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Transfusion Clinique et Biologique 16 (2009) 159163

Prsentation en symposium

Gnotypage des systmes de groupe sanguin dintrt transfusionnel au CNRGS. I : les systmes FY, JK, MNS
Genotyping of blood group systems at the CNRGS. I: FY, JK, MNS systems B.N. Pham *, T. Peyrard, M. Ripaux, S. Bourgouin, S. Martin-Blanc, P.-Y. Le Pennec, P. Rouger
Centre national de rfrence pour les groupes sanguins (CNRGS), Institut national de la transfusion sanguine, 20, rue Bouvier, BP 79, 75522 Paris cedex 11, France Disponible sur Internet le 21 avril 2009

Rsum But de ltude. La dtermination des antignes rythrocytaires dduite de lanalyse des systmes de groupe sanguin par des techniques de biologie molculaire (gnotypage) est devenue en quelques annes un outil indispensable dans les laboratoires dimmunohmatologie spcialiss. Le Centre national de rfrence pour les groupes sanguins (CNRGS) ralise en routine le gnotypage des systmes FY, JK et MNS (gnotypage courant), donnant un phnotype dduit pour les antignes FY1, FY2, JK1, JK2, MNS3 et MNS4. Patients et mthodes. Nous avons ralis une tude des prescriptions de gnotypage courant parvenues au CNRGS au cours des trois annes prcdentes. Rsultats. Entre fvrier 2006 et fvrier 2009, le CNRGS a effectu 2392 gnotypages, dont 981 gnotypages courants. Lanalyse ralise sur les 172 gnotypages courants effectus en 2008 a montr que les prlvements parvenaient avec une demande explicite de gnotypage dans 63,9 % des cas. Sur ces demandes, 42,7 % taient des demandes isoles de gnotypage, tandis que 57,2 % taient des demandes didentication danticorps anti-rythrocytaires et de gnotypage. Toutes les demandes se sont rvles tre conformes aux indications de gnotypage donnes par les recommandations professionnelles, sans prescription abusive, savoir contexte transfusionnel dans 63,6 % des cas ou positivit dun test direct lantiglobuline dans 24,5 % des cas. Enn, 36 % des prlvements parvenus au CNRGS ne demandaient pas explicitement la ralisation dun gnotypage, cependant effectu par le CNRGS dans le cadre dun bilan immunohmatologique (identication des anticorps anti-rythrocytaires). Conclusion. Si lintrt du gnotypage nest plus dmontrer, sa place exacte dans les laboratoires dimmunohmatologie spcialiss reste encore dterminer. Lutilisation des techniques de gnotypage haut dbit devrait ouvrir de nouvelles perspectives. # 2009 Elsevier Masson SAS. Tous droits rservs.
Mots cls : Gnotypage ; SNP ; Systmes de groupe sanguin ; FY ; JK ; MNS ; Transfusion

Abstract Aim of the study. Determination of blood group antigens from data obtained by using molecular methods (genotyping) has become an indispensable tool in the specialized immunohematology laboratories. The French National Reference Centre for Blood group typing (CNRGS) routinely performs genotyping of the FY, JK and MNS system (common genotyping), providing a phenotype deduced from genotyping data for FY1, FY2, JK1, JK2, MNS3 and MNS4 antigens. Patients and methods. We performed a study to evaluate the common genotyping prescriptions referred to the CNRGS over the last three years. Results. Between February 2006 and February 2009, the CNRGS performed 2392 genotyping, including 981 common genotyping. Analysis of 172 common genotyping performed in 2008 showed that 63.8% of the prescriptions expressed a genotyping demand. Of the latter, 42.7% were genotyping prescriptions only, whereas 57.2% were prescriptions of genotyping associated with alloantibody identication. All prescriptions refer to blood group genotyping indications issued from guidelines, with no incorrect prescription, that are patients transfused within four months before blood sampling in 63.6% of cases or a positive direct antiglobulin test in 24.5% of cases. Lastly, 36% of the blood samples referred to the CNRGS

* Auteur correspondant. Adresse e-mail : bnpham@ints.fr (B.N. Pham). 1246-7820/$ see front matter # 2009 Elsevier Masson SAS. Tous droits rservs. doi:10.1016/j.tracli.2009.03.014

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had no genotyping prescription. Yet, common genotyping was performed by the CNRGS to get complete immunohematology data for antibody identication. Conclusion. Usefulness of blood group genotyping in specialized immunohematology laboratories is obvious. However, the strategy for implementation of molecular methods remains to be dened. Use of high-throughput DNA analysis should change our way of working. # 2009 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
Keywords: Genotyping; SNP; Blood group systems; FY; JK; MNS; Transfusion

1. Introduction Limplantation des techniques de biologie molculaire dans les laboratoires dimmunohmatologie spcialiss a permis de raliser une avance majeure dans le domaine au cours des vingt dernires annes. Classiquement, le typage des systmes de groupes sanguins fait appel des techniques srologiques bases sur lhmagglutination. Ltude de lexpression des antignes rythrocytaires par ces techniques est appele phnotypage rythrocytaire. Simple et peu coteux, le phnotypage rythrocytaire reste au jour daujourdhui un gold standard de limmunohmatologie. Cependant, les limites de son utilisation sont atteintes en cas de ractifs indisponibles, de positivit du test direct lantiglobuline ou dantcdents transfusionnels (transfusion de globules rouges dans les quatre mois ayant prcd le prlvement). La dtermination des antignes rythrocytaires dduite de lanalyse des systmes de groupe sanguin par des techniques de biologie molculaire (gnotypage) montre alors tout son intrt. Le principal mcanisme gntique impliqu dans la plupart des polymorphismes de groupe sanguin est le polymorphisme li un seul nuclotide ou SNP pour single-nucleotide polymorphism. Cest un type de polymorphisme de lADN dans lequel deux chromosomes diffrent sur un segment donn par une seule paire de bases. La mise en vidence de ces SNP peut faire appel diffrentes techniques. Le polymorphisme de longueur de fragment de restriction-raction en chane par polymrase (PCR-RFLP) et la PCR spcique dallle ont t les premires utilises. Dans la PCR-RFLP, le SNP touche une base nuclotidique, modiant alors un site denzyme de restriction (apparition dun nouveau site ou disparition dun site qui existait dans la forme sauvage). La PCR spcique dallle permet quant elle de discriminer deux allles qui diffrent lun de lautre par un polymorphisme simple [1]. La PCR spcique dallle repose sur la capacit dune enzyme, la Taq polymrase, dapparier correctement une amorce spcique dun allle en 3 et de lamplier. Sur le plan technique, il est donc ncessaire davoir deux couples damorces, chaque couple damorces tant constitu dune amorce spcique dun des polymorphismes et dune amorce commune. Ltude des produits de PCR peut se faire classiquement par lectrophorse sur gel dagarose. Actuellement, la dtection des amplicons gnrs durant la raction de PCR a de plus en plus recours la technologie de PCR en temps rel [2]. La PCR en temps rel est une technique en systme clos reposant sur la visualisation de la phase exponentielle de la raction de PCR grce un uorochrome spcique de lADN ou une sonde oligonuclotidique uorescente spcique dune squence.

Depuis plusieurs annes, le Centre national de rfrence pour les groupes sanguins (CNRGS) utilise diffrentes techniques de biologie molculaire (PCR spcique dallle, PCR-RFLP, PCR en temps rel, squenage, etc.) pour gnotyper les systmes de groupe sanguin dintrt transfusionnel, savoir les systmes RH (gnotypage des gnes RHD et RHCE), KEL, FY, JK, MNS et DO. Le gnotypage RH est le plus complexe. Il ncessite de dnir une stratgie base si possible sur lutilisation simultane danticorps monoclonaux spciques et de techniques de PCR. Le gnotypage RH sera abord ultrieurement (article en prparation). Dans ce travail, nous nous sommes limits ltude des prescriptions de gnotypage des systmes courants FY, JK et MNS (gnotypage courant), permettant de dduire un phnotype pour les antignes FY1, FY2, JK1, JK2, MNS3 et MNS4. Cette tude a t ralise sur les prescriptions parvenues au CNRGS entre fvrier 2006 et fvrier 2009. 2. Patients et mthodes 2.1. Patients Les prlvements reus par le CNRGS provenaient en grande partie des laboratoires dimmunohmatologie de ltablissement franais du sang (EFS) prenant en charge les prlvements des patients. Certains prlvements taient envoys par des laboratoires hospitaliers ou dautres laboratoires danalyses de biologie mdicale. De faon rglementaire, le nom patronymique, le nom de jeune lle si ncessaire, la date de naissance, la date de prlvement, le nom du prleveur devaient gurer sur la demande danalyses. Par ailleurs, devaient tre prciss sur la demande le contexte clinique, les antcdents transfusionnels (transfusion de globules rouges dans les quatre mois ayant prcd le prlvement), les antcdents obsttricaux. Enn, les donnes du phnotype rythrocytaire RH/KEL, voire du phnotype tendu (phnotypes FY, JK, MNS. . .) devaient tre reportes sur la demande. Des prlvements sanguins rcolts sur tube acide thylne diamine ttra-actique (EDTA) (deux tubes pour les tudes en biologie molculaire) et sur tube sans anticoagulant (deux tubes pour la srologie) taient requis pour chaque patient. 2.2. Mthodes Le terme de gnotypage courant utilis au CNRGS implique le typage des polymorphismes gntiques des trois principaux systmes de groupe sanguin dintrt transfusionnel

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en dehors des systmes ABO et RH, savoir les systmes FY, JK et MNS. Lanalyse gntique de ces trois systmes, avec dtermination des allles, permet de rendre un phnotype dduit du gnotype sur les antignes FY1, FY2, JK1, JK2, MNS3 et MNS4. Le gnotypage des systmes FY et JK a fait appel des techniques de PCR en temps rel avec dtection des polymorphismes par analyse des courbes de fusion sur Light Cycler1 2.0 et 1.2 (Roche Diagnostics, Meylan, France). Le gnotypage du systme MNS a t ralis par PCR allle spcique avec dtection des produits de PCR par lectrophorse sur gel dagarose 1 %. Pour chaque patient, lextraction dADN partir des tubes primaires a t faite avec lautomate MagnaPur Compact Instrument (Roche Diagnostics). Pour lensemble des techniques de biologie molculaire utilises pour raliser un gnotypage courant, la quantit dADN variait de 20 150 ng par raction de PCR. 2.2.1. Systme FY Deux polymorphismes gntiques du systme FY ont t systmatiquement explors. Le premier correspond au polymorphisme FY*1/FY*2 dtermin par un changement G > A en position 125 dans lexon 2 du gne FY [3]. Le deuxime est un polymorphisme situ dans la rgion promotrice du gne FY, en amont du site dinitiation de la transcription, et correspond un changement 33T > C qui abolit le site de xation du facteur de transcription rythrode GATA-1 [4]. Ltude de ce systme a t dcrite par Araujo et al. [5]. Les techniques ont t adaptes par le CNRGS. Si ncessaire, un troisime polymorphisme, le polymorphisme FY*X (265C > T), tait explor [6]. 2.2.2. Systme JK Le polymorphisme gntique JK*1/JK*2 se trouve au niveau de lexon 9 du gne SLC14A1 en position 838 et consiste en un changement G > A [7]. Ltude de ce polymorphisme a t dcrite par Araujo et al. [5]. Les techniques ont t adaptes par le CNRGS. 2.2.3. Systme MNS Deux polymorphismes gntiques sont classiquement explors au CNRGS, savoir le polymorphisme MNS*1/ MNS*2 et le polymorphisme MNS*3/MNS*4. Cependant, seul le polymorphisme MNS*3/MNS*4 est explor de faon systmatique lorsquun gnotypage courant est ralis. Le polymorphisme MNS*3/MNS*4 se trouve au niveau de lexon 3 du gne GYPB, en position 143 et consiste en un changement T > C. Son tude a t dcrite par Eshleman et al. [8] Les techniques ont t adaptes par le CNRGS. 3. Rsultats Entre fvrier 2006 et fvrier 2009, le CNRGS a effectu 2392 gnotypages. Sur ces 2392 gnotypages, 981 taient des gnotypages courants, tandis que les 1411 autres gnotypages concernaient le gnotypage du systme RH. Lanalyse des donnes obtenues en 2008 a montr que le CNRGS avait ralis dans le cadre de son activit de diagnostic,

un gnotypage courant sur 172 prlvements. Ces prlvements provenaient en majorit des laboratoires dimmunohmatologie receveurs de lEFS. Les autres provenaient de laboratoires hospitaliers ou dautres laboratoires danalyses de biologie mdicale. Les patients taient des femmes dans 49,4 % des cas (85/172), des hommes dans 41,3 % des cas (71/ 172) et des enfants de moins de 15 ans dans 9,3 % des cas (16/ 172). Lge des adultes allait de 16 97 ans (mdiane dge de 59 ans), alors que celui des enfants allait de 1 15 ans (mdiane dge de neuf ans). La demande dexamens immunohmatologiques faisait mention du contexte clinique dans 82,5 % des cas (142/172). Le phnotype RH/KEL tait fourni dans 81,9 % des cas (141/172). Les prlvements sont parvenus au CNRGS avec une demande explicite de gnotypage courant dans 63,9 % des cas (110/172). Sur ces demandes explicites de gnotypage courant, 42,7 % dentre elles (47/110) taient des demandes isoles de gnotypage, tandis que 57,2 % (63/110) taient des demandes didentication danticorps anti-rythrocytaires et de gnotypage. Dans 63,6 % des cas (70/110), la demande de gnotypage courant tait lie un ou des pisodes transfusionnels intervenus dans les quatre mois prcdents le prlvement. Dans 24,5 % des cas (27/110), la demande de gnotypage courant tait lie une impossibilit de raliser le phnotypage rythrocytaire compte tenu dun test direct lantiglobuline positif (contexte auto-immun le plus souvent). La positivit du test direct lantiglobuline a t conrme dans tous les cas, sauf un. Ce test direct tait positif de nature IgG avec une intensit de 4+, 3+, 2+ et 1+ dans six, 17, un et deux cas, respectivement. Dans 11,8 % des cas (13/110), la demande de gnotypage tait lie une impossibilit de raliser le phnotypage rythrocytaire suite une insufsance mdullaire. Les prlvements sont parvenus au CNRGS sans demande explicite de gnotypage courant dans 36 % des cas (62/172). La demande dexamens immunohmatologiques portait uniquement sur lidentication danticorps anti-rythrocytaires. Dans 83,8 % des cas (52/62), la demande didentication danticorps anti-rythrocytaires tait en rapport avec un ou des pisodes transfusionnels intervenus dans les quatre mois prcdant le prlvement. Dans 36 dossiers, le gnotypage courant a t dtermin pour pallier labsence de donnes concernant le phnotypage tendu. Dans les 16 dossiers restants, le gnotypage courant a t dtermin soit pour complter les donnes dun phnotypage partiel (donnes concernant le systme FY seul, le systme JK seul, les systmes FY et MNS, etc.), soit pour conrmer les donnes de phnotypage tendu fourni par le laboratoire prescripteur dans un contexte didentication difcile dun anticorps sans spcicit courante, dirig contre un antigne de frquence leve. Dans 16,3 % des cas (10/62), la demande didentication danticorps anti-rythrocytaires tait faite hors contexte transfusionnel. Sur six des dix prlvements traits, le test direct lantiglobuline tait positif de nature IgG (intensit 3+ dans cinq cas et 2+ dans un cas), empchant la ralisation dun

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phnotypage tendu classique. Dans les quatre autres cas, le CNRGS a ralis un gnotypage courant dans le cadre dun bilan immunohmatologique complet an didentier au mieux lanticorps sans spcicit courante dirig contre un antigne de frquence leve mis en vidence dans les prlvements. La corrlation phnotype/gnotype sur ces analyses na pas pu tre dtermine puisque le phnotype FY, JK, MNS tait le plus souvent inconnu. Cependant, dans les quelques situations o lexpression de certains antignes FY, JK ou MNS tait phnotypiquement connue, aucune discordance avec le phnotype dduit na t observe. 4. Discussion Le gnotypage des systmes de groupe sanguin dintrt transfusionnel est devenu en quelques annes un outil indispensable dans les laboratoires dimmunohmatologie spcialiss. La base molculaire dun grand nombre de polymorphismes de groupes sanguins, savoir le polymorphisme li un seul nuclotide, permet lutilisation de techniques de biologie molculaire simples et reproductibles. Cependant, il importe de rappeler que les rsultats du gnotypage des systmes de groupe sanguin ne permettent que de dduire un phnotype rythrocytaire probable. Lexpression des glycolipides, glycoprotines et protines la membrane des hmaties est gouverne par une chane dvnements non rduite au seul polymorphisme gnomique dintrt tudi. Ce fait peut tre illustr par lexemple du phnotype rythrocytaire rare MNS:3,4,5. Ce phnotype rare prsent par les populations noires ou afro-antillaises correspond labsence dexpression des antignes MNS3(S), MNS4(s) et MNS5(U) au niveau de la glycophorine B. Chez certains individus prsentant ce phnotype silencieux, il est cependant possible de gnotyper le gne GYPB codant la glycophorine B et de mettre en vidence un polymorphisme MNS3 et/ou MNS4 malgr labsence dexpression de la glycophorine B [9]. Les mcanismes molculaires associs ces variants du systme MNS ne sont pas totalement connus lheure actuelle [10]. De faon courante, le CNRGS ralise le gnotypage des systmes de groupe sanguin FY, JK et MNS (appel gnotypage courant) dans des dlais pouvant tre de moins de 24 heures rception des prlvements, si la situation clinique lexige. Les indications du gnotypage courant sont essentiellement limpossibilit de raliser un phnotypage rythrocytaire, soit suite :  un pisode transfusionnel intervenu dans les quatre mois ayant prcd le prlvement ;  un test direct lantiglobuline positif ;  un pisode transfusionnel intervenu dans les quatre mois ayant prcd le prlvement et un test direct lantiglobuline positif. Ltude que nous avons ralis au CNRGS sur lanne 2008 montre que les prescriptions de gnotypage des systmes de groupe sanguin entrent totalement dans ces recommandations,

sans prescription abusive. Dans notre exprience, plus de la moiti des demandes de gnotypage courant (63,6 %) entraient dans le cadre dun contexte transfusionnel prcdant les prlvements, alors que la positivit dun test direct lantiglobuline donnait lieu une demande de gnotypage courant dans 24,5 % des cas seulement. La survenue dune alloimmunisation anti-rythrocytaire est lun des problmes essentiels poss par les patients ncessitant des transfusions rptes de globules rouges. La frquence dapparition dalloanticorps anti-rythrocytaires va de 2 40 %, en fonction du type de patients transfuss et des pratiques transfusionnelles [11]. Aussi, peut-on se poser la question de lefcacit de raliser systmatiquement un phnotypage tendu aux systmes FY, JK et MNS avant transfusion de globules rouges, si celle-ci est potentiellement rptable. Une tude cot efcacit permettrait peut-tre de rpondre cette question. Bien quun certain nombre de prescriptions danalyses immunohmatologiques parvenant au laboratoire ne demandent pas de dterminer le gnotype des patients, le CNRGS peut tre amen raliser ces analyses dans le cadre de la scurit transfusionnelle. En effet, lidentication danticorps antirythrocytaires ncessite une confrontation des donnes phnotypiques et srologiques. Il importe donc de connatre le polymorphisme des systmes FY, JK et MNS qui sont, de fait, des systmes dintrt transfusionnel majeurs. Linterprtation de la nature allo- ou auto-anticorps des anticorps antirythrocytaires ne pourrait se faire sans lensemble de ces donnes immunohmatologiques. Si lintrt du gnotypage de groupes sanguins nest plus dmontrer, sa place exacte dans les laboratoires dimmunohmatologie spcialiss reste encore dterminer. Rcemment, se sont dveloppes des technologies permettant lanalyse simultane dun certain nombre de SNP sur un mme chantillon dADN par une technique de gnotypage haut dbit [12]. La matrise de ces nouvelles technologies dans un futur proche devrait ouvrir de nouvelles perspectives. Cependant, plusieurs questions restent au jour daujourdhui sans rponse : les performances exactes des technologies de typage haut dbit, tant du ct donneurs que receveurs, la place du gnotypage de groupes sanguins dans les laboratoires dimmunohmatologie spcialiss en termes de complment dinformations ou en remplacement des techniques phnotypiques classiques, le cot du gnotypage de groupes sanguins tant du ct donneurs que receveurs et surtout lestimation du paramtre cotefcacit dans le cadre de la scurit transfusionnelle. Seules des tudes minutieuses ralises par des quipes indpendantes pourront amener des rponses quant la place exacte de la biologie molculaire en immunohmatologie. Rfrences
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