UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS FACULDADE DE FARMCIA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS

MARCELA MARIA DE CASTRO CAMPOS

ESTUDO DA REMOO E TOXICIDADE DOS PESTICIDAS ATRAZINA E OXIFLUORFEM PELA CIANOBACTRIA Microcystis novacekii EM CONDIES DE CULTIVO

Belo Horizonte MG 2009

MARCELA MARIA DE CASTRO CAMPOS

ESTUDO DA REMOO E TOXICIDADE DOS PESTICIDAS ATRAZINA E OXIFLUORFEM PELA CIANOBACTRIA Microcystis novacekii EM CONDIES DE CULTIVO

Dissertao apresentada ao Programa de PsGraduao em Cincias Farmacuticas da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial obteno do ttulo de Mestre em Cincias Farmacuticas. rea de concentrao: Cincias Farmacuticas Orientador: Prof. Dra. Srgia Maria Starling Magalhes Co-orientador: Prof. Dr. Francisco Antnio Rodrigues Barbosa

Belo Horizonte 2009

Dedico este trabalho aos meus amados pais e minha orientadora e amiga, Prof. Srgia, por todos ensinamentos transmitidos, carinho e pacincia durante os anos de convivncia.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me conceder tantas boas oportunidades, por me dar uma famlia linda que eu tanto amo e por ser minha fortaleza e meu auxlio nos momentos difceis.

Aos meus pais, Marcelo e Cidinha, que so minha inspirao, meus grandes incentivadores e ao mesmo tempo meus maiores crticos. Tudo que eu possa fazer nunca ser o suficiente para agradecer tamanho carinho e amor com que me cercam! minha grande amiga e irm, Mariana, que acompanhou minhas alegrias e minhas angstias to de perto. E ao Lucas, meu irmo querido!

Agradeo de uma forma muito especial minha grande mestra, Srgia, que tem todo o mrito da realizao deste trabalho. Obrigada por me conduzir nos caminhos da pesquisa desde a iniciao cientfica, mas mais ainda por ser to sensata e sempre encontrar solues para os vrios imprevistos que surgiram durante esta jornada!

A todos os meus amigos e colegas de trabalho do Laboratrio de guas e do Servio de Microbiologia de Produtos da Funed, em especial Crisolita, que muito me incentivou e ajudou para que eu alcanasse meus objetivos.

Ao Laboratrio de Resduos de Pesticidas da Funed, onde foram realizadas as anlises cromatogrficas deste trabalho.

A todos do Departamento de Farmcia Social, principalmente ao pessoal do Laboratrio de gua/Sade Pblica, os quais muitas vezes eu nem encontrava, mas sabia que podia contar. No posso deixar de homenagear aqui aquelas que to bem me acolheram logo quando iniciei minhas atividades no meu primeiro estgio: Maria Angela e Edna, obrigada!

Ao Prof. Francisco Barbosa por abrir as portas do Laboratrio de Limnologia do ICB e disponibilizar as culturas de cianobactrias para realizao deste trabalho.

 Isabela, companheira de mestrado, e s bolsistas Taciane e Iara do Laboratrio de Limnologia do ICB por todo o suporte que viabilizou a realizao dos experimentos.

Ao Gleydson, meu amigo de todas as horas, com quem eu realmente pude contar nos momentos em que mais precisei. Suas conversas e experincias nunca me deixaram desanimar.

Ao Laboratrio de Qumica Farmacutica FAFAR pela realizao dos espectros no infra-vermelho e ao Departamento de Qumica ICEX/UFMG pela realizao dos espectros de ressonncia magntica nuclear.

FAPEMIG pelo financiamento do Projeto.

Realmente, sozinha, eu nunca teria concludo este trabalho, mais do que qualquer outro que eu j possa ter iniciado. Portanto, meus agradecimentos so sinceros e de corao. Obrigada a todos que de alguma forma fizeram parte desta jornada!

Quando algum julga ter alcanado o saber, porque ainda no sabe onde est o verdadeiro conhecimento. Cor 8, 2.

RESUMO

A contaminao das guas por pesticidas devido s atividades antropognicas tem se tornado uma preocupao mundial em funo dos danos ambientais e sade pblica. As cianobactrias so micro-organismos capazes de crescer em ambientes poludos e seu potencial como agente de biorremediao de ambientes contaminados promissor. O presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial de remoo dos pesticidas atrazina e oxifluorfem pela Microcystis novacekii e a toxicidade desses agentes para a cianobactria em condies de cultivo em laboratrio. O ensaio de biodegradao foi realizado em cinco concentraes de cada pesticida em meio de cultura WC (water culture), durante 96 horas e as anlises quantitativas, por cromatografia gasosa acoplada a detector de

nitrognio/fsforo e captura de eltrons. A cianobactria demonstrou potencial para degradao da atrazina do meio em concentrao igual ou superior a 50g/L, com mdias de remoo de 22,2% em 96 horas. Em concentraes mais baixas, 25g/L, a degradao no aconteceu em valores significativos, sugerindo a existncia de uma concentrao mnima do herbicida para ativao dos processos metablicos celulares. O oxifluorfem apresentou concentraes significativamente baixas no incio do experimento na presena da cianobactria, alm de uma alta taxa de remoo no grupo controle ao final do experimento; indicando que alm de mecanismos biolgicos de remoo do meio, ele passvel de remoo por outras vias, sendo a fotlise uma possibilidade. Em relao toxicidade, a Microcystis novacekii mostrou-se tolerante a elevadas concentraes dos pesticidas, sendo a EC50 (96 horas) 4,2 mg/L e 17,6 mg/L para atrazina e oxifluorfem, respectivamente, confirmando a resistncia da espcie. Os resultados do presente estudo podem subsidiar novos trabalhos para avaliao do potencial da Microcystis novacekii como futuro agente de biorremediao de ambientes contaminados com estes e outros pesticidas.

Palavras-chave: Cianobactria. Microcystis novacekii. Biodegradao. Toxicidade. Pesticidas. Atrazina. Oxifluorfem.

ABSTRACT

Water contamination by pesticides due to anthropogenic activities has become a global concern in terms of environmental damage and public health. The cyanobacteria are microrganisms capable of growing in polluted environments and their potential as agents of bioremediation of contaminated environments is promising. This study aimed to evaluate the potential for removal of the pesticides atrazine and oxyfluorfen by the cyanobacteria Microcystis novacekii and their toxicity in a laboratory culture. The biodegradation test was conducted in five concentrations of each pesticide in the culture medium WC (water culture) for 96 hours and quantitative analysis by gas chromatography coupled to detection of

nitrogen/phosphorus and electron capture. The cyanobacteria showed potential for atrazine degradation of the medium in concentrations equal or greater than 50g/L, with average removal of 22.2% in 96 hours. In lower concentrations, 25 g/L, the degradation did not occur in significant values, suggesting the existence of a minimum concentration of the herbicide for activation of cellular metabolic processes. The oxyfluorfen showed significantly lower concentrations at the beginning of the experiment in the presence of cyanobacteria and a pronounced spontaneous degradation in the control group at the end of the experiment, indicating that others mechanisms for degradation is likely to happen, as photolysis. Regarding toxicity, Microcystis novacekii shown to be tolerant to high concentrations of pesticides, and the EC50 (96 hours) 4.2 mg/L and 17.6 mg/L for atrazine and oxyfluorfen, respectively, confirming the resistance of the specie. The results of this study may support further work to evaluate the potential of Microcystis novacekii as a future bioremediation agent of environments contaminated with these and other pesticides.

Keywords:

Cyanobacteria.

Microcystis

novacekii.

Biodegradation.

Toxicity.

Pesticides. Atrazine. Oxyfluorfen.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Estrutura qumica da atrazina...................................................................21 Figura 2 Degradao da atrazina e formao de seus principais metablitos........23 Figura 3 Estrutura qumica do oxifluorfem...............................................................26 Figura 4 Fotos da Microcystis novacekii..................................................................31 Figura 5 Mecanismo de biodegradao da atrazina por Pseudomonas sp (ADP)............................................................................34 Figura 6 Esquema do ensaio de biodegradao.....................................................47 Figura 7 Esquema do ensaio de toxicidade............................................................49 Figura 8 Espectro no IV da atrazina........................................................................54 Figura 9 Espectro de RMN 1H (DMSO deuterado, 200 MHz) da atrazina..............54 Figura 10 Espectros atrazina de RMN 13C e DEPT (DMSO deuterado, 50 MHz)....................................................................55 Figura 11 Espectro no IV do oxifluorfem.................................................................57 Figura 12 Espectro de RMN 1H (DMSO deuterado, 200 MHz) do oxifluorfem........57 Figura 13 Espectro de RMN 13C (DMSO deuterado, 50 MHz) do oxifluorfem........58 Figura 14 Cromatograma do padro de referncia e da atrazina purificada...........59 Figura 15 Cromatograma do padro de referncia e do oxifluorfem purificado......60 Figura 16 Correlao entre absorvncia a 680 nm e a contagem celular para Microcystis novacekii...............................................................................62 Figura 17 Correlao entre absorvncia a 680 nm e a contagem celular para Microcystis novacekii na presena de atrazina (100 g/L).......................62 Figura 18 Correlao entre absorvncia a 680 nm e a contagem celular para Microcystis novacekii na presena de oxifluorfem (1000 g/L)................63 Figura 19 Curva de calibrao para quantificao atrazina....................................64 Figura 20 Monitorizao por DO680 do crescimento da Microcystis novacekii durante ensaio de biodegradao da atrazina........................................66 Figura 21 Curva de calibrao para quantificao do oxifluorfem..........................70 Figura 22 Monitorizao por DO680 do crescimento da Microcystis novacekii durante ensaio de biodegradao do oxifluorfem...................................71 Figura 23 Fotlise do oxifluorfem e a formao de metablitos..............................75

Figura 24 Crescimento da Microcystis novacekii estimado por DO680 durante 96 horas de monitoramento do ensaio toxicidade da atrazina................78 Figura 25 Porcentagem de inibio do crescimento da Microcystis novacekii exposta a atrazina por 96 horas..............................................................78 Figura 26 Crescimento da Microcystis novacekii estimado por DO680 durante 96 horas de monitoramento do ensaio de toxicidade do oxifluorfem......79 Figura 27 Porcentagem de inibio do crescimento da Microcystis novacekii exposta ao oxifluorfem por 96 horas ......................................................80

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Padro de potabilidade para pesticidas segundo a Portaria n 518/2004............. ...................................................................20 Tabela 2 Composio do meio WC.........................................................................43 Tabela 3 Concentraes dos pesticidas para o teste de toxicidade.......................49 Tabela 4 Dados espectromtricos da atrazina........................................................53 Tabela 5 Dados espectromtricos do oxifluorfem...................................................56 Tabela 6 Determinao da pureza da atrazina por injeo no CG juntamente com o padro cromatogrfico...................................................................59 Tabela 7 Determinao da pureza do oxifluorfem por injeo no CG juntamente com o padro cromatogrfico...................................................................60 Tabela 8 Resultados da biodegradao da atrazina pela cianobactria Microcystis novacekii.................................................................................65 Tabela 9 Resultados da biodegradao do oxifluorfem pela cianobactria Microcystis novacekii.................................................................................70 Tabela 10 Inibio do crescimento da Microcystis novacekii pelo herbicida atrazina...........................................................................77 Tabela 11 Inibio do crescimento da Microcystis novacekii pelo herbicida oxifluorfem.......................................................................79

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS

C CG CG-ECD CG-NPD DEPT DMSO ELISA d dd Hz IV J lx m mL mg/L MOPS L g/L ng/L nm q rpm RMN SPE t WC v/v

Graus Celsius Cromatografia Gasosa Cromatografia gasosa acoplada a detector de captura eltrons Cromatografia gasosa acoplada a detector de nitrognio e fsforo Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Dimetilsulfxido Enzyme linked immuno sorbent assay teste imunoenzimtico Deslocamento qumico (RMN) / deformao angular (IV) Dupleto Dupleto duplo Hertz Infra-vermelho Constante de acoplamento Lux unidade de medida de iluminao Multipleto Mililitro Miligrama por litro cido 3-[N-morfolino]propanesulfnico (C7H15NO4S) Microlitro Micrograma por litro Nanograma por litro Nanmetros Quarteto Rotaes por minuto Ressonncia Magntica Nuclear Extrao em fase slida Tripleto Water Culture Nmero de onda Volume por volume

SUMRIO

1 INTRODUO........................................................................................................14 2 REVISO DE LITERATURA..................................................................................17 2.1 Pesticidas.............................................................................................................17 2.1.1 Atrazina.............................................................................................................21 2.1.2 Oxifluorfem........................................................................................................25 2.2 Biodegradao como tcnica de recuperao ambiental....................................27 2.3 As cianobactrias.................................................................................................29 2.3.1 Microcystis novacekii (KOMREK) COMPRE................................................31 2.4 As cianobactrias como agentes de biodegradao............................................31 2.5 Toxicidade ambiental............................................................................................33 2.6 Parque Estadual do Rio Doce..............................................................................36 2.7 Alguns aspectos analticos do monitoramento de pesticidas...............................37 3 OBJETIVO..............................................................................................................40 3.1 Geral.....................................................................................................................40 3.2 Especficos...........................................................................................................40 4 MATERIAL E MTODOS.......................................................................................41 4.1 Pesticidas atrazina e oxifluorfem..........................................................................41 4.2 Padres cromatogrficos, solventes, reagentes e cartuchos para SPE..............41 4.3 Instrumental..........................................................................................................41 4.4 Vidrarias...............................................................................................................42 4.5 Purificao dos pesticidas....................................................................................42 4.6 Meio de cultura.....................................................................................................42 4.7 Cultivo da cianobactria Microcystis novacekii....................................................43 4.8 Contagem de clulas ao microscpio ptico / curva de crescimento...................44 4.9 Correlao entre contagem celular e densidade ptica.......................................45 4.10 Ensaio de biodegradao...................................................................................45 4.11 Metodologia analtica..........................................................................................46 4.12 Ensaio de toxicidade..........................................................................................48 4.12.1 Clculo da inibio do crescimento.................................................................50

5 RESULTADOS........................................................................................................52 5.1 Identificao e grau de pureza dos pesticidas atrazina e oxifluorfem..................52 5.2 Contagem celular X densidade ptica..................................................................61 5.3 Ensaios de biodegradao...................................................................................63 5.3.1 Biodegradao atrazina.....................................................................................64 5.3.2 Biodegradao oxifluorfem................................................................................69 5.4 Toxicidade............................................................................................................76 5.4.1 Toxicidade atrazina...........................................................................................77 5.4.2 Toxicidade oxifluorfem.......................................................................................78 5.4.3 O efeito do metanol sobre o crescimento da Microcystis novacekii..................82 6 CONCLUSO.........................................................................................................84 REFERNCIAS..........................................................................................................86

1 INTRODUO

A gua o recurso natural mais elementar e fundamental do qual dependem todos os processos e toda a biota existente. Alm de ser um recurso vital para a sobrevivncia de todas as espcies do planeta Terra, imprescindvel no desenvolvimento econmico e social, para a sade humana e para manter a sustentabilidade dos processos biolgicos. O Brasil possui no menos que 12% da gua doce do planeta Terra e provavelmente 25% das espcies de peixes conhecidas. Por outro lado, possui um baixssimo nvel de tratamento de esgotos domsticos e industriais, lanando em seus corpos dgua pelo menos 70% dos esgotos coletados sem qualquer tratamento. Como resultado observa-se ampla degradao ambiental, perda de biodiversidade aqutica e riscos sade humana (BARBOSA, 2008).

A qualidade da vida na Terra est estritamente ligada s condies ambientais. At recentemente acreditava-se que os recursos naturais eram abundantes e ilimitados, hoje em dia, no entanto, o comprometimento desses recursos mostra, em maior ou menor grau, a negligncia humana ao utiliz-los. O problema global, a contaminao ambiental observada em todo o planeta, embora seja amplamente reconhecido que a degradao das condies ambientais uma ameaa potencial sade pblica (VIDALI, 2001).

Os contaminantes qumicos na gua so geralmente considerados de menor gravidade do que os microbianos. Possivelmente devido aos efeitos adversos sade humana provenientes dos poluentes qumicos, em baixas concentraes, estarem associados a longos perodos de exposio, ao passo que efeitos microbianos so praticamente imediatos. No entanto, a presena de contaminantes qumicos na gua pode causar srios problemas sade (WHO, 2007).

A gua por suas caractersticas fsicas e qumicas veicula inmeras substncias potencialmente txicas aos humanos e para os diversos organismos expostos por longos perodos ou a quantidades elevadas (BONAVENTURA e JOHNSON, 1997).

O nmero de substncias qumicas de origem antropognica expandiu-se enormemente a partir do sculo passado, com isso, grandes quantidades de produtos txicos, como combustveis, detergentes, fertilizantes, lubrificantes, pesticidas e muitos outros so lanados no ambiente, contaminando o ar, o solo e os cursos dgua (BONAVENTURA e JOHNSON, 1997).

O aumento da populao mundial e a demanda crescente por alimentos tem incentivado o agronegcio e motivado o uso de grandes quantidades de pesticidas nas plantaes, para prevenir ou combater pragas, assegurando maior

produtividade. Como conseqncia, concentraes residuais de agrotxicos so encontradas nos diversos ambientes, principalmente na gua e nos alimentos. Alm dos efeitos sobre a sade humana, a contaminao ambiental pode acarretar grandes alteraes da flora e da fauna resultando em srios problemas ambientais (MARASCHIN, 2003).

A contaminao das guas superficiais por pesticidas decorrente da lixiviao do solo por enxurradas, da ao do vento que carreia o pesticida aplicado, em geral, na forma de aerossol, do uso e descarte incorretos destes produtos e do descarte inadequado das embalagens. Os lenis freticos tambm podem ser contaminados por percolao destes compostos (SANCHES et al., 2003).

Uma vez que a contaminao ambiental j tenha ocorrido, a preveno de novas fontes de poluio e a remediao do ambiente contaminado tornam-se estratgias fundamentais para garantir a sustentabilidade ambiental. As tcnicas de

recuperao ambiental tem como objetivo a completa degradao dos poluentes, ou, pelo menos, a diminuio de sua concentrao at nveis aceitveis ou sua converso a substncias de menor toxicidade, reduzindo os danos ambientais e preservando a sade humana (BONAVENTURA e JOHNSON, 1997; VIDALI, 2001).

Entre as tcnicas de recuperao ambiental o uso de micro-organismos apresentase como uma das estratgias mais eficientes, tanto do ponto de vista de efetividade quanto de remoo com relao ao custo e gerao de resduos secundrios (BOOPATHY, 2000).

A biodiversidade da flora e da fauna brasileira incentiva os estudos para identificao de espcies locais, facilmente acessveis, que possam contribuir para a recuperao de reas poludas. Neste contexto, o estudo do potencial de cianobactrias isoladas de lagos brasileiros para biodegradao de pesticidas permite conhecer o impacto toxicolgico desses agentes sobre esse grupo de produtores primrios, alm de estimar o potencial metablico dessas espcies. As cianobactrias so ubquas no ambiente e possuem mecanismos bem

desenvolvidos de adaptao s condies ambientais, o que lhes confere grande resistncia em ambientes poludos, podendo ser utilizadas como agentes de recuperao de reas impactadas.

2 REVISO DE LITERATURA

2.1 Pesticidas

Os termos pesticida, biocida, defensivo agrcola, praguicida e agrotxico so comumente usados com o mesmo significado, embora definies mais restritas possam incluir ou excluir dessas classificaes diferentes grupos de substncias qumicas (MARASCHIN, 2003). Algumas definies para estes agentes so apresentados a seguir.

No Brasil, a Lei n 7.802 de 11.07.89 define: Agrotxicos so os produtos e os agentes de processos fsicos, qumicos ou biolgicos, destinados ao uso nos setores de produo, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrcolas, nas pastagens, na proteo de florestas, nativas ou implantadas, e de outros ecossistemas e tambm de ambientes urbanos, hdricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composio da flora e da fauna, a fim de preserv-las da ao danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como as substncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores do crescimento (BRASIL, 1989).

Segundo a United States Environmental Protection Agency (USEPA) um pesticida qualquer substncia ou mistura de substncias com capacidade de prevenir, destruir, repelir ou atenuar qualquer peste (USEPA, 2009).

Os pesticidas podem ser classificados em funo de vrios aspectos que os diferenciam em classes. Por exemplo, de acordo com o tipo de peste que controlam: algicidas, fungicidas, herbicidas, inseticidas, entre outros. Uma outra forma de classific-los de acordo com a sua estrutura qumica (USEPA, 2009).

Uma classificao tambm bastante utilizada para pesticidas em relao sua toxicidade. Os pesticidas esto divididos em quatro classes toxicolgicas. A classe I abrange os compostos considerados altamente txicos para seres humanos; a II, os mediamente txicos; a III, os pouco txicos e a IV, os compostos considerados praticamente no-txicos para seres humanos (SANCHES et al., 2003).

A capacidade atual dos pases desenvolvidos de produzir e colher grandes quantidades de alimentos em reas relativamente pequenas com participao reduzida de trabalho humano tem sido possvel graas ao uso de pesticidas (MIRANDA et al., 2007).

Praticamente, desde sua introduo, os pesticidas sintticos constituem um problema, devido ao seu impacto potencial sobre a sade humana, em virtude do contato direto e da ingesto de gua e alimentos contaminados. Acrescenta-se o fato de que muitos pesticidas tem dado origem a problemas ambientais devido sua toxicidade, persistncia, hidrofobicidade e capacidade de se bioacumular em organismos aquticos (BAIRD, 2002).

O Brasil assumiu, em 2008, a liderana mundial no consumo de pesticidas, superando os Estados Unidos, onde as lavouras ocupam uma rea maior. O levantamento do Instituto Internacional de Pesquisa em Agronegcios mostra um crescimento de quase 30% no mercado interno de insumos agrcolas no ano passado, enquanto a demanda global cresceu 15% em comparao com 2007 (BOTELHO, 2009).

As caractersticas fsico-qumicas dos pesticidas, assim como a forma de uso e as propriedades do solo, so fatores importantes para explicar a dinmica desses resduos no ambiente. Pesticidas quimicamente estveis tendem a permanecer mais tempo no ambiente aumentando a probabilidade de dissipar-se para locais cada vez mais distantes do local de aplicao. A forma de aplicao tambm afeta a sua distribuio inicial (WAUCHOPE et al., 1992).

O grau com que os pesticidas alcanam as guas superficiais depende de uma srie de fatores, que inclui a quantidade utilizada durante a aplicao, a extenso com que essas substncias so adsorvidas pelo solo, sua volatilizao, a taxa de degradao, sua solubilidade na gua e a quantidade percolada. A quantidade lixiviada at as guas superficiais depende principalmente do ndice pluviomtrico local e da extenso com que tais agentes so adsorvidos pelo solo. A pulverizao de pesticidas prxima aos cursos dgua e a disposio inadequada de resduos e embalagens tambm so importantes fatores de contaminao (WHO, 2007).

 importante ressaltar que, em alguns casos, menos de 0,1% da quantidade de pesticidas aplicados alcanam o alvo proposto, os 99,9% restantes tem potencial de atingir outros compartimentos ambientais, como as guas superficiais e

subterrneas, que aparecem como o destino final dos pesticidas (RIBEIRO, 2007).

Os efeitos dos pesticidas nos ecossistemas no ficam restritos aos organismos alvo a que devem atuar, mas se estendem a muitos outros organismos, como as algas, que tem um papel importante no ecossistema aqutico como produtores primrios (MA e LIANG, 2001).

Considerando ainda que o ambiente aqutico abriga micro-organismos que participam dos ciclos dos nutrientes e decomposio nos ecossistemas, os efeitos dos pesticidas sobre esses podem ter impactos subseqentes nos nveis trficos mais altos da cadeia alimentar. A toxicidade dos pesticidas pode afetar os microorganismos tanto em sua estrutura quanto na funo exercida pelos mesmos. Os pesticidas podem ser metabolizados ou bioacumulados pelos micro-organismos. Os mecanismos de toxicidade variam, dependendo do tipo de pesticida e das espcies microbianas expostas. Os herbicidas geralmente so os mais txicos para os microorganismos fotossintetizantes, j que exercem sua toxicidade inibindo a fotossntese. Os dados de toxicidade dos pesticidas para micro-organismos do solo so mais comuns do que aqueles envolvendo micro-organismos aquticos (DELORENZO, SCOTT e ROSS, 2001).

O uso intensivo de agrotxicos no Brasil tem suscitado a preocupao de profissionais de diversos setores face aos riscos potenciais que essas substncias trazem ao ambiente e aos seres humanos. Nesse contexto, a gua para consumo humano pode ser uma importante forma de exposio. O padro nacional de potabilidade da gua regulamentado pela Portaria do Ministrio da Sade n 518/2004 e contempla 22 pesticidas, apresentados na Tabela 1.

Os efeitos sobre a sade humana decorrentes do consumo de gua contaminada por pesticidas variam segundo a classe toxicolgica do mesmo. Dentre os problemas j identificados destacam-se os distrbios hepticos, danos ao sistema nervoso central, como dores de cabea, tonturas, irritabilidade, movimentos

musculares involuntrios, transtornos cardiovasculares e reprodutivos. H ainda evidncias de desregulao endcrina e danos oculares e renais, alm de anemia e aumento do risco de desenvolvimento de cncer (FERNANDES NETO e SARCINELLI, 2009).

Tabela 1 Padro de potabilidade para pesticidas segundo a Portaria n 518/2004 Pesticida Alaclor Aldrin e Dieldrin Atrazina Bentazona Clordano (ismeros) 2,4 D DDT (ismeros) Endossulfan Eldrin Glifosato Heptacloro e Heptacloro epxido Hexaclorobenzeno Lindano (-BHC) Metolacloro Metoxicloro Molinato Pendimetalina Pentaclorofenol Permetrina Propanil Simarazina Trifluralina
Fonte: Portaria do Ministrio da Sade n 518/2004. 1 VMP: Valor Mximo Permitido.

VMP1 (g/L) 20,0 0,03 2 300 0,2 30 2 20 0.6 500 0,03 1 2 10 20 6 20 9 20 20 2 20

Atualmente o desafio consiste em desenvolver pesticidas cada vez mais seletivos e menos prejudiciais ao homem e ao meio ambiente; assim como possibilitar a

substituio dos pesticidas pelo controle com agentes biolgicos naturais para atenuao das pragas e pelo melhoramento gentico das plantas (MARASCHIN, 2003).

Dado o impacto ambiental dessas substncias, o desenvolvimento de metodologias que tenham por objetivo a sua depurao de extrema importncia, tanto do ponto de vista ambiental quanto de sade pblica.

2.1.1 Atrazina

A atrazina um dos herbicidas mais utilizados e mais estudados em todo o mundo, sendo frequentemente encontrada em ambientes aquticos (NRA, 1997; TANG, HOAGLAND e SIEGFRIED, 1998; STRUTHERS, JAYACHANDRAN e MOORMAN, 1998; GRAYMORE, STAGNITTI e ALLINSON, 2001; KADIAN et al., 2007). Sua estrutura qumica est apresentada na Figura 1.

Cl N

N N HN

N H

Figura 1 Estrutura qumica da atrazina

Dentre os herbicidas da classe das triazinas, a atrazina o mais conhecido. Foi introduzida no mercado em 1958 e usada em enormes quantidades para destruir ervas daninhas em lavouras. Do ponto de vista bioqumico, a atrazina atua bloqueando a realizao da fotossntese. Em concentraes elevadas, tem sido utilizada para eliminar todas as plantas vivas, por exemplo, para criar reas de estacionamento de veculos (BAIRD, 2002).

A atrazina, herbicida de classe III, tem seu uso agrcola autorizado no Brasil para aplicao em pr e ps-emergncia das plantas infestantes nas culturas de abacaxi, cana-de-acar, milho, pinus, seringueira, sisal e sorgo (ANVISA, 2007a).

Devido ao seu elevado uso em todo o mundo, a atrazina um dos herbicidas mais prevalentes no meio ambiente. Apresenta uma solubilidade em gua de aproximadamente 30 mg/L e uma meia-vida no solo entre 15 e 100 dias. Embora persista na maioria dos solos durante apenas alguns meses, quando a atrazina e seus metablitos alcanam os cursos dgua sua meia-vida da ordem de anos (RALEBITSO, SENIOR e VANVERSEVELD, 2002; BAIRD, 2002).

A estabilidade da atrazina pode ser explicada pela configurao eletrnica do anel heterocclico, semelhante do benzeno. estvel temperatura ambiente e na faixa de pH comum aos vrios compartimentos ambientais. A atrazina pode se degradar em vrios metablitos, que variam em persistncia no ambiente e em toxicidade. Os metablitos mais comuns so a hidroxiatrazina (HA), dietilatrazina (DEA), diisopropilatrazina (DIA), didealquilatrazina (DDA) e dietilhidroxiatrazina (DEHA). DIA, DEA e DDA so formados por biodegradao, enquanto HA e DEHA podem ser formados tanto por reaes qumicas quanto por biodegradao. DEA e DIA so fitotxicos e o DEA o metablito de maior interesse, pois considerado quase to txico quanto a atrazina (SANCHES et al., 2003; GRAYMORE, STAGNITTI e ALLINSON, 2001). O esquema de degradao da atrazina e formao de seus metablitos apresentado na Figura 2.

A degradao da atrazina na gua ocorre principalmente por processos biolgicos, incluindo N-dealquilao, desclorao e clivagem do anel; podendo tambm ser degradada via processos fotoqumicos, no entanto, estes tendem a ser muito menores do que as primeiras formas mencionadas (STRUTHERS,

JAYACHANDRAN e MOORMAN, 1998).

Apesar das suas limitaes como fonte de energia, devido a total oxidao dos carbonos do anel aromtico, sua susceptibilidade ao catabolismo aumentada pela presena de carbono e nitrognio em sua estrutura qumica, comportando-se como

fonte desses elementos em condies limitantes de nutrientes (RALEBITSO, SENIOR e VANVERSEVELD, 2002).

Fonte: The NRA Review of Atrazine, 1997.

Figura 2 - Degradao da atrazina e formao de seus principais metablitos.

Considerando que a ao da atrazina envolve a inibio do processo fotossinttico, em meio aqutico natural os efeitos txicos mais diretos da atrazina sobre a biota ocorrem sobre as algas. Estes efeitos no ecossistema aqutico no so completamente elucidados, embora muitos estudos cientficos afirmem que impactos significantes podem ocorrer em baixas concentraes por um longo perodo de exposio. Deve-se salientar que os metablitos da atrazina podem se apresentar mais persistentes e em concentraes mais altas que a prpria atrazina em perodos bem aps a estao de aplicao do pesticida (GRAYMORE, STAGNITTI e ALLINSON, 2001).

A grande dissipao da atrazina nas guas superficiais e subterrneas faz com que ela seja frequentemente encontrada em guas de abastecimento nos Estados Unidos e, por essa razo, passou a ser considerada importante indicador de contaminao. A USEPA classifica a atrazina como possvel agente carcingeno humano e tem assessorado a realizao de projetos com o objetivo de proteger os cursos dgua da contaminao por esse herbicida (SANCHES et al., 2003).

Em outros pases as concentraes encontradas de atrazina variam de 0,2 g/L at concentraes acima de 1000 g/L (NRA, 1997), sendo tambm encontrada em sedimentos de rios, indicando que esse pesticida, uma vez ligado ao sedimento moderadamente persistente neste ambiente (GRAYMORE, STAGNITTI ALLINSON, 2001). e

Um estudo em Queensland, Austrlia, evidenciou que a atrazina o contaminante mais abundante nas guas, estando presente por mais de trs anos em 35% das amostras. Na Austrlia, este pesticida tem sido detectado frequentemente em guas superficiais e subterrneas, particularmente em reas de agricultura irrigada e plantaes; sua concentrao pode chegar a 2 mg/L em amostras de gua em programas de monitoramento (NRA, 1997).

A atrazina j foi inclusive detectada em gua da chuva. Hall et al. (1993) encontraram concentraes de at 445 ng/L desse herbicida em gua de precipitao.

Tang, Hoagland e Siegfried (1997) relatam que estudos tem indicado que a atrazina inibe o crescimento e a fotossntese das algas e que esta resposta ao pesticida varia enormemente dependendo da concentrao utilizada, da durao da exposio e da espcie testada.

A toxicidade potencial da atrazina tem motivado pesquisas direcionadas para a sua biorremediao. Esta tcnica tem sido considerada a metodologia de escolha para a recuperao de reas comprometidas devido ao potencial de metabolizao dos micro-organismos, custo relativamente baixo e reduzido impacto ambiental (RALEBITSO, SENIOR e VanVERSEVELD, 2002).

2.1.2 Oxifluorfem

O oxifluorfem um herbicida do grupo qumico ter-difenlico com classificao toxicolgica III, apresentando-se levemente txico a praticamente no txico para humanos. Oxifluorfem praticamente atxico pela ingesto; seu contato com pele e mucosas pode desencadear irritaes cutneas e oculares. Por ser altamente hidrofbico, apresenta potencial de bioacumulao no tecido adiposo das espcies aquticas, sendo muito txico aos invertebrados, moluscos, plantas e peixes (USDA, 2005).

A Organizao Mundial de Sade classificou o oxifluorfem como um pesticida que dificilmente causar intoxicao aguda no homem, desde que utilizado

adequadamente. Aps exposio oral, oxifluorfem rapidamente absorvido e excretado praticamente na forma inalterada nas fezes e urina; sendo que muito pouco permanece nos tecidos (WHO, 2002).

Esta classe de herbicidas principalmente composta por teres, mas alguns compostos so cidos ou apresentam comportamento cido. A estrutura do oxifluorfem apresentada na Figura 3.

Oxifluorfem atua inibindo a enzima protoporfirinognio oxidase (protox) que uma enzima importante na sntese de porfirina nos cloroplastos. A inibio desta enzima bloqueia a formao da clorofila e causa um acmulo dos seus precursores, que, na

presena de luz so convertidos em molculas reativas que rompem a membrana celular (LAGANA et al., 2000).

O F3C Cl O NO2

Figura 3 Estrutura qumica do oxifluorfem

Oxifluorfem apresenta meia-vida no solo em intervalo abrangente: de 30 a 603 dias. Devido sua baixa solubilidade em gua, 0,1 mg/L, tem a tendncia de permanecer ligado aos solos e sedimentos (EXTOXNET, 2002; SCRANO et al, 1999, 2004; USDA, 2005).

Os ter-difenlicos so comumente usados como herbicidas para o controle de muitos tipos de ervas daninhas, consequentemente, j foram detectados em guas superficiais e gua potvel. As concentraes de oxifluorfem podem atingir uma faixa de 0,6 a 1,5 mg/L, com mdia de at 1 mg/L em ambientes aquticos. Dados de monitoramento j registraram picos de concentrao de at 40 mg/L em guas superficiais, concentraes bem acima da prpria solubilidade do herbicida na gua, sendo consideradas acidentais e atpicas (JINNO et al., 1999; USDA, 2005).

A taxa de dissipao do oxifluorfem em solos depende tanto da temperatura quanto da umidade, mas a temperatura parece ser o fator mais importante; praticamente no h dissipao de oxifluorfem a temperaturas de 10C. Devido ao fato do oxifluorfem no ser muito mvel no solo, provavelmente no contamine guas subterrneas em profundidade maior que trs metros. Mas alguns solos com menor coeficiente de adsoro podem permitir a contaminao de guas subterrneas mais profundas. A meia-vida do herbicida significativamente menor na gua do que no solo e os micro-organismos parecem desempenhar um papel importante neste contexto (YEN, SHEU e WANG, 2003).

A toxicidade dos herbicidas ter-difenlicos pode permanecer no ambiente devido sua estabilidade e consequentemente capacidade de entrar na cadeia alimentar e gua. Entre os ter-difenlicos, bifenox e oxifluorfem so compostos considerados carcinognicos ou possivelmente carcinognicos. Em bioensaios com camundongos foi observado um aumento na incidncia de carcinoma heptico, o que resultou na classificao do oxifluorfem como sendo um possvel carcingeno humano (SHEU et al., 2006).

As algas so mais sensveis ao do oxifluorfem do que os peixes, sendo que as formulaes contendo oxifluorfem apresentam-se mais txicas do que a substncia com alto teor de pureza (> 95%). Acrescenta-se que as algas verdes so mais sensveis e as espcies mais tolerantes parecem ser as cianobactrias (USDA, 2005).

O uso agrcola do oxifluorfem autorizado, no Brasil, para a aplicao em premergncia das plantas infestantes nas culturas de algodo, arroz, caf, cana-deacar, cebola, citros e soja e para uso em pr e ps-emergncia das plantas infestantes nas culturas de eucalipto e pinus (ANVISA, 2007b).

No que diz respeito ao padro de potabilidade da gua para consumo humano estabelecido pela Portaria do Ministrio da Sade n 518/2004, no h um limite mximo permissvel para o oxifluorfem.

2.2 Biodegradao como tcnica de recuperao ambiental

A biodegradao a capacidade dos micro-organismos (bactrias, fungos, algas) de metabolizao de produtos qumicos (BAIRD, 2002). A biorremediao definida como a tcnica que emprega micro-organismos para a recuperao de locais contaminados (absoro / degradao de resduos ambientais de forma a eliminlos completamente ou a transform-los em espcies menos txicas). Baseia-se na explorao do potencial biolgico para a recuperao de reas ambientais degradadas, at se eliminar completamente o contaminante ou atingir limites abaixo das concentraes legalmente permitidas. Para a biorremediao ser efetiva, os

micro-organismos devem metabolizar os poluentes e convert-los a produtos menos txicos (BONAVENTURA e JOHNSON, 1997; VIDALI, 2001).

A busca de mtodos mais eficientes, baratos e seguros para tratamento de resduos das atividades antropognicas mostra-se como uma necessidade urgente frente ao amplo nmero de substncias contaminantes do ambiente. Entre as tecnologias tradicionais utilizadas para a recuperao ambiental destacam-se a incinerao de resduos a altas temperaturas e vrios tipos de decomposio qumica. Tais mtodos apresentam vrios inconvenientes, destacando-se sua complexidade tecnolgica, o custo e a pouca aceitao pelo pblico, especialmente para a incinerao, que pode aumentar a exposio aos contaminantes pelos trabalhadores e moradores nos arredores da instalao, apresenta elevado gasto energtico, produo de gases txicos e CO2 (BAIRD, 2002). Como alternativa so propostos mtodos biolgicos para o tratamento dos resduos, sendo desejvel a mineralizao dos mesmos, ou seja, sua converso total em CO2 e H2O. A remediao, baseada na absoro e na biodegradao de poluentes por micro-organismos selecionados ou geneticamente modificados, tem se mostrado promissora para a recuperao de ambientes contaminados. uma tecnologia relativamente simples, com grande aceitao por parte do pblico, custo relativamente baixo e pode ser conduzida in locu (VIDALI, 2001).

Ressalta-se que a biotecnologia ambiental no um campo novo; compostagem e tratamento de esgoto so exemplos clssicos de aplicao desse mtodo, no entanto, estudos recentes oferecem oportunidades para processos biolgicos mais eficientes (SEECH et al., 2008).

Como

outras

tecnologias,

biorremediao

tem

suas

limitaes:

alguns

contaminantes so resistentes ao ataque microbiano e a toxicidade do composto qumico para o agente de biorremediao outra limitao importante (VIDALI, 2001). Alm disso, os processos biolgicos podem levar ativao toxicolgica formando metablitos mais txicos do que a substncia original e podem ainda expor os micro-organismos a substncias potencialmente mutagnicas, levando a

alteraes do material gentico dessas espcies com conseqncias pouco conhecidas.

Recentemente tem aumentado o interesse na utilizao das cianobactrias como agentes de controle da poluio, j que elas possuem muitas vantagens em relao a outros micro-organismos tradicionalmente estudados, como bactrias e fungos. As cianobactrias so conhecidas por tolerar e habitar ambientes com alto grau de poluio e mostram alta eficincia como acumuladoras e degradadoras de diferentes tipos de contaminantes ambientais, incluindo metais pesados e pesticidas, respectivamente. No entanto, os benefcios reais da sua aplicao como agentes de remediao e descontaminao requerem mais estudos (EL-BESTAWY, 2008).

2.3 As cianobactrias

As cianobactrias originaram-se h cerca de 3,5 bilhes de anos, sendo provavelmente os primeiros produtores primrios de matria orgnica a liberarem oxignio elementar na atmosfera primitiva. So micro-organismos procariontes (no possuem ncleo verdadeiro), sem flagelos, caracterizados pela ausncia de ncleo definido e de organelas citoplasmticas. Os pigmentos e demais componentes celulares encontram-se distribudos em toda a massa protoplasmtica da clula (CARMICHAEL, 1994; LACEN PE, 2008).

As cianobactrias so encontradas nos mais variados tipos de habitats, mas predominam em gua doce como rios e lagos, podendo ocorrer tambm em solos, fontes termais, geleiras e desertos. Preferencialmente ocorrem em temperaturas mais elevadas, em torno de 26 pH de 6 a 9 e amb ientes mais estveis (lnticos) C, como lagos e reservatrios (CETESB, 2004; VIDOTTI e ROLLEMBERG, 2004).

Existem cianobactrias unicelulares, coloniais e filamentosas. Algumas espcies produzem clulas diferenciadas: os heterocitos, especializados na fixao de nitrognio, e os acinetos, especializados na acumulao de substncias de reserva. Podem apresentar aertopos, que so estruturas que acumulam gases resultantes do metabolismo, responsveis pela migrao vertical na coluna dgua. Geralmente

so envolvidas por uma massa gelatinosa ou revestidas por uma bainha mucilaginosa (CETESB, 2004).

A maioria das cianobactrias aerbica fotoautotrfica, sendo a fotossntese a principal forma de metabolismo energtico. Algumas cianobactrias tambm mostram uma distinta habilidade de nutrio heterotrfica, sendo consideradas mixotrficas (capacidade de assimilar compostos orgnicos), o que possibilita a sua existncia nas partes mais profundas de lagos, na ausncia de luz (CHORUS e BARTRAM, 1999).

As cianobactrias, no entanto, podem ser fonte de considerveis transtornos em algumas situaes. O seu crescimento abundante (bloom) em reservatrios de gua e mananciais cria problemas severos para o abastecimento de gua, j que algumas espcies so produtoras de cianotoxinas (CHORUS e BARTRAM, 1999).

As floraes de cianobactrias esto relacionadas com o crescimento exacerbado e a mudana gradual da comunidade algal dominante em ambientes aquticos, principalmente no que se refere substituio da dominncia das algas verdes pelas cianobactrias. As razes para essas alteraes no so somente fatores fsicos (temperatura e luminosidade), mas tambm fatores nutricionais (nitrognio e fsforo). No entanto, existem poucos relatos no que se refere a outros fatores, como os poluentes, aos quais esses organismos apresentam diferentes sensibilidades. Os contaminantes podem atingir o ambiente aqutico e resultar em uma mudana na estrutura desses grupos, com alterao na dominncia de algas verdes para cianobactrias. Se elas apresentam sensibilidades bem diferentes s substncias qumicas e sendo o ltimo grupo bem menos sensvel aos poluentes, a contaminao do ambiente aqutico por pesticidas pode resultar em uma mudana da dominncia, podendo ser um fator importante para sustentar as floraes de cianobactrias em algumas situaes (MA et al., 2005).

As cianobactrias constituem um dos grupos fitoplanctnicos mais pesquisados atualmente devido a caracterstica de rpida resposta s modificaes ambientais. Elas habitam vrios ambientes aquticos poludos, atuando de forma dominante em relao a outras espcies. Apresentam efetiva ao de acmulo e biodegradao de

diferentes tipos de poluentes e tambm mostram-se como micro-organismos eficientes na assimilao de compostos orgnicos em meios de cultivo, assim como na remoo de metais pesados (EL-BESTAWY, 2008).

2.3.1 Microcystis novacekii (KOMREK) COMPRE

Essa espcie caracteriza-se por denso arranjo celular no centro da colnia e com clulas isoladas na periferia. Suas colnias jovens so esfricas a levemente ovais, a maioria de 50 a 70 m de dimetro. Difere-se da Microcystis aeruginosa por suas clulas ligeiramente menores e caracterstica mucilagem hialina. Microcystis novacekii no faz parte do grupo de cianobactrias bem-conhecidas e raramente citada na literatura em trabalhos de ficologia (HINDK, 2006). A Figura 4 apresenta duas fotografias da espcie.

Fonte: HINDK, 2006.

Figura 4 Fotos da Microcystis novacekii

2.4 As cianobactrias como agentes de biodegradao

A maioria das publicaes envolvendo a degradao de pesticidas tem seu foco na utilizao de bactrias, enquanto o papel das algas e cianobactrias na transformao destes poluentes recebe uma ateno limitada. Apesar de apresentarem ampla capacidade metabolizadora, tanto para produtos naturais quanto para agentes txicos, existem poucos dados a respeito do papel das cianobactrias na biodegradao de pesticidas.

Megharaj et al. (1994) avaliaram o potencial de duas algas verdes (Chlorella vulgaris e Scenedesmus bijugatus) e quatro cianobactrias (Nostoc linckia, Nostoc muscorum, Oscillatoria animalis e Phormidium foveolarum) para metabolizar metil paration. As cianobactrias apresentaram maior efetividade do que as algas verdes na metabolizao do inseticida, sendo que N. muscorum foi capaz de degradar completamente o metil paration e o seu produto de hidrlise, p-nitrofenol.

Em

estudo

conduzido

por

Mansy

El-Bestawy

(2002)

foi

avaliada

biotransformao da fluometurona pelas cianobactrias Microcystis aeruginosa, Anabaena cylindrica, Anabaena flos-aquae e Anabaena spiroides. Todas as espcies apresentaram grande capacidade de metabolizar o herbicida. Em cinco dias as espcies reduziram entre 87,5 e 93,0% a concentrao do pesticida no meio.

El-Bestawy et al. (2007) descreveram que as cianobactrias dos gneros Synechococcus, Oscilatoria, Nostoc, Nodularia e Cyanothece foram capazes de degradar o pesticida lindano rapidamente. Kuritz e Wolk (1995) tambm verificaram o potencial das cianobactrias Anabaena sp e Nostoc ellipsosporum em metabolizar o mesmo pesticida.

Cceres, Megharaj e Naidu

(2008) estudaram a degradao de um pesticida

organofosforado, fenamifos, por cinco diferentes espcies de algas verdes (Scenedesmus sp. MM1, Scenedesmus sp. MM2, Chlamydomonas sp.,

Stichococcus sp. e Chlorella sp.) e cinco espcies de cianobactrias (Nostoc sp. MM1, Nostoc sp. MM2, Nostoc sp. MM3, Nostoc muscorum e Anabaena sp.) todas isoladas de solos contaminados por este pesticida. Todas as espcies testadas foram capazes de metabolizar o pesticida, sendo consideradas pelos autores como potenciais agentes a serem utilizados na biorremediao de reas contaminadas por este organofosforado.

Gonzlez-Barreiro et al. (2006), avaliando o potencial de remoo de herbicidas triaznicos (atrazina e terbutrina) de meio aquoso por uma espcie de alga verde (Chlorella vulgaris) e uma espcie de cianobactria (Synechococcus elongatus) verificaram rpida eliminao dos pesticidas do meio e concluram que tais microorganismos podem ser empregados em tcnicas de biorremediao de ambientes

aquticos poludos com herbicidas triaznicos. Complementa-se que a cianobactria se mostrou mais resistente presena da atrazina.

Muitas pesquisas tem sido conduzidas com o objetivo de isolar e melhorar microorganismos de reas contaminadas que sejam capazes de mineralizar e utilizar atrazina como uma fonte de carbono e energia. Estes micro-organismos podem ser utilizados sozinhos ou em consrcios, variando sua efetividade na degradao da atrazina (RALEBITSO, SENIOR e VanVERSEVELD, 2002).

Apesar de bastante estudada, nenhum trabalho descrito na literatura apresenta a proposta de um mecanismo de degradao da atrazina pelas cianobactrias. No entanto, em um trabalho de Mandelbaum, Allan e Wackett (1995) foi isolada uma cepa de Pseudomonas sp, ADP, que se mostrou capaz de biodegradar o pesticida em concentraes maiores que 1000 mg/L e se tornou uma cepa referncia e extensivamente estudada para elucidao do metabolismo de biodegradao da atrazina. O esquema de degradao da atrazina pela Pseudomonas sp, cepa ADP, est apresentado na Figura 5.

Com relao ao oxifluorfem existem poucos estudos. A sensibilidade das algas verdes e a tolerncia das cianobactrias s formulaes de oxifluorfem so confirmadas pela literatura. Rojickova-Padrtova e Marsalek (1999) conduziram um trabalho com seis espcies de algas verdes e uma cianobactria expostas ao herbicida e a espcie que se mostrou mais tolerante foi Synechoccus leopoliensis.

Estes estudos podem contribuir para o desenvolvimento de processos de biorremediao usando cianobactrias.

2.5 Toxicidade ambiental

A toxicologia ambiental se preocupa com os efeitos dos agentes txicos sobre a sade e o bem-estar de humanos, animais e plantas, por meio da interao desses organismos (COSTA et al, 2008). Considerando ainda que os efeitos dos herbicidas nos ecossistemas no so restritos aos organismos-alvo, mas se estendem a toda a

biota, os estudos de toxicidade tornam-se ferramentas importantes para o gerenciamento e controle ambiental (MA e LIANG, 2001).

Figura 5 Mecanismo de biodegradao da atrazina por Pseudomonas sp (ADP).

Ensaios de toxicidade so mtodos utilizados na deteco e avaliao da capacidade inerente de um agente em produzir efeitos deletrios nos organismos vivos. Consistem na exposio de organismos padronizados a diferentes concentraes de substncias qumicas, presentes nos efluentes ou gua, por um determinado perodo de tempo (RODRIGUES et al., 2003).

Os testes de toxicidade no permitem obter uma resposta absoluta sobre o risco que uma substncia apresenta para populaes especficas, uma vez que muito difcil extrapolar os resultados de toxicidade obtidos para os organismos-teste em laboratrio para outras espcies (RIBO, 1997).

A utilizao de ensaios de carter ecotoxicolgico, que venham a dar informaes quanto ao efeito txico causado em ecossistemas por substncias qumicas nele presentes, torna-se a cada dia mais importante nas avaliaes de impacto ambiental. Os testes de toxicidade aqutica so bastante utilizados porque os ecossistemas aquticos constituem os principais receptores de contaminantes, sejam eles lanados diretamente nos corpos dgua por meio das descargas de efluentes, emitidos no ar ou depositados nos solos (COSTA et al., 2008).

Dentre os organismos mais recomendados para ensaios de avaliao da toxicidade aqutica esto as algas, pois so produtores primrios dominantes na cadeia alimentar no ambiente aqutico (RODRIGUES et al., 2003).

O uso de algas como indicadores biolgicos importante porque qualquer alterao na dinmica de suas comunidades pode afetar os nveis trficos superiores. Dentre as vantagens em se utilizar algas em testes de toxicidade podemos destacar o seu ciclo de vida relativamente curto, o que possibilita a observao de efeitos txicos em vrias geraes (COSTA et al., 2008).

A sensibilidade de diferentes espcies expostas a uma mesma substncia qumica muito varivel. De acordo com Ma e Liang (2001), pesquisas utilizando diferentes espcies de algas como organismos-teste tem mostrado uma grande variao nas suas respostas s substncias qumicas.

Existe muita informao a respeito dos aspectos toxicolgicos dos pesticidas sobre as algas verdes, no entanto, muito pouco conhecido com relao s cianobactrias (MA et al., 2005).

Em geral, estudos dos efeitos dos pesticidas para micro-organismos do solo so mais comuns do que para os do meio aqutico. Os dados de toxicidade dos

pesticidas para micro-organismos em conjunto com os dados de monitoramento destas substncias no ambiente podem ajudar na avaliao de risco ambiental e dos impactos sobre a sade humana (DELORENZO, SCOTT e ROSS, 2001).

2.6 Parque Estadual do Rio Doce

O Parque Estadual do Rio Doce (PERD) est situado na poro sudoeste do Estado de Minas Gerais, a 248 km de Belo Horizonte, na regio do Vale do Ao, inserido nos municpios de Marliria, Dionsio e Timteo. A unidade de conservao abriga a maior floresta tropical de Minas, em seus 36.970 hectares e a primeira unidade de conservao estadual criada em Minas Gerais. O Decreto Lei n 1.119, que criou oficialmente o Parque, foi assinado 14 de julho de 1944 (IEF, 2009).

O PERD o terceiro maior sistema lacustre brasileiro, formado por um conjunto de 130 lagos naturais nos mais diversos estgios de trofia. O Parque vem sendo objeto de vrios estudos ambientais que visam, basicamente, avaliar seus habitats e ecossistemas, considerando, principalmente, os inmeros impactos antrpicos de seu entorno (TUNDISI e SAIJO, 1997). De maneira geral, grande parte dos corpos de gua que compem o sistema de lagos tem sofrido algum tipo de impacto, seja pelo uso da gua ou pela modificao da paisagem. Apenas na rea onde se encontra o Parque as lagoas esto preservadas. Nos entornos do PERD encontram-se reas submetidas a impactos antrpicos variados. Destacam-se reas ocupadas por extensas plantaes de Eucalyptus sp para atender indstria siderrgica e, mais recentemente, de celulose. A rea restante ocupada por pastagens e culturas diversificadas. Adicionalmente, h ainda a poluio das guas pela carga considervel de esgotos domsticos e industriais.

O sistema de lagos do mdio Rio Doce desperta grande interesse por apresentar uma grande diversidade de espcies e desde a dcada de 70 vem sendo estudado. O Laboratrio de Limnologia do ICB/UFMG tem coordenado pesquisas dirigidas ao sistema lacustre do PERD. Uma das linhas de pesquisa desenvolvidas por este Laboratrio envolve a manuteno de um banco de cianobactrias, fazendo o

isolamento, identificao e manuteno de culturas de espcies provenientes das lagoas do PERD. Atualmente so mantidas no Laboratrio de Limnologia do ICB/UFMG as culturas de Microcystis novacekii, Microcystis aeruginosa, Microcystis protocystis, Cylindrospermopsis raciborskii e Merismopedia sp.

2.7 Alguns aspectos analticos do monitoramento de pesticidas

A extrao em fase slida (Solid-Phase Extraction SPE) um mtodo bem conhecido de preparao de amostras. Trata-se de uma tcnica de separao lquido-slido baseada nos mecanismos de separao da cromatografia lquida de baixa presso. Do ponto de vista prtico, a SPE, em sua forma mais simples e conhecida, comporta-se como uma cromatografia lquida empregando-se uma pequena coluna aberta, usualmente denominada cartucho/seringa de extrao, o qual contm a fase slida, denominada fase estacionria em cromatografia (HENNION, 1999).

At recentemente, a tcnica analtica mais usada no preparo de amostras complexas para anlise era a extrao lquido-lquido (LLE), que se baseia na solubilidade relativa dos analitos presentes na amostra em dois solventes, idealmente imiscveis. um procedimento demorado, requer grandes volumes de solventes orgnicos, apresenta custo elevado, de difcil automao e geralmente de pequena repetibilidade/reprodutibilidade em decorrncia da necessidade de vrias etapas envolvendo o analito de interesse. Enquanto a LLE envolve a manipulao do analito vrias vezes, na SPE isto no ocorre. O tempo total tpico para a extrao empregando LLE de uma hora, contra apenas cinco minutos para a SPE. Adicionalmente, o volume total de solvente orgnico consumido nos mtodos de LLE de aproximadamente 500 mL contra apenas alguns mililitros na SPE. Ressalta-se ainda que a SPE facilmente automatizada, permitindo extrair dezenas de amostras simultaneamente, o que no ocorre com a LLE (LANAS, 2004).

Os cartuchos para extrao foram introduzidos no mercado em 1979, mas sua aceitao ampliou-se nos ltimos anos, devido presso para a diminuio do uso de solventes orgnicos nos laboratrios, que foram encorajados a substituir processos com grande gerao de resduos lquidos e particularmente solventes

orgnicos. A SPE reconhecida pela USEPA como uma tcnica alternativa para a preparao de amostras em relao extrao lquido-lquido em vrios procedimentos para a anlise de compostos orgnicos em amostras de gua e efluentes (HENNION, 1999).

Os parmetros relevantes para a SPE so: as propriedades fsico-qumicas do analito de interesse, a concentrao necessria, a natureza da matriz, o tipo de cromatografia envolvida e o modo de deteco (LANAS, 2004).

O processamento da amostra na SPE consiste em quatro etapas distintas. Inicialmente, a fase slida (o cartucho) condicionada com solvente para melhorar a reprodutibilidade da reteno do analito e para reduzir o carreamento de impurezas da fase slida durante a eluio. Em seguida, o solvente substitudo pelo mesmo solvente da amostra e ento o cartucho carregado com a amostra em fluxo controlado. Opcionalmente, aps o processamento da amostra, a fase slida pode ser lavada com um determinado solvente para eluir componentes de matriz indesejveis sem eluir o analito. Os analitos de interesse so ento eludos da fase slida com um pequeno volume de um segundo solvente para a subseqente determinao cromatogrfica (POOLE, GUNATILLEKA e SETHURAMAN, 2000).

Em relao fase slida, durante muitos anos, a maioria dos processos para o tratamento de amostras aquosas, biolgicas ou ambientais, foi realizado utilizando slica C18. No entanto, uma limitao da slica de fase reversa que ela deve ser condicionada com um solvente aquoso e permanecer hidratada at o carregamento da amostra (HENNION, 1999).

Atualmente, muitas fases so especificadas como tendo uma ampla faixa de polaridade. Uma nova gerao de polmeros (Oasis, Waters) foi desenvolvida para a extrao de um grande espectro de analitos, por exemplo: lipoflicos, hidrofbicos, cidos, bsicos e neutros em um mesmo cartucho, sendo considerados universais por esta razo. O Oasis HLB uma fase com equilbrio hidroflico-lipoflico, umidecvel por gua e de fase reversa que atende a todos os tipos de extrao em fase slida. Estas fases tm excelente capacidade de reteno, aceitando um

espectro maior de polaridade dos analitos, mesmo se a fase slida secar durante o condicionamento ou carregamento da amostra (LLERS et al., 2001).

A SPE usualmente empregada com o propsito de isolar ou concentrar um ou mais analitos presentes em uma matriz complexa para posterior anlise por intermdio do uso de um mtodo instrumental (LANAS, 2004).

3 OBJETIVO

3.1 Geral

Avaliar o potencial de remoo dos pesticidas atrazina e oxifluorfem do meio de cultura WC (Water Culture) pela cianobactria Microcystis novacekii em condies de cultivo em laboratrio.

3.2 Especficos

- Estimar a eficincia dos processos de remoo biolgica dos pesticidas do meio de cultivo; - Verificar a toxicidade dos pesticidas estudados, para a Microcystis novacekii, estabelecendo a dose que causa 50% de inibio do crescimento (EC50); - Discutir possveis mecanismos de degradao dos pesticidas atrazina e oxifluorfem pela espcie Microcystis novacekii.

4 MATERIAL E MTODOS

4.1 Pesticidas atrazina e oxifluorfem

As matrias-primas atrazina e oxifluorfem foram gentilmente fornecidas pela empresa Milenia Agrocincias SA; com teor de pureza rotulado para atrazina de 80,2% e de 86,9% para o oxifluorfem.

4.2 Padres cromatogrficos, solventes, reagentes e cartuchos para SPE

Padres cromatogrficos. Os padres cromatogrficos utilizados foram adquiridos da Supelco (atrazina) e Chem Service (oxifluorfem), com teor de pureza 99,9%. Solventes e Reagentes. Os solventes utilizados, metanol e acetato de etila, foram grau pesticida adquiridos dos laboratrios Merck e Tedia, respectivamente. SPE. Para a extrao em fase slida utilizou-se cartucho Oasis HLB (Waters) 30 m, 1cc, 30 mg e manifold a vcuo para SPE.

4.3 Instrumental

Os espectros na regio do infravermelho (IV) foram registrados em espectrmetro ATR-IR, Spectrum One, Perkin Elmer (Laboratrio de Qumica Farmacutica, FaFar, UFMG). Os espectros de RMN 1H e de RMN
13 1 13

C foram realizados em aparelho BRUKER

AVANCE DRX-400 (Laremar, Departamento de Qumica, ICEx, UFMG), utilizandose sonda dual C e H de deteco direta de 5 mm para os experimentos
13

unidimensionais de RMN 1H, de

C e DEPT 135 e sonda de deteco inversa de 5

mm equipada com bobina para o emprego de pulsos de gradiente de campo para os experimentos bidimensionais (COSY e HMQC). Como referncia interna utilizou-se o tetrametilsilano (TMS).

Os espectros em cromatografia gasosa foram realizados em Cromatgrafo a Gs 6890 N Agilent Technologies com injeo automtica 7683 Agilent, no Laboratrio de Resduos de Pesticidas da Fundao Ezequiel Dias Funed.

Para

acompanhamento

do

crescimento

da

cianobactria

utilizou-se

espectrofotmetro MERCK Spectroquant NOVA 400.

A contagem celular foi realizada em microscpio ptico da marca Olympus modelo CX 41 utilizando-se cmara de Fuchs-Rosenthal.

4.4 Vidrarias

Toda vidraria utilizada nos experimentos foi submetida a imerso em banho de hipoclorito de sdio (5%), lavada com detergente neutro Extran (Merck) e enxaguada exaustivamente com gua corrente, sendo o ltimo enxge por gua destilada. Toda vidraria foi esterilizada em autoclave a 121 , por 20 minutos. C

4.5 Purificao dos pesticidas

Para a utilizao experimental, o ideal que as substncias apresentem teor de pureza acima de 95%, por isso conduziu-se procedimento de purificao dos pesticidas atrazina e oxifluorfem no Laboratrio de Qumica Farmacutica da Faculdade de Farmcia da UFMG.

Para a purificao, os pesticidas foram recristalizados em metanol/gua e resfriamento em banho de gelo permanecendo overnight em geladeira. O precipitado foi filtrado a vcuo e lavado com gua (3 x 30 mL). Aps a secagem acondicionou-se em recipiente mbar.

Foram realizados testes para confirmao da substncia purificada e grau de pureza. As substncias foram identificadas por espectros no IV e RMN, alm de comparao com padro de referncia e quantificao por CG.

4.6 Meio de cultura

O meio de cultura utilizado para cultivo da Microcystis novacekii, com caractersticas no axnicas, para os experimentos de toxicidade e biodegradao foi o meio de cultura WC (Water Culture). A composio do meio est descrita na Tabela 2.

Aps o preparo, o meio foi autoclavado a 121 por 20 minutos. Os micronutrientes, C as vitaminas e o tampo MOPS (pKa 7,2) foram adicionados ao meio aps autoclavao, temperatura ambiente. O pH final do meio foi de 7,0 0,5.

Tabela 2 Composio do meio WC Componentes Macronutrientes CaCl2 . 2H2O MgSO4 . 7H2O NaHCO3 K2HPO4 NaNO3 Na2SiO3 . 9H2O Micronutrientes Na2 . EDTA FeCl3 . 6H2O CuSO4 . 5H2O ZnSO4 . 7H2O CoCl2 . 6H2O MnCl2 . 4H2O Na2MoO4 . 2H2O H3BO3 Vitaminas Tiamina . HCl Biotina Vitamina B12
Fonte: Guillard e Lorenzen, 1972.

Concentrao (mg/L)

36,76 36,97 12,60 8,71 85,01 28,42

4,36 3,15 0,01 0,022 0,01 0,18 0,006 1,0

0,1 0,0005 0,0005

4.7 Cultivo da cianobactria Microcystis novacekii

Neste trabalho foi utilizada a cultura de Microcystis novacekii isolada da gua de uma lagoa do PERD e mantida em cultivo pelo Laboratrio de Limnologia do ICB/ UFMG.

Ressalta-se que em estudo no publicado realizado pelo Laboratrio de Biotecnologia e Marcadores Moleculares do ICB/UFMG a avaliao gentica da cepa de Microcystis novacekii isolada do PERD no apresentou o gene para produo de cianotoxina (microcistina), tratando-se, portanto, de cepa no toxignica. Esses resultados foram confirmados pela aplicao da tcnica de imunoensaio (ELISA), para deteco de microcistina, no laboratrio central da COPASA (Companhia de Saneamento de Minas Gerais).

As culturas foram mantidas em cmara ambiente para germinao a temperatura de 25,0 2,0C e fotoperodo de 12 horas (claro/escuro), com intensidade de luminosidade 30-86 mol.s-1.m-2. O meio de cultura utilizado foi o meio WC.

As cepas foram mantidas em erlenmeyers de 250 mL, com 100 mL de meio de cultura WC. Os meios foram preparados e os cultivos repicados a cada sete dias. Semanalmente, as culturas foram monitoradas por observao ao microscpio ptico.

4.8 Contagem de clulas ao microscpio ptico / Curva de crescimento

O crescimento da cultura de Microcystis novacekii foi estimado pelo nmero de clulas/mL obtido por contagem ao microscpio ptico (MCALICE, 1971). Foram acrescentadas duas gotas da soluo de lugol a 1 mL da cultura de Microcystis novacekii; manteve-se ao abrigo da luz por 30 minutos. A digesto da mucilagem foi obtida pela adio de 500 L de NaOH (1 M) alquota e aquecimento em banhomaria a 80 C, por cinco minutos.

Aps homogeizao em agitador tipo vortex por 30 segundos, a amostra foi transferida para a cmara de Fuchs-Rosenthal, para contagem ao microscpio ptico. Aps sedimentao de dez minutos foram contadas todas as clulas presentes nos campos at que se obtivesse 400 clulas, sendo estimada a densidade da cultura (clulas/mL).

4.9 Correlao entre contagem celular e densidade ptica

Avaliou-se a correlao entre a contagem celular (em clulas/mL) e a densidade ptica (medida em espectrofotmetro) do crescimento da Microcystis novacekii em meio WC, na presena e ausncia dos pesticidas atrazina na concentrao de 100 g/L e oxifluorfem 1000 g/L. Todos os testes foram realizados em triplicata.

cultura da Microcystis novacekii em meio WC (200 mL) foram adicionados 100 g/L de soluo metanlica de atrazina ou 1000 g/L de oxifluorfem. A cultura foi incubada a 25,0 2,0 C, fotoperodo de 12 horas (claro/escuro), sob iluminao por luz fluorescente branca/fria de intensidade 3500 lx, durante cinco dias. Diariamente foram retiradas duas alquotas (5 mL), aps homogeneizao, para contagem celular ao microscpio ptico e para a medida da DO680 em espectrofotmetro. Para estimar o crescimento pela DO680, as alquotas foram transferidas para cubeta de 10 mm e verificada a medida da absorvncia das amostras de cada frasco, a 680 nm em espectrofotmetro. O branco foi registrado pela medida da absorvncia do meio WC sem a adio dos pesticidas e da cultura contendo as clulas de Microcystis novacekii.

A contagem ao microscpio ptico foi realizada segundo o procedimento descrito no item 4.8.

4.10 Ensaio de biodegradao

Os testes de biodegradao da atrazina e oxifluorfem pela cianobactria Microcystis novacekii foram realizados seguindo o protocolo OECD Guidelines for testing of chemicals (2003).

A preparao dos experimentos foi realizada em capela de fluxo laminar, a fim de manter a cultura isenta de contaminao.

Os ensaios foram realizados em erlenmeyers de vidro borossilicato de 250 mL, com volume final de 200 mL do meio de cultura WC. O inculo inicial da Microcystis

novacekii, 10 mL, padronizado em aproximadamente 106 clulas/mL, em fase exponencial de crescimento, foi adicionado em cada frasco, de forma que em cada unidade experimental a concentrao de partida da cianobactria fosse da ordem de 105 clulas/mL. Todos os frascos foram mantidos a temperatura de 25,0 2,0 C, fotoperodo de 12 horas claro/escuro, iluminao por luz fluorescente branca/fria de intensidade 3500 lx. Os testes de biodegradao da atrazina foram incubados sem agitao, j os ensaios de biodegradao do oxifluorfem foram incubados sob agitao contnua (100 rpm).

No quarto dia de crescimento da cultura foram adicionados volumes pr-definidos de soluo estoque dos pesticidas de forma a obter as concentraes finais de 25, 50, 100, 250 e 500 g/L. A soluo estoque dos pesticidas foi preparada dissolvendo-se cada herbicida em metanol grau pesticida e mantendo-se a soluo sob refrigerao e ao abrigo da luz.

O crescimento da Microcystis novacekii na ausncia do pesticida foi utilizado como controle positivo e o meio de cultura no inoculado, adicionado das mesmas concentraes do pesticida, foi usado como controle da degradao espontnea das substncias. Culturas contendo apenas o solvente utilizado como veculo do pesticida (metanol) tambm foram avaliadas para excluir possveis interferncias do solvente no processo de biodegradao. Todas as concentraes e os controles foram testados em triplicata. Na Figura 6 apresentado um esquema do ensaio de biodegradao.

O crescimento da cianobactria foi monitorado por densidade ptica a 680 nm durante 96 horas. Alquotas de 10 mL foram retiradas das culturas, filtradas em filtros Milex 0,45 m, e utilizadas para a quantificao da concentrao do pesticida.

4.11 Metodologia analtica

Atrazina e oxifluorfem foram extrados por extrao em fase slida.

Testes

Meio WC + M. novacekii + pesticida

25 g/L

50 g/L

100 g/L

250 g/L

500 g/L

Controles

Meio WC + pesticida

25 g/L

50 g/L

100 g/L

250 g/L

500 g/L

Controles

Controles

Controle crescimento da M. novacekii Meio WC + M. novacekii

Controle do crescimento na presena do solvente Meio WC + M. novacekii + solvente

Figura 6 Esquema do ensaio de biodegradao Atrazina. As extraes foram conduzidas utilizando cartuchos Oasis HLB (Waters) condicionados com 1 mL de metanol seguido de 1 mL de gua Milli-Q (Millipore). As amostras foram acidificadas (pH 3) com cido clordrico 1N e os cartuchos carregados com 10 mL da amostra, em fluxo de 1 a 3 mL/min sob vcuo. Os cartuchos foram lavados com 1 mL de soluo metanol/gua (5:95). Aps secagem a vcuo por 15 minutos, os herbicidas foram eludos com 1 mL de acetato de etila.

Aps a concentrao, realizou-se a quantificao da atrazina utilizando-se cromatografia em fase gasosa com detector de nitrognio/fsforo (CG-NPD) equipado com coluna DB-1, Agilent Technologies. Fluxo constante 1,4 mL/min. Rampa: 100 por 2 min, 30 C C/min at 170 por 6 mi n, 20 C C/min at 200 por 8 C min, 30 C/min at 280 por 25 min. Injetor: 250 e detector 310 C C C.

Oxifluorfem. As condies de extrao foram as mesmas, com exceo do volume de carregamento da amostra que foi de 1 mL.

Aps a concentrao, realizou-se a quantificao do oxifluorfem utilizando-se cromatografia em fase gasosa com detector de captura de eltrons (CG-ECD) equipado com coluna DB-1, Agilent Technologies. Fluxo constante 1,2 mL/min. Rampa: 100 por 1 min, 30 C C/min at 180 por 2 mi n, 15 C C/min at 250 por 8 C min, 15 C/min at 280 por 40 min. Injetor: 220 e detector 310 C C C.

Em paralelo anlise quantitativa dos pesticidas atrazina e oxifluorfem, foi realizada tambm injeo dos padres de referncia dos mesmos para comparao dos tempos dos picos caractersticos.

4.12 Ensaio de Toxicidade

Os testes de toxicidade da atrazina e oxifluorfem para a cianobactria Microcystis novacekii foram realizados seguindo o protocolo OECD 201 Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test, 2006.

A erlenmeyers de 250 mL, contendo 200 mL do meio de cultura WC, adicionaram-se 10 mL do inculo contendo aproximadamente 106 clulas/mL, em fase exponencial de crescimento. Todos os frascos foram mantidos a temperatura de 25,0 2,0 C, fotoperodo de 12 horas claro/escuro, iluminao por luz fluorescente branca/fria de intensidade 3500 lx e agitao contnua de aproximadamente 100 rpm.

No quarto dia de crescimento da Microcystis novacekii foram adicionados cultura volumes pr-definidos de soluo estoque dos pesticidas de forma a obter as concentraes finais descritas na Tabela 3.

Aps a inoculao dos pesticidas, todos os frascos foram mantidos a temperatura de 25,0 2,0 C, fotoperodo de 12 horas claro/escuro, iluminao por luz fluorescente branca/fria de intensidade 3500 lx e agitao contnua de aproximadamente 100 rpm. Os frascos foram distribudos aleatoriamente na mesa agitadora, sendo as

posies alteradas diariamente, de modo a diminuir possveis diferenas de luminosidade e temperatura no crescimento da cianobactria.

Tabela 3 Concentraes dos pesticidas para o teste de toxicidade Ensaio toxicidade da atrazina Atrazina (g/L) 1000 2000 4000 8000 10000 Ensaio toxicidade oxifluorfem Oxifluorfem (g/L) 2000 4000 8000 16000 20000

Foram realizados controles de crescimento da cianobactria na ausncia da substncia teste e controles do efeito do solvente no crescimento da cianobactria. A concentrao de metanol foi de 0,05% v/v nos frascos dos experimentos. Todas as concentraes teste e os controles foram avaliados em triplicata. Na Figura 7 apresentado um esquema do ensaio de toxicidade.

Testes

Meio WC + M. novacekii + pesticida

C1 g/L

C2 g/L

C3 g/L

C4 g/L

C5 g/L

Controles

Controles

Controle crescimento da M. novacekii Meio WC + M. novacekii

Controle do crescimento na presena do solvente Meio WC + M. novacekii + solvente

Figura 7 - Esquema do ensaio de toxicidade

O crescimento celular das culturas controle e das culturas teste foi monitorado diariamente, durante 96 horas, pela medida da densidade ptica a 680 nm.

De acordo com o protocolo OECD, 2006, a srie de concentraes a ser testada para cada substncia deve, de preferncia, apresentar inibio do crescimento da cianobactria na faixa de 5 a 75%.

4.12.1 Clculo da inibio do crescimento

Os resultados do crescimento obtidos em 96 horas de experimento foram utilizados para calcular os valores da EC50 (dose de pesticida que tem como resposta 50% de inibio do crescimento da espcie) de cada pesticida para a Microcystis novacekii, usando anlise de regresso linear da concentrao do herbicida (ln) pela porcentagem de inibio.

A taxa mdia de crescimento para um perodo especfico (96 horas) foi calculada como o aumento logartmico da densidade das clulas de Microcystis novacekii para cada concentrao e controles testados, de acordo com a frmula n 1, a seguir:

i-j = ln Xj ln Xi (dia-1) tj - ti Onde:

(n 1 )

i-j a mdia especfica de crescimento do perodo i a j; Xi a medida do crescimento no tempo i; Xi a medida do crescimento no tempo j. Para calcular a porcentagem de inibio referente a cada concentrao testada, aplicou-se a frmula n 2: % Ir = c - t x 100 c (n 2)

Onde: %Ir a porcentagem de inibio na taxa de crescimento (referente quela concentrao); c a taxa de crescimento mdio do grupo controle; t a taxa de crescimento mdio para a concentrao avaliada. Para a finalidade de clculo da porcentagem de inibio da cianobactria pelos pesticidas, foi considerado grupo controle as unidades de meio de cultivo sem adio do pesticida, mas com a presena do solvente usado como veculo dos herbicidas (metanol), com o objetivo de eliminar as interferncias da presena do solvente no crescimento da espcie.

As porcentagens de inibio do crescimento em funo do logaritmo das concentraes dos pesticidas foram inseridas em grfico e o valor da concentrao que levou a 50% de inibio foi estabelecida por interpolao, utilizando-se a equao da reta.

5 RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 Identificao e grau de pureza dos pesticidas atrazina e oxifluorfem

A confirmao estrutural da atrazina e do oxifluorfem foi obtida por meio dos espectros no IV, de RMN 1H e de RMN 13C e DEPT (atrazina).

Aps purificao por recristalizao, a atrazina foi obtida como um slido amorfo de cor branca, conforme descrito no The NRA Review of Atrazine (1997) e o oxifluorfem como um slido amorfo de cor amarela compatvel com a descrio da substncia pura no USDA (2005).

Os espectros no IV dos pesticidas atrazina (Figura 8) e oxifluorfem (Figura 11) foram comparados com as principais absores descritas no Clarkes Analysis of Drugs and Poisons e mostraram-se concordantes.

Nas Tabelas 4 e 5 esto apresentadas as principais absores no IV para os herbicidas atrazina e oxifluorfem, respectivamente, assim como os valores dos deslocamentos qumicos dos sinais observados nos espectros de RMN 1H e RMN
13

C e suas atribuies.

No espectro de RMN 1H para a atrazina, Figura 9, verifica-se um multipleto em 7,77 7,64 correspondente a 2H do grupo N-H. Dois quartetos foram observados em 4,0 e 3,28 correspondentes aos hidrognios 2 e 2, respectivamente. Observou-se tambm um multipleto em 1,21 1,02 correspondente a 9H (H1 e H1).
13

A anlise do espectro de RMN

C e DEPT (atrazina), Figura 10, indicou a presena

de sinais correspondentes aos carbonos metlicos (C1 e C1), metilnicos (C2 e C2) e aos carbonos aromticos (C3 e C4). As atribuies esto apresentadas na Tabela 4.

Tabela 4 Dados espectromtricos da atrazina IV: Figura 8 max (cm-1) 804 1343 1402 1539 1616 2972 3113 e 3253 RMN 1H (DMSO, 200 MHz): Figura 9 (ppm) 7,77 7,64 4,00 3,28 1,21 1,02 Multiplicidade m q q m Integral 2H 1H 2H 9H Atribuio N-H H2 H 2 H1 e H1 J (Hz) J2-1 6,6 J2-1 6,4 Atribuio C Cl (deformao angular) C N amina (deformao angular) C H metila (deformao angular) N H amina (deformao angular) C = N imina (estiramento) C H aliftico (deformao angular) N H amina secundria (deformao angular)

RMN 13C (DMSO, 50MHz): Figura 10 (ppm) 167,54 165,18 e 164,50 42,00 35,01 22,11 14,30 Atribuio C6 C2 C 2 C 2 C 1 (2 C) C 1

98,9 98 96 94 92 90
3253 3113

2972 965 876

88 86
1243

837 692 1055 1264 1616 1166 1304 1126 1343 1402 991 1456

84 %T 82 80 78 76 74 72 70 68 66 65,0 4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600
1539

804

1400

1200

1000

800

650,0

Figura 8 Espectro no IV da atrazina

Cl

6
N

2
N

N H

1 2

HN

1 2

1.25

1.00

0 .49

1 0.0

9 .5

9 .0

8 .5

8 .0

7 .5

7.0

6 .5

6 .0

5 .5

5.0

4 .5

4 .0

3.5

3.0

2 .5

2 .0

1.5

4 .67

1.121 1.093 1.066 1.019

Cu rr en t Da ta P ar am et er s NA ME a tr a EX PN O 1 PR OC NO 1 F2 - A cq ui si ti on P ar am et er s Da te _ 2 00 90 32 0 Ti me 12 .0 7 IN ST RU M sp ec t PR OB HD 5 m m Mu lt in uc l PU LP RO G z g3 0 TD 32 76 8 SO LV EN T D MS O NS 16 DS 2 SW H 4 13 9. 07 3 Hz FI DR ES 0 .1 26 31 4 Hz AQ 3. 95 84 24 3 se c RG 18 1 DW 12 0. 80 0 us ec DE 7 .5 0 us ec TE 0. 0 K D1 1 .0 00 00 00 0 se c MC RE ST 0 .0 00 00 00 0 se c MC WR K 0 .0 15 00 00 0 se c == == == == C HA NN EL f 1 == == == == NU C1 1H P1 11 .2 0 us ec PL 1 -2 .0 0 dB SF O1 20 0. 13 12 35 9 MH z F2 - P ro ce ss in g pa ra me te rs SI 32 76 8 SF 20 0. 13 00 00 3 MH z WD W EM SS B 0 LB 0 .3 0 Hz GB 0 PC 1 .4 0

7.767 7.731 7.689 7.641

4.053 4.020 3.987 3.954 3.343 3.275 3.244 3.211 3.179

2.499

1 .0

0 .5

pp m

Figura 9 Espectro de RMN 1H (DMSO deuterado, 200 MHz) da atrazina

1 68 . 1 8

1 67 . 5 4

16 4 .5 0 1 6 4. 0 9

16 5 . 41

16 5 . 18

42 . 0 2 4 0 . 77

3 9. 5 2

39 . 1 0

38 . 6 8 3 8 . 27

2 2. 1 3

21 . 9 5
== CP NU PC PL PL PL SF

Cu rre nt Da ta Par ame ter s NA ME atr a EX PNO 2 PR OCN O 1 F2 - Acq ui sit ion Pa ram et ers Da te_ 2 009 032 0 Ti me 1 2.1 0 IN STR UM s pec t PR LPR OG 5 mm Mu lti nuc l PU OBH D zg pg3 0 TD 6 553 6 SO LVE NT DMS O NS 21 4 DS 4 SW H 12 562 .81 4 Hz FI DRE S 0 .19 169 3 Hz AQ 2. 608 382 7 sec RG 3 276 8 DW 39 .80 0 use c DE 7.5 0 use c TE 0. 0 K D1 2.0 000 000 0 sec d1 1 0.0 300 000 0 sec MC RES T 0.0 000 000 0 sec MC WRK 0.0 150 000 0 sec == === === C HAN NEL f1 == == === = NU C1 13 C P1 1 0.0 0 use c PL 1 0.0 0 dB SF O1 50. 328 244 0 MHz === === C HAN NEL f2 == == === = DPR G2 wal tz1 6 C2 1H PD2 7 0.0 0 use c 2 - 2.0 0 dB 12 1 3.9 2 dB 13 12 0.0 0 dB O2 2 00. 130 800 5 MHz

Cl

6 N

N 2 4 N HN

N H 2

F2 - Pro ce ssi ng par ame te rs SI 3 276 8 SF W 50. 322 750 3 MHz WD EM SS B 0 LB 3.0 0 Hz GB 0 PC 1.0 0

1 2

22 0

20 0

180

160

140

120

100

80

60 42 . 00 4 1 . 82

40 3 5. 0 1 2 2. 2 7 2 2. 1 1 4 1 .6 4

20 21 . 9 4 14 . 65 1 4 . 30

14 . 6 6 1 4 . 31 0

4 0 . 35

3 5 . 03

3 9 .9 3

2 2 .3 0

ppm

Cu rr ent Da ta Par am ete rs NA PN at ra EX ME O 3 PR OC NO 1 F2 - Ac qui sit ion P ara met Da te _ 2 00 903 20 Ti me 12. 26 IN ST RUM spe ct PR OB HD 5 mm Mu lt inu cl PU de pt1 35 TD LP ROG 655 36 SO LV ENT DM SO NS 77 DS 4 SW H 11 99 0.4 07 FI DR ES 0 .1 829 59 AQ 2. 73 290 11 RG 163 84 DW 4 1.7 50 DE 7. 00 TE CN D1 d2 d1 DE MC MC ST 2 2 LT A RE ST WR K 1 45. 2.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 00 00 03 00 00 00 15 0 000 000 448 020 012 000 000 .0 00 00 28 00 73 00 00 ers

Hz Hz sec use c use c K sec sec sec sec sec sec

== == === = C HAN NEL f 1 = === === = NU C1 1 3C P1 10. 00 use c p2 20. 00 use c PL 1 0. 00 dB SF O1 50. 32 774 08 MHz == CP NU P3 p4 PC PL PL SF F2 SI SF WD SS LB GB PC == === = C HAN NEL f 2 = === DP RG2 wa ltz 16 C2 1H 11. 20 22. 40 PD 2 70. 00 2 -2. 00 12 13. 92 O2 2 00. 13 080 05 - Pr oce ssi ng pa ram ete 327 68 50. 32 275 09 W EM B 0 3. 00 0 1. 40 === = use c use c use c dB dB MHz rs MHz Hz

2 10

2 00

19 0

18 0

170

1 60

1 50

14 0

130

1 20

1 10

10 0

90

80

70

60

50

40

30

20

10

p pm

Figura 10 Espectros atrazina de RMN 13C e DEPT (DMSO deuterado, 50 MHz)

Em relao ao oxifluorfem, no espectro de RMN 1H, Figura 12, foram observados dupletos em 7,92 e 7,20 correspondentes aos hidrognios H3 / H6; dupletos em 7,79 e 6,70 atribudos aos hidrognios H5 / H8; um dupleto duplo em 7,58 e outro em 6,44 correspondentes aos hidrognios H4 / H7. Verificou-se tambm a presena de um quarteto em 4,14 e um tripleto em 1,49 correspondentes aos hidrognios H2 e H1, respectivamente, do grupo etila.
13

No espectro de RMN sinais

C do oxifluorfem, Figura 13, verificou-se a presena dos aos deslocamentos dos carbonos aromticos, do

correspondentes

grupamento CF3 e dos carbonos do grupo alquil cujas atribuies esto apresentadas na Tabela 5.

Tabela 5 Dados espectromtricos do oxifluorfem IV: Figura 11 max (cm-1) 3122 2985 1609; 1577; 1501 1265 e 1121 1519 e 1323 1078 RMN 1H (DMSO, 200MHz): Figura12 (ppm) 7,92 7,79 7,58 Multiplicidade d d dd Integral 1H 1H 1H Atribuio H-3 ou H-6 H-5 ou H-8 H-4 ou H-7 J (Hz) J3-4 ou J6-7 = 9,0 J5-4 ou J8-7 = 1,5 J4-3 ou J6-7 = 8,5 J4-5 ou J7-8 = 1,5 7,20 6,70 6,44 d d dd 1H 1H 1H H-3 ou H-6 H-5 ou H-8 H-4 ou H-7 J4-3 ou J6-7 = 8,5 J5-4 ou J8-7 = 2,4 J4-3 ou J6-7 = 9,0 J4-5 ou J7-8 = 2,4 4,14 1,49 q t 2H 3H H-2 H-1 J2-1 = 7,0 J1-2 = 7,0 Atribuio C H aromtico (deformao angular) C H aliftico (deformao angular) C = CH aromtico (estiramento) C-O-C diaril ter (deformao angular) NO2 aromtico (deformao angular) C-O ter aliftico (deformao angular)

RMN 13C (DMSO, 50MHz): Figura 13 (ppm) 160,95; 155,00; 153,66; 135,68; 128,81; 128,22; 127,29; 125,72; 122,02; 108,21; 103,89 65,90 14,57 C2 C1 Atribuio C aromtico e C-F3

98,7

96
3122

94 92 90 88 86 %T 84 82 80 78

2985

1397 1622 1609 1471 776 1501 1577 896 749 722 694

886 1519 998 1027 1323 1166 836 823

1245

76 74 72 70,0 4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 1400 1200 1000 800 650,0
1265 1121 1078

Figura 11 Espectro no IV do oxifluorfem

7.940 7.895 7.797 7.790 7.608 7.600 7.565 7.271 7.226 7.184 6.704 6.692 6.474 6.462 6.429 6.417

4.193 4.158 4.123 4.088

1.522 1.487 1.452 1.256

Current Data Parameters NAME oxy EXPNO 1 PROCNO 1 F2 - Acquisition Parameters Date_ 20090320 Time 12.41 INSTRUM spect PROBHD 5 mm Multinucl PULPROG zg30 TD 32768 SOLVENT CDCl3 NS 16 DS 2 SWH 4139.073 Hz FIDRES 0.126314 Hz AQ 3.9584243 sec RG 362 DW 120.800 usec DE 7.50 usec TE 0.0 K D1 1.00000000 sec MCREST 0.00000000 sec MCWRK 0.01500000 sec ======== CHANNEL f1 ======== NUC1 1H P1 11.20 usec PL1 -2.00 dB SFO1 200.1312359 MHz F2 - Processing parameters SI 32768 SF 200.1300003 MHz WDW EM SSB 0 LB 0.30 Hz GB 0 PC 1.40

O
2

F3C
8

O Cl
4 3

NO2

OXYFLUORFEM

1.86

1.00

1.05

0.97

0.98

2.02

9.0

8.5

8.0

7.5

7.0

6.5

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

3.20

1.0

0.5

0.0

0.000 ppm

Figura 12 - Espectro de RMN 1H (DMSO deuterado, 200 MHz) do oxifluorfem

160.95 155.00 153.66

135.68 128.81 128.22 127.29 125.72 122.02

108.21 103.89

77.86 77.23 76.59

65.90

14.57
Current Data Parameters NAME oxy EXPNO 2 PROCNO 1 F2 - Acquisition Parameters Date_ 20090320 Time 12.46 INSTRUM spect PROBHD 5 mm Multinucl PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT CDCl3 NS 175 DS 4 SWH 12562.814 Hz FIDRES 0.191693 Hz AQ 2.6083827 sec RG 32768 DW 39.800 usec DE 7.50 usec TE 0.0 K D1 2.00000000 sec d11 0.03000000 sec MCREST 0.00000000 sec MCWRK 0.01500000 sec ======== CHANNEL f1 ======== NUC1 13C P1 10.00 usec PL1 0.00 dB SFO1 50.3282440 MHz ======== CHANNEL f2 ======== CPDPRG2 waltz16 NUC2 1H PCPD2 70.00 usec PL2 -2.00 dB PL12 13.92 dB PL13 120.00 dB SFO2 200.1308005 MHz F2 - Processing parameters SI 32768 SF 50.3227191 MHz WDW EM SSB 0 LB 3.00 Hz GB 0 PC 1.40

O
2

F 3C
8

O Cl
4 3

NO2

O X Y FLU O R FE M

220

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20

ppm

Figura 13 - Espectro de RMN 13C (CDCl3, 50 MHz) do oxifluorfem Os espectros obtidos so compatveis com as estruturas qumicas dos herbicidas.

A pureza da atrazina e do oxifluorfem, aps a recristalizao, foi determinada pela injeo em cromatgrafo a gs do padro de referncia e da substncia purificada (teste). Foram preparadas solues de trs concentraes do padro e do teste, em triplicata, em acetato de etila.

Os resultados de pureza da atrazina, determinados por integrao da rea do pico no tempo de reteno de 14,3 minutos, esto apresentados na Tabela 6.

Na Figura 14 apresentado um cromatograma da injeo do padro da atrazina e da substncia purificada. Pode-se observar a sobreposio dos picos referentes ao herbicida indicando pureza superior a 99% e a ausncia de outros picos.

Tabela 6 Determinao da pureza da atrazina por injeo no CG juntamente com o padro cromatogrfico Concentrao (ng/L) 1 2,04 2,04 2,04 2 3,06 3,06 3,06 3 4,08 4,08 4,08 2,07599 2,05247 2,05530 3,01773 3,02081 3,01395 4,10311 4,10704 4,09361 2,02637 2,02462 2,02976 3,05595 3,04945 3,04673 4,05103 4,03410 4,06693 Resultado pureza: 99,40% 98,76 % 101,10 % 98,33 % Padro (ng/L) Teste (ng/L) % Pureza

Figura 14 Cromatograma do padro de referncia e da atrazina purificada.

Na Tabela 7 esto descritos os resultados referentes ao grau de pureza do oxifluorfem.

Na Figura 15 apresentado um cromatograma da injeo do padro do oxifluorfem e da substncia purificada. Verifica-se a sobreposio dos picos no tempo de reteno de 14,0 minutos e o alto grau de concordncia entre eles, alm da ausncia de outros picos.

Tabela 7 Determinao da pureza do oxifluorfem por injeo no CG juntamente com o padro cromatogrfico Concentrao (ng/L) 1 6,24 6,24 6,24 2 9,36 9,36 9,36 3 12,48 12,48 12,48 6,65595 6,65296 6,65498 8,51785 8,54478 8,52958 12,94701 12,87837 12,85852 6,56996 6,56658 6,57763 8,68028 8,66887 8,68077 12,79743 12,78538 12,88224 Resultado pureza: 99,96 % 99,43 % 101,71 % 98,75 % Padro (ng/L) Teste (ng/L) % Pureza

Figura 15 Cromatograma do padro de referncia e do oxifluorfem purificado.

Os valores mdios de pureza foram 99,4% e 99,9% (ambos acima de 95%) para atrazina e oxifluorfem, respectivamente, possibilitando utilizao dos mesmos nos experimentos de toxicidade e biodegradao.

5.2 Contagem celular X densidade ptica

A metodologia de contagem celular ao microscpio ptico para obteno da densidade celular da cultura da cianobactria uma tcnica tradicional, porm trabalhosa, demorada e que apresenta uma grande variabilidade. Mtodos alternativos so propostos na tentativa de estimar, com maior preciso, o crescimento celular.

Vrios estudos j foram realizados utilizando a correlao entre contagem celular e a densidade ptica a 680 nm (DO680) para monitoramento do crescimento de algas (MA et al., 2001, MA e CHEN, 2005; DELORENZO, SCOTT e ROSS, 2001; ROJIOKOV-PADRTOV, 1999; TANG, HOAGLAND SIEGFRIED, 1997). O prprio Guia da Organization for Economic Cooperation and Development (OECD), 2006, para o teste de toxicidade de substncias qumicas sobre microalgas e cianobactrias, prev o uso da densidade ptica como forma de acompanhamento do crescimento desses organismos, desde que exista uma boa correlao entre as medidas realizadas e a contagem celular. O comprimento de onda 680 nm o mais utilizado para o monitoramento do crescimento de cianobactrias.

O monitoramento do crescimento celular da Microcystis novacekii por meio da contagem por microscopia ptica e por densidade ptica a 680 nm apresentou correlao linear de 91%, sendo possvel a utilizao da densidade ptica para estimar rapidamente o crescimento celular da espcie. A curva de correlao apresentada na Figura 16.

A correlao entre absorvncia e contagem celular tambm foi avaliada para a cianobactria na presena dos pesticidas, j que a exposio aos mesmos poderia interferir no espectro de absoro, comprometendo a correlao entre os dois parmetros de contagem. Na presena de atrazina (100 g/L) a correlao se manteve (r2 = 0,89), indicando que na faixa de concentrao avaliada a exposio ao pesticida no altera significativamente a relao entre as duas variveis (Figura 17).

Contagem celular x absorvncia Controle

0,080 0,070 Absorvncia 0,060 0,050 0,040 0,030 0,020 0,010 0,000 0 20000 40000 60000 80000
2

100000

Contagem (cel/m L)

r = 0,91

Figura 16 Correlao entre absorvncia a 680 nm e contagem celular para Microcystis novacekii.

Contagem celular x absorvncia Atrazina

0,120 0,100 Absorvncia 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 0 50000 100000 Contagem (cel/m L) 150000
2

200000

r = 0,89

Figura 17 Correlao entre absorvncia a 680 nm e contagem celular para Microcystis novacekii na presena de atrazina (100 g/L).

O mesmo foi observado com relao ao oxifluorfem. Na Figura 18 apresentada a curva de correlao entre a contagem ao microscpio ptico e a densidade celular da Microcystis novacekii na presena de oxifluorfem (1000 g/L). O coeficiente de correlao linear foi de 0,84.

Embora o coeficiente de correlao seja menor que o observado para a cultura no exposta aos pesticidas, a grande variabilidade no mtodo de contagem ao

microscpio ptico e o pequeno nmero de observaes podem ser responsveis por essas variaes.

Em ambos os casos as correlaes observadas foram consideradas aceitveis para a avaliao do crescimento da espcie frente aos pesticidas, permitindo a utilizao da densidade ptica para estimar o crescimento da Microcystis novacekii nos testes de toxicidade e biodegradao.

Contagem celular x absorvncia Oxifluorfem

0,100 0,080 Absorvncia 0,060 0,040 0,020 0,000 0 20000 40000 60000 80000
2

100000

Contagem (cel/m L)

r = 0,84

Figura 18 - Correlao entre absorvncia a 680 nm e contagem celular para Microcystis novacekii na presena de oxifluorfem (1000 g/L).

5.3 Ensaios de biodegradao

Segundo a OECD (2003), a necessidade de avaliao da biodegradao de pesticidas deve-se ao fato de que a degradao de compostos orgnicos no ambiente influencia a exposio das vrias espcies aos mesmos, sendo, portanto, um parmetro importante para a estimativa dos riscos e efeitos adversos s espcies. Alm de fornecer informaes e subsidiar decises a respeito das aplicaes biotecnolgicas.

Este mtodo padro de avaliao de biodegradao de xenobiticos estabelece uma variao na concentrao do xenobitico de forma a obter-se estimativas de biodegradao em diferentes concentraes. Baixas concentraes das substncias

devem ser testadas, garantindo que a cintica de biodegradao obtida nos ensaios reflita quela esperada no ambiente que est sendo simulado.

Para os estudos da biodegradao da atrazina e do oxifluorfem foram estabelecidas inicialmente concentraes a serem testadas supondo que a degradao do pesticida teria uma cintica linear com relao a concentrao de exposio. Ao mesmo tempo, as concentraes deveriam permanecer em uma faixa compatvel com as observadas para os pesticidas nos programas de monitoramento.

5.3.1 Biodegradao atrazina

A quantificao da atrazina nos testes de biodegradao foi obtida por integrao da rea do pico referente ao pesticida, comparada com a curva de calibrao apresentada na Figura 19.

Embora a extrao em fase slida seja um procedimento bem estabelecido, com resultados sistemticos, a padronizao do mtodo de extrao foi avaliada para ambos os pesticidas. Nas condies padronizadas (item 4.11) a taxa de recuperao mdia da atrazina foi de 96,4%.

Curva calibrao atrazina 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Concentrao (ng/mcL)

rea

r2 = 0,99988 y = 100,245 x + 0,58124

0,35

0,4

0,45

Figura 19 Curva de calibrao para quantificao atrazina

Os ensaios de biodegradao foram realizados durante quatro dias. A inoculao do pesticida no meio de cultura no promoveu alteraes visveis sobre o crescimento

da cultura. No foi observado descoramento, aglutinao ou qualquer outro comportamento atpico.

Os resultados referentes remoo da atrazina pela Microcystis novacekii, durante 96 horas de experimento, so apresentados na Tabela 8. Na Figura 20 pode-se observar a variao da densidade ptica com o tempo de monitoramento.

Tabela 8 Resultados da biodegradao da atrazina pela cianobactria Microcystis novacekii Concentrao Avaliada (g/L) Incio Experimento (g/L) A Final Experimento (g/L) B Porcentagem Degradao A-B

Controles (sem Microcystis novacekii) 25 50 100 250 500 23,22 55,89 107,12 224,67 602,28 22,87 57,03 88,49 232,04 548,38 1,51 1,02* 17,39 1,03* 8,95

Testes (com Microcystis novacekii) 25 50 100 250 500 24,51 46,54 120,10 258,35 580,74 22,88 34,41 79,20 196,21 397,89 6,65 26,06 34,05 24,05 31,49

Variao entre as taxas de biodegradao e degradao espontnea (%) (Testes Controles) 25 50 100 250 500
*Variaes das condies analticas sem significado experimental.

5,14 26,06 16,66 24,05 22,54

Os maiores valores de remoo, em relao degradao espontnea do pesticida, foram encontrados nas concentraes 50, 250 e 500 g/L e a mdia de degradao obtida foi de 22,2%, considerando as concentraes de 50 a 500 g/L.

Nas concentraes do pesticida menores que 50 g/L a degradao foi pouco significativa com relao ao controle (5,1%).

Crescimento da Microcystis novacekii durante ensaio biodegradao atrazina 0,140 0,120 Absorvncia 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 0 24 48 72 96 120 Tempo (horas)

Controle Cianobactria Controle solvente Teste 25 mcg/L Teste 50 mcg/L Teste 100 mcg/L Teste 250 mcg/L Teste 500 mcg/L

Figura 20 Monitorizao por DO680 do crescimento da Microcystis novacekii durante ensaio de biodegradao da atrazina

Estes resultados so concordantes com alguns estudos descritos na literatura para a degradao da atrazina por outros micro-organismos. No trabalho de Mandelbaum, Allan e Wackett (1995) relatada a degradao de 17% do herbicida por uma cepa de Pseudomonas em amostras de solo contaminadas com 1,5 g/g do pesticida.

Resultados semelhantes so descritos por Iuv e El (1975) para degradao e acumulao de outro herbicida da classe das triazinas, bastante semelhante atrazina, a simazina, pela cianobactria Anabaena variabilis. A taxa de degradao mxima do herbicida no meio foi de 18%.

Estes dados podem ser justificados pela grande estabilidade desse pesticida no meio aquoso. Nos estudos de monitoramento ambiental a atrazina um dos pesticidas mais encontrados. Sua estabilidade em meio aquoso neutro, aliada a

baixa taxa de biodegradao pelas espcies aquticas so responsveis pela sua grande persistncia ambiental.

conhecido, entretanto, que existe grande variabilidade entre os micro-organismos na efetividade de degradao da atrazina. Gonzlez-Barreiro et al. (2006) em estudo avaliando a capacidade de remoo de herbicidas triaznicos do meio de cultura pela cianobactria Synechococcus elongatus verificou que a mesma foi capaz de remover at 80% da atrazina do meio em 24 horas.

A biodegradao dependente basicamente dos fenmenos de captao, fortemente relacionados lipofilia, dos mecanismos de transporte transmembrana e da capacidade dos sistemas metablicos da espcie de utilizar o xenobitico (compostos qumicos estranhos a um organismo ou sistema biolgico) como substrato, promovendo alteraes estruturais que visam, em ltima anlise, a detoxificao celular.

Quando se consideram diferentes espcies, a capacidade metablica pode sofrer grandes variaes e as vias enzimticas podem atuar de forma diferenciada frente ao xenobitico. A Microcystis novacekii, aparentemente, apresenta capacidade metablica limitada para degradao da atrazina, ao contrrio do observado para a espcie Synechococcus elongatus. A espcie, Microcystis novacekii, portanto, pode apresentar uma forma de remoo ou uma via de degradao diferente para a atrazina.

Struthers, Jayachandran e Moorman (1998) verificaram que a incorporao celular e a mineralizao da atrazina era dependente da presena de fontes de carbono adicionais ao meio de cultura de espcies bacterianas no fotossintetizantes. Nas condies experimentais, onde a atrazina era a nica fonte de carbono, a taxa de degradao da mesma foi menor do que 10%. A adio de sacarose ao meio fez com que esses valores atingissem quase 60%.

Considerando que nos experimentos realizados a atrazina era a nica fonte de carbono presente no meio WC e o perodo relativamente curto da durao do ensaio (96 horas), novos estudos devem ser conduzidos alterando-se as condies de

cultivo e o tempo de exposio, buscando aumentar as taxas de biodegradao da atrazina pela Microcystis novacekii.

A existncia de concentraes limtrofes de pesticidas para desencadear o processo de biodegradao recebe pouca ateno na literatura, mas relevante quando o micro-organismo exposto a concentraes extremamente baixas de um xenobitico. Por exemplo, apesar das taxas de biodegradao do fenol, benzoato, benzilamina e 4-nitrofenol em ambientes aquticos serem lineares por uma ampla faixa de concentrao dos substratos, que se estende entre ng/L e g/L, foi verificado que as taxas de biodegradao do 2,4-D em concentraes da ordem de g/L foram extremamente baixas (BOETHLING e ALEXANDER, 1979). Esta observao foi em seguida confirmada para outros compostos por Hoover et al. (1986).

Estes dados podem ser interpretados como suporte ao conceito da existncia de uma concentrao limiar, abaixo da qual a biodegradao no ocorre, ou acontece em taxas insignificantes. Embora as razes para a existncia dessa concentrao limiar no estejam completamente elucidadas, duas hipteses podem ser apresentadas. Primeiro: as concentraes do substrato podem ser muito baixas para um efetivo transporte para dentro da clula. Segundo: pode haver uma concentrao limitante (mnima) do substrato necessria para a induo do sistema enzimtico. Em concentraes muito baixas as enzimas necessrias podem no ser ativadas, e isto poderia ser um fator limitante para a biodegradao (NEILSON e ALLARD, 2007).

Nos cromatogramas obtidos no foi verificada a presena de outros picos significativos que pudessem representar a formao de metablitos de degradao da atrazina. O ocorrido pode estar relacionado com o mtodo analtico utilizado. No entanto, este fato pode sugerir tambm acumulao do pesticida pela Microcystis novacekii e no uma degradao. Geller (1980) avaliando o potencial de biodegradao da atrazina por bactrias isoladas de solo, verificou que o herbicida no era degradado pelos micro-organismos, mas se ligava s clulas bacterianas, sendo removido do meio.

Megharaj et al. (1994) observaram que algas verdes e cianobactrias foram capazes de metabolizar o metilparation, convertendo-o ao produto de hidrlise e, em seguida, utilizar o p-nitrofenol como fonte de carbono fazendo sua completa remoo do meio.

Trabalhando-se com concentraes residuais, a possvel formao de metablitos no meio de cultivo pode ocorrer em concentraes muito baixas, dificultando sua recuperao durante o procedimento analtico.

De acordo com OECD (2003), baixas concentraes das substncias teste devem ser utilizadas nos ensaios para determinar as taxas de biodegradao. As concentraes no devem ser elevadas de forma a garantir que a cintica obtida no teste reflita aquela esperada para as condies ambientais. Altas concentraes so geralmente utilizadas em testes com objetivo de identificao e quantificao dos produtos de transformao.

De toda forma, a remoo mdia de 22,2% da atrazina pela Microcystis novacekii em condies de cultivo em laboratrio sugere que a cianobactria pode desempenhar um papel considervel na recuperao de ambientes aquticos contaminados por este herbicida; particularmente quando se trata de um tempo de monitoramento de apenas 96 horas. No entanto, podem ser consideradas alteraes nas condies experimentais para os prximos estudos, a fim de otimizar os resultados obtidos.

5.3.2 Biodegradao oxifluorfem

A quantificao do oxifluorfem foi obtida por integrao da rea do pico referente ao pesticida, comparada com a curva de calibrao do mesmo (Figura 21).

A taxa de recuperao mdia do oxifluorfem pela metodologia de SPE, seguindo as condies padronizadas pelo item 4.11, foi de 81,7%.

Curva calibrao oxifluorfem 500000 450000 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 Concentrao (ng/mcL)

rea

r2= 0,99237 y = 1,06*107 x 19236,05

0,03

0,035

0,04

0,045

Figura 21 Curva de calibrao para quantificao do oxifluorfem

Os resultados referentes ao teste de biodegradao do oxifluorfem pela Microcystis novacekii, aps 96 horas de experimento, so apresentados na Tabela 9.

Tabela 9 Resultados da biodegradao do oxifluorfem pela cianobactria Microcystis novacekii Concentrao Avaliada (g/L) Incio Experimento (g/L) A Final Experimento (g/L) B Porcentagem Remoo AB

Controles (sem Microcystis novacekii) 25 50 100 250 500 26,08 42,63 98,08 276,48 418,80 24,77 30,47 79,77 111,18 58,50 5,0 28,5 18,7 59,8 86,0

Testes (com Microcystis novacekii) 25 50 100 250 500 15,12 10,92 12,88 21,00 36,17 9,62 10,48 10,90 12,47 13,42 36,4 4,0 15,4 40,6 62,9

Na Figura 22 pode-se observar a curva de crescimento da cultura da Microcystis novacekii estimada por DO680 durante as 96 horas de monitoramento.

Crescimento da Microcystis novacekii durante biodegradao oxifluorfem

0,150 Ab so rvncia 0,120 0,090

Controle Cianobactria Controle Solvente Oxifluorfem 25 mcg/L Oxifluorfem 50 mcg/L

0,060 0,030 0,000 0 24 48 72 96 120 Tempo (horas)

Oxifluorfem 100 mcg/L Oxifluorfem 250 mcg/L Oxifluorfem 500 mcg/L

Figura 22 Monitorizao por DO680 do crescimento da Microcystis novacekii durante ensaio de biodegradao do oxifluorfem

Os resultados em termos de remoo do herbicida do meio de cultivo apresentaram difcil sistematizao. Verificou-se logo no incio do experimento uma diferena entre os valores encontrados para os grupos controle e teste. As concentraes de oxifluorfem nos testes foram bem menores do que no grupo controle.

Considerando o curto perodo de contato entre a cianobactria e o pesticida, descartou-se a possibilidade de biodegradao do mesmo. As evidncias podem sugerir tratar-se de adsoro do oxifluorfem pelas clulas da Microcystis novacekii.

descrito na literatura a capacidade das algas e cianobactrias em apresentar na superfcie celular stios de adsoro de metais pesados e de uma srie de substncias dissolvidas no meio aquoso; particularmente quando estas apresentam na sua superfcie grupos catinicos. Essas propriedades fazem desses organismos potenciais adsorventes de uma grande variedade de xenobiticos do ambiente. No entanto, os mecanismos bioqumicos responsveis por essa remoo e assimilao so pouco conhecidos (HUNTLEY, 1989).

Alguns autores afirmam que o primeiro passo na biodegradao de um pesticida decorrente de um processo passivo envolvendo a partio do composto entre o meio

externo aquoso e a poro hidrofbica da clula. Segundo Cceres, Megharaj e Naidu (2008), a bioacumulao de substncias qumicas em ambientes aquticos ocorre quando a taxa de captao excede a taxa de eliminao e parece estar relacionada ao coeficiente de partio octanol /gua (Kow). Substncias qumicas e seus metablitos com Kow maior que 3 tendem a um maior potencial de bioacumulao. Considerando que o Kow do oxifluofem 4,47 (EXTOXNET, 2002), ele se encaixa neste perfil.

Os compostos orgnicos hidrofbicos, como o oxifluorfem, no se associam com todas as partculas de uma forma semelhante, preferindo se ligar a superfcies lipdicas ou com alto teor de carbono orgnico. O equilbrio de concentrao entre um composto orgnico hidrofbico e as algas e cianobactrias, por exemplo, descrito como fator de bioacumulao (BAF Bioaccumulation Factor). O fator de bioacumulao pode apresentar diferentes valores para compostos e espcies diferentes. O tipo de lipdeo que constitui a parede celular dos micro-organismos tambm pode alterar o fator de bioacumulo (SWACKHAMER e SKOGLUND, 1991).

Encontram-se descritos na literatura para o gnero Microcystis sp valores para o fator de bioacumulao para bifenilas policloradas de 1.000 a 1.000.000; tais valores so considerados muito elevados, indicando o grande potencial do gnero na remoo destes compostos do meio (SWACKHAMER e SKOGLUND, 1991).

A remoo de compostos orgnicos hidrofbicos pode ser por simples soro na superfcie ou por ligantes presentes na parede celular seguido de transporte ativo. O equilbrio pode ser atingido em poucas horas a at trs dias. No entanto, os relatos na literatura de trabalhos realizados que elucidem os mecanismos so escassos (SWACKHAMER e SKOGLUND, 1991).

Gonzlez-Barreiro et al. (2006) verificaram que pesticidas mais lipoflicos e consequentemente com maior coeficiente de partio (Kow) apresentam tendncia de serem removidos do meio de cultura mais rapidamente atravs de adsoro pelas clulas das algas e cianobactrias.

Dhanaraj, Kumar e Lal (1989) verificaram a capacidade de duas cianobactrias, Anabaena sp e Aulosira fertilissima em bioconcentrar os pesticidas aldrin e forato. A remoo dos compostos do meio de cultivo foi diretamente proporcional concentrao dos inseticidas e inversamente proporcional solubilidade dos mesmos em gua. A bioconcentrao do aldrin pela Anabaena sp e pela A. fertilissima foi de 3,9 a 247,5 g/g respectivamente e foi alcanada entre 8 e 16 horas.

Navarro et al. (2009) compararam a habilidade de duas algas marinhas Macrocystis integrifolia e Lessonia migrescens e dois adsorventes abiticos na remoo de fenis de solues aquosas. As algas apresentaram maior potencial de adsoro. Os autores afirmam que a diferena na composio da parede celular altera a capacidade de adsoro de xenobiticos do meio e que o coeficiente de partio octanol/gua desempenha um importante papel na adsoro de compostos orgnicos.

Em estudo conduzido por Jonsson et al. (2001) verificou-se que a alga Chlorella sacchrophila capaz de acumular o pesticida piridafention do meio aquoso e que a taxa de remoo do mesmo diminui enormemente depois que se atinge um alto nvel de concentrao. A espcie apresentou alta capacidade de remoo no incio do experimento, mas com o decorrer do tempo cessou a remoo do composto apesar do decaimento da concentrao do pesticida e da taxa de crescimento da cianobactria.

O fato sugere a ativao de mecanismos celular de detoxificao com provvel saturao ou inibio por altas concentraes do pesticida. Modelos similares de remoo de DDT pelas cianobactrias Anabaena sp e Aulosira fertilissima tambm foram observados (HUNTLEY, 1989).

Em um primeiro momento, no incio do teste, a alterao da concentrao do herbicida no meio de cultivo pode ter sido referente presena da cianobactria, mas os resultados do grupo controle evidenciaram, ao final do experimento, uma elevada remoo do pesticida, principalmente para a concentrao 500 g/L, na qual a taxa de remoo foi de 86,0% nas 96 horas de experimento.

Essa remoo pronunciada do herbicida nos frascos controles pode indicar que outros processos de remoo no biolgica ocorreram, no permitindo, portanto, a afirmao da ocorrncia de bioacumulao do mesmo pela Microcystis novacekii.

Duas hipteses podem ser colocadas com relao remoo do oxifluorfem do meio de cultivo nos frascos controle.

Primeiro: embora nenhum pico adicional tenha sido identificado nos cromatogramas dos testes de biodegradao, pode-se considerar a possibilidade de uma alta taxa de degradao espontnea. Nesse caso, as condies experimentais de extrao podem no ter permitido a deteco dos produtos de degradao.

Uma segunda hiptese de que a alta lipofilia do oxifluorfem e consequentemente baixa solubilidade em meio aquoso tenha propiciado a adeso do pesticida s paredes do frasco. No incio do experimento adicionou-se o pesticida, fez-se rpida homogeneizao e retirou-se amostra para anlise. Com o decorrer do tempo do experimento e a agitao contnua propiciou-se o contato do herbicida com as paredes do frasco. O mesmo pode ter ocorrido com os frascos teste. No primeiro momento, o contato do herbicida com as clulas foi maior, sendo em grande parte removido. O restante ficou disponvel para interao com o recipiente durante o experimento.

Considerando a hiptese de degradao espontnea, deve-se ponderar que o oxifluorfem estvel hidrlise, sendo a fotlise a forma de degradao mais provvel do mesmo. Essa transformao descrita e ocorre principalmente quando o herbicida se encontra em guas lmpidas (SCRANO et al., 1999; USEPA, 2002). Na Figura 23 apresentado esquema de fotlise do oxifluorfem e seus produtos de degradao.

Salienta-se, entretanto, que em ambientes naturais a gua rica em matria orgnica e dependendo do tipo de solo, a gua pode conter elevada turbidez, limitando a penetrao da luz, o que dificulta a degradao por via fotoltica. O oxifluorfem, pode, assim, persistir no ambiente. No se pode, portanto, afirmar que a

cianobactria no exera um papel na degradao do oxifluorfem em condies ambientais.

1. oxifluorfem 2. 2-cloro-1-(3-etoxi-4-hidroxifenoxi)-4-(trifluormetil)benzeno 3. 2-cloro-1-(3etoxi-4-aminofenoxi)-4-(trifluormetil)benzeno 4. 2-cloro-1-(3-hidroxi-4-nitrofenoxi)-4-(trifluormetil)benzeno Fonte: Scrano et al., 1999.

Figura 23 Fotlise do oxifluorfem e a formao de metablitos

O meio de cultura utilizado nos experimentos lmpido e com baixo teor de compostos orgnicos (no h partculas visveis em suspenso) os quais poderiam funcionar como protetores da molcula do herbicida em relao radiao.

Considerando que estudos de monitoramento comprovam a existncia do oxifluorfem como contaminante dos corpos dgua (USDA, 2005; SCRANO et al., 2004; YEN, SHEU e WANG, 2003; LAGANA et al., 2000), presume-se que no meio ambiente a fotodegradao do mesmo no ocorra com tanta intensidade.

Dessa forma, os resultados de remoo encontrados ao final do experimento representam uma possibilidade de remoo do oxifluorfem do meio pela cianobactria, associado a degradao abitica do mesmo ou sua deposio nas paredes do frasco.

Deve-se considerar que a etapa de filtrao do meio de cultivo para a obteno das alquotas para o procedimento analtico pode ter sido um fator colaborador para a

diminuio da concentrao do oxifluorfem nos testes, pois, com a filtrao, a conseqente concentrao celular na membrana pode ter favorecido a reteno do pesticida na biomassa algal.

De qualquer forma, os possveis produtos de fotlise ou a adsoro do pesticida pela Microcystis novacekii no apresentaram toxicidade para a cianobactria durante o experimento, haja vista Figura 20 referente ao crescimento da Microcystis novacekii durante o ensaio de biodegradao do oxifluorfem. Aparentemente esses processos no comprometeram o desenvolvimento da espcie.

Os resultados dos testes de biodegradao indicaram potencial da cianobactria Microcystis novacekii na remoo dos pesticidas atrazina e oxifluorfem do meio de cultivo. Para o oxifluorfem a elucidao dos mecanismos de remoo devem ser melhor investigados. Futura aplicao biotecnolgica da cianobactria no tratamento de corpos dgua e efluentes contaminados por esses herbicidas deve ser considerada.

5.4 Toxicidade

O Protocolo OECD (2006) padroniza as condies experimentais para a determinao dos efeitos de uma substncia no crescimento de microalgas e cianobactrias, com objetivo de avaliar o efeito de substncias qumicas txicas sobre organismos representativos do ecossistema aqutico. Mas, devido complexidade do ambiente aqutico e ao grande nmero de processos aos quais est sujeito um contaminante neste ambiente, existem limitaes na extrapolao para escala ambiental as informaes provenientes dos testes de toxicidade realizados em laboratrio. No entanto, estes testes so imprescindveis para predizer possveis efeitos txicos dos contaminantes sobre espcies aquticas.

Foram realizados ensaios preliminares com o objetivo de estabelecer o intervalo de concentraes a ser utilizado no planejamento dos ensaios de toxicidade. A partir dos resultados obtidos nestes ensaios, preparou-se uma srie de cinco concentraes para cada pesticida, que constituram as solues-teste para o ensaio de toxicidade, conforme apresentado anteriormente na Tabela 3.

Gherardi-Goldstein et al. (1990) alertam para o fato dos resultados dos ensaios de toxicidade e sua confiabilidade dependem do controle adequado das condies de ensaio. No presente trabalho, todos os testes foram realizados com pH ajustado para 7,0 0,5, temperatura de 25 2 fotoperod o 12 horas claro/escuro com C, intensidade luminosa de 3500 lux e agitao contnua de aproximadamente 100 rpm.

5.4.1 Toxicidade atrazina

Os resultados para o teste de toxicidade da atrazina para a Microcystis novacekii so apresentados na Tabela 10 e na Figuras 24 e 25.

Tabela 10 Inibio do crescimento da Microcystis novacekii pelo herbicida atrazina Concentrao Teste (g/L) 1000 2000 4000 8000 10000 r2: 0,9618 Equao da reta: y = -103.12 + 18.35 x EC50 (96 horas): 4202,6 g/L ln (x) 6,9077 7,6009 8,2940 8,9872 9,2103 % Inibio (y) 24,66 37,42 45,53 58,49 70,74

Valores do grfico apresentado na Figura 23

A interpolao do valor de 50% de inibio do crescimento na curva de toxicidade permite a obteno da EC50 (96 horas) da atrazina para a Microcystis novacekii. Esse valor corresponde a concentrao que promove 50 % de inibio do crescimento da espcie. Para a atrazina a EC50 foi de 4,2 mg/L.

Crescimento cianobactria no experimento toxicidade atrazina 0,120 0,100 Absorvncia 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 0 24 48 72 96 120 Tempo (horas) Controle do solvente Teste 1000 mcg/L Teste 2000 mcg/L Teste 4000 mcg/L Teste 8000 mcg/L Teste 10000 mcg/L

Figura 24 Crescimento da Microcystis novacekii estimado por DO680 durante 96 horas de monitoramento do ensaio de toxicidade atrazina

Curva Toxicidade Atrazina 100 80 % Inibio 60 40 20 0 4 5 6 7 ln concentrao 8 9 10

Figura 25 Porcentagem de inibio do crescimento da Microcystis novacekii exposta atrazina por 96 horas

5.4.2 Toxicidade oxifluorfem

Os resultados para o teste de toxicidade do oxifluorfem para a Microcystis novacekii so apresentados na Tabela 11 e nas Figuras 26 e 27.

Tabela 11 Inibio do crescimento da Microcystis novacekii pelo herbicida oxifluorfem Concentrao Teste (g/L) 2000 4000 8000 16000 20000 r2: 0,9442 Equao da reta: y = -63.1051 + 11.567 x EC50 (96 horas): 17639,9 g/L ln (x) 7.6009 8.2940 8.9872 9.6803 9.9035 % Inibio (y) 23.28 36.32 39.23 46.27 53.73

Valores do grfico apresentado na Figura 25

Crescimento da cianobactria no experimento toxicidade oxifluorfem 0,250 0,200 Absorvncia 0,150 0,100 0,050 0,000 0 24 48 72 96 120 Tempo (horas) Controle solvente Teste 2000 mcg/L Teste 4000 mcg/L Teste 8000 mcg/L Teste 16000 mcg/L Teste 20000 mcg/L

Figura 26 Crescimento da Microcystis novacekii estimado por DO680 durante 96 horas de monitoramento do ensaio de toxicidade do oxifluorfem

O valor da EC50 (72 horas) obtido para oxifluorfem foi de 10,9 mg/L. J a EC50 (96 horas), calculada a partir da equao da reta (Tabela 11), para a espcie foi de 17,6 mg/L de oxifluorfem.

Esses resultados evidenciam um potencial da espcie de tolerar altas concentraes do pesticida. Os dados so condizentes com o fato das cianobactrias serem resistentes exposio a vrios xenobiticos, inclusive pesticidas (VIDOTTI e ROLLEMBERG, 2004).

Curva de Toxicidade Oxifluorfem 100 80 % Inibio 60 40 20 0 4 5 6 7 8 9 10 11 ln concentrao

Figura 27 Porcentagem de inibio do crescimento da Microcystis novacekii exposta ao oxifluorfem por 96 horas

A Portaria n 518/2004 do Ministrio da Sade defin e como concentrao mxima permitida de atrazina em gua potvel 2 g/L e a legislao CONAMA n 357/2005, que estabelece concentraes mximas permitidas de agentes txicos nos corpos dgua, adota o mesmo valor. Ambas as referncias no contemplam limites para oxifluorfem. Contudo, pode-se observar que os dois pesticidas apresentaram EC50 elevada para a Microcystis novacekii, no caso da atrazina muito superior tolerada pela legislao.

A comparao dos resultados obtidos neste trabalho com os encontrados na literatura nem sempre foi possvel devido s diferenas das condies de ensaio, tais como o tempo de exposio substncia de referncia, a espcie testada, a natureza da substncia-teste e o tipo de resposta que se pretende obter.

Apesar do rpido desaparecimento do oxifluorfem do meio, apresentado nos testes de biodegradao, observou-se inibio do crescimento da Microcystis novacekii durante o teste de toxicidade. Independente do mecanismo envolvido neste processo, seja fotlise do herbicida com a possvel formao de metablitos ativos ou acumulao desse pela cianobactria, existe correlao entre o aumento da concentrao do pesticida e a inibio do crescimento da espcie. Ressalta-se que a toxicidade de um pesticida pode estar relacionada com a capacidade de remoo e bioacumulao do xenobitico do meio pelas espcies de algas (TANG,

HOAGLAND e SIEGFRIED, 1998). Novas propostas de trabalho devem ser conduzidas com o intuito de elucidar os mecanismos de toxicidade envolvidos.

Conforme Delorenzo, Scott e Ross (2001), os mecanismos de toxicidade variam dependendo do tipo e das caractersticas do pesticida e da espcie exposta. De toda forma, verificou-se a inibio do crescimento da Microcystis novacekii, mesmo com a diminuio da concentrao do pesticida no meio, que foi observado para o oxifluorfem.

A EC50 de 4,2 mg/L da atrazina para Microcystis novacekii mostrou que esta espcie mais tolerante a este herbicida do que outras cianobactrias. Como exemplo o trabalho realizado por Delorenzo, Scott e Ross (2001) obteve EC50 da atrazina para a cianobactria Anabaena flos-aquae 0,47 mg/L.

Como j era descrito na literatura para clulas superiores, o oxifluorfem mostrou-se menos txico que a atrazina para a cianobactria. As concentraes que inibem o crescimento da espcie em 50% (EC50) do oxifluorfem e da atrazina para a Microcystis novacekii so muito superiores s concentraes ambientais encontradas normalmente nos corpos dgua pelos estudos de monitoramento.

O fato das cianobactrias encontrarem-se na base da cadeia alimentar um fator de preocupao quanto toxicidade de xenobiticos para essas espcies. No caso dos pesticidas atrazina e oxifluorfem, ambos parecem no comprometer o crescimento da espcie estudada nas concentraes normalmente observadas em corpos dgua naturais.

Os dados de toxicidade so fundamentais para que se possa dar continuidade aos estudos de biodegradao. Substncias altamente txicas para a espcie em estudo limitam sua utilizao nos ensaios de biodegradao. A resistncia da cianobactria Microcystis novacekii a concentraes relativamente altas de pesticidas reforam os relatos da literatura da grande capacidade dessas espcies de adaptao a ambientes hostis, indicando que o potencial metabolizador da cianobactria Microcystis novacekii pode ser de grande importncia na preservao da qualidade das guas.

5.4.3 O efeito do metanol sobre o crescimento da Microcystis novacekii

Foi observado durante os experimentos que o grupo controle do solvente (meio WC + cianobactria + solvente) apresentou sistematicamente maior crescimento que a cultura controle.

A concentrao de metanol utilizada foi a mesma para todos os testes e para os controles do solvente (0,05%) e no apresentou efeito de toxicidade para a cianobactria. Pelo contrrio, observou-se uma induo de crescimento da mesma.

Considerando os testes de biodegradao e toxicidade da atrazina e oxifluorfem (ver Figuras 20, 22, 24 e 26), a taxa mdia de induo de crescimento da Microcystis novacekii pelo metanol na concentrao de 0,05%, nos controles, foi de 76,7% (utilizando as frmulas n. 1 e 2, do item 4.12.1).

O Guia OECD preconiza que quando solventes orgnicos so utilizados como veculo para a substncia teste, o grupo controle do solvente deve ser utilizado para o clculo da porcentagem de inibio e no o grupo controle de crescimento da cianobactria sem solvente. Ressalta-se que no presente estudo, para os testes de toxicidade, foi utilizado o grupo controle com 0,05% do solvente para os clculos da EC50 a fim de eliminar a interferncia do mesmo no teste. possvel tambm que a presena do solvente interfira nos testes de biodegradao, j que a cianobactria pode preferir utiliz-lo como fonte de carbono a biodegradar a substncia teste.

Evento semelhante observado na biorremediao de reas contaminadas por combustveis. No Brasil, a gasolina apresenta de 20 a 24% de etanol e existe uma tendncia dos micro-organismos em utilizar primeiro os alcois primrios, como etanol e metanol, como fonte de carbono, retardando a decomposio dos compostos aromticos. Os alcois primrios apresentam-se como substratos preferenciais (MARIANO, 2006). Como exemplo, Hubbard e colaboradores (1994) verificaram que na presena de metanol a degradao microbiana da gasolina foi de 69%, ao passo que no grupo controle a taxa foi de 93%.

O uso de solventes orgnicos em ensaios ecotoxicolgicos imprescindvel j que muitos poluentes orgnicos, como os pesticidas, apresentam baixa solubilidade em gua e necessitam ser solubilizados primeiro em solventes orgnicos para depois serem adicionados aos sistemas experimentais (MA e CHEN, 2005). Portanto, considerar os efeitos dos mesmos sobre as espcies muito importante para no comprometer os resultados observados e no mascarar efeitos da substncia a ser testada.

6 CONCLUSO

Os resultados obtidos neste trabalho indicam que uma cepa de Microcystis novacekii no txica apresentou considervel potencial de biodegradao da atrazina em concentraes iguais ou superiores a 50 g/L. Na concentrao de 25 g/L o herbicida parece no sofrer alterao no meio. Novos estudos devem ser conduzidos aumentando o tempo dos testes e alterando condies de cultivo a fim de verificar o aumento da taxa de degradao da atrazina e aprofundar na elucidao da formao de metablitos.

A pronunciada remoo do oxifluorfem no grupo controle ao final do experimento sugere a ocorrncia de mecanismo de degradao abitica, como fotlise, ou sua deposio na parede dos frascos. A grande diminuio das concentraes do pesticida nos testes logo no incio do experimento pode indicar que a cianobactria pode exercer papel importante na remoo do pesticida possivelmente por mecanismos de biossoro ou bioacumulao do mesmo. Ressalta-se, contudo, a possibilidade da interferncia do processo experimental como a filtrao na quantificao dos extratos.

A Microcystis novacekii se mostrou resistente presena de altas concentraes de ambos os pesticidas nos testes de toxicidade. As EC50 (96 horas) determinadas para atrazina (4,2 mg/L) e oxifluorfem (17,6 mg/L) so concentraes bem acima das concentraes desses herbicidas normalmente encontradas no ambiente. Este um resultado muito positivo, visto que confirma a resistncia da espcie e incentiva novos estudos de possveis utilizaes biotecnolgicas.

O metanol, enquanto veculo para os pesticidas, no apresentou toxicidade para a cianobactria. Na concentrao utilizada nos experimentos este apresentou efeito estimulador do crescimento e sua utilizao parece no interferir nos resultados obtidos. As correes utilizadas permitiram a realizao dos ensaios sem interferncia do solvente no resultado dos testes de toxicidade.

Os testes de ecotoxicidade so importantes para avaliar o potencial de risco ambiental dos contaminantes, uma vez que somente as anlises qumicas no possibilitam esse tipo de avaliao. Apesar de ser difcil extrapolar para o ambiente as informaes obtidas com esses testes, j que no ambiente aqutico os contaminantes esto sujeitos a diversos processos biticos e abiticos que no so reproduzidos no laboratrio, eles so imprescindveis para predizer possveis efeitos txicos dos contaminantes.

Sendo o presente trabalho de carter exploratrio e preliminar, espera-se que os resultados obtidos, em conjunto com os demais resultados do grupo de pesquisa do projeto Estudo da Biodegradao de Pesticidas Utilizando Cianobactrias Isoladas de Lagos Naturais do Parque Estadual do Rio Doce-MG, possam contribuir no entendimento do papel da cianobactria Microcystis novacekii nos ambientes naturais, abrindo perspectivas na sua utilizao em processos de biorremediao.

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