps, systmatique pour tout LCR. Dans tous les cas sont ensemencs des milieux permettant la croissance des bactries exigeantes responsables de mningites purulentes. A titre indicatif : Glose au sang cuit, supplmente en facteurs de croissance, incube 37C sous une atmosphre de 5 10 % de CO2. Glose au sang, incube 37C sous une atmosphre de 5 10 % de CO2. Un milieu pour anarobies incub 37C en anarobiose. Un bouillon lextrait globulaire (facultatif) permet de diluer les antibiotiques ventuellement prsents dans le LCR. Ces milieux sont observs aprs 18 h et 48 h dincubation 37C et conservs 5 jours. Selon les circonstances des milieux additionnels sont ensemencs : Mningite lymphocytaire chez un immunodprim (SIDA) - Glose de Sabouraud sans actidione Mningite lymphocytaire, hypoglycorachie, et suspicion de tuberculose

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Milieu de Lwenstein-Jensen (3 tubes ensemencs richement si possible) ou autre milieu spcifique.

3- Examen cytologique

S. pneumoniae Dtecter la rsistance aux btalactamines laide dun disque doxacilline et dtermination de la CMI de la pnicilline G, de lamoxicilline et du cfotaxime ou ceftriaxone.

Le LCR est utilis directement pour lanalyse biochimique et la numration des lments. La numration des lments est effectue dans une cellule de Nageotte ou une cellule de Malassez. Ltablissement de la formule leucocytaire (non ralisable si moins de 10 lments/mm3) sera effectu aprs centrifugation dans des tubes coniques striles, (ou mieux, aprs cyto-centrifugation) et aprs coloration de May-Grnwald-Giemsa ou osine-bleu de mthylne. La coloration de Gram, tape essentielle et rapide, est ralise sur une prparation obtenue de prfrence par cytocentrifugation. Celle-ci augmente les performances de lexamen. Ces performances dpendent de la densit bactrienne, elle-mme variable selon lespce en cause, la dure dvolution de la mningite, lexistence dune antibiothrapie pralable. Lexamen ltat frais en prsence dencre de chine permet de mettre en vidence de micro-organismes capsuls (pneumocoque, cryptocoque).
4- Identification et tude de la sensibilit aux antibiotiques

Bibliographie Confrence de consensus en thrapeutique antiinfectieuse les mningites purulentes communautaires . Saint-Etienne, 7 fvrier 1996, Md. Mal. Infect., 1996, N spcial : 944-1124. GRAY, L.D., FEDORKO, D.P. Laboratory diagnosis of bacterial meningitis. Clin. Microbiol. Rev., 1992, 5 : 130-145. LAMBERT-ZECHOVSKY, N., BINGEN, E. Epidmiologie et bactriologie des mningites bactriennes nonatales. Rev. Fr. Lab., 1991, 220 : 21-27. MEREDITH, F.T., PHILLIPS, H.K., RELLER, L.B. Clinical utility of broth cultures of cerebrospinal fluid from patients at risk for shunt infections. J. Clin. Microbiol., 1997, 35 : 3109-3111. PERKINS, M..D., MIRRETT, S., RELLER, L.B. Rapid bacterial antigen detection is not clinically useful. J. Clin. Microbiol., 1996, 33 : 1486-1491.

Lexamen des colonies, le Gram, loxydase et la catalase permettent de prciser lorientation diagnostique qui dtermine le choix de la galerie didentification ensemencer, les choix des techniques dtude de la sensibilit aux antibiotiques et les mthodes de typage mettre en uvre. H. influenzae Rechercher une btalactamase N. meningitidis - Rechercher une btalactamase (exceptionnelle) - Rechercher une sensibilit diminue la pnicilline G par mesure du diamtre dinhibition obtenu avec un disque doxacilline et dtermination de la CMI. - Procder au groupage antignique - Adresser la souche au centre de rfrence

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