PRACTICA No 8 CURVA DE CRECIMIENTO PARA HONGOS NO FILAMENTOSOS Docente Catedrtico: Marcela Quintero Ruiz

8.1 INTRODUCCIN La curva de crecimiento o tambin llamada cintica de crecimiento es un procedimiento empleado para evaluar el crecimiento de un organismo como respuesta a los elementos nutricionales aportados por el medio de cultivo y las condiciones ambientales proporcionadas en el laboratorio como temperatura, aireacin, agitacin etc. Gracias a esta metodologa podemos predecir como ser el comportamiento de la biomasa expresada como clulas (X), consumo de sustrato (S), producto (P), cuando se cambian ciertas condiciones y poder extrapolar estos resultados a una escala mayor de produccin (Escalamiento). (Doran, P. 1999) Los microorganismos como bacterias no filamentosas y levaduras cuando crecen sobre fuentes de carbono sencillas y en medios qumicamente definidos experimentan una fases de crecimiento tpicas denominadas - Adaptacin - Logartmica o exponencial. - Estacionaria - Muerte
9 8 7

12 10 M

Biomasa g/l

6 5 4 3 2 1 0

8 6

4 2 0

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Tiempo horas

Biomasa (x)

Sustrato (s)

Figura 1. Cintica de crecimiento para bacterias no filamentosas y levaduras

8.2. OBJETIVOS Objetivo general Realizar una curva de crecimiento para levaduras mediante la tcnica de recuento de clulas en cmara de Neubauer.

Sustrato g/l

Objetivos especficos - Determinar la formacin de biomasa en funcin del tiempo mediante la tcnica de recuento en cmara de Neubauer. - Reconocer y analizar cada una de las fases de crecimiento experimentadas por una levadura cuando se realiza una fermentacin discontinua. 8.3 REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO - Caldo para levaduras - Solucin salina 0.85 % p/v - Colorantes de Gram - Azul de metileno 8..4 MATERIALES POR GRUPO DE TRABAJO - Tubos de 13 x 100 mm tapn de algodn (2) con las muestras de fermentacin correspondientes. - Tubos 13X100 con solucin salina al 0.85% 4,5 ml, para diluciones ( 6) - Pipetas ( 6) - Cmara de Neubauer.(6) - Gradillas (1) - Capilares 8.4.1 MATERIALES PARA LA FERMENTACIN (MONITORAS) - Frascos tapa azul de 1000 ml para las horas de fermentacin 0 8 (3) - Erlenmeyer de 500 ml con 100 ml de Agua destilada esteril (1) - Ajitador orbital (1) o bombas de pecera con mangueras(2) - Caja de petri con una cepa Saccharomyces cerevisiae.(1) 8.5 MICROORGANISMO A EVALUAR - Saccharomyces cervisiae 8.6 EQUIPOS Microscopios Ajitador orbital Cmara de Neubauer (6)

8.7 METODOLOGA 8.7.1. Produccin del inoculo En un erlenmeyer de 500 ml con 90 ml de agua destilada estril a temperatura ambiente adicione 15 g de Sacharomyces cerevisiea para su hidratacin durante 20 minutos. Verifique mediante coloracin de Gram la pureza del microorganismo.

8.7.2. Fermentacin discontinua

Prepara 1000 ml de medio de cultivo para el crecimiento de la levadura en un erlenmeyer, vierta 330ml de medio en cada frasco shott (3). Lleve a esterilizar durante 15 minutos. Deje enfriar y aada a cada en cada frasco shott 33 ml de la suspensin de levadura previamente realizada. Coloque los frascos sobre un agitador orbital a 50rpm. Realizar muestreos a la hora 0, 2, 4, 6,7 y 8. Rotule los frascos como 1, 2 y 3. Del frasco No1. Tome las muestras de la hora 0 y 2, del No.2 muestre las horas 4 y 6 y del No.3 las horas 7 y 8. De cada hora de muestreo deposite alcuotas de 3ml en tubos tapa rosca 13X100ml.. Estos tubos sern llevados a refrigeracin inmediatamente para evitar la proliferacin de clulas. 8.7.3. Determinaciones en el laboratorio - La monitora debe distribuir los tubos con las alcuotas de 3 ml a cada grupo de trabajo. - Realice coloracin de Gram para verificar la pureza del microorganismo. 8.7.4 Recuento en cmara de Neubauer Tome 0,1 ml de azul de metileno a una concentracin del 0,1% y adicinelo en el tubo marcado con la dilucin 10-1. Tome 0,5 ml de la muestra y depostelo en el tubo de la dilucin 10-1 y a partier de este realice diluciones seriadas hasta 10-5 Alistar la cmara de Neubauer colocando la lamina de cuarzo o una laminilla cubre objetos. Con el capilar, tomar la muestra de la dilucin 10-5 y colocarlo en la cmara de Neubauer evitando que se formen burbujas o quede la muestra por fuera de la cmara. En caso de que esto ocurra montar nuevamente la muestra Colocar la cmara en el microscopio y observar en 40X Contar en los 25 cuadrantes las clulas vivas (clulas sin coloracin), clulas muertas (clulas de color azul) y las clulas gemantes. N total de clulas en los 25 cuadrantes x el factor de la cmara x Factor de dilucin = Cel/ml N Clulas x 104 x 102 = Cel / ml Porcentaje de Viabilidad = (Clulas vivas - Clulas muertas) Clulas muertas Porcentaje de gemacin= Gemantes x 100 Total vivas x 100

8.8 RESULTADOS 8.8.1 Curva de crecimiento para Saccharomyces cerevisiae por recuento en cmara de Neubauer.

Tiempo 0 2 4 6 7 8

Tabla Curva de crecimiento para Saccharomyces cerevisiae Concentracin de Porcentaje de Viabilidad Porcentaje de gemacin clulas/ml

8.8.2. Representacin grfica de resultados Represente en papel semilogartmico los datos directos sin transformar, ploteando biomasa vs tiempo, identifique las fases de crecimiento y determine cuanto tiempo aproximadamente dura en cada fase. 8.9 DISCUSIN 8.10. CONCLUSIONES 8.11.REVISIN TEORICA DE COMPLEMENTACIN - Que es y como se hace un espectro de absorcin. Cual es su utilidad en biotecnologa. - Que es una curva de crecimiento? - Cules son las fases que se pueden presentar durante una curva de crecimiento para microorganismos no filamentosos?