CURSO DE INMUNOLOGA GENERAL: 13.

Inmunidad celular Enrique Iez Pareja Departamento de Microbiologa Universidad de Granada Espaa NDICE: 13.1 INTRODUCCIN * 13.2 INMUNIDAD MEDIATIZADA POR CLULAS FAGOCTICAS * 13.2.1 Quimiotaxis * 13.2.2 Unin del microorganismo al fagocito * 13.2.3 Desencadenamiento de la captacin * 13.2.4 Fagocitosis y mecanismos matadores * 13.2.4.1 Mecanismos dependientes de oxgeno * 13.2.4.2 Mecanismos independientes de oxgeno * 13.2.5 Activacin de los macrfagos * 13.3 PAPEL DE LAS CLULAS T COADYUVANTES (TH) * 13.4 CITOTOXICIDAD MEDIADA POR CLULAS * 13.4.1 Citotoxicidad directa especfica (mediatizada por linfocitos CTL) * 13.4.1.1 Activacin y diferenciacin de los linfocitos T citotxicos * 13.4.1.2 Fase efectora: Ataque y destruccin de la clula diana * 13.4.2 Citotoxicidad directa inespecfica mediada por clulas NK * 13.4.3 Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) * 13.5 RESPUESTA DE HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO RETARDADO * 13.5.1 Fases de la hipersensibilidad de tipo retardado * 13.5.1.1 Sensibilizacin * 13.5.1.2 Fase efectora * 13.5.2 Interaccin entre citoquinas y clulas en la DTH * 13.5.3 Efectos de la hipersensibilidad retardada *

13.1 INTRODUCCIN Actualmente se tiende a considerar como "inmunidad mediada por clulas" cualquier respuesta contra microorganismos o tumores en la que los anticuerpos jueguen un papel subordinado o secundario. Pero a estas alturas ya sabemos que en Inmunologa es difcil "poner puertas al campo": En la respuesta inmune humoral especfica hay que activar clulas al principio de dicha respuesta. En muchas respuestas celulares los anticuerpos juegan papeles esenciales como "puentes" entre clulas (lo veremos con la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, ADCC). Adems, cualquier respuesta celular va acompaada en paralelo de produccin de anticuerpos, que a su vez pueden modificar las respuestas celulares de varias maneras: p. ej., la formacin de complejos Ag-Ac provoca la activacin del complemento, en la que se liberan pptidos que funcionan como factores quimiotcticos que inducen la acumulacin de mayor nmero de clulas inmunes y el aumento de la respuesta inflamatoria. Por otro lado, no hay que suponer que todas las respuestas celulares dependen de linfocitos T: de hecho las primeras lneas defensivas contra microorganismos son inespecficas, y descansan en la identificacin de componentes microbianos comunes por parte de clulas del sistema de inmunidad natural (macrfagos, granulocitos neutrfilos, etc.). Una de las posibles clasificaciones de la inmunidad mediada por clulas sera la siguiente: 1. Reacciones dependientes de fagocitos del sistema natural: fagocitosis produccin de citoquinas 2. El papel central de las clulas TH en la determinacin del tipo de mecanismo efector puesto en marcha. 3. La citototoxicidad directa que conduce a la lisis de la clula diana enferma es realizada por varios tipos celulares: dentro del sistema especfico: linfocitos T citotxicos (matadores), que se denominan linfocitos T citolticos (CTL) en su fase efectora; dentro del sistema natural: clulas agresoras naturales (NK) y macrfagos. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) Clulas T CD4+ que median reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado, que en su estado efector se denominan TDTH.

13.2 INMUNIDAD MEDIATIZADA POR CLULAS FAGOCTICAS El alumno encontrar provechoso repasar las caractersticas de las clulas mieloides fagocticas, tratadas en el tema 2. Aqu profundizaremos en estas clulas, sobre todo en lo que atae a los mecanismos de destruccin intracelular del patgeno una vez que lo han engullido. La actuacin de estas clulas la podemos dividir a efectos pedaggicos, en varias fases: 1. Quimiotaxis 2. unin del microorganismo al fagocito 3. desencadenamiento de la captacin del microorganismo 4. fagocitosis y mecanismos matadores. 13.2.1 Quimiotaxis La atraccin de los fagocitos del sistema de inmunidad natural hacia el foco de infeccin se puede deber a varios factores: por sustancias de origen directamente microbiano. Tal es el caso de cortos pptidos derivados de los extremos aminoterminales de protenas bacterianas (p. ej., el formil-Met-Leu-Phe es quimiotctico para los leucocitos, que llevan receptores capaces de reconocerlo). Ciertos componentes microbianos (como la endotoxina de bacterias Gram-negativas) activan la ruta alternativa del complemento, que libera los pptidos C3a y C5a, que son muy quimiotcticos sobre fagocitos. 13.2.2 Unin del microorganismo al fagocito Esta fase es importante, ya que de su xito depende la ocurrencia de la internalizacin ulterior y el desencadenamiento de los mecanismos matadores. La unin inespecfica entre bacteria y fagocito se realiza por interaccin entre molculas de superficie del microorganismo y receptores del leucocito: molcula bacteriana lectinas oligosacridos de superficie F -glucanos lpido A (endotoxina) receptor del fagocito Oligosacridos de superficie Lectinas CR3 y LFA-1 CR3 y LFA-1

Podemos hacer una tabla parecida, pero en la columna de la bacteria ahora vamos a considerar molculas del hospedador que recubren al microorganismo (opsonizacin), y que a su vez sirven para que sean reconocidas por receptores de leucocitos: comp. opsonizantes del hospedador unidos a la bacteria C3b inmunoglobulinas MBP Receptor del fagocito

CR1 (*) FcR (*) C1qR

(*) Los receptores CR1 y FcR estn entrelazados entre s por medio del citoesqueleto, lo que explica en parte su accin sinrgica Los receptores inespecficos de tipo lectina disminuyen en el macrfago activado (en presencia de IFN-K), mientras que aumentan los CR1 y FcR. Ello permite a las clulas Th indicar a los macrfagos que entran al tejido que fabriquen ms molculas capaces de citoadherencia. 13.2.3 Desencadenamiento de la captacin La captacin del microorganismo se ve facilitada si est recubierto por el componente C3b del complemento y/o por anticuerpos: esta opsonizacin permite potenciar poderosamente el mecanismo amebiano del fagocito. 13.2.4 Fagocitosis y mecanismos matadores En el captulo 2 ya nos referimos a la fagocitosis, por lo que no volveremos a insistir aqu en ella, sino que nos centraremos en lo que ocurre cuando el microorganismo, englobado en el fagosoma, recibe la descarga de los grnulos (lisosomas) del fagocito. El contenido preformado de estos grnulos, junto con sustancias producidas de novo, constituyen una batera de mecanismos encaminados a la muerte del patgeno. Estos mecanismos se pueden clasificar en dos grandes tipos: dependientes e independientes de oxgeno. 13.2.4.1 Mecanismos dependientes de oxgeno Los podemos estudiar a su vez bajo dos categoras: los que se basan en intermediarios reactivos de oxgeno, y los intermediarios reactivos de nitrgeno. 1. Intermediarios reactivos de oxgeno (ROI). La unin de partculas a los receptores de la membrana del fagosoma del macrfago provoca el denominado estallido respiratorio (por activacin de la ruta de la hexosa monofosfato), que produce mucho NADH. a. Antes de que el lisosoma se fusione con el fagosoma, en ste tiene lugar una reduccin de oxgeno molecular (O2) catalizada por la NADH-oxidasa de la membrana del fagosoma; el anin superxido resultante (O-2) es txico por s mismo, pero a su vez da lugar a otros radicales txicos de vida corta, como el perxido de hidrgeno (H2O2), el radical hidroxilo (OH) y el oxgeno singlete (O12). El macrfago

se protege de los ROI que puedan salir del fagosoma por medio de una cadena de reacciones redox en que participa glutation. b. Una vez que el lisosoma se fusiona con el fagosoma, aqul libera la mieloperoxidasa, que acta sobre los perxidos en presencia de haluros (I- y Cl-), para producir compuestos halogenados (hipohaluros) muy txicos y de vida larga: cido hipocloroso (ClOH), e hipoiodoso (IOH). 2. Intermediarios reactivos de nitrgeno (NRI) a. La enzima NOS (xido ntrico-sintetasa) combina el oxgeno molecular con el nitrgeno guanidino de la Larginina, para generar xido ntrico (NO), que es txico para bacterias y clulas tumorales. Los macrfagos de ratn (pero no los humanos) necesitan para activar esta ruta a un nivel ptimo dos seales: interfern gamma (IFN-K ) para activar la enzima NOS, y factor de necrosis tumoral (TNF) (ver el apartado 13.2.5). 13.2.4.2 Mecanismos independientes de oxgeno Estos mecanismos dependen de protenas antimicrobianas preformadas y acumuladas en los grnulos: 1. Protenas catinicas, con actividades de tipo antibitico: a. defensinas (en macrfagos de conejo y en PMN neutrfilos humanos). Son pptidos catinicos , de unos 30 aminocidos, ricos en cys y arg. Forman canales permeables a los iones en las bicapas lipdicas de los microrganismos. Actan antes de que tenga lugar la acidificacin del fagolisosoma. b. Catepsina G c. Azurozidina 2. Lisozima, que acta rompiendo el peptidoglucano de bacterias (sobre todo de Gram-negativas). 3. Lactoferrina (producida por neutrfilos): secuestra hierro, indispensable para las bacterias. 13.2.5 Activacin de los macrfagos Los macrfagos en reposo pueden matar, desde luego, pero sus capacidades microbicidas pueden mejorar por medio de su activacin. Esta activacin puede provocarse por: 1. productos microbianos que causan a. activacin directa de monocitos y macrfagos b. activacin indirecta: los macrfagos sin activar y las clulas NK liberan citoquinas que a su vez activan a los macrfagos. 2. Ulterior activacin por citoquinas producidas por linfocitos TH, sobre todo por IFN-K . Provocan atraccin quimiotctica de fagocitos y/o activacin de los mecanismos dependientes e independientes de oxgeno. En aos recientes se est viendo que la activacin del macrfago es algo ms complejo de lo que se crea. La idea clave que ha surgido es que el macrfago despliega unas u otras de sus funciones efectoras dependiendo de la combinacin particular de estmulos qumicos que reciba, a saber, citoquinas y molculas inflamatorias. La activacin de los macrfagos de ratn se puede lograr mediante el IFN-K secretado por el TH, o por la endotoxina (lpido A) de las bacterias gram-negativas. Pero a su vez, los macrfagos activados secretan TNF-E , que al actuar sobre macrfagos ya activados provocan una mayor potenciacin de sus capacidades al activarse la ruta dependiente del xido ntrico. En humanos, el macrfago, en presencia de IFN-gamma, activa la 1-alfa hidroxilasa, que convierte el 15hidroxicolecalciferol circulante en 1,25-dihidroxicolecalciferol (calcitriol o vitamina D3). A su vez, este calcitriol activa ms al macrfago al tiempo que inhibe los linfocitos Th1. Esta respuesta en humanos puede ser parte de la razn de que cuando falla la eliminacin del parsito haya un cambio desde TH1 a TH2, con lo que se hace crnica la respuesta celular. La produccin de calcitriol en el caso de tuberculosis o sarcoidiosis puede llegar a circulacin perifrica, originando una afeccin de hipercalcemia. Llegados a este punto, quiz sea bueno llamar la atencin sobre las diferentes fases de la respuesta inmune en las que participan los macrfagos: 1. En la defensa inicial frente al patgeno: el macrfago sin activar tiene su capacidad fagoctica basal. Al mismo tiempo secreta citoquinas que ayudan a otras clulas (p. ej., recordar la IL-1 que participa en la activacin de linfocitos B). 2. En la presentacin del antgeno: acta como clula presentadora para linfocitos TH, que a su vez se activan secretando citoquinas. 3. En la fase efectora el macrfago se activa por citoquinas (como el IFN-K secretado por linfocitos TH), lo cual va a potenciar sus actividades antimicrobianas, antitumorales y de secrecin de citoquinas. Las citoquinas secretadas por macrfagos en respuesta a componentes microbianos cumplen importantes papeles: la IL12 y el TNF-E , en sinergia con otros mediadores, mejoran la actividad antimicrobiana inespecfica: el TNF-E mejora la capacidad microbicida de PMN neutrfilos y de los propios macrfagos; el TNF-E junto con la IL-12 provocan que las clulas NK liberen IFN-K, el cual aumenta la actividad de los macrfagos; el TNF-E induce cambios en las superficies de clulas endoteliales y de fagocitos, que pueden interaccionar de modo que los fagocitos se extravasan para acceder al lugar de la inflamacin, donde se localiza el foco de infeccin.

13.3 PAPEL DE LAS CLULAS T COADYUVANTES (TH) Las clulas TH desempean papeles esenciales en la inmunidad celular: 1. determinan la especificidad de la respuesta inmune (qu antgenos y qu epitopos son reconocidos); 2. intervienen en la seleccin de los mecanismos efectores destinados a eliminar al patgeno; 3. ayudan a la proliferacin de las clulas efectoras adecuadas; 4. mejoran las funciones de fagocitos y otras clulas efectoras. El primero de estos papeles citados ya ha sido abordado en otro captulo: la interaccin del conjunto de receptores TCRCD3-CD4 con los epitopos en el MHC-II de clulas presentadoras condiciona la especificidad de la respuesta. Pero el sistema inmune ha de efectuar una segunda decisin esencial: qu mecanismos efectores se ponen en marcha, que sean los adecuados para la naturaleza de cada infeccin en particular. Dentro de la inmunidad mediada por clulas, existen varios mecanismos: 1. citotoxicidad directa especfica, por medio de linfocitos T citotxicos CD8+ (CTL); 2. degranulacin de eosinfilos y mastocitos una vez que han contactado con la clula a eliminar a travs de anticuerpos, que sirven de "puentes" moleculares (ADCC); 3. activacin de macrfagos y reaccin de hipersensibilidad de tipo retardado. Entonces, cmo se determina el tipo de accin para cada tipo de situacin? La respuesta estriba en buena parte en el patrn local de citoquinas producidas al inicio de la respuesta inmune, desencadenado ante cada tipo de patgeno, as como en la concentracin local de metabolitos esteroideos y de vitamina D3 en el tejido linfoide: estos factores determinan que predomine uno de dos subtipos de clulas TH, lo que finalmente condicionar el desencadenamiento de uno u otro de los mecanismos efectores. As pues, los linfocitos TH presentan dos subpoblaciones, denominadas TH1 y TH2. Dichas subpoblaciones se desarrollan a travs de una ruta que se bifurca: TH vrgenes THP estimulacin inicial TH0 estimulacin crnica TH1 TH2 memoria largo plazo THM

Cada uno de estos tipos de linfocitos TH secreta un patrn caracterstico de citoquinas: THP ... IL-2 ... ... .. . . ... ... TH0 IFN-K IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 .. ... ... TH1 IFN-K TH2 ... ... THM ... IL-2 ... . .

IL-2 ... . IL-3 TNF-E GMCSF

IL-4

IL-5

IL-6

IL-10 IL-3 TNF-E GMCSF

(En la tabla se han resaltado en cursiva sobre color amarillo las citoquinas caractersticas de TH1 y TH2, que no son comunes a ambas subpoblaciones). Veamos pues, en qu se diferencian funcionalmente los lincitos de ambas subpoblaciones: Las clulas TH1 tienden a activar los macrfagos, y responden bien a

Las clulas TH2 tienden a incrementar la produccin de mastocitos y eosinfilos, y mejoran la produccin de ciertos isotipos de inmunoglobulinas, incluyendo la IgE. Las clulas TH2 responden bien a antgenos presentados por linfocitos B. Una vez establecidos, cada uno de estos patrones de respuesta es capaz de inhibir o suprimir al otro, debido a la accin de ciertas citoquinas de cada tipo de clula TH: Esta diferenciacin de TH1 y TH2 se descubri en el ratn, pero existen cada vez ms pruebas de que igualmente existe en la especie humana. A los TH1 se les suele llamar linfocitos T "inflamatorios", y a los TH2, "coadyuvantes". Un ejemplo clnico de este papel particular de los dos tipos de clulas TH lo tenemos en las dos clases extremas de lepra: en la lepra tuberculoide se inducen sobre todo linfocitos TH1, por lo que hay una buena activacin de macrfagos, lo cual redunda en que se detectan pocas bacterias intracelulares. En cambio, en la lepra lepromatosa se induce la subpoblacin TH2, que colabora eficazmente en la respuesta especfica humoral; pero los anticuerpos evidentemente no pueden acceder al interior celular, por lo que existen abundantes bacilos en el interior de los macrfagos; stos, al no poder ser activados eficazmente, no pueden eliminar al parsito. Hay gran destruccin de tejidos. 13.4 CITOTOXICIDAD MEDIADA POR CLULAS En este apartado vamos a tratar aquellos mecanismos efectores que dependen de la accin de clulas del sistema inmune capaces de matar/lisar clulas enfermas (clulas diana), a las que se unen de modo directo o indirecto: 1. Citotoxicidad directa especfica: es la llevada a cabo por los linfocitos citotxicos (TC), que estn restringidos por el haplotipo propio MHC-I, y que poseen CD8+ como molculas correceptoras. (aunque algunas son CD4+ y estn restringididas por MHC-II) 2. Citotoxicidad directa inespecfica: las clulas agresoras naturales (NK) reconocen determinantes inespecficos de clulas tumorales o infectadas con ciertos virus. 3. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos: es un mecanismo indirecto por el que clulas matadoras como NK, eosinfilos, etc., interaccionan con el antgeno por medio de puentes de anticuerpos previamente unidos a receptores para Fc de la clula. 13.4.1 Citotoxicidad directa especfica (mediatizada por linfocitos CTL) El papel ms importante de este mecanismo es el de eliminar clulas propias infectadas por virus. Como veremos, los linfocitos TC en reposo, al activarse apropiadamente, terminan diferencindose a los llamados linfocitos T citolticos (CTL), que son los efectores de la inmunidad celular especfica. El 90% de estos linfocitos son CD8+, y estn restringidos por el MHC-I propio. Son capaces de reconocer a la mayora de clulas nucleadas. Pero existe un 10% de linfocitos TC que fenotpicamente son CD4+ y estn restringidos por MHC-II. La actuacin de estas clulas la podemos considerar en dos fases: 1. Activacin y diferenciacin de los precursores TC hasta CTL 2. Fase efectora: destruccin de la clula diana, a su vez diferenciable en: adhesin y formacin del conjugado entre el CTL y la clula diana golpe letal disociacin del CTL destruccin de la clula diana. 13.4.1.1 Activacin y diferenciacin de los linfocitos T citotxicos Los linfocitos Tc vrgenes parece que se activan solamente en los rganos linfoides secundarios, nicos entornos en los que reciben las seales necesarias. Requieren en realidad 3 seales: 1. La seal especfica suministrada por la interaccin entre su complejo TCR-CD3-CD8 con el MHC-I de una clula presentadora profesional infectada (p. ej., una clula dendrtica interdigitante) 2. La seal coestimulatoria suministrada por la misma clula (unin entre B7 y CD28). 3. La interleucina IL-2. Parece ser que el Tc expresa tras la interaccin inicial una pequea cantidad de IL-2, pero en el caso de estos Tc vrgenes no suele ser suficiente para activarlos. La aportacin clave de IL-2 procede de clulas Th1 cercanas. De hecho, se piensa que tanto el Th como el Tc vrgenes se activan simultneamente al unirse a la misma clula presentadora (no olvidemos que las APCs exhiben MHC-I y MHC-II). En cambio, las clulas Tc de memoria tienen menos requerimientos para su activacin. De hecho, como ya sabemos, al tener molculas de adhesin celular diferentes a los correspondientes Tc vrgenes, pueden encontrarse el antgeno (epitopo peptdico en contexto MHC-I) en tejidos extralinfoides. 1. No requieren obligatoriamente la seal coestimulatoria. 2. No requieren obligatoriamente la ayuda de Th, ya que al unirse de modo especfico a una clula propia infectada que le suministre el pptido adecuado, provoca que el Tc produzca no slo receptores de IL-2, sino niveles adecuados de IL-2 capaces de auto-activarlas. De esta manera, se provoca la proliferacin y diferenciacin del linfocito en reposo (virgen o de memoria) hasta que se convierte en linfocito T citoltico (CTL). Este CTL se caracteriza por poseer algo ms de citoplasma que el TC, y sobre todo por poseer grnulos densos a los electrones, rodeados de unidad de membrana (llamados a veces granulosomas) y un aparato de Golgi. 13.4.1.2 Fase efectora: Ataque y destruccin de la clula diana 1) Formacin del conjugado Tras el reconocimiento especfico, se produce una interaccin de gran avidez entre molculas de LFA-1 del CTL y molculas de ICAM-1 de la clula diana. Esta unin dura unos 5-10 minutos, durante los cuales las seales de la unin intercelular se transducen al interior del CTL por medio de cascadas de proten-quinasas y proten-fosfatasas, que

conducen a la activacin de una serie de funciones del CTL. Se dice entonces que el linfocito queda programado para la lisis. 2) Golpe letal El citoesqueleto del CTL se reorganiza, de modo que tanto el aparato de Golgi como los granulosomas se sitan en el polo celular que queda en contacto con la clula diana. Entonces, los grnulos se fusionan con la membrana citoplsmica, producindose la exocitosis de su contenido al estrecho espacio intercelular ("beso de la muerte"). 3) Disociacin del CTL Antes de que se produzca la lisis de la clula diana, el CTL se separa, probablemente ayudado por el hecho de que la LFA1 vuelve al estado de baja afinidad. 4) Destruccin de la clula diana Parece ser que la destruccin de la clula diana puede ocurrir por varios mecanismos, predominando uno u otro en funcin de la naturaleza de la superficie de la clula diana, y del grado de activacin que haya alcanzado el linfocito CTL. Monmeros de perforina contenida en los granulosomas llegan a la membrana de la clula diana, y en presencia de Ca++ se polimerizan para formar cilindros huecos de poliperforina (con unas 20 unidades), que atraviesan la bicapa lipdica. De este modo se forma un canal (con un dimetro de 520 nm) que es permeable a iones, y que puede provocar la lisis osmtica de la clula diana (aunque su papel principal es servir como canal para dejar pasar a otros componentes de los grnulos). Pero no siempre el efecto de la poliperforina es la lisis. En otros casos parece que el papel de los canales es el de permitir la entrada de otras sustancias del granulosoma que inducen la apoptosis de la clula diana. De hecho se ha visto que pueden entrar fragmentinas (granzimas) que inducen la fragmentacin de los cromosomas en mltiplos de nuclesoma. Veamos algunas ideas actuales sobre el mecanismo de apoptosis desencadenado por los linfocitos Tc. Antes que nada, hay que aclarar el papel de la granzima B. Como ya sabemos, se trata de una fragmentina, que induce fragmentacin del ADN en mltiplos de nucleosomas. Ahora bien, este efecto es indirecto: las fragmentinas no son DNAasas, sino proteasas. La Granzima B tiene una actividad parecida a la llamada enzima convertidora de interleucina 1 (ICE). La ICE es una proteasa endgena con un papel central en la ruta endgena de la apoptosis. Dicha ruta se puede activar por una serie de estmulos externos (carencia de factores de crecimiento, ciertos virus, dao al ADN), que transforman la ICE inactiva a forma activa. Una vez activada, la ICE rompe proteolticamente un sustrato an desconocido, que induce las ADNasas, que fragmentarn el ADN. Pues bien, se piensa que la granzima B secretada por el CTL (y que entra a la clula diana a travs de los canales de perforina) activa a la ICE o bien la sustituye para desencadenar el mecanismo de esta ruta apoptsica endgena. Pero este no es el nico mecanismo inductor de apoptosis por parte de los CTLs (de hecho, algunos clones de CTLs carecen de perforina y de granzimas, y sin embargo inducen muerte celular de la clula diana). Podemos encontrar otro mecanismo dependiente de la interaccin entre el llamado ligando Fas del CTL y el receptor Fas de la clula diana. El receptor Fas (tambin llamado APO-1) es una protena de membrana que pertenece a la llamada familia TNF de receptores de citoquinas. Por su lado, el ligando de Fas del CTL es una protena de membrana que exhibe homologas de secuencia con TNF, y se une al Fas. La unin entre el ligando de Fas con el Fas de la clula infectada o enferma induce en sta una seal que dispara la ruta endgena de apoptosis, con la consiguiente activacin de la ICE y subsiguiente fragmentacin del ADN. Las vesculas del CTL pueden contener TNF-a y TNF-b (=linfotoxina), que junto con el IFN-g producido por TC o por otras clulas, desencadena efectos citotxicos que tardan ms tiempo (>3-4 horas) que los anteriores. Se desconoce el mecanismo, pero parece que igualmente inducen apoptosis. Cmo se protege el CTL de sus propios mecanismos matadores? Por lo pronto, el condroitn sulfato (proteoglucano) del CTL se puede unir a la perforina, inactivndola. Pero puede que haya otros mecanismos: por ejemplo, la hiptesis de Peters dice que la perforina sale del granulosoma dentro de pequeas vesculas igualmente membranosas; la membrana de estas sub-vesculas contendran complejos TCR-CD3-CD8, que encaminaran a las pequeas vesculas hacia la clula diana, pero no al CTL. 13.4.2 Citotoxicidad directa inespecfica mediada por clulas NK Recordemos que las clulas NK son un tipo de linfocitos granulares grandes (de hecho NK es casi sinnimo de LGL), que suponen un 5% de las clulas linfoides en sangre, y que carecen de los marcadores de linfocitos T y B. Se consideran como linfocitos "inespecficos", pertenecientes al sistema de inmunidad natural. El mecanismo citotxico de las clulas NK es parecido al de los linfocitos citolticos (CTL), pero a diferencia de ellos, carecen de especificidad y de memoria, y no estn restringidos por el MHC clsico. Poseen un papel importante en los primeros das de una infeccin virsica, al eliminar clulas en las que el virus se est multiplicando. Constituyen pues un mecanismo efector celular temprano, antes de que lleguen los linfocitos TC, y especialmente preparado frente a ciertos virus que usan la estrategia de inducir un descenso del nivel de MHC-I Recientemente se ha propuesto un modelo de dos receptores para explicar cmo reconocen estas clulas inespecficas a las clulas infectadas por virus o tumorales. Se piensa que las NK reciben seales de dos receptores de modo que distinguen entre clulas sanas y enfermas. Segn este modelo, el receptor NKR-P1 se une a oligosacridos de glucoprotenas de superficie de la clula enferma, procedentes de glucosilaciones anmalas. En principio, esta seal le indica a la NK que debe prepararse para matar a la clula con la que ha contactado, pero para ello debe de ocurrir simultneamente una ausencia de seal procedente de otro receptor, el Ly-49. El receptor Ly-49 de la clula NK se une a ciertos alelos de molculas MHC-I. Cuando una clula NK se encuentra ante una clula normal, aunque reciba la seal de NKR-P1, no la mata, ya que la interaccin entre Ly-49 y las MHC-I enva una seal a la NK para que detenga su mecanismo matador. En cambio, muchas clulas enfermas (por virus o tumorales) presentan un bajo nivel de MHC-I, por lo que el mecanismo dependiente de NKR-P1 no se ve frenado.

La actividad matadora de NK se activa por IFN-a e IFN-b (liberado por muchas clulas enfermas al inicio de la infeccin), y por IL-12 (producido por macrfagos). A su vez, la IL-12 y el TNF-a (tambin del macrfago) provocan que la NK secrete grandes cantidades de IFN-g , con lo que se mantienen a raya ciertos patgenos intracelulares hasta que se activen las clulas T. Como se ve, un nuevo rasgo que parece indicarnos de nuevo el carcter de lnea defensiva temprana que intepretan estas clulas. De hecho, rara vez las clulas NK eliminan efectivamente el virus, pero lo mantienen a raya hasta que llegan las clulas TC. 13.4.3 Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) Existen varios tipos de clulas potencialmente citotxicas que poseen receptores para Fc de anticuerpos, y que pueden por lo tanto participar en la destruccin de clulas diana (enfermas) o de helmintos recubiertos en ambos casos por anticuerpos. Los acontecimientos suelen tener lugar en las siguientes fases: 1. formacin de inmunocomplejos (es decir, la clula enferma o el helminto se recubre de anticuerpos); 2. una clula agresora adecuada (p. ej., la NK) interacciona con la clula enferma o el parsito a travs de los anticuerpos, que se engarzan con el receptor para Fc de la clula agresora; 3. finalmente, dicha clula agresora libera por exocitosis el contenido de sus grnulos, y/o secreta productos txicos, que tienden a matar a la clula enferma o parsito. De este modo, clulas que son propiamente del sistema inmune natural, y por lo tanto son inespecficas, pueden llegar a destruir especficamente mediante el puente de anticuerpos. De hecho, actan como clulas efectoras finales del sistema humoral especfico (es decir, pueden llegar a ser los "brazos armados" o "verdugos" en una respuesta que se inici con la secrecin de anticuerpos). Las clulas NK, monocitos y PMN neutrfilos poseen el receptor Fcg RIII (=CD16), de baja afinidad, que reconoce las subclases IgG1 e IgG3. Los eosinfilos posen FcI R-I y FcI R-II, estando especializados en destruir helmintos (p. ej., las esquistosmulas, que son las larvas de Schistosoma). 13.5 RESPUESTA DE HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO RETARDADO La hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) es una reaccin inflamatoria localizada que se induce por citoquinas secretadas por ciertas subpoblaciones de linfocitos TH (concretamente, de TH1) activados previamente por contacto con ciertos tipos de antgenos, y que se caracteriza por el reclutamiento al foco infeccioso de grandes cantidades de clulas inflamatorias, sobre todo de macrfagos. Se llama retardada porque, al contrario que la inmediata, tarda 2 o 3 das en manifestarse. La palabra hipersensibilidad alude en principio a efectos negativos sobre el propio hospedador, pero en muchos casos el efecto consiste en pequeos daos tisulares, siendo en general la respuesta beneficiosa, puesto que va encaminada a destruir a ciertos patgenos intracelulares. 13.5.1 Fases de la hipersensibilidad de tipo retardado En la respuesta hipersensible de tipo retardado podemos distinguir una fase inicial de sensibilizacin en la que se produce el contacto inicial con el estmulo antignico, y que no presenta sntomas, y una fase efectora, dependiente de un contacto secundario con el antgeno, en la que se manifiestan tales sntomas y que es la tendente a eliminar al patgeno. 13.5.1.1 Sensibilizacin La fase de sensibilizacin dura de una a dos semanas, tiempo durante el cual los linfocitos TH se activan y expanden clonalmente tras el reconocimiento del antgeno presentado por clulas presentadoras (APCs). Dichas clulas presentadoras pueden ser: clulas de Langerhans de la piel, que transportan el antgeno desde la epidermis hasta los ganglios linfticos regionales, donde lo muestran a los linfocitos TH; macrfagos; (en humanos y otras especies) clulas del endotelio vascular. Al final de esta fase se tiene pues una poblacin expandida de linfocitos T CD4+ de memoria, que recirculan constantemente. 13.5.1.2 Fase efectora Esta fase ocurre en tejido extralinfoide, y es la reaccin de hipersensibilidad en sentido estricto, detectndose sus sntomas a las 24 horas del contacto secundario con el antgeno que provoc la sensibilizacin inicial, pero alcanza su apogeo a las 48-72 horas. En esta fase sale fibringeno al tejido, y se convierte en fibrina, que junto con la acumulacin de linfocitos T y de macrfagos hace que el tejido se hinche y se vuelva duro (esto es la base de los sntomas de induracin y edema) La podemos subdividir en tres etapas: desencadenamiento, inflamacin y resolucin. En el desencadenamiento el linfocito T activado (que ahora denominaremos como TDTH), ante el contacto secundario con el antgeno presentado por una APC, secreta ciertas citoquinas, cuyas acciones dan paso a la reaccin de inflamacin. La inflamacin se produce cuando las citoquinas secretadas reclutan y activan a macrfagos y otras clulas inflamatorias hacia el sitio de infeccin, ponindose en marcha una compleja serie de interacciones entre clulas inespecficas del sistema inmunitario y citoquinas, con amplificacin de la respuesta. Todo ello va encaminado a destruir al agente patgeno intracelular. La resolucin se produce porque los macrfagos activados aumentan su capacidad de eliminacin del patgeno. Estos macrfagos son la principal clula efectora de la hipersensibilidad retardada, pudiendo representar el 90% de la poblacin celular infiltrada. Como se ve, esta respuesta tiene un claro valor adaptativo en la eliminacin de ciertos parsitos intracelulares, pero cuando el estmulo es demasiado persistente, la DTH se vuelve destructiva para el hospedador. Este aspecto inmunopatolgico se manifiesta en la llamada reaccin granulomatosa: los macrfagos, con los parsitos sin eliminar en su interior, se adhieren unos a otros, adquiriendo morfologas epitelioides; posteriormente estas clulas

epitelioides se pueden fusionar entre s, generando clulas gigantes multinucleadas, que pueden llegar a desplazar al tejido normal, con lo que se forman ndulos o tubrculos, que pueden conducir a necrosis del tejido. 13.5.2 Interaccin entre citoquinas y clulas en la DTH En este epgrafe vamos a ampliar el aspecto molecular y celular de la respuesta de hipersensibilidad retardada, resaltando cmo las distintas citoquinas actan sobre distintos tipos celulares, responsables de diversos aspectos de esta respuesta. La IL-2 del linfocito TDTH funciona de modo autocrino, permitiendo la expansin clonal, con lo que aumenta el nmero de estas clulas, que siguen produciendo ms citoquinas. Conforme avanza la respuesta, la IL-2 tambin ejerce un efecto paracrino, estimulando a otros clones de linfocitos TDTH. La IL-3 y el GM-CSF inducen hematopoyesis del linaje granulocito-monoctico en la mdula sea. Obviamente ello acarrea que mayores cantidades de PMN y macrfagos puedan pasar al foco de infeccin. El IFN-g el TNF-b de las clulas T, as como el TNF-a y la IL-1 de los macrfagos actan sobre las clulas endotelilales vasculares cercanas al foco de infeccin, con los siguientes efectos: aumento de la expresin de molculas de adhesin (ICAM, ELAM, VCAM); cambios de forma, tendentes a que las clulas endoteliales se separen entre s, dejando paso para la extravasacin de leucocitos; las clulas endoteliales estimuladas secretan IL-8 y otros factores quimiotcticos que atraen a monocitos circulantes (quimiocinas). Las consecuencias son que los PMN neutrfilos (primeros leucocitos en llegar) y los monocitos circulantes se adhieren a las clulas endoteliales de las vnulas postcapilares, pasan por diapdesis y entran al tejido infectado. La entrada de los monocitos lleva consigo su diferenciacin a macrfagos. Los macrfagos son atrados y activados en el foco de infeccin debido a la accin de IFN-g y del factor quimiotctico y activador de los monocitos (MCAF). Otro factor secretado por TDTH, llamado MIF (inhibidor de la migracin de macrfagos) evita que el macrfago "pase de largo" el foco infectivo, afinando su quimiotaxis. Por lo tanto, los macrfagos van llegando en grandes cantidades al foco infeccioso, y se van activando (sobre todo por el interfern inmune), experimentando importantes cambios: aumentan su tamao aumentan sus niveles de enzimas lticos en sus grnulos aumentan su capacidad fagoctica (por opsonizacin con IgG2a -en el ratn-) incrementan su efectividad matadora de microorganismos intracelulares funcionan mejor como clulas presentadoras de antgeno, debido a que es mayor el nmero de molculas MHC de clase II en su membrana, porque secretan mayor cantidad de IL-1 y porque expresan ms molculas de adhesin como la B7 (coestimulatoria), ICAM-1 y LFA-3. El que los macrfagos acten mejor ahora como APC supone que activan a ms linfocitos TDTH, con lo cual se cierra el ciclo, pero amplificado. Este tipo de respuesta que se retroalimenta positivamente puede llegar a convertirse en un "arma de doble filo", ya que puede degenerar en una respuesta negativa para el hospedador, una vez que se traspasa un umbral. Sin embargo, su valor positivo se ponde de manifiesto en experimentos con ratones transgnicos noqueados (K.O.) que tienen inactivado el gen del IFN-K : son incapaces de matar a Mycobacterium bovis, una bacteria contra la que los ratones normales se defienden perfectamente. 13.5.3 Efectos de la hipersensibilidad retardada El efecto positivo de la DTH es que tiende a eliminar ciertos patgenos intracelulares y antgenos de contacto: bacterias intracelulares como Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, Listeria monocitogenes, Brucella abortus. Hongos intracelulares como Candida, Pneumocystis carinii, Histoplasma, Cryptococcus. Protozoos como Leishmania. Larvas de helmintos, como las de Schistosoma. Virus. La DTH desempea un papel importante en la defensa contra estos agentes, ya que el macrfago activado destruye mejor al patgeno, y el contenido de sus grnulos, vertido a exterior, destruye clulas propias infectadas (en este ltimo papel es importante la accin del TNF-b ). Obviamente, se produce cierto dao tisular, pero ste suele estar autolimitado y puede ser reparado ulteriormente. El papel positivo de la DTH se puede comprobar "por contraste" considerando aquellas enfermedades en las que precisamente este + mecanismo est alterado: por ejemplo, en el SIDA, en el que existen bajos niveles de linfocitos T CD4 : ello acarrea que se pierda la facultad de montar una respuesta de hipersensibilidad retardada, por lo que los individuos afectados estn sometidos a frecuentes y amenazadoras infecciones por Candida, Pneumocystis, Cryptococcus, o por bacterias patgenas e incluso oportunistas que no suelen causar tanta mortalidad en la poblacin sana. De hecho, una de las maneras de seguir el curso del SIDA es evaluar peridicamente en laboratorio la capacidad de respuesta DTH con clulas de los pacientes. Sin embargo, en ciertos casos la propia respuesta defensiva degenera en patolgica: tal ocurre en la tuberculosis, en la que se pueden llegar a formar ndulos (tubrculos) en muchos tejidos (tpicamente en los pulmones), que pueden terminar necrosndose (cavernas caseosas en pulmn). En una situacin de infeccin crnica por parsito intracelular (como en la tuberculosis) las citoquinas producidas en la DTH estimulan la proliferacin de fibroblastos y la produccin de colgeno, potencindose los efectos por la accin de PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) y de TGF-F del macrfago activado. Posteriormente emigran y proliferan clulas endoteliales (angiognesis, es decir, formacin de nuevos vasos sanguneos). Se produce pues la sustitucin del tejido normal por tejido fibroso (cicatrizacin) y formacin de granuloma.