Universidad de Oviedo

Licenciatura de Bioqumica METODOLOGIA Y EXPERIMENTACION BIOQUIMICA II PRACTICAS DE CROMATOGRAFIA Da 1. Introduccin. Cromatografa de intercambio inico (carga elctrica). Preparacin y cuantificacin de disoluciones de protenas. Da 2. Cromatografa de intercambio inico. Determinacin de la capacidad de carga de las resinas. Da 3. Cromatografa de intercambio inico. Elucin de albmina con gradiente salino. Da 4. Cromatografia de exclusin molecular (tamao y forma). Preparacin de columnas manuales y separacin de solutos. Inyeccin de columna automatizada. Da 5. Cromatografa de afinidad (afinidad biolgica). Anlisis resultado cr. de exclusin molecular automatizada. Da 6. Otras tcnicas cromatogrficas. SDS-PAGE con muestras de cr. de afinidad y exclusin molecular. Da 7. Cromatografa en capa fina (reparto por solubilidad). Da 8. Estrategias de purificacin de protenas. Emulacin informtica con el programa ProteinLab.

Bibliografa: Tcnicas instrumentales de anlisis en Bioqumica J.M. Garca Segura y otros. Ed. Sntesis, Madrid 1996. ISBN 84-7738-429-0.

INTRODUCCION.
Las clulas y organismos contienen una gran cantidad de componentes diferentes, muchos de los cuales tienen propiedades similares. Entre ellos, las protenas constituyen una fraccin sustancial, y son el objetivo ms habitual de las tcnicas bioqumicas de purificacin, y el que precisa y permite ms variedad de ellas por la heterogenidad de sus caractersticas. Para su purificacin con objeto de estudio o utilizacin, suele ser necesario pasar por uno o varios pasos, que consisten en procedimientos de fraccionamiento en los que se aprovechan las propiedades fisico-qumicas de la protena para separarla de manera progresiva de otras sustancias. La idea no es tanto minimizar la prdida de protena como eliminar los otros componentes de la mezcla, de manera que slo quede la sustancia requerida. El criterio bsico para establecer la pureza de una muestra de inters tras su purificacin es la demostracin de que presenta un solo componente: que produzca una nica mancha o spot en un anlisis por electroforesis bidimensional en base a su Pmol y pI. Las tcnicas de purificacin son aplicables a la separacin/fraccionamiento de la mayora de las muestras biolgicas, y entre ellas, las tcnicas cromatogrficas son las que tienen mayor versatilidad y aplicacin, aunque tambin se suelen aplicar otras como la precipitacin diferencial o el isoelectroenfoque. Los procedimientos de aislamiento de protenas y otras biomolculas suelen incorporar cierto nmero de pasos cromatogrficos independientes para purificar la sustancia de inters en base a varios posibles criterios: solubilidad, carga inica, polaridad, tamao y forma molecular, y unin especfica a otras molculas. En general, en estas prcticas nos referiremos a biomolculas o solutos tipo protenas, que son los grandes protagonistas de los procesos cromatogrficos bioqumicos. El trmino cromatografa fue acuado en 1906 por el botnico ruso Mikhail Tswett para hacer referencia a la separacin de los pigmentos contenidos en extractos vegetales, a medida que stos se filtraban a travs de una columna rellena de un slido poroso. As pues, la raz chroma, que en griego quiere decir color (y que tambin est presente en trminos no relacionados, como cromosoma o cromatina), se refiere a esta separacin inicial de sustancias coloreadas. Tambin tswett significa color, en ruso. Las cromatografas son un grupo de mtodos fsico-qumicos de separacin en los que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales est en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase mvil) se mueve en una direccin definida. As, bajo la denominacin de cromatografa se engloban varias tcnicas en las que los componentes o solutos de una mezcla, disueltos en una fase mvil, se van separando entre s a medida que se desplazan con diferente velocidad a travs de un lecho fijo o fase estacionaria en una direccin definida. La fase mvil o eluyente es el fluido (lquido o gas) en que estn las sustancias a separar, y que permite la interaccin de stas con la fase estacionaria, a menudo mediante el arrastre de las mismas mientras se mueve a travs de ella en una direccin definida. Segn el tipo de cromatografa, la fase mvil puede tener una composicin fija o variable. Efluir: Dicho de un lquido o gas, fluir o escaparse hacia el exterior. Eluir: Ir pasando la fase mvil o eluyente o efluente a travs de una columna hasta la salida de los solutos. Flujo: es la velocidad de elucin. VR = F . tR Tiempo de retencin, tR: tiempo transcurrido entre la aplicacin de la muestra y la elucin de la columna de un soluto dado. Volumen de retencin VR o volumen de elucin Ve: volumen de la fase mvil que ha de pasar a travs de la fase estacionaria de una columna para que eluya un soluto dado. La fase estacionaria es la que no se mueve y que retiene a los solutos a separar que interaccionan con ella. Un concepto relacionado, y a veces coincidente, es el de soporte o matriz, que es el slido que constituye, retiene o mantiene fija la fase estacionaria. Los requisitos generales que debe tener un soporte son: carcter hidroflico y ausencia de carga para evitar adsorciones inespecficas, estabilidad mecnica y qumica, inerte, gran superficie, y tamao del grano y porosidad controlables.
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Fase inmovilizada: Una fase estacionaria que est inmovilizada en las partculas del soporte o la pared interior de la columna. P.e. cromatografa de exclusin molecular. Fase ligada: Una fase estacionaria que est unida de forma covalente a las partculas de soporte o a la pared interior de la columna. P.e. cr. de afinidad o cr. de intercambio inico. Cromatgrafo: el instrumento empleado para realizar una separacin cromatogrfica. Cromatograma: grfica u otra presentacin que muestre el resultado de la cromatografa, habitualmente reflejando la concentracin de soluto (o magnitud equivalente) en ordenadas, frente al VR o al tR en abscisas. En la cr. plana, cromatograma puede referirse a la propia superficie (papel o capa) en la que se ha realizado la separacin. El poder de la cromatografa deriva de la naturaleza continua del proceso de separacin. Un solo paso de purificacin (o plato terico) puede tender en mayor o menor medida a separar una mezcla en sus componentes, pero la aplicacin de este proceso de forma continua de manera que se repite cientos o hasta cientos de miles de veces, termina por producir la separacin de la mezcla en sus componentes. El concepto de plato terico se refiere a cada una de las lminas en que imaginariamente se puede considerar dividida una columna cromatogrfica, de forma que en cada una de ellas las molculas de un soluto presentes en la fase mvil van alcanzando un equilibrio de interaccin o de reparto con la fase estacionaria. El retraso que finalmente experimente el soluto depender del nmero de esas etapas de equilibrio o nmero de platos tericos n de la columna, que es una medida de la eficiencia de sta, mientras que valor de la altura del plato terico h est inversamente relacionado con ella. Tericamente, la capacidad de resolucin de una columna aumenta a medida que el tamao de partcula del soporte disminuye. Sin embargo, a menor tamao de partcula mayor resistencia al paso del efluente, y por tanto menor flujo de la fase mvil a travs de la fase estacionaria. Este menor flujo aumenta el tR, y por tanto los picos cromatogrficos de solutos se ensanchan por difusin y se reduce la capacidad de resolucin. A menudo se emplean bombas de baja presin (peristlticas) para aumentar el flujo, pero en niveles aceptablemente bajos para no provocar aumentos de presin que daen la matriz y reduzcan an ms el flujo. La naturaleza de las interacciones que se establecen entre los solutos y la fase estacionaria es distinta para cada tipo de cromatografa, dependiendo del aspecto fsicoqumico en que se basen. Las interacciones de cada soluto individual retardan su progreso cromatogrfico en una magnitud que depende de sus propiedades. Los solutos pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eludos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente. As, los primeros solutos que se obtienen en un proceso cromatogrfico son los que menos interaccionan con la fase estacionaria. La adecuada eleccin de las fases mvil y estacionaria permite que las diferencias de interaccin entre los distintos componentes de una mezcla y ellas se traduzcan en su separacin o fraccionamiento efectivo (aspecto preparativo), a la vez que pueden identificarse (aspecto analtico) atendiendo a su velocidad de avance caracterstica. En general las cromatografas con propsitos preparativos se realizan a gran escala y aqullas con propsitos analticos a pequea escala. Las fuerzas de retardo que actan sobre cada uno de los componentes de una mezcla a fraccionar y los hacen migrar a distintas velocidades por una columna, harn que se separe en
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bandas de sustancias ms o menos puras. Estas pueden recolectarse como fracciones separadas de efluente (con un colector de fracciones) para su anlisis, o para purificacin si se seleccionan slo las que contengan una protena de inters. Los materiales separados pueden monitorizarse de forma directa en el efluente con detectores que midan absorbancia, fluorescencia, radiactividad, ndice de refraccin, pH o conductividad elctrica, o bien en las fracciones individuales recolectadas. Adems, la presencia de biomolculas especficas puede detectarse por su actividad enzimtica o biolgica, o bien por inmunodeteccin. Clasificacin. Los distintos mtodos cromatogrficos se pueden clasificar de acuerdo con los siguientes criterios: 1. Estado fsico de las fases mvil y estacionaria. Esta es una divisin ms metodolgica que conceptual, que responde a los diferentes modos de operacin e instrumentacin necesarios para manejar lquidos o gases. - cromatografa lquida: la fase mvil es un lquido que discurre a travs de una fase estacionaria que es lquida (cr. lquido-lquido) o slida (cr. lquido-slido). En el caso de la primera, es necesario el concurso de un soporte slido que fije la f. estacionaria para que no sea arrastrada por la f. mvil. - cromatografa gaseosa: la fase mvil es un gas. Es necesario vaporizar la muestra, que luego se arrastra mediante un gas inerte (generalmente N 2) para ponerse en contacto con la fase estacionaria, que puede ser lquida (cr. gas-lquido) o slida (cr. gas-slido, menos frecuente). Debido al proceso de volatilizacin de la muestra, que raramente es aplicable a biomolculas grandes, no se suele usar en laboratorios de Bioqumica y Biologa Molecular. 2. Disposicin de la fase estacionaria o tipo de contacto entre las fases. - en columna: la f. estacionaria est contenida dentro de una columna con entrada y salida, que puede ser de vidrio, plstico, tefln, etc. Como la f. mvil, la muestra se introduce por gravedad o aplicando presin y va interaccionando con la f. estacionaria a medida que progresa su elucin a travs de la columna. - en superficie plana: la f. estacionaria tiene forma de plano o est sobre un plano. ste puede ser un papel, que sirva de f. estacionaria o que est impregnado con una sustancia que acte como tal (cr. en papel), o bien una capa de partculas slidas extendida y fijada sobre un soporte tal como una placa de vidrio (cr. en capa fina). La f. mvil se mueve bsicamente por capilaridad. - en batch: la equivalencia de este trmino ingls sera por tandas o lotes. Esta variante consiste en operar con la fase estacionaria en suspensin (en un tubo, vaso, etc), sin necesidad de usar columnas cromatogrficas ni elucin continua en una direccin. Por ello no puede ser aplicada a la cr. de exclusin molecular, y est especialmente indicado para las cr. de intercambio inico o de afinidad. 3. Interaccin entre muestra y fase estacionaria. - cromatografa de reparto: el tipo de interaccin es la solubilidad, de forma que la separacin de los componentes de la mezcla se realiza en base a las diferencias en solubilidad de las sustancias en las fases estacionaria y mvil. Intervienen varias interacciones de los solutos con ambas fases, producindose una retencin diferencial por la primera. En cada accin de reparto, los componentes de la mezcla se reparten diferencialmente entre ambas fases de acuerdo con su coeficiente termodinmico de reparto k = [ ]FM / [ ]FE , que es la relacin de concentraciones en el equilibrio de un soluto distribudo entre dos fases

inmiscibles (en este caso, la mvil y la estacionaria). Las cromatografas en capa fina o en fase inversa se basan en reparto. - cromatografa de exclusin molecular: tambin llamada de penetrabilidad, y mal llamada de filtracin en gel o filtracin molecular, se basa en diferencias en tamao y forma tridimensional. La interaccin por difusin de los solutos con parte de la fase mvil atrapada como fase estacionaria en un soporte slido formado por microesferas porosas (es un caso de cr. lquido-lquido) permite separar las molculas en base a su capacidad para acceder al interior de las microesferas. No se establece ninguna interaccin entre las fases mvil y estacionaria.

- cromatografa de afinidad: se basa en procesos de reconocimiento especfico tridimensional entre molculas. Las interacciones entre la f. estacionaria y uno o varios solutos de inters presentes en la muestra son muy fuertes y especficas, de forma que stos quedan fuertemente retenidos. Hay un reconocimiento de estructuras submoleculares mediante mltiples interacciones dbiles (electrostticas, puentes de H, hidrofbicas, de Van der Waals), como en las uniones hormona-receptor o antgeno-anticuerpo. - cromatografa de adsorcin: se basa en procesos de asociacin molecular mediante uniones superficiales basadas en interacciones electrostticas y/o hidrofbicas inespecficas. Cuando el tipo de interaccin es de carcter indefinido y mixto, se habla de adsorcin inespecfica. Cuando se tiene una f. estacionaria que tiene unidos grupos especficos cargados positiva o negativamente, o bien hidrofbicos, las cr. de adsorcin se pueden dividir en: - intercambio inico: se establecen relaciones electrostticas entre grupos positivos o negativos de la f. estacionaria (intercambiadores) y los grupos cargados de la muestra que pasan a travs de la columna. Dentro de l estn el intercambio aninico y el intercambio catinico, en funcin de que la carga del grupo intercambiador sea positiva o negativa. - interaccin hidrofbica: en un entorno de alta concentracin salina, zonas apolares de los ligandos presentes en la muestra se unen a los grupos hidrofbicos de la f. estacionaria. La separacin es muy complicada porque las uniones son muy fuertes, y se hace con gradientes inversos (decrecientes) de concentracin salina. Se suele usar para protenas con zonas hidrofbicas expuestas a la superficie, como las de membrana.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.

La cromatografa de intercambio inico se basa en las interacciones electrostticas y permite la separacin de macromolculas en funcin de sus cargas mediante su interaccin diferencial con una fase estacionaria de naturaleza inica. Res+A- + B- Res+B- + ALa fase estacionaria consta de intercambiadores inicos (Res+), que son grupos cargados unidos covalentemente a un soporte o matriz. Estn asociados a iones de carga opuesta o contraiones (A-); la asociacin reversible de stos se intercambia y est en equilibrio con la de molculas de los solutos de su misma carga presentes en la muestra (B -), entre los que est nuestra molcula de inters. La carga y naturaleza qumica de los intercambiadores determina la carga de los solutos inicos que se unen a ellos y la fuerza con que lo hacen. Por su parte, la interaccin de los solutos con los intercambiadores es ms fuerte a medida que su relacin carga/masa es mayor. Esta tcnica cromatogrfica es una de las ms empleadas en Bioqumica, por la versatilidad que proporcionan la gran variedad de grupos intercambiadores disponibles, y sus respuestas a condiciones cambiantes de pH y concentracin inica. Est muy indicada en las primeras etapas de los procesos de purificacin, por su buena resolucin y alta retencin de solutos, aunque por la misma razn se puede usar en cualquier momento. Segn la carga de la fase estacionaria, hay - cr. de intercambio aninico, en la que el intercambiador es un catin o base, es decir, una matriz con un grupo cargado positivamente, al que se unen aniones y polianiones. Los contraiones tambin son aniones (Cl-, acetato, OH-). - cr. de intercambio catinico, si el intercambiador es un anin o cido, o sea, una matriz con un grupo cargado negativamente, al que se unen cationes y policationes. Los contraiones tambin son cationes (Na+, K+, H+).

Segn la influencia del pH en la carga de los intercambiadores, stos pueden ser fuertes o dbiles, lo que en la prctica delimita el intervalo de pH en el que pueden ser manejados. - Fuertes: sus grupos estn totalmente ionizados en un amplio rango de pH (ms bsico en catinicos y ms cido en aninicos), de forma que su actividad o capacidad de intercambio se mantiene al mximo en todo ese rango. Entre ellos estn TEAE (trietil aminoetil, aninico), QAE (aminoetil cuaternario, aninico) y SP (sulfopropilo, catinico).

- Dbiles: sus grupos estn ionizados en un rango de pH ms estrecho. La disociacin, que define su carga y por tanto su capacidad de intercambio, vara mucho con el pH; en determinados rangos, la capacidad disminuye enormemente ante un aumento (aninicos) o disminucin (catinicos) de una unidad de pH. Entre ellos estn DEAE (dietilaminoetil, aninico) y CM (carboximetilo, catinico). Los rangos de pH aproximados de uso son, para intercambiadores fuertes entre pH 2 y 12, para los catinicos dbiles entre pH 5,5 y 12 y para los aninicos dbiles entre pH 2 y 8,5. Efectos del pH. En principio, los intercambiadores dbiles son mejores, porque permiten modular mejor su accin con el pH: pequeos cambios en el pH tienen ms repercusin en la carga del intercambiador, sea para el proceso de carga o para el de elucin. En todo caso, en intercambio inico es especialmente necesario asegurar el pH de los medios de elucin, dada la dependencia entre pH y estado inico. Por otra parte, tambin hay que tener en cuenta la relacin entre la carga del soluto a separar y el pH del tampn. Las protenas y otros polmeros poliinicos con cargas positivas y negativas pueden unirse tanto a intercambiadores catinicos como aninicos, segn su carga neta. Las protenas poseen grupos cargados positivos y negativos en las cadenas laterales de los aminocidos bsicos y cidos, y en los extremos amino y carboxilo. Las afinidades de unin de los polielectrolitos con grupos cido-base dependen en gran medida del pH debido a la variacin de su carga neta con l. - si el pH = pI, la carga neta es cero - si el pH < pI, la carga neta es positiva y la protena es un catin - si el pH > pI, la carga neta es negativa y la protena es un anin De estos principios se debe aprovechar el investigador para separar entre s biomolculas mediante cr. de intercambio inico. As, el pI de la protena decide qu pH usar y, segn la carga neta, qu intercambiador usar. Por tanto, hay que tener en cuenta si se conoce o no el pI de la protena, y obrar en consecuencia. Por ejemplo, para una protena de pI 5,5, a pH 4 hay que usar un intercambiador catinico y a pH 7 uno aninico, mientras que a pH 5,5 no se puede trabajar porque no se une.

Sin embargo, las protenas suelen ser estables (y funcionalmente activas) solamente en un estrecho rango de estabilidad ante el pH en el que se puede trabajar sin riesgo de desnaturalizacin de la protena, de forma que la eleccin de intercambiador puede estar condicionada por la estabilidad frente al pH de la protena de inters. As, en principio, se podra utilizar tanto un intercambiador aninico como uno catinico para purificar cualquier protena de inters. El concepto es trabajar al pH ms alejado posible del pI (en uno u otro sentido, segn el intercambiador), pero dentro del rango de estabilidad. Si no se conocen pI y estabilidad, se puede estimar el primero buscando el pH al que no se una al intercambiador (usando un mismo intercambiador fuerte a distintos pHs) y la segunda midiendo su actividad (si se puede) tras tratamientos a distintos pHs. Etapas cromatogrficas. 1. equilibrado de la fase estacionaria (que habitualmente est en un tampn de conservacin especial) con tampn de carga. Son necesarios un pH apropiado para que los grupos intercambiadores estn completamente ionizados y fuerza inica apropiada para favorecer la atraccin entre iones. 2. carga o aplicacin de la muestra en presencia del tampn de carga para la adsorcin de los componentes, habitualmente una mezcla de protenas. Las protenas sin carga o con la misma carga del intercambiador no se unen a ste. 3. lavado, pasando ms tampn de carga por la columna para eliminar los componentes de la muestra que no interaccionen. Quedan retenidos los componentes que tienen carga opuesta al intercambiador, tanto ms cuanto mayor sea su relacin carga/masa. 4. elucin, para liberar secuencialmente los componentes que hayan interaccionado con el intercambiador. Para ello se usan gradientes de fuerza inica o de pH. Tanto el tampn de carga como el de lavado y el de elucin se consideran fase mvil. 5. regeneracin del intercambiador, habitualmente con un tampn de alta fuerza inica, para eliminar todos los posibles ligandos unidos residualmente al intercambiador, y lavado posterior con tampn adecuado para ponerlo al pH y fuerza inica apropiados para su almacenamiento o equilibrado. Esto es una gran ventaja de esta tcnica: los intercambiadores se pueden reutilizar porque la matriz no ha sufrido alteracin covalente de ningn tipo. Eleccin del tampn y la fuerza inica. Aparte del pH de la fase mvil, en la purificacin de un soluto/protena hay que tener en cuenta el tipo de tampn que se usa y la fuerza inica o concentracin salina en la que tiene lugar la interaccin con el intercambiador. Respecto al tipo de tampn, la forma cargada del mismo no debe interferir con el proceso de intercambio de iones, por lo que no debe actuar como contrain y competir con la protena por la unin a la f. estacionaria, porque ello desvirtuara su equilibrio (y adems se creara un gradiente de pH en la columna). Para ello, el componente inico del tampn debe de tener la misma carga que la fase estacionaria.

As, para la cr. i. aninico, la especie cargada del tampn no puede ser aninica, porque el tampn deja de funcionar, ya que se une a la matriz y se desplaza el equilibrio. Para estos intercambiadores se suelen usar histidina (pKa 6,15), imidazol (7,0), trietanolamina (7,77), Tris (8,16), dietanolamina (8,8) y otros. Por la misma razn, para la cr. i. catinico se debe usar un tampn aninico, como actico (pKa 4,76), ctrico (4,76), Mes (6,15), fosfato (7,2), Hepes (7,55) y otros. Los componentes de la muestra que se carga tienen que estar en las mismas condiciones de pH y fuerza inica que el tampn de equilibrado del intercambiador. Para la seleccin de la fuerza inica para la carga se realiza, como en el caso del pH, una determinacin emprica, en este caso variando la fuerza inica de cada tubo. Se suele usar una fuerza inica baja para permitir una unin ptima del soluto/protena de inters, pero la ms alta posible, para disminuir la posibilidad de unin de otras protenas de interaccin ms dbil y permitir luego una elucin ms fcil. El volumen de muestra aplicado no importa, por lo que para evitar problemas con la fuerza inica o el pH, la muestra se diluye 10 20 veces en el tampn, de manera que se asegura que est en las condiciones adecuadas. En algunos casos puede ser conveniente eliminar sales por dilisis o cr. de exclusin molecular. En cualquier caso, la cantidad total de muestra no debe superar la capacidad de adsorcin del gel. Efecto de la fuerza inica en el equilibrio de unin. La afinidad con la que un soluto particular se une a un intercambiador inico determinado depende de las identidades y concentraciones de los otros iones en solucin debido a la competencia entre estos iones por los sitios de unin en el intercambiador. Respecto a la fuerza inica, hay que considerar los procesos de carga y lavado por una parte, y el de elucin por otra, adems del de regeneracin. En general, la carga se hace en fuerza inica baja (aunque la ms alta posible), lo que permite que las protenas, o los solutos en general, interaccionen con el intercambiador inico o resina. Para un intercambiador catinico genrico Res-, con un soluto catinico S+, y un contrain tipo como el Na+, el equilibrio sera: Res-Na+ + S+ Res-S+ + Na+ K = [Res-S][Na+] / [Res-Na][S+] O bien, para un intercambiador aninico genrico Res+, con un soluto aninico S- y un contrain tipo como el Cl-: Res+Cl- + S- Res+S- + ClK = [Res-S][Cl-] / [Res-Cl][S-] El valor de la constante de equilibrio K est determinado por las afinidades de Na + y S+, o bien de Cl- y S-, por el intercambiador correspondiente. Las afinidades de los solutos poliinicos S+ y S- estn fuertemente influenciadas por el pH, que determina su carga. Por otra parte, cuanto menor sea el valor de [Na+], o de [Cl-], mayor ser el de cada [Res-S] en el equilibrio. As, como ya se apunt, la idea es hacer la unin en la fuerza inica ms baja que permita el mximo de unin, reduciendo en lo posible la unin de componentes indeseados.

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Elucin. El proceso de separacin/purificacin de solutos puede mejorarse si a la columna cargada con la mezcla se le aplica el mtodo de elucin en gradiente. En este mtodo la fuerza inica, el pH, o ambos, varan en forma continua o escalonada a medida que se eluye la columna, con la intencin de liberar en forma secuencial a las distintas protenas que estn unidas al intercambiador inico. Este procedimiento lleva por lo general a una mejor separacin de protenas que la elucin isocrtica con una nica solucin.

Los ms utilizados son los gradientes continuos, en los que la concentracin salina o el pH de la solucin eluyente varan de manera constante con el volumen de solucin pasado por la columna. El aumento de fuerza inica compite con el soluto por la unin al intercambiador y provoca un desplazamiento del equilibrio hacia la izquierda, mientras que la variacin de pH, altera la carga del soluto, del intercambiador, o de ambos, para alterar las condiciones de equilibrio y revertir la unin. La primera opcin es ms reproducible, por lo que habitualmente se suele hacer un gradiente de fuerza inica creciente (bien continuo o discontinuo/escalonado; sobre todo de NaCl o KCl), a partir del valor del tampn de carga y hasta llegar al menos a la concentracin en la que eluye el ligando de inters, tanto para intercambiadores aninicos como catinicos. Con fuerza inica constante y variando el pH, se obtiene liberacin de las protenas a medida que el pH del tampn de elucin va igualando los correspondientes pI y las protenas van perdiendo la carga, pero estos gradientes dan ms problemas porque al afectar tambin la carga del intercambiador es ms difcil mantener el control y la reproducibilidad. En cualquier caso, el gradiente de pH debe ser decreciente para i. aninicos, puesto que para que se desplacen los aniones unidos al intercambiador deben ganar carga positiva, y creciente en catinicos, ya que los cationes unidos tienen que perder carga positiva para despegarse. Los gradientes combinados pH/fuerza inica, suelen ser discontinuos. Los gradientes continuos pueden ser lineales (la velocidad de aumento es constante con el tiempo), cncavos (al principio el cambio es pequeo y al final brusco; separa mejor las protenas en la primera parte y reduce el tiempo de separacin en la segunda), convexos (el cambio es brusco al principio y separa bien la
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segunda parte), o mixtos. Se suelen preparar automticamente mediante un sistema de bombas, que mezclan los componentes de acuerdo con caractersticas prefijadas. Matrices. La cromatografa de intercambio inico se hace habitualmente en columna, aunque tambin se hace en batch para realizar pruebas en pequeos volmenes en varias condiciones experimentales, o bien para grandes volmenes (p.e. en los primeros pasos de una purificacin) cuando las condiciones ya estn optimizadas. Respecto a las matrices o soportes empleados como fase estacionaria, sus propiedades qumicas y mecnicas gobiernan las caractersticas de flujo, accesibilidad de los iones y estabilidad del intercambiador. Normalmente estn constitudas por polmeros naturales (celulosa, agarosa, gel de slice, dextrano entrecruzado) o polmeros de sntesis, como la acrilamida o las llamadas resinas (como el Dowex: poliestireno-divinilbenceno). En general, al conjunto de la fase estacionaria con su grupo intercambiador se le suele llamar (impropiamente porque no todos lo son) resina de intercambio inico.

Los

intercambiadores celulsicos se encuentran entre los materiales ms utilizados para la separacin de molculas biolgicas. La celulosa es ligeramente modificada por combinacin con grupos inicos para formar el intercambiador inico. El intercambiador aninico de tipo celulsico ms empleado es la DEAE-celulosa, mientras que la CM-celulosa es el intercambiador catinico ms empleado. Los intercambiadores de tipo gel pueden tener los mismos tipos de grupos cargados que los de tipo celulsico. Tienen como ventajas que combinan las propiedades de separacin de la filtracin por geles con las del intercambio inico, y que por su estructura porosa y su alto grado de sustitucin de grupos cargados, estos geles tienen mayor capacidad de carga que los de tipo celulsico. Las matrices de dextrano (p.e. Sephadex) presentan el problema de que se hinchan y deshinchan dependiendo de cmo sea la fuerza inica y el pH. Entonces, cuando opera la columna y se intenta eluir selectivamente con un cambio de fuerza o de pH, las esferas de la matriz menguan o aumentan y el gel disminuye o aumenta. La razn est en la carga de las esferas, que depende del pH y la fuerza inica. Cuando el intercambiador est totalmente ionizado, existe mucha repulsin entre las esferas de la matriz, lo que provoca mayor hinchamiento. Cuando pH pKa, hay menor carga, menor repulsin y menor hinchamiento. Por otra parte, a menor fuerza inica, menos contraiones, lo cual supone mayor repulsin entre las partculas de matriz y por tanto mayor hinchamiento. Todo esto no ocurre con otras matrices, como la agarosa. Una desventaja de las matrices de tipo celulsico y en gel es que son fcilmente compresibles por las presiones aplicadas al intentar incrementar el flujo del eluyente, lo que paradjicamente reduce en gran medida el flujo. Este problema se soluciona con el uso de matrices no compresibles, como derivados del slice o esferas de vidrio, recubiertos de
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intercambiador. Estos materiales permiten velocidades de flujo y presiones muy elevadas, lo que permite separaciones cromatogrficas ms eficaces. Debido a su naturaleza hidrofbica, las resinas sintticas no se suelen utilizar para purificar biopolmeros, pero sin embargo son muy tiles para compuestos pequeos, que pueden acceder a su interior y beneficiarse de la alta densidad de grupos cargados. REALIZACIN DE LAS PRCTICAS. El primer da prepararemos las soluciones necesarias para la prctica, y haremos una recta patrn A280/concentracin de albmina. El segundo da estudiaremos la capacidad de carga o adsorcin de la albmina srica bovina (BSA) a dos intercambiadores aninicos, uno dbil (DEAE-Sephadex) y otro fuerte (QAE-Sephadex), a dos pHs distintos, pH 7,0 y pH 10,0. Como la BSA tiene un pI de 4,7 , en ambos casos estar cargada negativamente. Buscamos demostrar que los intercambiadores responden de forma diferente (su carga cambia ms o menos) ante los cambios de pH. El tercer da uniremos BSA (67 kDa, pI 4,7) u ovoalbmina (43 kDa, pI 4,6) a DEAESephadex, a un pH al que ambas estn cargadas negativamente (pH 7,0), y estudiaremos el efecto de gradientes discontnuos de concentracin de los aniones citrato, cloruro y acetato para revertir la unin de las protenas. Buscamos estudiar cmo los aniones tienen distinta afinidad por el intercambiador para desplazar la unin de las protenas, y cmo la unin de cada una de ellas es desplazada ms o menos fcilmente en funcin de su relacin carga/masa. 1er da. Preparacin de disoluciones. Se reparte la preparacin de soluciones generales entre los distintos grupos, para usar todos las mismas disoluciones y disminuir la variabilidad: - BSA 40 mg/ml 100 ml - Ovoalbmina 40 mg/ml 10 ml - NaCl 1,0 M 50 ml - Na-acetato 1,0 M 50 ml - Na-citrato 1,0 M 50 ml - Tris-HCl 0,1 M pH 7,0 200 ml - Tris-HCl 0,1 M pH 10,0 200 ml - DEAE-Sephadex (suspensin en solucin de almacenamiento) - QAE-Sephadex (suspensin en solucin de almacenamiento) El primer da cada grupo de trabajo preparar las siguientes soluciones: Para el 1er-2 dia: 1. BSA 2 mg/ml, Tris-HCl 20 mM (*) pH 7,0 2. BSA 5 mg/ml 3. BSA 10 mg/ml 4. BSA 15 mg/ml 5. BSA 20 mg/ml 6. BSA 2 mg/ml, Tris-HCl 20 mM (*) pH 10,0 7. BSA 5 mg/ml 8. BSA 10 mg/ml 9. BSA 15 mg/ml 10. BSA 20 mg/ml - Tris-HCl 20 mM pH 7,0 - Tris-HCl 20 mM pH 10,0 50 ml 50 ml 5,0 ml 1,3 ml 1,3 ml (*) ojo: concentracin final

Para el 3er da: - BSA 5 mg/ml, Tris-HCl 20 mM (*) pH 7,0

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- ovoalbmina 5 mg/ml, Tris-HCl 20 mM (*) pH 7,0 - Tris-HCl 20 mM pH 7,0 50 ml 1,0 ml 1,0 ml

5,0 ml

1. Na-citrato 5 mM, Tris-HCl 20 mM (*) pH 7,0 2. Na-citrato 10 mM 3. Na-citrato 20 mM 4. Na-citrato 30 mM 5. Na-citrato 40 mM 6. Na-citrato 50 mM 7. NaCl 50 mM, Tris-HCl 20 mM (*) 8. NaCl 100 mM 9. NaCl 150 mM 10. NaCl 200 mM 11. NaCl 250 mM 12. NaCl 300 mM pH 7,0

13. Na-acetato 50 mM, Tris-HCl 20 mM (*) pH 7,0 14. Na-acetato 100 mM 15. Na-acetato 150 mM 16. Na-acetato 200 mM 17. Na-acetato 250 mM 18. Na-acetato 300 mM

1,0 ml

Cuantificacin de las disoluciones de albmina. Cuando se hayan preparado las disoluciones de albmina que se indican, se determina su absorbancia a 280 nm y se calcula el coeficiente de conversin entre concentracin y absorbancia. Hay que tener en cuenta que para medir la A 280 es necesario diluir las disoluciones ms concentradas (diluir hasta 1 ml con agua 1:20 las de 10, 15 y 20 mg/ml, 1:10 las de 5 mg/ml y 1:5 las de 2 mg/ml). Como indicacin, la A280 de 1 mg/ml de BSA 0,5 - 0,7

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2 da) Determinacin de las capacidades de carga de los intercambiadores DEAE-Sephadex y QAE- Sephadex a distintos pHs. La mitad de los grupos usar DEAE-Sephadex y la otra mitad QAE-Sephadex. Cada grupo usar su resina a pH 7,0 y pH 10,0. OJO: agitar la suspensin de resina cada vez que se vaya a pipetear. Equilibrado: Aadir 0,2 ml de la suspensin de la resina a cada uno de 10 tubos eppendorf numerados. Centrifugar 2 min y descartar el sobrenadante. OJO: el precipitado es transparente. Buscar la interfase con cuidado. Resuspender el intercambiador precipitado con 1,0 ml de Tris-HCl 20 mM del pH adecuado (7 10). Agitar en el vortex. Centrifugar 2 min. Quitar sobrenadante. Aadir de nuevo 1 ml de tampn. Agitar, centrifugar y quitar sobrenadante otra vez. Carga: Tras el ltimo lavado, aadir a los tubos preparados a tal efecto 1,0 ml de cada una de las 10 distintas disoluciones de BSA. Mezclar bien por inversin de los tubos, esperar unos minutos y centrifugar como anteriormente. Recoger los sobrenadantes en tubos aparte y determinar su A280, diluyendo la muestra con agua 1:2 para los sobrenadantes de 5 mg/ml, 1:5 para los de 10 mg/ml y 1:10 para los de 15 y 20 mg/ml. De los datos de A280 de las disoluciones iniciales y los sobrenadantes tras la adsorcin, calcular los mg de BSA unidos al intercambiador en cada caso. mg BSA = [(A0 ASN) x 1 mg/ml x 1 ml ] / A280 para 1 mg/ml Representar grficamente los valores de BSA unida (en ordenadas) frente a la concentracin inicial (en abscisas).

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3er dia) Elucin con gradiente escalonado de Na-citrato, NaCl y Na-acetato de protenas unidas a DEAE-Sephadex a pH 7,0. La mitad de los grupos usar BSA y la otra mitad ovoalbmina, y en todos los casos se usar DEAE-Sephadex a pH 7,0. Equilibrar tres tubos con 0,2 ml de DEAE-Sephadex en Tris-HCl 20 mM pH 7,0 , tal y como se hizo el da anterior (centrifugar 2 min y quitar sobrenadante; lavar dos veces con 1 ml de Tris 20 mM pH 7,0). Carga: Aadir a cada uno de los tres precipitados 1,0 ml de la disolucin de una de las protenas 5 mg/ml (BSA u ovoalbmina) en Tris-HCl 20 mM pH 7,0. Mezclar por inversin del tubo varias veces. Centrifugar 2 min y descartar el sobrenadante. Lavado: Lavar las resinas dos veces con 1,0 ml de tampn Tris-HCl 20 mM pH 7,0. Descartar los sobrenadantes. Elucin: Aadir a los tres tubos con intercambiadores 1,0 ml de las disolucin de Nacitrato 5 mM (tubo 1), NaCl 50 mM (tubo 7) o Na-acetato 50 mM (tubo 13). Mezclar, centrifugar 2 min y recoger los sobrenadantes para medir en ellos la A280. Repetir la operacin sucesivamente en los mismos tubos con las seis disoluciones crecientes de Na-citrato, NaCl y Na-acetato. Determinar la A280 en los sobrenadantes de las eluciones salinas (no hace falta diluir). Representar grficamente los resultados (eje x = concentracin de sal; eje y = A280). Comentarlos en relacin con la afinidad de los aniones y la mayor o menor relacin carga/masa (en funcin de sus pI y Pmol) de la BSA y la ovoalbmina.

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CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR.

La cromatografa de exclusin molecular, exclusin por tamao o penetrabilidad (o impropiamente filtracin en gel) permite separar sustancias en base a sus diferencias en tamao y/o forma molecular. Es decir, la separacin cromatogrfica se hace en funcin del tamao siempre que se trate de molculas que tengan aproximadamente la misma forma tridimensional. Por ejemplo, la regla no se cumple al separar protenas fibrosas y globulares entre s. La cromatografa se realiza siempre en columna, porque para su desarrolllo es necesario el proceso de arrastre de la fase mvil. Como soporte de la fase estacionaria se usan geles inertes hidratados formados por partculas esfricas porosas de tamao microscpico (de unas 10 m), hechas a su vez de polmeros hidroflicos con estructura macromolecular en red. Una imagen aproximada de la estructura de estas partculas sera la de microesponjas, con un entramado hueco capaz de alojar lquidos en su interior. El dimetro de los poros est dentro de un rango determinado propio de cada tipo especfico de soporte o gel. La fase mvil alojada en el interior de las partculas constituye la fase estacionaria. Al eluir la fase mvil por la columna, el lquido intersticial entre las partculas sufre el arrastre, pero el lquido atrapado por el entramado de fibras de las partculas del gel no lo sufre. Tcnicamente, no se establece ninguna interaccin entre ambas fases. Cuando se hace pasar una muestra con varios componentes a travs de una columna de exclusin molecular, en la fase mvil va a haber molculas de tamao superior al del poro, que no son capaces de entrar a la fraccin atrapada dentro del soporte, y de tamao inferior, que s pueden acceder a la fase estacionaria. Respecto al tamao efectivo de una molcula en una solucin acuosa hay que tener en cuenta su masa (o volumen) y su dimetro hidrodinmico: el dimetro efectivo que ocupa una molcula en rotacin tridimensional continua. As, las molculas elongadas, por su mayor dimetro hidrodinmico, tienen menor probabilidad de penetrar por un poro determinado que las molculas esfricas de igual masa molecular. Las molculas que no penetran a travs de los poros discurren por los espacios intersticiales entre las partculas, por lo que irn pasando ms rpidamente y eluyen con el volumen de exclusin. Se denomina lmite de exclusin al Pmol de las molculas ms pequeas incapaces de penetrar los por poros de un gel determinado, aunque este parmetro tambin depende de la forma molecular. Las molculas de tamao inferior al lmite de exclusin s pueden entrar a la fase estacionaria a travs de los poros del gel, de forma que quedan retenidas y se retrasan en la elucin. Esta retencin es mayor a medida que sean menores y entren mejor a travs de los poros del soporte. Las muy pequeas (como p.e. las sales) entraran a travs de todos los poros posibles, interaccionando al mximo con la f. estacionaria. Por tanto, las molculas

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grandes eluyen antes que las pequeas: cuanto mayor es la molcula, menos interacciona y ms pronto sale; cuanto ms pequea, ms interacciona y ms tarda en salir. As, la eleccin del tipo de gel es importante para el fraccionamiento ptimo de mezclas complejas de protenas. El uso de un gel inapropiado puede provocar que la protena de inters sea totalmente excluda de las partculas del gel y eluya al principio en el volumen muerto con otras protenas, o bien que, al contrario, se equilibre completamente con toda la fase estacionaria y eluya con otras protenas al final, en la fraccin salina. En general, el tamao de poro del gel debe ser tal que la protena de inters sea parcialmente excluda de las partculas, lo que produce la posibilidad de su mejor separacin de otras. Respecto a su capacidad de fraccionamiento para procesos de purificacin, la resolucin de este mtodo cromatogrfico es baja comparada con la de otros. Eso se debe en buena parte a que el elemento clave en los equilibrios entre fases que dirigen esta cromatografa es la difusin. Sin embargo, sus ventajas son que las condiciones de separacin son muy suaves (pH y fuerza inica fisiolgicos, temperatura ambiente, etc), lo que permite separar protenas en condiciones que preservan la actividad biolgica, difciles para otros tipos de cromatografa, y que no hay prdida de muestra. En este sentido, es muy apropiada para la separacin/purificacin de protenas oligomricas con labilidad estructural, en las que la estructura cuaternaria se suele mantener por interacciones dbiles, y/o de grandes complejos, en los que la funcionalidad est asociada a la integridad de la estructura. Por otra parte, permite calcular el peso molecular de macromolculas, normalmente protenas y en algunos casos polisacridos. Para ello, una determinada columna se calibra filtrando una mezcla cuyos componentes son conocidos y deben tener en lo posible una forma similar a la protena problema (siendo el tipo estndar la seudoesfrica de protenas globulares). Tras su calibracin con protenas conocidas, la medida del Ve de la protena de inters permitir deducir su Pmol respecto a la curva de calibracin. Hay que tener en cuenta que en la cr. de exclusin molecular las condiciones de separacin de las protenas son especficas de cada columna particular, ya que dependen de la geometra de la columna, condiciones de empaquetamiento, flujo de la fase mvil y otros factores. As, el funcionamiento de cada columna de exclusin molecular no es objetivable a otras de sistemas experimentales anlogos, a diferencia de lo que sucede en el caso de cromatografas como la de intercambio inico o de afinidad. La filtracin en gel suele utilizarse tambin para eliminar sales de una solucin proteica. Por ejemplo, una protena que se precipit con sulfato de amonio puede librarse con facilidad del mismo si el precipitado se disuelve en un volumen mnimo de tampn adecuado y se aplica a una columna de gel con un lmite de exclusin menor que la masa molecular de la protena. Al eluir la columna con el tampn, la protena abandonar la columna antes que el sulfato de amonio. Parmetros de estudio. Para estudiar el comportamiento de las molculas en estas cromatografas se usan los siguientes parmetros: Volumen muerto o de exclusin (V0). Es el volumen de f. mvil que se encuentra ocupando los espacios intersticiales de la f. estacionaria y las conducciones de la columna, o bien el volumen que hay que hacer pasar para eluir a travs de la columna una sustancia mayor que el dimetro de poro (o que el lmite de exclusin). Se determina filtrando una sustancia de masa molecular muy elevada, generalmente azul dextrano, y midiendo su volumen de elucin.
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Volumen interno (Vi). Corresponde a la fraccin de la f. mvil que constituye la f. estacionaria por encontrarse ocupando el interior de la malla del gel, delimitada por los poros. Volumen del gel (Vgel, Vp). Es el volumen ocupado por el polmero o matriz slida que retiene la f. estacionaria. Suele ser muy pequeo y habitualmente se desprecia en los clculos. Volumen total (VT). Es el volumen ocupado por las fases mvil y estacionaria y el soporte. Se puede estimar calculando el volumen interno de la columna vol = r2 h. Volumen de elucin (Ve). Es el volumen de f. mvil que debe pasar por una columna para que eluya una molcula que se encuentra en el rango de separacin del gel. Es igual a la suma de V0 y la fraccin de Vi a la que la molcula tiene acceso. Es caracterstico de cada sustancia para cada sistema cromatogrfico. VT = V0 + Vi + Vgel - Como Vgel es despreciable, VT = V0 + Vi , correspondiendo V0 al volumen de la f. mvil, y Vi al de la f. estacionaria, - Como Vi no se puede medir directamente, Vi = VT - V0 - El vol. de elucin V e depende del V0 y de aquella proporcin de Vi a la que la partcula a eluir es accesible: Ve = V0 + k Vi (Ve = V0 + Kav Vi)

- Para molculas muy grandes que no entren a travs de los poros, Ve = V0 k = 0 - Para molculas de tamao intermedio, 0 < k < 1 - Si la partcula es tan pequea que puede acceder a todos los poros, tiene un volumen de elucin igual al volumen total: Ve = V0 + Vi = VT k = 1 O, lo que es lo mismo, con el paso de un volumen de fase mvil igual al de la columna han de eluir todos los solutos. Si no es as, existe algn tipo de interaccin entre la partcula y el soporte. Coeficiente de reparto (Kav). Es el parmetro que ms se usa. Es la fraccin de f. estacionaria a la que puede acceder por difusin un soluto dado. Kav = (Ve - V0) / (VT - V0) Su valor es caracterstico de cada molcula para una columna dada. P.e. si V0 = 35 ml, Ve = 50 ml, VT = 100 ml Kav = (50-35)/(100-35) = 0,23. Para una columna dada, y dentro del rango efectivo de separacin, hay una relacin lineal entre el Kav y el log Pmol (en realidad es sigmoidal, con una zona central lineal de
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pendiente negativa) de un grupo de sustancias cromatografiadas en ese sistema, siempre que tengan caractersticas hidrodinmicas similares, de forma que mayores tamaos implican menores Kav. El Pmol de una protena se puede hallar interpolando sobre la recta patrn el valor experimental de su Kav. Adems de Ve y Kav hay otros parmetros que miden el comportamiento de una molcula en un sistema de cr. de exclusin molecular, como Ve/VT, Ve/V0, Kd y R. Hay una amplia variedad comercial de soportes en cuanto a tamaos de las partculas y de sus poros, lo que permite elegir los adecuados para el rango de masas moleculares a separar. Los materiales ms usados para constituir estos soportes son poliacrilamida, agarosa, dextrano, metacrilatoetilenglicol, y otros. Todos estos geles son muy insolubles en agua, pero muy higroscpicos. El gel viene deshidratado y hay que hincharlo. Ninguno de ellos se hincha en solventes orgnicos, por lo que no pueden usarse para separar sustancias orgnicas o liposolubles. Dextrano: es un polmero de sacarosa en el que se consiguen distinta cantidad de enlaces cruzados entre las cadenas de sacarosas, lo que da lugar a distintos rangos de tamao de poro. Estos geles son estables en agua o disoluciones alcalinas y tienen la ventaja de que se pueden autoclavar, pero son inestables a pH cido y en presencia de agentes oxidantes. Un tipo de gel comn es el Sephadex, de distintos tipos segn sus rangos de separacin, que suelen cubrir de 1 a 2 rdenes de magnitud. P.e. Sephadex G75 indica que separa en un rango inferior a 75 kDa (de 3 a 80). Agarosa: son derivados del agar. Los tamaos de poro son mucho mayores que los del dextrano, por lo que son adecuados para separar entre s molculas de tamao superior. Son geles muy inertes, resistentes a pH bsico pero poco estables en cido. Por encima de 30C se reblandecen, y si se congelan su estructura se altera. P.e. Sepharosa. Poliacrilamida: se preparan polimerizando distintas proporciones de acrilamida y bisacrilamida, con lo que se consiguen geles con una gran variedad de tamaos de poro. Tambin los hay de componentes mixtos, como los Sephacryl, de dextrano y poliacrilamida o bien los Ultrogel, de agarosa y poliacrilamida, todos ellos muy estables, con gran rigidez, y capaces de fraccionar protenas hasta altsimos Pmol.

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REALIZACION DE LAS PRACTICAS. I) Preparacin de una columna y cromatografa manual. En esta prctica vamos a observar cmo se comportan tres molculas de tamao muy diferente (azul dextrano, citocromo c y azul de xilenol, de 2000, 12,5 y 0,54 kDa) en cromatografas de exclusin molecular realizadas en soportes con distinto rango de separacin. As, prepararemos columnas de Sephadex G25, G50 y G75, que son capaces de discriminar protenas entre los rangos 1-5 kDa, 1,5-30 kDa y 3-80 kDa, respectivamente. Una tercera parte de los grupos usar Sephadex G25, otra G50 y la otra G75, en columnas de 20 ml. Antes de aadir la suspensin de gel, se deben lavar bien las columnas con agua destilada. Tambin conviene desariear los geles con vaco para evitar la formacin de burbujas al empaquetar las columnas. Los soportes cromatogrficos estn equilibrados con NaCl 0,15 M en Tris-HCl 50 mM pH 7,5. Para rellenar las columnas con gel, sencillamente se va aadiendo suspensin de la misma y dejando que se empaquete hasta la altura deseada, aadiendo tampn a discrecin para evitar que el gel se deseque. Las columnas se empaquetan hasta obtener un volumen total de lecho cromatogrfico de 10 ml para el Sephadex G25, y de 15 ml para G50 y G75. Colocar un redondel de papel de filtro en la parte superior del lecho, para evitar alteraciones en ste al cargar la muestra y el tampn de elucin. Una vez empaquetadas las columnas se cargan 0,5 ml de una disolucin que contiene 2 mg/ml de azul dextrano, 10 mg/ml de citocromo c y 0,2 mg/ml de azul de xilenol. Una vez que la muestra ha entrado completamente al lecho, se aade tampn a discrecin. Desde el momento en que se aade la muestra se recoge en un tubo de 10 ml el eluyente de la columna. A partir de los 3 ml se recogen fracciones de 0,5 ml en tubos eppendorf hasta que haya salido la ltima banda coloreada. Medir en un colormetro la A600 (azul dextrano y azul de xilenol) y la A 410 (citocromo c) de las fracciones apropiadas de entre las recogidas. Para contar con un volumen de medida suficiente es necesario aadir a cada una otros 2,5 ml de agua. Dibujar los perfiles de elucin de las dos sustancias. Determinar V 0 (el pico del azul dextrano) para la columna, y los Ve y Kav del citocromo c y el azul de xilenol. Comparar los resultados obtenidos para los tres soportes cromatogrficos G25, G50 y G75. II) Cromatografa automatizada. En una columna (1,6 x 90 cm) de Sephadex G75, ya empaquetada y equilibrada con NaCl 0,15 M en Tris-HCl 50 mM pH 7,5, se cargan 2 ml de una mezcla que contiene, en tampn de elucin y 5% de glicerol, las siguientes protenas:
Azul dextrano (2000 kDa) -amilasa (200 kDa) alcohol deshidrogenasa (150 kDa) Albmina de suero bovino (66 kDa) Anhidrasa carbnica (29 kDa) Citocromo C (12,4 kDa) DNP-glicina (0,24 kDa) 1 mg/ml 4 mg/ml 5 mg/ml 10 mg/ml 3 mg/ml 2 mg/ml 0,1 mg/ml

Esta mezcla se cromatografa a una velocidad de flujo de 0,2 ml/min. En un colector automtico se registra de forma continua la A280 a 0,5 mm/min, y se recogen fracciones de 2 ml.

Con los resultados obtenidos definir Vo y Ve para las protenas y el azul de xilenol. Calcular el valor de VT en funcin del dimetro interno y altura de la columna. Calcular las Kav y hacer una representacin de las mismas (eje x) frente a los log Pmol (eje y). Analizar las fracciones de inters mediante SDS-PAGE (Da 6), y comparar los resultados obtenidos por tcnicas cromatogrficas y electroforticas.

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CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD.
Una caracterstica notable de muchas biomolculas y especialmente protenas es su capacidad de unir con firmeza molculas especficas en forma no covalente. Esta propiedad puede usarse para purificar estas protenas por cromatografa de afinidad, un tipo especial de cr. de adsorcin lquido-slido, en la que biomolculas denominadas ligandos de afinidad (p.e. anticuerpos, cofactores, inhibidores enzimticos, lectinas,) unidas covalentemente a soportes slidos adecuados, retienen a los solutos de inters (casi siempre protenas) de manera selectiva y reversible. Subyacente a la cromatografa de afinidad est el concepto de funcionalidad biolgica, detrs del que se encierra otro ms molecular, segn el cual la mayor parte de las funciones biolgicas son el resultado de interacciones muy especficas entre dos o ms biomolculas. Estas uniones se basan en el acoplamiento llave-cerradura tpico de Bioqumica y Biologa Molecular, en el que tiene lugar un reconocimiento superficial a nivel de estructura terciaria de una macromolcula con otra, que interaccionan de manera especfica (p.e. hormonareceptor, protena-ligando, antgeno-anticuerpo, enzima-sustrato, etc). Cuando se pasa a travs de un sistema cromatogrfico de afinidad un extracto o mezcla conteniendo la protena de inters, sta se une al ligando inmovilizado y las otras sustancias se eliminan de la columna por arrastre con el lquido de elucin. La protena, purificada en gran medida, puede luego recuperarse mediante un cambio en las condiciones de elucin que provoca la liberacin de la matriz cromatogrfica. La gran ventaja de la cromatografa de afinidad es que explota las capacidades de unin especficas de las protenas en lugar de las diferencias en propiedades fsico-qumicas, como ocurre con otros mtodos cromatogrficos. De la elevada especificidad de estas interacciones da cuenta la capacidad de reconocimiento que muestran tales sistemas biolgicos, que terminarn unindose an cuando se encuentren en mezclas muy complejas. As, las ventajas de esta tcnica son que permite purificar sustancias presentes en muy baja concentracin y/o a partir de mezclas muy complejas conteniendo solutos de caractersticas similares al de inters. Habitualmente se asume que es el soluto retenido el que interesa purificar; sin embargo, la cr. de afinidad tambin puede ser til para la retencin de elementos no deseados. La cromatografa de afinidad tiene una serie de caractersticas generales que la distinguen de otros tipos de cr. lquidas: alta selectividad en el mecanismo de retencin, campo de aplicacin restringido, separacin de un solo soluto o tipo de solutos, y uso de sistemas de baja presin y columnas cortas de escasa eficacia cromatogrfica intrnseca. Tiene un campo de aplicacin muy amplio, en el que se puede incluir la purificacin de casi cualquier biomolcula. El requisito es disponer de un ligando que, junto con tal biomolcula, configuren un sistema de interaccin biolgica. En esencia, la tcnica se basa en anclar covalentemente a un soporte cromatogrfico uno de los componentes del sistema biolgico; si el segundo componente viaja en la fase mvil, y ambos estn funcionalmente activos, se producir su unin especfica, es decir, su retencin en la columna. Si el ligando es sustrato de una enzima que se est purificando, las condiciones cromatogrficas deben ser tales que no permitan el funcionamiento cataltico de la enzima para evitar la destruccin del mismo. El ligando utilizado en el aislamiento de una protena particular por cr. de afinidad debe tener una afinidad suficiente por la protena como para inmovilizarla sobre la matriz, pero no tan alta como para impedir su liberacin posterior. La unin entre soluto y ligando suele ser el resultado de un equilibrio de asociacin-disociacin, y, como tal, es una interaccin reversible. Sin embargo, el equilibrio suele estar muy desplazado hacia la forma asociada, y la disociacin efectiva slo se consigue por competicin con ligando libre o tras un cambio conformacional que altere la complementariedad entre las partes. En este caso, el

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problema a resolver ser encontrar las condiciones de elucin que provoquen un cambio conformacional reversible asociado a la liberacin del soluto retenido. Segn su naturaleza, los ligandos de afinidad pueden ser macromolculas biolgicas o bien molculas de bajo peso molecular. Segn su actuacin, que se fundamenta en la selectividad en la retencin, se distinguen dos grandes grupos: ligandos generales, capaces de enlazar un determinado tipo o grupo de compuestos bioqumicos, como las lectinas y nucletidos, y ligandos especficos, que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, como los anticuerpos en la cromatografa de inmunoafinidad. Respecto al uso de ligandos generales, se debe a que es posible encontrar interacciones con caractersticas comunes entre grupos o tipos de biomolculas. Ello permite a los fabricantes de fases estacionarias ofrecer productos con ligandos de carcter general para la cromatografa de afinidad de cada uno de estos grupos, que ser algo tan sencillo como empaquetar la correspondiente fase estacionaria en una columna, y proceder segn la metodologa habitual. La

concanavalina A o la protena A son dos conocidos ejemplos que permiten entender la utilidad de estos soportes comerciales para cr. de afinidad especfica de grupo. La primera es una protena de origen vegetal (lectina), capaz de unirse a residuos monosacridos del tipo manopiransidos y -glucopiransidos. As, la unin de la ConA a una matriz proporciona una f. estacionaria vlida para la cr. de afinidad de glicoprotenas, polisacridos o glicolpidos con esos residuos. La protena A de Staphylococcus aureus se une especficamente a la regin Fc de las inmunoglobulinas, especialmente de las IgG de mamferos. As, su anclaje covalente a un soporte proporciona una buena f. estacionaria para la cr. de afinidad de anticuerpos. Preparacin de la fase estacionaria. Este es, en principio, un problema particular para cada muestra. Debido a la incontable variedad de interacciones biolgicas posibles, no es factible disponer comercialmente de fases estacionarias adecuadas para cada una de ellas, por lo que en esta tcnica es frecuente la preparacin por el interesado de la fase estacionaria ms adecuada para la purificacin de su protena problema. Para ello, existen procesos estandarizados de unin de ligandos a soportes adecuados. Antes de proceder al anclaje covalente del ligando es necesario seleccionar el soporte o matriz, cuyos requisitos son los mismos que para otros tipos de cromatografas: estabilidad mecnica y qumica, gran superficie, carcter hidroflico, ausencia de carga, y tamao del grano y porosidad controlables. El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgnicos derivados de polisacridos (sobre todo de la agarosa, con mltiples grupos OH libres, como la Sepharose 4B, muy usada), polmeros de acrilamida y metacrilato y algunas slices.
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La inmovilizacin de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en cada caso tiene connotaciones especficas. Se debe obtener una capa estable y densa del ligando, que adems debe conservar su actividad especfica con plenitud. En general, se inmovilizan mediante el establecimiento de enlaces qumicos covalentes entre el soporte slido activado y un grupo reactivo del ligando que est lo ms lejos posible de la zona activa de bioadsorcin. La agarosa se activa mediante tratamiento con bromuro de ciangeno (CNBr), lo que genera grupos imidocarbonato que pueden reaccionar con los ligandos a travs de sus grupos amino. Muchas protenas no pueden unirse a ligandos acoplados a la agarosa con CNBr debido a una interferencia estrica con la matriz de agarosa. Este problema se soluciona si se une el ligando a la agarosa mediante un grupo espaciador flexible, usando soportes activados comerciales como la agarosa activada mediante un grupo epoxi reactivo unido a un espaciador de longitud definida (p.e. una cadena de 12 tomos). El epoxi puede reaccionar con muchos de los grupos nucleoflicos de los ligandos, lo que permite que stos se unan de manera covalente al espaciador y la agarosa. Tambin se pueden usar carbodiimidas para la fijacin a soportes a travs de grupos aminos unidos a un espaciador. Aplicacin de la muestra y elucin. Por regla general, el volumen de lecho cromatogrfico empaquetado lleva la cantidad mnima de fase estacionaria necesaria para retener completamente los solutos presentes en la muestra problema. El tampn de equilibrado se habr escogido de forma que se favorezca la interaccin biolgica de inters, a la vez que se reduzcan al mnimo las interacciones inespecficas. Dada la elevada afinidad que suelen mostrar las molculas interaccionantes, lo normal es trabajar con fuerzas inicas relativamente elevadas (p.e. NaCl 0,2 M). Una vez aplicada la muestra, se continuar pasando tampn de equilibrado hasta lavar todos los contaminantes. El flujo de la columna, durante la aplicacin de la muestra y su posterior elucin, puede ser una variable crtica cuando las constantes de velocidad de las reacciones de asociacin y disociacin sean bajas. En general, es recomendable emplear flujos bajos durante la aplicacin y la elucin, mientras que en los lavados se podrn utilizar flujos altos. Para el proceso de purificacin es tan importante tener la fase estacionaria adecuada como un buen mtodo de elucin. Una vez que una protena se haya unido a una columna de afinidad y se hayan eliminado las impurezas por lavado, hay que liberarla de la columna. Una de las formas de hacerlo es eluir la columna con una solucin de un compuesto que compita por la unin con el sitio de la protena o del ligando. Una elucin especfica es la que se consigue cuando la fase mvil tiene algn agente inhibidor de la unin ligando-protena que compite por unirse a uno de ellos; esta ser la preferida siempre que resulte factible. Dentro de ella estn la elucin normal, basada en la interaccin inhibidor-protena y que es la situacin ms frecuente, y la elucin invertida, basada en la interaccin inhibidor-ligando de afinidad. En este caso la columna quedar contaminada por el agente empleado, pero ste se podr eliminar por medios ms drsticos, cuando ya la funcin biolgica no sea una limitacin. En las eluciones inespecficas se suele acudir a alterar las condiciones de la solucin de manera que rompan la interaccin entre el ligando y la protena, p.e. mediante cambios de pH, fuerza inica o temperatura. A veces es necesario combinar estos tres recursos, o incluso alterar la conformacin del ligando. Sin embargo, se debe tener cuidado de que las condiciones de la solucin no produzcan un dao irreversible a la protena. Como ltima opcin, se puede acudir al empleo de agentes caotrpicos (p.e. KSCN o urea), buscando la desnaturalizacin del sistema biolgico. Ello estar indicado en los casos en que esta desnaturalizacin sea reversible, o cuando la conformacin nativa no sea un requisito para los estudios posteriores. Son pocas las reglas generales sobre cmo disminuir la afinidad entre dos biomolculas interaccionantes: es un terreno dominado por el empirismo, que requiere considerar las peculiaridades de cada caso. Una vez finalizada la separacin, se procede a la regeneracin de la columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo de tampn de equilibrado o similar.

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Tipos especiales de cromatografa de afinidad. A continuacin se describen algunos sistemas cromatogrficos que presentan peculiaridades suficientes para recibir un tratamiento conceptual diferenciado. Cr. de inmunoafinidad: La fusin entre la inmunoqumica y la cr. de afinidad gener un mtodo poderoso de purificacin de molculas biolgicas. La unin de anticuerpos monoclonales a un material cromatogrfico adecuado produce una sustancia que slo ligar a la protena contra la que se gener el anticuerpo. Este tipo de cromatografa puede lograr purificaciones de hasta 10.000 veces en un solo paso. Sus desventajas son la dificultad tcnica para la produccin de anticuerpos monoclonales y las condiciones drsticas que suelen requerirse para la elucin de la protena unida. Cr. de afinidad con eptopos HA, FLAG o c-myc. Las tcnicas de ingeniera gentica permiten purificar por afinidad protenas para las que no hay ligando til, formando una protena de fusin de ellas con otra para la que hay un ligando disponible. Para ello se inserta un pequeo eptopo proteico (como HA: MYPYDVPDYA FLAG: DYKDDDDK) en uno de los extremos de la protena recombinante de inters. Los plsmidos se introducen en sistemas de expresin procariotas o eucariotas, y las protenas fusin se pueden purificar fcilmente a partir de los extractos celulares de expresin mediante el uso de anticuerpos contra el eptopo correspondiente, unidos a un soporte inerte. Estos complejos se obtienen fcilmente de forma comercial y se usan tambin para procesos de inmunoprecipitacin de la protena (en realidad, cr. de afinidad en batch). Los anticuerpos que detectan esos eptopos tambin estn disponibles en forma libre para procesos de inmunodeteccin. Cr. de afinidad con GST: En este caso se obtienen por ingeniera gentica protenas de fusin cuya porcin N-terminal est formada por la enzima glutatin-S-transferasa (GST; 220 aminocidos, 26 kDa). Como en el caso anterior, las protenas fusin se expresan en el sistema de eleccin y son purificadas con facilidad a partir del extracto celular correspondiente por cr. de afinidad en columnas de glutatin-agarosa. Las fusiones se unen especficamente al tripptido glutatin (-Glu-Cys-Gly) fijado a un soporte cromatogrfico como Sepharosa 4B (tanto en columna como en batch) y son eludas de forma especfica usando una solucin de glutatin. A continuacin, si se quiere liberar la protena de inters del
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fragmento GST, se pueden tratar las fusiones con proteasas especficas, como trombina o factor Xa, cuyos sitios de corte son includos en la zona de fusin. Un enfoque similar se puede realizar con fusiones de la maltose binding protein, que son purificadas con columnas de afinidad en las que el ligando es maltosa Cr. de afinidad sobre metales inmovilizados. Este sistema no se basa en el concepto de funcionalidad biolgica que subyace en otras cr. de afinidad; de ah que algunos autores prefieran englobarla dentro del intercambio inico, en una subvariedad que podra llamarse intercambio de ligandos. Explota las propiedades quelantes de las cadenas laterales de His, Cys y Trp de muchas protenas, que son capaces de formar compuestos de coordinacin con metales de transicin (p.e. Cu2+, Zn2+, Ni2+, Co2+). La puesta a punto de estos sistemas consiste en inmovilizar alguno de estos cationes en fases estacionarias provistas de agrupamientos quelantes muy potentes, como el ac. iminodiactico o el nitrilotriactico. Conviene mencionar que se trata de una cromatografa frecuentemente usada para la purificacin de protenas recombinantes, para lo que suelen expresarse modificadas con una secuencia apndice de 6 His consecutivas, que no suele afectar a sus propiedades funcionales o de secrecin. Esta cola de His muestra una elevada afinidad por el Ni2+, lo que puede aprovecharse para purificar protenas recombinantes en un solo paso. Cromatografa sobre colorantes inmovilizados. Este tipo de cromatografa se emplea fundamentalmente en el campo de las protenas. Su metodologa recuerda a la de la cromatografa de afinidad, y con frecuencia se la incluye como una subvariedad de ella. La interaccin de ciertos colorantes textiles (a menudo anlogos de nucletidos) con ciertas protenas es slo una cuestin de azar, debida a la flexibilidad que muestran los primeros, capaces de adoptar conformaciones complementarias a centros de unin presentes en las protenas, de forma que incluso pueden funcionar como inhibidores competitivos. Por supuesto, estas interacciones carecen de significacin biolgica.

La aleatoriedad de estas interacciones se manifiesta en el elevado empirismo de este tipo de cromatografas. De partida no se puede predecir si un determinado colorante ser capaz o no de interaccionar con una protena dada, y no hay ms remedio que realizar una serie de pruebas con diferentes colorantes, para saber si alguno resulta adecuado. La matriz cromatogrfica sobre la que se inmovilizan los colorantes suele ser, como en la cromatografa de afinidad, la agarosa. En general, la retencin de los solutos se realiza a pH neutro y con bajas fuerzas inicas (0,05 M), ya que las interacciones en juego no suelen resistir fuerzas inicas por encima de 0,3 M. La elucin de las protenas retenidas es otro aspecto que debe investigarse con antelacin. Ha de comprobarse si la interaccin es reversible bajo condiciones inespecficas, ya que no es extrao encontrarse ante adsorciones irreversibles en trminos de funcionalidad de la protena. Si se comprueba que la interaccin puede ser revertida, el siguiente paso es encontrar algn mtodo de elucin especfica con algn ligando especfico de la protena de inters (p.e. sustrato o inhibidor enzimtico, coenzima, efector, etc) para establecer una competencia entre el colorante inmovilizado y el mencionado ligando. La inespecificidad esencial de la interaccin entre protenas y colorantes hace que los mtodos de elucin inespecfica (aumento de fuerza inica, cambio de pH) aporten muy poca selectividad y resolucin.
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REALIZACION DE LAS PRCTICAS. En este caso vamos a realizar dos prcticas diferentes para demostrar cmo funcionan las tcnicas de cromatografa de afinidad y de cromatografa sobre colorantes inmovilizados. A. Cromatografa de afinidad con Glutatin Sepharosa 4B. Como explicamos, este sistema cromatogrfico se emplea para purificar en un solo paso protenas de fusin con la glutatin-S-transferasa. El proceso consiste en aadir una mezcla o extracto proteico que contenga nuestra protena de fusin* a una matriz comercial en la que el tripptido glutatin est unido covalentemente a un soporte de Sepharosa 4B. Una vez unida, y eliminados por lavado el resto de las protenas, se eluye especficamente con una solucin de glutatin reducido libre. En nuestro caso, partiremos de un extracto proteico de bacterias que han sido transformadas con el plsmido pGEX-2T_GAPDH y que han expresado la protena de fusin GST-GAPDH. El Pmol esperado de sta debe de estar en torno a 62 kDa (36 kDa de GAPDH y 26 kDa de GST).
* Poner en 0,3-0,5 ml de PBS el precipitado de unos 5 ml de un cultivo de E. coli que haya expresado una protena fusin con GST. Sonicar y centrifugar 10-15 min. Coger el sobrenadante o extracto celular.

Procedimiento. - Tampn de unin: t. fosfato salino pH 7,3 (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) - Tampn de elucin: 50 mM Tris-HCl, 10 mM glutatin reducido, pH 8,0 - Agitar con cuidado el tubo de Glutatin Sepharosa 4B para resuspender la matriz (MGS). Aadir 50 l a un tubo eppendorf. - Centrifugar a 5000 rpm 2 min. Quitar el sobrenadante con cuidado. - Lavar el precipitado de MGS con 200 l de tampn de unin. Resuspender con cuidado, centrifugar a 5000 rpm 2 min y retirar el sobrenadante. - Repetir el paso anterior. - Aadir el extracto celular (100-300 g en hasta 500 l de tampn de unin) al precipitado de MGS (guardar una muestra de extracto celular para anlisis posterior por SDS-PAGE). Incubar a temperatura ambiente en agitacin suave por al menos 30 min. - Sedimentar la MGS centrifugando a 5000 rpm 2 min. Retirar con cuidado el sobrenadante y guardarlo para el anlisis posterior. - Lavar la MGS con 300 l de tampn de unin. Agitar con cuidado. Centrifugar a 5000 rpm 2 min y retirar el sobrenadante. - Repetir el paso anterior. - Eluir la protena de fusin unida a la MGS aadiendo 50 l de tampn de elucin. Incubar a temperatura ambiente 5-10 min en agitacin suave. Sedimentar la MGS por centrifugacin a 5000 rpm 2 min. - Recoger con cuidado el sobrenadante, donde estar la protena de fusin. B. Cromatografa sobre colorantes inmovilizados en columnas de Cibacron Blue. La composicin normal del suero humano es de un 90% de agua y un 10% de solutos. De stas un 10% son sales inorgnicas, un 20% pequeos nutrientes y metabolitos, y un 70% protenas sricas. A su vez, dentro de stas, la albmina suele suponer un 55-60%, las globulinas un 10-15%, las -globulinas un 5-15% y las -globulinas un 15-30%. En esta prctica vamos a usar dos columnas comerciales que unen albmina o albmina e IgG, que se usan habitualmente para eliminar de los sueros esas dos protenas mayoritarias y poder analizar mejor el resto de ellas (ver hoja 29). La albmina es retenida por un colorante inmovilizado (tipo Cibacron Blue) y las IgG son retenidas por protenas de la pared de algunas bacterias, tipo Protena A o Protena G, que se unen a la regin comn F c de esas inmunoglobulinas.
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Como muestras usaremos sueros de distintas especies (humano, murino, bovino), de forma que tambin estudiaremos la efectividad de retencin para la albmina e IgG de las distintas especies. Para el anlisis cargaremos en los dos tipos de columna los sueros de las tres especies, y luego eluiremos las protenas unidas mediante tratamientos drsticos de fuerza inica (para el BSA) o pH (para las IgG). Posteriormente analizaremos las muestras mediante SDS-PAGE para comprobar la selectividad y eficiencia de unin.

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Para el anlisis electrofortico, coger 5 l de suero diludo, 5 l del eludo o flowthrough del paso 6 y 15 l de los eludos del paso 8. En stos eliminar la sal centrifugando en microcolumnas de exclusin molecular. Para el anlisis de la cromatografa de GST-glutatin, coger 20 l del extracto inicial y otros 20 l del eludo final. Aadir a cada muestra 5 l de tampn de muestra de SDS-PAGE, calentar a 95C 5 min y cargar a los geles, o guardar congeladas hasta su uso.

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OTRAS TCNICAS CROMATOGRFICAS.

Cromatografa de adsorcin. Es el mtodo cromatogrfico original. Es una cromatografa de adsorcin inespecfica lquido-slido que suele utilizarse para separar entre s sustancias no polares de Pmol < 5.000, a menudo de ismeros estructurales y/o grupos de sustancias relacionadas, pero raramente para protenas. En ella, las molculas se adsorben fsicamente, por uniones de Van der Waals o puentes de hidrgeno, a la superficie de soportes polares insolubles como gel de slice (cido silcico) o almina (Al2O3), o bien de otros menos usados como carbn activado o tierra de diatomeas. Luego, las molculas se eluyen de la columna con un solvente puro como cloroformo, hexano o eter etlico, o con mezclas de ellos. El proceso de separacin se basa en la particin de las distintas sustancias entre el material polar de la columna y el solvente no polar. Cromatografa de hidroxiapatita. La hidroxiapatita o hidroxiapatito es una forma cristalina insoluble de fosfato clcico con la frmula emprica Ca5(PO4)3OH, que puede emplearse como fase estacionaria para separar protenas o cidos nucleicos, que se adsorben a ella. No se conoce con precisin la base fsico-qumica de este procedimiento de fraccionamiento, pero parece involucrar la adsorcin de aniones a los sitios de Ca2+ y de cationes a los sitios de PO43- en la hidroxiapatita cristalina. La capacidad resolutiva puede atribuirse a las propiedades de intercambio inico de los grupos PO43- y Ca2+, pero ello no es suficiente para explicar las resoluciones alcanzadas: en la selectividad cromatogrfica tambin influyen la formacin de compuestos de coordinacin con el Ca2+ y las restricciones estricas impuestas por la conformacin de los biopolmeros. Todo ello hace que este tipo de cromatografa ocupe una posicin separada del resto, y que se suela acudir a ella para resolver problemas experimentales que no han encontrado solucin con otras cromatografas. Dos de sus principales aplicaciones son la purificacin de anticuerpos monoclonales y la separacin de diferentes formas de DNA. Se han establecido algunas reglas generales empricas sobre el uso del hidroxiapatito en el campo de las protenas. As, si la columna se equilibra en tampn fosfato 1 mM, su carga neta puede considerarse negativa, si se equilibra en una disolucin no tamponada de NaCl 1 mM ser neutra, y si se equilibra en una disolucin no tamponada de CaCl 2 o MgCl2 ser positiva. Por tanto, el primer tampn de equilibrado estar indicado para la retencin de protenas bsicas, mientras que las otras disoluciones de equilibrado se recomiendan para protenas cidas. Tras lavado con la disolucin de equilibrado se procede a la elucin de las protenas retenidas, para lo que se han desarrollado protocolos con distintos gradientes. En general lo recomendable es eluir las protenas en orden de bsicas (con 1-5 mM MgCl 2), neutras (con 0,01-1 M NaCl) y cidas (con 0,01-0,3 M fosfato). Las fosfoprotenas constituyen un caso especial porque en ellas las interacciones de los iones fosforilo con el Ca2+ predominan sobre su carcter cido-base. En cuanto a los cidos nucleicos, las interacciones entre los grupos fosfato de las cadenas polinucleotdicas y el Ca2+ del hidroxiapatito son las que justifican la retencin. Cuanto mayor sea la rigidez del esqueleto polinucleotdico, ms fuerte es la interaccin; as, es posible separar mediante este tipo de cromatografa el DNA desnaturalizado del nativo, el DNA de cadena sencilla del DNA de doble cadena, e incluso el DNA superenrollado de las dobles hlices lineales. La elucin se suele llevar a cabo con gradientes de fosfato. Cromatografa en fase inversa o reversa. La cromatografa en fase inversa (CFI) es una forma de cromatografa de reparto lquido-lquido en la que el carcter polar de las fases est invertido respecto del de la cromatografa en capa fina o papel. La fase estacionaria presenta un lquido no polar inmovilizado sobre sobre un slido relativamente inerte, mientras que la fase mvil es un lquido ms polar. En sus orgenes, la CFI se llevaba a cabo sobre slica con fases mviles polares conteniendo cierta proporcin de un disolvente orgnico que se adsorba sobre la
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slica. Tales recubrimientos son inestables, y para mejorar la reproducibilidad se usan fases estacionarias con el compuesto orgnico unido covalentemente, que se comporta de forma muy parecida a un lquido que recubriera las partculas de slica. Por tanto, se puede aceptar la consideracin de la CFI como una cr. de reparto entre un lquido estacionado y otro que acta como fase mvil. En realidad estas fases orgnicas ancladas exhiben un comportamiento intermedio entre un lquido y un slido, aproximndose ms a este ltimo, de forma que la adsorcin de solutos parece jugar un papel destacado en la CFI. Esta cromatografa se desarroll en principio para separar mezclas de sustancias no polares, como lpidos, pero result efectiva tambin para separar sustancias polares como oligonucletidos y protenas, siempre que tengan reas no polares. En CFI la retencin inicial se propicia utilizando un tampn acuoso como tampn de equilibrado y de aplicacin de la muestra. Es la hidrofobicidad general de una molcula (no la superficial como en la cromatografa de interaccin hidrofbica) la que da cuenta de una mayor o menor retencin, debido a la elevada hidrofobicidad de las fases estacionarias empleadas. En contacto con ellas, los residuos apolares internos resultarn expuestos y participarn en la interaccin hidrofbica con los grupos no polares, de forma que muchas biomolculas (como las protenas) pierden su estructura terciaria. Las interacciones hidrfobas en esta cromatografa son fuertes, por lo que la elucin de los solutos adsorbidos a la fase estacionaria se consigue aumentando la proporcin de algn disolvente orgnico en la fase mvil, el cual contribuir adicionalmente a la prdida de plegamiento. Por todo ello, la CFI es un mtodo de separacin desnaturalizante, que no estar aconsejado cuando se trate de preservar la conformacin nativa de un biopolmero. Las fases inversas C18 son las ms populares en la separacin de solutos pequeos (p.e. pptidos, cidos grasos, mononucletidos, etc.). Sin embargo, para biopolmeros, estas cadenas alifticas son demasiado largas, lo que puede ocasionar retenciones irreversibles. En estos casos es ms frecuente acudir a slicas C 3 o C4. Las slicas C8 constituyen una buena situacin de compromiso entre ambos extremos. Los eluyentes ms usados son etanol, acetonitrilo, propanol y tetrahidrofurano. De entre ellos, suele preferirse el acetonitrilo por su menor viscosidad, que se traduce en picos de elucin ms estrechos. Al aumentar un 10% en el porcentaje de disolvente orgnico en la fase mvil disminuye la retencin de los solutos aproximadamente a la mitad. Esta regla falla a veces para protenas o pptidos grandes, que por encima de un determinado porcentaje pueden sufrir procesos de precipitacin, cambios conformacionales, o potenciacin de interacciones electrostticas inespecficas. Cromatografa de interaccin hidrofbica. Las interacciones hidrfobas tambin son la base de la cromatografa de interaccin hidrofbica (CIH), que separa las protenas sobre la base de la relacin de su superficie con el agua, como resultado de la asociacin entre regiones apolares promovida por entornos acuosos, que est favorecida termodinmicamente por el aumento de entropa que supone. En efecto, la solvatacin de las superficies hidrofbicas requiere que las molculas de agua implicadas adopten un orden estricto; al interaccionar las regiones hidrofbicas entre s, la superficie expuesta al agua disminuye, y con ello el nmero de molculas de agua ordenadas. En suma, disminuye el orden global y aumenta la entropa. En general todos los biopolmeros tienen un mayor o menor grado de hidrofobicidad, lo que hace que este tipo de cromatografa pueda ser utilizado para muy diversos problemas experimentales. Para una protena plegada en su conformacin nativa, la mayor parte de las cadenas apolares que tenga se encontrarn interaccionando hidrofbicamente en el interior de la estructura. Sin embargo, siempre pueden quedar cadenas de aminocidos ms o menos hidrofbicos en la superficie, expuestos al medio acuoso, cuya hidrofobicidad es la que da cuenta de la interaccin en CIH. Por ello, las interacciones hidrfobas resultantes en la CIH son relativamente dbiles, de manera que las protenas conservan su estructura nativa. As, se trata de una cromatografa no desnaturalizante, en la que se preservan las estructuras terciaria y cuaternaria de las protenas.
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Uno de los factores que permiten hablar de la cr. hidrofbica como una cromatografa no desnaturalizante es el empleo de fases estacionarias de moderado carcter hidrofbico, en contraste con la elevada hidrofobicidad de las fases estacionarias empleadas en CFI. En CIH se suele trabajar con fases estacionarias basadas en polmeros hidroflicos (p.e. agarosa, polmeros acrlicos), a los que se han unido covalentemente grupos hidrocarbonados como metilo, butilo o fenilo. Cuanto mayor sea la longitud de la cadena hidrocarbonada, mayor ser la retencin de los solutos. En el caso del grupo fenilo, ste puede afectar a la retencin de los biopolmeros no slo por su hidrofobicidad, sino tambin por interacciones con sus residuos aromticos, lo que puede producir inversiones de selectividad. En una columna de CIH las muestras que se apliquen han de contener altas concentraciones salinas (sobre 2-4 M) para favorecer las interacciones hidrofbicas y la retencin de los solutos. Algunas protrenas pueden precipitar a esas fuerzas inicas, y es necesario eliminarlas por centrifugacin antes de la carga. El pH, tanto de la muestra como de los tampones de equilibrado y elucin suele fijarse en torno a la neutralidad, como forma de preservar la conformacin nativa. No todos los iones favorecen por igual las interacciones hidrofbicas; incluso determinados iones las desfavorecen. Por orden decreciente de su capacidad favorecedora de las interacciones hidrofbicas: (PO4)3- > (SO4)2- > acetato > Cl- > Br- > SCN(NH4)+ > K+ > Na+ > Mg2+ > Ca2+ En estas series, los iones ms a la izquierda son los que mayor orden inducen en la estructura del agua (anticaotrpicos o cosmotrpicos), mientras que los de la derecha provovan desorden (caotrpicos). Cuanto menos caotrpico sea un in ms favorece las interacciones hidrofbicas. La elucin se puede llevar a cabo mediante gradientes que deben reducir en forma progresiva estas interacciones hidrfobas dbiles. As, se usan gradientes continuos o discontinuos de fuerza inica decreciente (las interacciones hidrfobas se refuerzan por el aumento de fuerza inica), en general a base de sulfato de amonio. Alternativamente se puede acudir al empleo de sales caotrpicas (p.e. KSCN), si bien ello puede conducir a desnaturalizaciones. Otra alternativa es el empleo de gradientes de pH: se trata entonces de variar el pH en el sentido de aumentar la carga neta de los solutos, hacindolos ms hidroflicos. Finalmente, tambin pueden emplearse concentraciones crecientes de detergentes o la disminucin de temperatura. El uso de gradientes de eluyente con elevadas concentraciones salinas produce ciertos inconvenientes: a) dificultad de deteccin mediante Abs UV; b) desviaciones en las lneas basales de los cromatogramas por variaciones en el ndice de refraccin; c) ensanchamiento de los picos por la elevada viscosidad de los eluyentes y por cambios en los estados de agregacin y conformacin de las molculas; d) necesidad de usar sales de alta pureza. Cromatografa lquida de alta resolucin. La cromatografa lquida de alto rendimiento o resolucin (high performance liquid chromatography, HPLC) constituye la forma ms eficaz de llevar a cabo un proceso cromatogrfico. A veces la P se interpreta como pressure, indicando las altas presiones necesarias para ella, aunque lo que en realidad la caracteriza es la performance, su elevada eficiencia. Las primeras son slo el precio a pagar por la alta eficiencia, aunque a veces se consigue con presiones no tan grandes. La HPLC no es una tcnica nueva en el campo de la cromatografa, sino el ltimo escaln en el desarrollo de sta, que abarca tanto el terreno instrumental como el de la fabricacin de nuevas fases estacionarias. En los sistemas HPLC la separacin cromatogrfica puede basarse en la adsorcin, el intercambio inico, la exclusin molecular, la afinidad, la CIH o la CFR, y las bases tericas y tcnicas de las separaciones son las mismas para las cromatografas convencionales. Las ventajas de la HPLC son: - su alta resolucin, que permite la purificacin rutinaria de mezclas que resisten la separacin por otras tcnicas.
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- su velocidad, que propicia que los tiempos de retencin se reduzcan y la mayora de las separaciones se complete en mucho menos de 1 hora. - su alta sensibilidad, que llega a permitir la estimacin cuantitativa de cantidades de material inferiores al picomol. - su reproducibilidad, facilitada en gran medida por su capacidad de automatizarse. Por lo tanto, en el presente pocos laboratorios de bioqumica funcionan sin acceso a un sistema de HPLC para purificar aminocidos, pptidos o protenas. Tambin se usa en los anlisis clnicos, dado que permite separar y obtener medidas del orden del nanogramo de materiales biolgicos como vitaminas, esteroides, lpidos y metabolitos de frmacos. Como mencionamos, en la cromatografa en columna, cuanto ms pequeas sean y ms densamente empaquetadas estn las partculas de matriz mejor ser la resolucin, pero mayor resistencia habr al flujo de la fase mvil por ella. Un aumento de presin aumenta el flujo, pero puede daar la matriz y estropear todo el sistema. Afortunadamente ahora hay disponibles nuevas matrices con tamao de partcula pequeo, pero que pueden soportar altas presiones, de forma que se pueden conseguir resoluciones mucho mayores. As, las elevadas eficiencias cromatogrficas de la HPLC derivan del empleo de fases estacionarias mucho ms finamente divididas (~ 5 m) que las usadas en cr. convencional. La cuantificacin de estas eficiencias en trminos de altura del plato terico h proporciona valores de hasta dos rdenes de magnitud inferiores a los de cr. convencional, lo que se traduce en picos de elucin muy estrechos, que reflejan elevadas resoluciones cromatogrficas. En otros trminos, el menor valor de h hace que en HPLC con columnas ms cortas se consigan mejores resultados que con las columnas ms largas de cr. convencional. En la HPLC, la matriz est tan densamente empaquetada que el lquido debe ser bombeado a travs de la columna a elevada presin. Por este motivo se emplean bombas de alta presin de precisin, y los conductos y las columnas son de metal, y no de cristal o plstico. Las matrices empleadas en cr. convencional no pueden ser utilizadas en HPLC, ya que su elevada porosidad las hara deformarse o romperse al someterlas a elevadas presiones. En HPLC las fases estacionarias han de estar formadas por partculas de mucha mayor rigidez mecnica. Las columnas, ms pequeas, estrechas y relativamente largas, se rellenan con una matriz no compresible de microesferas de vidrio, plstico o silica-gel recubiertas con una fina capa de fase estacionaria. Otra consecuencia del elevado grado de divisin de la fase estacionaria es la dificultad de su empaquetado, que hay que conseguir trabajando a elevadas presiones. En la prctica, lo normal es trabajar con columnas comerciales ya empaquetadas. Por tanto, a la hora de adquirir una de estas columnas habr que decidir previamente qu tipo de cromatografa se pretende realizar, y su formato. En la actualidad, muchas de las separaciones mediante HPLC se llevan a cabo con fases estacionarias basadas en slice, cuyos grupos hidroxilo libres pueden formar derivados con muchos de los grupos funcionales que suelen utilizarse en las cromatografas de intercambio inico, fase inversa, interaccin hidrofbica o afinidad. La fase mvil es uno de los sistemas de solventes explicados para cada cromatografa, includas eluciones en gradiente con mezclas binarias o incluso ternarias. Sin embargo, en el caso de la HPLC, el paso de fase mvil a travs de la columna altamente empaquetada se fuerza a presiones de hasta 450 atm, lo que reduce en grado notable los tiempos de anlisis. Los eluyentes se detectan a medida que salen de la columna de acuerdo con su Abs UV, ndice de refraccin o fluorescencia Una vez superados los problemas prcticos anteriores (elevadas presiones, fases estacionarias rgidas y empaquetado), el resto de etapas bsicas en el desarrollo de una cromatografa en columna ha de ser resuelto con una eficacia al menos similar a la que proporcione la columna de HPLC. De nada servira trabajar con una eficiente (y costosa) columna de HPLC, si la aplicacin de la muestra o la produccin del gradiente que se emplee para su elucin no se realizan con similar eficiencia. En definitiva, sacar el mximo partido a una columna de HPLC exige la utilizacin de sistemas o equipos de cromatografa integrados, donde todos sus componentes estn diseados y acoplados en busca de la eficacia ptima.
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Entre las altas presiones requeridas en HPLC y las bajas presiones de trabajo en cr. convencional, caben situaciones intermedias. Con fases estacionarias cuyo dimetro medio de partcula est en el intervalo 10-50 m, y flujos de la fase mvil con presiones no superiores a las 30 atm, hay menores exigencias en cuanto a la rigidez de las fases estacionarias, lo que ampla su diversidad y presencia comercial. Lgicamente, sus eficiencias sern menores que las de columnas de HPLC, pero considerablemente superiores a las de cr. convencional. Por ello, estas columnas de media presin se configuran como la opcin idnea a escala semipreparativa. Adems, por su menor presin de trabajo no obligan a descartar el empleo del vidrio y las conduciones de plstico. A veces, los nombres comerciales de estos equipos cromatogrficos para trabajar a media presin (p.e. FPLC) pueden llevar a confusin si se interpretan como una nueva tecnologa diferente a la de HPLC. En esencia, el diseo de los equipos cromatogrficos de alta y media presin es el mismo, con las lgicas diferencias en cuanto a especificaciones de sus componentes.

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SDS-PAGE con muestras cromatogrficas.

Gel de separacin (para 2 minigeles de 0,75 mm) Gel al 10% 30% Acril/Bisacrilamida (29:1) 1,5 M Tris-HCl pH 8,8 Agua 10% SDS 10% APS TEMED 3,3 ml 2,5 ml 4,0 ml 100 l 100 l 15 l

Gel de empaquetamiento 30% Acril/Bisacrilamida (29:1) 500 mM Tris-HCl pH 6,8 Agua 10% SDS 10% APS TEMED 1,7 ml 2,5 ml 5,6 ml 100 l 100 l 15 l

Tampn de muestra (4x): 100 mM Tris-HCl pH 6,8; 2% SDS; 1% -mercaptoetanol; 20% glicerol; 0,02% azul de bromofenol. Tampn de electroforesis (10x): Tris 248 mM, Glicina 1,92 M, 1% SDS. Solucin colorante: 0,25% azul Coomassie; 45% metanol, 10% cido actico. Solucin decolorante: metanol 10%, cido actico 10%. Preparacin de las muestras: Las muestras deben contener una concentracin baja en sales. Para prepararlas, mezclar un volumen de la disolucin de protenas a analizar con un volumen de tampn de muestra (2x). Incubar 3 min a 90 C y despus colocarlas en hielo. Cargar de 25 a 50 l de muestra por pocillo. Electroforesis: Llevarla a cabo a 100 voltios (unos 40 mA por gel) hasta que el colorante alcance en extremo inferior del gel. Teir el gel durante 10 min y desteirlo hasta que las bandas de protena sean visibles.

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CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA.

La cromatografa en capa fina (TLC, thin layer chromatography) es una tcnica extremadamente sensible y rpida que se puede usar para separar e identificar una gran variedad de compuestos orgnicos, generalmente de pequeo tamao (como aminocidos, nucletidos, lpidos, antibiticos, pigmentos, etc) mediante su reparto entre un solvente (f. mvil), y una capa delgada de un adsorbente idneo (f. estacionaria) sobre la que aqul se mueve. La f. mvil avanza por capilaridad sobre la f. estacionaria plana, de forma que cuando un determinado soluto interacta con las dos fases experimenta una serie de procesos (adsorcin en fase slida, solubilizacin en cada fase, arrastre por la fase mvil) que, en ltimo extremo, llevan a que se reparta entre ambas. En el equilibrio, la relacin entre las concentraciones del soluto en ambas fases es constante, y se denomina coeficiente de reparto, que define su movilidad en ese sistema cromatogrfico. Si en una mezcla cada componente tiene un coeficiente de reparto diferente del de los otros, la separacin ser buena. Naturalmente, dicho coeficiente depende de la naturaleza de las fases, as como de las condiciones de la cromatografa, todo lo cual es necesario ajustar a los intereses experimentales. El soporte de la fase estacionaria es un slido pulverizado, que se encuentra extendido en forma de una fina capa (0,15-0,5 mm de espesor) sobre una plancha de vidrio, plstico o metal. Este soporte se somete en su manufacturacin a un proceso de fragmentacin y criba, de forma que se obtienen partculas de tamao y forma muy homogneos. As se asegura que la superficie especfica sea muy elevada, y por tanto tambin la interfase de contacto entre las fases mvil y estacionaria. El material empleado en la f. estacionaria depende del tipo de muestras a separar, aunque suele ser de carcter polar; para separar aminocidos se utiliza gel de slice, almina, poliamidas, almidn o celulosa. La composicin de la f. mvil tambin depende del tipo de molculas a separar, utilizndose disolventes o mezclas de diferente polaridad, aunque suele predominar el carcter apolar. La separacin de los componentes de la muestra se da por migracin diferencial, es decir, que la f. mvil arrastra ms a las partculas ms apolares y las ms polares son ms retenidas por la f. estacionaria. El gel de slice, slica-gel o slica es el material ms usado para fases estacionarias, y debe su nombre al aspecto de gel que toma cuando se suspende en medios acuosos. Se obtiene a partir de silicato sdico, y en la superficie de sus partculas presenta grupos silanoles que confieren a la slica su carcter fuertemente polar. Para su uso es preciso eliminar el agua retenida por la slica (por interacciones polares con los silanoles) mediante calentamiento a 100C o activacin. De no tomar esta precaucin, la presencia de agua en la superficie de la f. estacionaria implicara un doble proceso (reparto por solubilidad y adsorcin), que alterara el criterio bsico de separacin en funcin del grado de humedad de la placa, lo que desvirtuara y hara poco reproducibles los resultados. La

muestra o mezcla a separar ha de ser depositada o aplicada, en forma de gota, sobre la f. estacionaria, antes de sumergir el extremo de la f. estacionaria ms prximo a ellas en la f. mvil. Considerando que los solutos tendern a expandirse por difusin a travs de la f.
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estacionaria durante el desarrollo cromatogrfico, para su mejor separacin hay que reducir al mximo el tamao de la mancha que deje la gota depositada, haciendo mltiples pequeas aplicaciones. La TLC suele llevarse a cabo en sentido ascendente, de forma que la f. mvil ir subiendo por la f. estacionaria gracias a la capilaridad generada por su estructura. El flujo ascendente alcanzar los solutos de las muestras, desplazndolos en mayor o menor medida en funcin del particular coeficiente de reparto de cada uno. A este proceso, durante el cual se van separando los solutos, se le llama desarrollo, y se mantiene hasta que el frente de avance de la f. mvil est prximo al extremo superior del soporte, momento en el cual acaba el proceso y se deja secar. Como la f. mvil est en contacto con la atmsfera, conforme se desarrolla la cromatografa se ir produciendo su evaporacin desde la superficie de la f. estacionaria, tanto ms cuanta ms superficie se exponga. Esto puede llegar a traducirse en una velocidad de evaporacin superior a la propia velocidad de avance de la f. mvil, con lo que el frente de avance quedara detenido. En todo caso, la evaporacin es indeseable porque afecta a la reproducibilidad de los resultados, especialmente cuando la f. mvil est formada por una mezcla de solventes de diferente volatilidad, ya que su composicin ir cambiando al avanzar la cromatografa. Para evitar estos problemas, la placa se coloca en el interior de un tanque o cmara cromatogrfica (generalmente de vidrio), con una atmsfera presaturada de f. mvil. Terminado el desarrollo cromatogrfico, los diferentes solutos habrn avanzado ms o menos segn sus coeficientes de reparto y podrn ser localizados, bien directamente si son coloreados o bien por algn mtodo de deteccin que los haga visibles. Las distancias de migracin no se miden en valores absolutos, sino en trminos relativos a la distancia avanzada por el frente de la f. mvil, por lo que se hace necesario marcarlo antes de evaporarla. El nmero que expresa esta distancia relativa se llama factor de retraso, y se denota con el smbolo Rf (retardation factor, o relative to front): Rf = x / f = avance soluto / avance frente Este nmero (< 1,0) es caracterstico de cada soluto para una composicin dada de f. mvil y una f. estacionaria determinada. Variaciones indeseadas en la cantidad de agua retenida por la f. estacionaria, o en su estructura, espesor o composicin, pueden dar origen a pequeas alteraciones del Rf. Un mtodo de deteccin sencillo, utilizado con frecuencia y que permite la inmediata visualizacin de muchos solutos, se basa en el empleo de placas de TLC con un agente fluorescente. Al finalizar el desarrollo, se coloca la placa bajo una fuente de luz UV, observndose cmo toda ella emite radiacin visible excepto en las posiciones donde se encuentran los solutos, por haberse producido por los solutos un proceso de desactivacin de fluorescencia, o uno de absorcin de luz UV. Si este procedimiento no resulta aplicable, se acudir a otros mtodos de deteccin, que podrn ser inespecficos, cuando se persiga la deteccin de todos los solutos presentes en la muestra, o especficos, basados en la reaccin coloreada de determinados grupos funcionales. Con carcter general, el procedimiento a seguir ser el de rociar la placa con un lquido que provoque la reaccin de deteccin. Si sta modifica la naturaleza qumica de los solutos (p.e. ninhidrina para aminocidos, o ac. sulfrico para casi todo) se dice que la reaccin es destructiva, y obviamente no estar indicada en aplicaciones preparativas. Si las muestras estn marcadas radiactivamente, se emplean los mtodos autorradiogrficos normales. Aunque lo ms frecuente es su uso analtico, la TLC tambin puede usarse a escala preparativa, de forma que hasta 100 mg de algunas sustancias pueden purificarse de esta manera. Para ello suele ser deseable cromatografiar un volumen de muestra mayor ( 200 l) al de aplicaciones analticas (1-10 l), y se hace preciso trabajar con capas ms gruesas (hasta 2 mm), as como aplicar la muestra en bandas en lugar de en puntos discretos. En estos casos se roca slo un extremo de la placa con el lquido de deteccin, infiriendo de ah la localizacin de las sustancias en el resto, de donde podrn ser recuperadas. Ello es tan simple
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como rascar la capa en la posicin donde se encuentre adsorbida la sustancia de inters y suspender el raspado en algn disolvente adecuado, donde el soluto embebido se disolver. Mediante una simple filtracin o centrifugacin se dispondr de una disolucin de la sustancia purificada. En el caso de muestras complejas, puede ser difcil o imposible encontrar una nica f. mvil que permita la adecuada separacin de todos los solutos y se puede acudir a desarrollos bidimensionales: tras emplear una f. mvil en una direccin, se utiliza otra distinta para el segundo desarrollo en direccin perpendicular a la del primero, secando la placa entre ambos.

REALIZACION DE LA PRACTICA. En esta prctica usaremos un sistema cromatogrfico de capa fina para identificar aminocidos puros en base a su movilidad en TLC, y para separar los aminocidos contenidos en mezclas provenientes de protenas digeridas extensivamente con proteasas. Las muestras se aplican cerca de un extremo de la lmina del gel, que se coloca en vertical sobre la f. mvil, y sta ascender por capilaridad arrastrando las muestras. Finalmente, stas pueden ser observadas mediante un revelado con ninhidrina, que reacciona con los grupos amino dando compuestos coloreados.

Materiales. - Fase estacionaria: placas de cromatografa de celulosa (0,1 mm de grosor). - Fase mvil o disolvente: n-butanol : acetona : ac. actico : agua (35:35:10:20) - Cubeta de cristal para desarrollar la cromatografa. - Disolucin reveladora: 1 g de ninhidrina y 0,2 g de isatina en 200 ml de etanol al 70%. Antes de revelar aadir 2,4,6-trimetilpiridina en proporcin 1/100. - Muestras problema: 20 mg/ml de BSA y 20 mg/ml de quimotripsingeno digeridos con proteasa K. - Muestras patrn: 1 mg/ml de Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Phe y Trp. Procedimiento. 1. Colocar el disolvente en el tanque o cubeta de cristal, de forma que cubra hasta una altura de 1 cm aproximadamente. Este proceso se hace varias horas o el da antes, para conseguir en su interior una atmsfera saturada de solvente.

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2. Coger una placa de celulosa. Se debe manipular con guantes para evitar las manchas dactilares, y cogindola por los bordes para evitar daar la f. estacionaria. Con un lpiz muy blando, marcar una lnea a 1,5 cm del borde inferior y en ella los puntos para aplicar las muestras, separados entre s por 1,0-1,2 cm. 3. Con la placa en posicin horizontal, aplicar 2 l de cada muestra apoyando mnimamente la punta de la micropipeta sobre el punto sealado. Esta operacin debe de hacerse aplicando el mnimo volumen posible y secando varias veces, para evitar una superficie de aplicacin excesivamente grande. 4. Introducir con cuidado la placa en la cubeta. Poner la tapa y dejar ascender la f. mvil hasta que llegue cerca del extremo superior (unas 2 horas). 5. Sacar la placa de la cubeta. Marcar con un lpiz el frente de avance de la f. mvil. Secar al aire, con secador o en estufa, en un ambiente ventilado. Si se desea mejor resolucin, se puede hacer una segunda cromatografia en las mismas condiciones una vez seca la placa. 6. Sumergir la placa seca en solucin de revelado (o pulverizar), escurriendo con cuidado el exceso. Secar en una estufa a 80C o ms. Los amincidos se ven como manchas de color rosa-morado. Resultados. Para cada sustancia en estudio hay que calcular su Rf o coeficiente de migracin relativa: Rf = distancia recorrida por el compuesto / distancia recorrida por el solvente El Rf de cada compuesto es constante para unas fases mvil y estacinaria dadas, lo que permite la identificacin de sustancias en una mezcla mediante comparacin con patrones conocidos. El solvente que hemos usado arrastra con mayor eficiencia a los aminocidos hidrofbicos; tras stos se mueven los hidroxiaminocidos y los aminocidos con cadena lateral corta y finalmente corren los aminocidos polares. Discutir el resultado de la separacin en funcin de los valores de hidrofobicidad de las cadenas laterales mostrados en el esquema adjunto.

Como actividad extra, cada grupo preparar otra placa para separar y visualizar los pigmentos componentes de las tintas de una coleccin de rotuladores Edding 1200 de varios colores.

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ESTRATEGIAS DE PURIFICACIN DE PROTENAS. EMULACIN INFORMTICA CON EL PROGRAMA PROTEINLAB. Strategy

Initial considerations Any cell, whether prokaryotic or eukaryotic, contains tens of thousands of different proteins with a wide range of biological activities. Purification of individual proteins is therefore central to any detailed biological analysis of their structure and function. There is no single procedure whereby any and every protein can be isolated in pure form, but rather a set of procedures each of which attempts to distinguish between proteins on the basis of specific structural or functional characteristics. By selecting appropriate procedures and applying these in a carefully considered sequence of steps, it is usually possible to obtain a high degree of purification of the desired protein and in an acceptable yield. There is no standard order in which these procedures should be used to obtain optimal purifications. Because of structural and functional differences between proteins, an ideal sequence of steps for one protein will, quite possibly, be unsuccessful for another. A knowledge of the theoretical basis of each procedure will allow the researcher to choose an initial sequence of techniques with which to attempt any given purification. However, the development of an optimised protocol involves considerable trial-and-error experimentation to assess the potential of each step. Irrespective of the purification scheme adopted, it is essential to realize that most proteins are quite fragile molecules. Exposure to even moderate temperatures (e.g. 37C) causes slow denaturation so that all purification steps should be carried out at low temperature (0-4C) unless specified otherwise. Proteins are also sensitive to extremes of pH so that purification procedures are always carried out in buffered solutions and pH extremes are avoided. Finally, since many proteins are more unstable in dilute solution, the protein concentration should not be allowed to fall to unreasonably low levels. Isolation of the protein in soluble form Although this program simulates the purification of proteins from solution, the starting point for protein purification is usually a culture of bacterial, plant or animal cells or a particular animal tissue or organ. The initial requirement is to release the protein from the cells without causing loss of its biological activity. A widely used gentle procedure for liberating proteins from animal cells is homogenization: relatively soft mechanichal procedures. Bacteria, yeasts and plant cells have thick cell walls which require the use of more disruptive procedures such as sonication (sonic radiation) or the use of a high-pressure press. A major advantage of homogenization, if it can be used, is that the integrity of most intracellular organelles is preserved. Thus, if the desired protein is restricted to a particular organelle such as the nucleus, mitochondrion or lysosome, or is perhaps bound to the plasma membrane, substantial purification can be achieved by isolating that cellular fraction before releasing the protein. Common procedures to achieve this are differential centrifugation and density-gradient centrifugation. If the desired protein is located in soluble form inside the purified organelle, it can now be released by disrupting the organelle either using sonication or the addition of non-ionic detergent such as Triton X-100. If the protein is an integral part of the organelle membrane or plasma membrane, it can be released by the use of detergent. Once the protein is available in soluble form it can be purified by using any of the standard techniques mentioned later and simulated in this computer package. Choice of purification methods There are numerous protein purification procedures available, some of which are much more commonly used than others. The optimal purification scheme for a particular protein depends mainly upon the structural and functional properties of the desired protein and of the protein contaminants from which it is to be purified. Indicated below are some general

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guidelines in the selection of techniques but it must be remembered that the precise conditions for the application of those methods are largely defined by trial-and-error experimentation. (i) The early steps in a purification scheme are usually those which have the lowest resolving power such as ammonium sulphate precipitation or, for some proteins, heat denaturation. These procedures have the advantage of greatly reducing the total amount of protein in the sample so that chromatographic procedures, which are theoretically capable of high resolution, can then be applied to maximum advantage. Very high-resolution but lowcapacity procedures such as isoelectric focusing are often applied only late in a purification scheme when the total amount of protein is relatively small and contaminating proteins are present in quite low concentrations. This type of high-resolution procedure, usually conducted on a fairly small scale, is therefore intended to remove the remaining few impurities. (ii) It is typically more efficient to choose a series of methods which exploit different physical or functional properties of the proteins rather than a series of steps exploiting the same property. Thus, purification schemes employing column chromatography, usually include at least one size-fractionation procedure (gel filtration) and at least one chargefractionation step (ion-exchange chromatography). (iii) During chromatography, it is common practice to sacrifice some yield for increased purity. In other words, do not try to recover every last microgram of desired protein if this means including fractions containing relatively large amounts of protein contaminants. The fractions to be pooled ready for the next purification step should be chosen on the basis of highest possibly purity at reasonable yield. (iv) Some protein fractionation techniques, in particular SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), isoelectric focusing and two-dimensional gel electrophoresis, are not usually employed as preparative procedures for protein purification but rather are used to check the progress of purification. They are high-resolution analytical techniques. However, increasingly in modern biochemistry it may be sufficient to purify only a few micrograms of the protein of interest for analysis. In such situations, these 'analytical' techniques may yield enough protein for research purposes and therefore be considered preparative. (v) Another important consideration when choosing a fractionation technique is its cost. Both the materials used and the staff time consumed have to be considered. Some techniques are relatively cheap and quick, such as heat treatment or ammonium sulphate fractionation, while others tend to be expensive and time-consuming. Particularly expensive are those techniques that consume ampholytes, such as preparative isoelectric focusing. Therefore, while several techniques seem at first sight to be very attractive in terms of the high resolution that they offer, generally these advantages tend to be offset by their cost when applied to large samples. Indeed, equally good results can often be obtained more economically by the combination of several less expensive techniques. Monitoring the purification Each purification procedure subdivides the protein mixture into a number of fractions one or more of which will contain the protein of interest whilst other fractions will contain proteins which are not required and so are discarded. Clearly, to determine which fractions are to be kept one needs to be able to detect and quantify the protein of interest. If this protein is an enzyme, the requirement is for a specific and sensitive assay for its catalytic activity. If the protein is a hormone, one may be able to use a hormone-binding assay, radioimmunoassay or even a bioassay. Alternatively, the protein may contain a characteristic moiety, such as a porphyrin ring, or a trace metal, such as copper or molybdenum, which can be measured accurately and so quantify the amount of that protein present. Also, the protein can be inmunodetected by western analysis using antibodies against itself or against a tag, if a protein fusion is being detected. This simulation software assumes, for simplicity, that the protein to be purified is an enzyme. Traditionally, one unit of enzyme activity is defined as that which causes the conversion of 1 mol of substrate per minute under the (optimal) conditions of measurement.
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In recent years, a new international unit of enzyme activity has been recommended. This is the Katal (abbreviated kat) and is defined as the amount of enzyme which causes the consumption of 1 mol of substrate per second. Thus an 'old' enzyme unit is equal to 16.67 nanokatals (i.e. 16.67 nkat). In addition to measuring the amount of the desired protein in all fractions at each stage of purification, it is also necessary to determine the total amount of protein present in each fraction. This information is needed not only to assist in the decision as to which fractions should be pooled for subsequent purification steps, but also allows the investigator to judge the degree of purification at each stage so that the effectiveness of each procedure can be properly assessed. Specific activity, enrichment and yield Since enzyme activity itself is a measure only of the amount of the enzyme present and says nothing of the presence of other contaminating proteins, an additional term, specific activity, is also required. Using the traditional unit of enzyme activity, the specific activity is the number of enzyme units per milligram of protein. Alternatively, using the new international unit of enzyme activity, specific activity is quoted as katals per kilogram of protein. The specific activity of the desired enzyme will be low in the original tissue or cell extract and will increase during purification to a maximum when the enzyme is pure. Specific activity is thus a measure of enzyme purity. In monitoring the effectiveness of an enzyme purification, it is not the absolute value of specific activity which is important since this will depend upon the intrinsic catalytic capabilities of the particular enzyme under study. Rather, the important aspect is how the specific activity changes during the purification. The degree of enrichment of the enzyme achieved in any given step can be calculated as follows: Enrichment = specific activity of fraction / original specific activity A successful purification step should not only increase the specific activity of the enzyme substantially but the enzyme should also be recovered in good yield. This can be calculated as follows: Yield = (units of enzyme after purification step / units of enzyme in the original preparation) x 100% Note that the yield of enzyme after a particular purification procedure may be low not because the procedure is failing to purify that protein, but because it is causing some inactivation of the enzyme. An additional problem sometimes experienced is that the enzyme may have been active immediately subsequent to the purification step but may lose substantial activity if stored for long periods prior to assay. A lower yield than expected indicates reason for further investigation. Assessment of purity At a late stage of protein purification when the protein and enzyme profiles of fractions coincide, one may believe that the enzyme has been purified. Proof that the protein is pure can only really be obtained by protein sequencing. However, considerably simpler analytical procedures can be used to provide a good indication of the degree of purity. The commonest procedure is SDS-PAGE which is both rapid and sensitive and separates polypeptides solely on the basis of size. Alternatively, one can attempt analytical isoelectric focusing which separates proteins by charge differences. Ideally, however, one should test the apparently pure protein by two-dimensional gel electrophoresis which separates proteins by charge in the first dimension (isoelectric focusing) and size in the second dimension. The component polypeptides of a protein mixture are displayed as spots on a rectangular gel slab.

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Given the very high resolution of this technique, a sample which displays a single polypeptide spot is probably (but not certainly) pure.

Techniques:
Heat treatment Ammonium sulphate fractionation Gel filtration Ion exchange chromatography Hydrophobic interaction chromatography Isoelectric focusing Affinity chromatography HPLC Heat treatment Protein purification procedures are usually carried out at low temperature (0-4C) since most proteins are stable at low temperature. As the temperature increases from 0C to 37-40C their stability decreases significantly. Above 40C or so, most proteins become increasingly unstable and denature, and at neutral pH, the denatured proteins usually precipitate. Individual proteins differ in their heat sensitivity and so this can be used for purification purposes. The temperature stability of the desired enzyme is determined by a trial experiment following enzyme activity in the cell extract after incubation at different temperatures for a set period of time. The minimum temperature at which gross inactivation occurs is noted. Once this temperature is known, less stable proteins can be preferentially inactivated by incubating the cell extract at a temperature 5-10C below this value for 15-30 min. The denatured precipitated protein is then removed by centrifugation. Since denaturation of cell proteins occurs to some extent at all temperatures and simply increases with increasing temperature, the total activity of the desired enzyme usually falls to some extent after a heat denaturation step. This procedure is therefore rather crude. However, it may be a useful early step for the purification of rather more heat-stable proteins. Ammonium sulphate fractionation The solubility of proteins varies according to the ionic strength and hence according to the salt concentration of the solution. Two distinct effects are observed. At low concentrations of salt, the solubility of the protein increases with salt concentration. This phenomenon is called 'salting-in'. However, as the salt concentration (ionic strength) is increased still further, the solubility of the protein begins to decrease. At sufficiently high ionic strength the protein solubility will have decreased to the point where the protein will be almost completely precipitated from solution - an effect called 'salting-out'. The theoretical basis of salting-out is complex but one factor is probably the competition between the protein and salt ions for available water molecules. At high salt concentrations, insufficient water molecules are available for full solvation of the protein so that protein protein interactions become predominant over protein-water interactions, and precipitation occurs. Since proteins differ markedly in their solubilities at high ionic strength, salting-out is a very useful procedure to assist in the purification of a given protein. Indeed, enzyme purification schemes almost invariably include such a step. In practice, ammonium sulphate is the salt commonly used since it is highly water-soluble, relatively cheap and available at high purity. Furthermore it has no adverse effects upon enzyme activity. Typically a small-scale experiment is conducted initially to determine the optimal ammonium sulphate concentration to use. This procedure is typically carried out at 0-4C to maximize protein stability. Great care must be taken to ensure that the salt concentration of the whole solution increases uniformly without the occurrence of local high concentrations which could precipitate the protein of interest along with the undesired proteins. Therefore the solution is stirred
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continuously as small aliquots of crushed, solid ammonium sulphate (or preferably saturated ammonium sulphate solution) are added. After each addition, the ammonium sulphate is allowed to disperse fully before the next addition. Once the required ammonium sulphate concentration is reached, incubation at 0-4C is continued for a brief period to allow protein precipitation to occur, and the precipitated protein is then recovered by centrifugation. The concentration of ammonium sulphate in the solution is thus increased stepwise, recovering the precipitated protein at each stage. Each protein precipitate is dissolved individually in fresh buffer and assayed for both total protein content and the activity of the desired enzyme. Based on these data one can then plan a successful ammonium sulphate fractionation procedure for the bulk purification of the enzyme. An ammonium sulphate concentration is chosen which will precipitate the maximum proportion of undesired protein whilst leaving most of the enzyme still in solution. This precipitated protein is removed by centrifugation and then the ammonium sulphate concentration of the remaining solution is increased to a value that will precipitate most of the enzyme whilst leaving the maximum amount of residual protein contaminants still in solution. The precipitated enzyme is recovered by centrifugation and dissolved in fresh buffer for the next stage of purification. Residual ammonium sulphate will be present in this enzyme solution and may need to be removed by gel filtration or dialysis before the next purification step can be attempted. In addition to its role as an extremely useful and universally applicable purification step, ammonium sulphate purification is often employed again at later stages of purification simply to concentrate the protein from dilute solution after procedures such as gel filtration.

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