ED 9 : protéomique

Constance Delaby Caroline Kannengiesser

Décembre 2007 Faculté de médecine X. Bichat-PCEM2
1

Plan général de l’ED •Généralités •Stratégies d’identification d’une protéine, Les méthodes •Exercices •Avantages et limites des méthodes
2

Génomique & Protéomique
• Génomique : ADNg : Relativement constant
• mutations somatiques (réparation), recombinaison V-D-J dans lymphocytes…) • environ 30 000 gènes Homme

• Protéomique : monde dynamique • molécules hétérogènes
• variabilité pour un gène donné • > 500 000 protéines Homme

Grande diversité protéique : - séquence - modifications pré, co et post –traductionnelles - repliement - assemblage : complexes de 2 à 80 partenaires
3

Expression d’un gène
Génome
constant dans toutes les cellules d’un organisme (sauf évènements somatiques)

N’informe pas sur degré d’expression/activité des protéines dans une cellule

taux d’ARNm :

Protéome : dynamique • varie au cours du développement
• varie d’un type cellulaire à l’autre (spécificité tissulaire) • varie selon état physiologique vs pathologique
4

ADN génomique
transcription Processing Et Splicing alternatif

ARNprem

Isoformes ≠

ARNm a
traduction

ARNm b Protéine B

ARNm c Protéine C

Protéine A

Modifications post traductionnelles Glycosylation, Phosphorylation, Adénylation, Hydroxylation, Sumoylation….

Protéolyse

protéine

protéine protéine

protéine protéine protéine
5

compartimentalisation

dégradation

activité

interaction

Analyse du protéome au cours du développement 1 GENOME PROTEOME 1 Éclosion des oeufs PROTEOME 2 chenille PROTEOME 3 chrysalide PROTEOME 4 papillon développement 6 .

nature 2006 .Bases moléculaires des cancers 7 Hanash S.

La protéomique = l’étude du protéome. -une cellule. un tissu… • l’identification des protéines constituant un complexe protéique (interactions protéines-protéines) • la recherche et l ’identification de protéines impliquées dans des voies de signalisation par exemple par une analyse différentielle (sauvage/mutant). c’est-à-dire l’ensemble des protéines constituant -un compartiment cellulaire (ex: les protéines nucléaires). 8 . -un tissu -ou un organisme vivant entier… -permet notamment : • la recherche et l ’identification systématique de l ’ensemble des protéines constituant un organisme.

Stratégies d’identification d’une protéine • 1 Méthodes séparatives : • a) chromatographie bidimensionnelle • b) électrophorèse bidimensionnelle • 2 Méthodes de purification : chromatographie d’affinité • 3 Méthodes d’identification : • a) MALDI-TOF • b) ESI • 4 Autres approches : SELDI-TOF 9 .

Stratégies d’identification d’une protéine • 1 Méthodes séparatives : • a) chromatographie bidimensionnelle • b) électrophorèse bidimensionnelle (E2D) • 2 Méthodes de purification : chromatographie d’affinité • 3 Méthodes d’identification : • • ESI MALDI-TOF • 4 Autres approches : SELDI-TOF 10 .

1 a) méthodes séparatives : chromatographie bidimensionnelle des protéines : 2D-LC 2 dimensions • 1ère dimension : chromatofocalisation • équilibration de la colonne avec un tampon basique • injection de l’échantillon • injection de tampons de plus en plus acide • les protéines les plus basiques éluées en premier car non retenues Elution progressive des protéines en fonction de leur pHi (gradient de pH linéaire dans la colonne) •Etape très résolutive. très reproductible 11 .

rapide Stryer Figure 4. (3) bovine serum albumin (67 kd). (4) ovalbumin (43 kd).1 a) méthodes séparatives : chromatographie bidimensionnelle des protéines : 2D-LC • 2ème dimension : chromatographie en phase inverse HPLC • injection dans la colonne des protéines récupérées de la première dimension • équilibration de la colonne avec H2O • gradient H2O-acéto-nitrile (éluant de plus en plus hydrophobe) • les protéines récupérées en premier sont les plus hydrophiles Elution en fonction de l’hydrophobicité •Très résolutif.4 kd). and (5) ribonuclease (13. High-Pressure Liquid Chromatography (HPLC). 12 .6. (2) catalase (232 kd). (1) thyroglobulin (669 kd).

Stratégies d’identification d’une protéine • 1 Méthodes séparatives : • a) chromatographie bidimensionnelle • b) électrophorèse bidimensionnelle • 2 Méthodes de purification : chromatographie d’affinité • 3 Méthodes d’identification : • a) MALDI-TOF • b) ESI • 4 Autres approches : SELDI-TOF 13 .

1 b) Les méthodes séparatives : E2D • Aspect quantitatif • Méthode la plus fiable pour étudier .les modifications post-traductionnelles • Préparation des échantillons • Focalisation isoélectrique • SDS-Page • Coloration des gels 14 2 dimensions .l’abondance • Différentes étapes : .

protéases. glycosidases • éliminer les sels • maintenir les protéines sous forme soluble 15 .1 b) Electrophorèse bidimensionnelle : E2D • Préparation des échantillons • rompre les interactions entre molécules : libération des polypeptides individualisés et solubilisés • ne pas modifier les chaînes polypeptidiques libérées : inhibiteur des phosphatases.

1 b) Electrophorèse bidimensionnelle : E2D 2 dimensions en 2 temps : • 1ère dimension: Focalisation isoélectrique: • vitesse de migration des protéines dans un champ électrique proportionnelle à la charge • charge protéique proportionnelle à la ≠ entre le pH du milieu et le pI de la protéine gradient continu de pH Ampholytes (poly-électrolytes ionisables chargés + ou -) (borné : acide fort à l’anode. base forte à la cathode) Champ électrique 16 .

11. 17 .1 b) Electrophorèse bidimensionnelle : E2D • 1ère dimension: Focalisation isoélectrique: STRYER Figure 4.

Page STRYER Figure 4.12. nitrate d’Ag. fluorescence) 18 .1 b) Electrophorèse bidimensionnelle : E2D • 2ème dimension : SDS . • Coloration des gels (bleu de coumassie.

1 b) Electrophorèse bidimensionnelle : E2D 19 Introduction to proteomics. Liebler .

Page + Coloration au nitrate d’Ag 20 .1 b) Electrophorèse bidimensionnelle : E2D Focalisation isoélectrique + Gradient continu de pH immobilisé - - SDS .

1 b) Electrophorèse bidimensionnelle : E2D Exemples d’applications Protéomique d’expression Recherche de marqueurs diagnostiques Caractérisation Moléculaire de maladies Etudes toxicologiques 21 .

1 b) Electrophorèse bidimensionnelle : E2D Protéomique d’expression Foie souris wT Foie souris KO Analyse d’images (logiciels PD quest. image master 2D platinium) Comparaison images multiples Détection des spots Appariement (gel matching) Analyse des données 22 .

Proteomic analysis of iron overload in human hepatoma cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2006 23 .1 b) Electrophorèse bidimensionnelle : E2D Petrak J et al.

1 b) Electrophorèse bidimensionnelle : E2D Identification des protéines séparées •découpage des spots d’intérêt • • digestion protéique (trypsine) : peptides identification des peptides par spectrométrie de masse • bases de données • comparaison de séquence • vérification 24 .

1 b) Electrophorèse bidimensionnelle : E2D 2D-DIGE : E2D différentielle en fluorescence • liaison de cyanine (Cy2. Cy5) sur les résidus Lysine • liaison sur fonction amine des Lys • faible PM des cyanine • pas de modification de la charge des protéines • spectres de fluorescence différents 25 . Cy3.

1 b) Electrophorèse bidimensionnelle : E2D 2D-DIGE : E2D différentielle en fluorescence Extrait protéique 1 Cy5 Extrait protéique 2 Cy3 Extrait protéique 1/2 Cy2 standard interne E2D (un gel pour trois échantillons) Lecture à λ1 Lecture à λ2 Lecture à λ3 (normalisation donc pas de variation inter gel) Analyse différentielle qualitative et quantitative (standard interne) 26 .

1 b) Electrophorèse bidimensionnelle : E2D 2D-DIGE : E2D différentielle en fluorescence Exemple sain malade L’analyse d’images d’un gel DIGE plus aisée car migration des 3 échantillons sur le même gel 27 .

Avantages et limites des méthodes Chromatographie bidimensionnelle des protéines 2D-LC (+) méthode non destructive. les protéines sont intactes (+) reproductibilité (+) interface avec la spectrométrie de masse (-) coûteux (-) compatibilité avec spectrométrie de masse limitée en fonction des détergents utilisés 28 .

glycosylations (car focalisation) (-) la densité des spots doit rester raisonnable • Gamme dynamique quantitative • Spectre d’analyse (-) concentrer les échantillons au max (-) protéines très basiques / haut PM sont difficiles à voir • Reproductibilité (-) variabilités techniques et biologiques 29 .Avantages et limites des méthodes E2D • Résolution et séparation (+) on peut voir les phosphorylations.

Stratégies d’identification d’une protéine • 1 Méthodes séparatives : • a) chromatographie bidimensionnelle • b) électrophorèse bidimensionnelle • 2 Méthodes de purification : chromatographie d’affinité • 3 Méthodes d’identification : • a) MALDI-TOF • b) ESI • 4 Autres approches : SELDI-TOF 30 .

2 méthodes de purification : Purification de complexes par chromatographie d’affinité • Fonctionnalité des protéines • complexes protéiques • fonctionnalité définie par l’association entre protéines • Stratégie classique • couplage ligand-résine • adsorption molécule d’intérêt • désorption molécule d’intérêt 31 .

Stratégies d’identification d’une protéine • 1 Méthodes séparatives : • a) chromatographie bidimensionnelle • b) électrophorèse bidimensionnelle • 2 Méthodes de purification : chromatographie d’affinité • 3 Méthodes d’identification : • a) MALDI-TOF • b) ESI • 4 Autres approches : SELDI-TOF 32 .

•L'analyseur qui permet de séparer les différents ions en fonction du rapport m/z.3 a) Méthodes d’identification : MS-MALDI • MS : spectrométrie de masse : Principe = mesurer la masse molaire de biomolécules en les séparant en fonction de leurs rapports m/z avec une grande sensibilité et une bonne résolution. également possible de fractionner les chaînes polypeptidique au niveau des liaisons peptidiques ou au niveau des chaînes latérales pour obtenir des informations sur la séquence ou la composition en acides aminés. •Le détecteur qui permet de convertir le courant ionique en courant 33 électrique mesurable. La structure d'un spectromètre de masse : •La source d'ionisation qui permet de produire des ions en phase gazeuse (de type MALDI ou ESI). .

Temps de vol a besoin d'une source d'ion pulsé. des analyseurs à stabilité de trajectoire de type quadriôle ou trappe ionique peuvent fonctionner en mode continue. Au contraire. 34 un temps de vol est facilement compatible avec une source de type MALDI alors que les sources ESI sont compatible avec les analyseyrs quadripole et trappe ionique .

3 a) Méthodes d’identification : MS-MALDI • MALDI : Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation • échantillon-matrice fixé sur support solide • ionisation et désorption laser • analyseur. séparation en fonction du rapport m/z • détecteur • enregistrement • analyseur de masse 35 .

3 a) Méthodes d’identification : MS-MALDI Méthode d’ionisation : MALDI Analyte-matrice (absorbe à λ du laser) LASER Désorption d’ions caractéristiques de l’échantillon Ions positifs Ions négatifs Analyseur de masse Plaque métallique 36 .

Liebler 37 .3 a) Méthodes d’identification : MS-MALDI Méthode d’ionisation : MALDI Introduction to proteomics.

3 a) Méthodes d’identification : MS-MALDI L’analyseur temps de vol : T.F • Principe : accélération des ions de masse différente à une énergie cinétique uniforme Temps de vol différent pour parcourir une distance donnée • Expulsion des ions de la source d’ionisation par paquets Accélération sous une différence de potentiel Vs Introduction to proteomics. Liebler 38 .O.

] . 279. T.16. 39 embedded in an appropriate matrix. (1) The protein sample.3 a) Méthodes d’identification : MS-MALDI STRYER Figure 4. (Lippincott-Raven. Watson. is ionized by the application of a laser beam. (3) The lightest ions arrive first. [After J. (4) The ionizing laser pulse also triggers a clock that measures the time of flight (TOF) for the ions. 1997). (2) An electrical field accelerates the ions formed through the flight tube toward the detector. 3d ed. p. Introduction to Mass Spectrometry. MALDI-TOF Mass Spectrometry.

Introduction to Mass Spectrometry.3 a) Méthodes d’identification : MS-MALDI STRYER Figure 4. 3d ed.] 40 . 282. p. 1997). [After J. (Lippincott-Raven. molecules with multiple charges as well as small quantities of a singly charged dimer of insulin. MALDI-TOF Mass Spectrum of Insulin and β -lactoglobulin. However. A mixture of 5 pmol each of insulin (I) and β-lactoglobulin (L) was ionized by MALDI. (2 I + H)+.17. which produces predominately singly charged molecular ions from peptides and proteins (I + H+ for insulin and L + H+ for lactoglobulin). T. also are produced. Watson.

3 b) Autre Méthode d’ionisation : ESI • ElectroSpray ionization = ionisation par électrospray • échantillon en solution • production de gouttelettes chargées à partir de l’analyte dissout en solution • évaporation du solvant. diminution de la taille de la gouttelette • désintégration des gouttelettes : micro-goutelettes plus chargées • ions désolvatés -> spectrométrie de masse 41 .

3 b) Autre Méthode d’ionisation : ESI 42 .

Stratégies d’identification d’une protéine • 1 Méthodes séparatives : • a) chromatographie bidimensionnelle • b) électrophorèse bidimensionnelle • 2 Méthodes de purification : chromatographie d’affinité • 3 Méthodes d’identification : • a) MALDI-TOF • b) ESI • 4 Autres approches : SELDI-TOF 43 .

4 Approche SELDI-TOF • SELDI = Surface Enhanced Laser Desorption Ionization support : surface d’échange chromatographique • reverse (molécule hydrophobes) • molécules hydrophiles • échange cationique (cations) • échange anionique (anions) • affinité (anticorps. ligand enzyme. ADN…) Choix de la barrette en fonction de l’analyse 44 .

4 Approche SELDI-TOF D’après S Lehman. Montpellier 45 .

Montpellier 46 .D’après S Lehman.

extraits tissulaires) dans les puits 47 .4 Approche SELDI-TOF Dépôt des échantillons (sérum.

4 Approche SELDI-TOF Lavages (stringence croissante pour éliminer le non spécifique) 48 .

4 Approche SELDI-TOF Ajout d’EAM (energy absorbing molecules) Pour faciliter la désorption et l’ionisation dans le TOF-MS Desorption-Ionisation Laser Analyse spectrométrie de masse TOF 49 .

4 Approche SELDI-TOF 50 .

Avantages et limites des méthodes SELDI (+) Résolution et sensibilité • identification directe de partenaires si couplée à MS (-) limites • suppose une connaissance à priori des propriétés biochimiques des protéines étudiées • reproductibilité (sensibilité) • analyse simultanée d’une protéine dans diverses conditions 51 .

substitution. délétion) 52 .Identification des protéines • identification automatique : criblage des banques de données • Comparer spectre de la protéine inconnue aux spectres virtuels de toutes les protéines de la banque • Spectre virtuel • digestion enzymatique in silico • Spectre de masse des fragments • ou : étape d’interprétation du spectre expérimental en aa • séquence potentielle ensuite comparée aux séquences de la banque • logiciels d’analyse tolérants (insertion.

exercices 53 .

Applications des approches protéomiques • Protéomique différentielle • Identifications de marqueurs de maladies Outil pour la protéomique clinique (ex SELDI TOF) • détecter la maladie à un stade précoce ou la susceptibilité à la maladie • Analyse des glycosylations • Analyse des phosphorylations 54 .

•Place de la bioinformatique et des mathématiques •Ère post génomique. métabolome 55 . protéomique.

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