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GUIA PARA LA VERIFICACION DE ESPECTOFOTOMETROS UV-VISIBLE UTILIZADOS EN EL ANALISIS DE SUELO Y AGUA.

Azcarate M.P.(1); Kloster N.S. (2) ; Ostinelli M. (3); Carreira D. (3)

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Laboratorio de Anlisis Agronmicos. E.E.A. Chubut. INTA. Ex Ruta 25 Km 1480. (9100) Trelew. Chubut. Argentina. EMail: mpazcarate@yahoo.com.ar 2 Laboratorio de Suelo y Agua. E.E.A. Anguil, INTA. RN N5 km 580. (6326) Anguil. La Pampa. Argentina. E-Mail: nkloster@anguil.inta.gov.ar 3 Laboratorio de Suelos. Instituto de Suelos. INTA Castelar. Las Cabaas y De Los Reseros s/n (1712) Villa Udaondo. Castelar. Buenos Aires. Argentina. E-Mail: mostinelli@cnia.inta.gov.ar; dcarreira@cnia.inta.gov.ar.

REA TEMTICA. (Marque una opcin) REQUISITOS TCNICOS 3. Campo de aplicacin RESUMEN. La espectrofotometra es una tcnica ampliamente utilizada en los laboratorios para el anlisis cuantitativo de numerosos compuestos, debido principalmente a su sencillez operativa y a la rapidez en el anlisis. La concentracin de una sustancia puede ser calculada a partir de la cantidad de luz absorbida por una muestra, en el rango del espectro del ultravioleta (UV) y visible (Vis) aplicando la ley de Lambert-Beer. Por ello, para generar datos confiables es de gran importancia la verificacin previa del funcionamiento del espectrofotmetro. Los principales parmetros a controlar en estos equipos son: la exactitud de la longitud de onda, la exactitud y precisin fotomtrica, la linealidad fotomtrica y la verificacin de la luz difusa o parsita. PALABRAS CLAVE. Espectrofotmetro. UV-Vis. Verificacin. Suelo. Agua Espectrofotmetros UV-Vis utilizados para el anlisis de muestras de suelo y agua para uso agropecuario. 4. Fundamentos 4.1. Equipamiento La mayora de los instrumentos espectroscpicos, como el espectrofotmetro, estn constituidos por cinco componentes: lmpara o fuente luminosa, selector de longitud de onda , celda para alojar la muestra, detector de radiacin, y amplificador de seal con medidor o registrador. 4.2. Teora Desde hace muchos aos se han utilizado las propiedades de la luz y su interaccin con las sustancias para identificarlas y determinar la concentracin de las mismas. Estos estudios se basan en la estrecha relacin que existe entre la absorcin de la radiacin electromagntica de las sustancias, tanto en la zona del espectro visible como en el ultravioleta e infrarrojo, y su concentracin. Si un haz de luz monocromtico paralelo (I0) atraviesa una cubeta de b cm de paso ptico, conteniendo una solucin con una concentracin (c) de una especie absorbente. A causa de la interaccin de la luz y de las partculas absorbentes la intensidad del haz se atena de I0 a I. La transmitancia (T) de la solucin es entonces la fraccin de la radiacin incidente transmitida por la solucin: T = I / I0 (1) Tambin puede expresarse en forma porcentual: T (%) = I / I0 x 100 (2)

1. Introduccin En el anlisis de muestras de suelo y agua, el espectrofotmetro constituye una herramienta fundamental para la cuantificacin de nutrientes y contaminantes. Del correcto desempeo de este instrumento depender en gran medida la calidad de los resultados obtenidos, por lo que se considera un equipo crtico en los ensayos de laboratorio y que necesariamente deber ser verificado peridicamente. 2. Objetivos El objetivo de sta gua es proporcionar informacin til para verificar el correcto funcionamiento de los espectrofotmetros UV-Vis del laboratorio.

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A fin de obtener ecuaciones de ajuste lineal se utiliza su transformada logartmica conocida como absorbancia (A) de una solucin y definida por la ecuacin A = - log T = log I0/I (3) La absorbancia de una solucin aumenta cuanto mayor es la atenuacin del haz de luz, ocurriendo lo inverso en la transmitancia. La absorbancia es directamente proporcional a la longitud b de la trayectoria a travs de la solucin, y a la concentracin c de la especie absorbente. Estas relaciones se expresan en la ley de Lambert-Beer como: A = bc (4) = absortividad molar expresada en L mol cm b = distancia recorrida a travs de la solucin (paso ptico) expresada en cm c = concentracin de la solucin expresada en mol L-1, 5. Desarrollo El Responsable del Sistema de Gestin de Calidad del Laboratorio (SGC) deber definir el programa de verificacin del equipamiento del laboratorio, en el cual incluir las actividades a realizar, sus responsables y la periodicidad de los controles. Esta ltima se define en funcin de las condiciones de uso y el registro acumulado de funcionamiento de los equipos. Las principales pruebas recomendadas en la bibliografa consultada, para verificar el correcto funcionamiento de un espectrofotmetro incluyen: la exactitud de la longitud de onda, la exactitud y precisin fotomtrica, la linealidad fotomtrica y la verificacin de la luz difusa o parsita. 5.1. Soluciones de calibracin Se encuentran disponibles en el mercado, materiales de referencia certificados de estas soluciones, aunque las mismas se pueden preparar en el laboratorio a partir de reactivos de alta pureza y cuyas propiedades fsicas y qumicas sean conocidas. Para materiales sin evidencia formal de la trazabilidad (y su incertidumbre) es responsabilidad de los laboratorios demostrar que los mismos son aptos para el fin previsto. 5.1.1. Solucin de xido de holmio en cido perclrico. Disolver en un vaso de precipitados 4,0 g de xido de holmio (III) en 96,0 g de cido perclrico al 10% (v/v). Calentar y agitar para facilitar su disolucin y luego dejar en reposo por 24 hs, a temperatura ambiente. 5.1.2. Solucin de sulfato de cobre en cido sulfrico. Disolver en un vaso de precipitados 20,0 g de sulfato de cobre pentahidratado, de una pureza mayor al 99,9%, en
-1 -1

suficiente agua destilada. Adicionar, con cuidado, 10 ml de cido sulfrico (d = 1,84 g cm-3), y trasvasar cuantitativamente la solucin a un matraz aforado de 1 litro. Enrasar con agua destilada y homogeneizar. 5.1.3. Solucin de cido sulfrico 0,005 mol L-1 Pesar en un vaso de precipitados 0,49 g de cido sulfrico (d = 1,84 g cm-3), diluir con agua destilada y trasvasar cuantitativamente a un matraz de 1 litro. Enrasar con agua destilada y homogeneizar. 5.1.4 Soluciones de Dicromato de potasio a) Solucin de concentracin 0,10 g L-1 Secar aproximadamente 1 g de dicromato de potasio, de una pureza mnima de 99,95%, en estufa a 105 C por 2 horas y enfriar en desecador. Pesar 0,10 g y disolver en un vaso de precipitados con la solucin de cido sulfrico 0,005 mol L-1. Trasvasar cuantitativamente a un matraz de un litro, enrasar con la solucin de cido sulfrico 0,005 mol L-1 y homogeneizar. b) Serie de soluciones de Dicromato de potasio Preparar cuatro soluciones de dicromato de potasio de diferente concentracin, requeridas para los controles, a partir de la solucin de 0,10g L-1, tal como se indica en la tabla 1, enrasando a un volumen final de 100 ml con cido sulfrico 0,005 mol L-1. Tabla 1. Serie de soluciones de dicromato de potasio.
Concentracin (g L-1) 0,02 0,04 0,06 0,08 ml de solucin de concentracin 0,10 g L-1 20 40 60 80

5.1.5. Solucin de Nitrito de sodio Secar aproximadamente 70 g de nitrito de sodio en estufa a 105C por 2 horas y enfriar en desecador. Pesar 50 g, disolver en un vaso de precipitados con agua destilada y trasvasar cuantitativamente a un matraz de un litro. Enrasar con agua destilada y homogeneizar. 5.2. Parmetros 5.2.1 Control de la exactitud de la longitud de onda La desviacin de la longitud de onda puede causar errores en los resultados cuantitativos de la lectura en el UV-Vis. En este control se verifica el grado de concordancia entre la longitud de onda seleccionada para la mxima absorbancia y la longitud de onda de referencia. Con una misma cubeta, ajustar el cero (0) del instrumento

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con la solucin de cido perclrico al 10%. Se recomienda medir segn el rango espectral una longitud de onda para el espectro UV y tres longitudes de onda para el espectro Vis. Dependiendo del ancho de banda del equipo, la mxima absorcin de la solucin de xido de holmio en cido perclrico se detectar a las longitudes de onda indicadas en la tabla 2. Tabla 2. Longitudes de onda () de mxima absorcin de la solucin de xido de Holmio en cido perclrico.
Ancho de banda (nm) 1 2 1 2 241,1 241,0 385,6 386,0 249,9 250,1 416,3 416,9 de mxima absorcin (nm) Rango UV 287,2 333,5 287,6 333,5 Rango Vis 467,8 485,2 468,1 485,2

valores y confrontndolos con los valores de referencia. 5.2.3. Control de la precisin fotomtrica Se denomina precisin fotomtrica a la medida de la dispersin de una serie de mediciones de absorbancia alrededor de la media, y se expresa como coeficiente de variacin porcentual. Para la determinacin, utilizar los datos obtenidos en la prueba de exactitud fotomtrica (5.2.2), con la solucin de dicromato de potasio de 0,06 g L-1 a las siguientes longitudes de onda: 235, 257, 313, 350 nm. 5.2.4. Control de la linealidad fotomtrica

278,1 278,1 451,4 451,3

345,4 345,5 536,6 537,2

361,3 361,1 640,5 641,1

5.2.2. Control de la exactitud fotomtrica La exactitud fotomtrica se determina comparando la absorbancia de una solucin de referencia (Tabla 3) con la lectura de sta, obtenida en el espectrofotmetro. Para cubrir satisfactoriamente el rango UV-Vis del espectro, se utilizan dos soluciones diferentes: dicromato de potasio, para el espectro UV y sulfato de cobre, para el espectro Vis. Tabla 3. Absorbancias de referencia de las soluciones en el rango UV-Vis
Longitud de onda (nm) 235 257 313 350 600 650 700 750 Absorbancia de Referencia 0,748 0,865 0,292 0,640 0,068 0,224 0,527 0,817

El estudio de la linealidad fotomtrica permite establecer el rango de absorbancia en el que el instrumento tiene respuesta proporcional a los cambios de concentracin. Para ello se determina la respuesta del espectrofotmetro a diferentes concentraciones de una sustancia que cumpla con la ley de Lambert-Beer. Se evala la linealidad fotomtrica realizando lecturas de absorbancia de la serie de soluciones de dicromato de potasio (0,02; 0,04; 0,06; 0,08 y 0,1 g L-1), utilizando la solucin de cido sulfrico 0,005 mol L-1 para realizar el ajuste a 0 de absorbancia del equipo. Las longitudes de onda a que se realizan las lecturas sern: 235, 257, 313 y 350 nm. 5.2.5. Control de Luz difusa o parsita Se denomina as a toda radiacin electromagntica de longitud de onda distinta a la seleccionada por el monocromador, que alcanza el detector y por lo tanto queda registrada por el instrumento. Este control se basa en la medida del porcentaje de transmitancia de una solucin de nitrito de sodio 50 g L-1. Esta sustancia tiene la propiedad de que sus soluciones absorben toda la radiacin incidente de longitudes de onda menores a los 390 nm, es decir, que es pticamente opaca a la luz. Por lo tanto, la transmitancia a 340 nm de esta solucin debe ser igual a cero, y toda transmitancia detectada corresponde a luz parsita. El ajuste del equipo a 0 de transmitancia se realiza con aire, luego se mide la transmitancia de la solucin de nitrito de sodio a una longitud de onda de 340 nm. Realizar las lecturas por triplicado. 6. Resultados En la tabla 4 se muestran los clculos y los resultados aceptables en la verificacin del funcionamiento del espectrofotmetro. Estos valores de aceptabilidad de los parmetros, fueron tomados de bibliografa relacionada con la industria farmacutica y de lineamientos de la farmacopea de diferentes pases.

Rango UV Solucin de dicromato de potasio en cido sulfrico Rango Vis Solucin de sulfato de cobre en cido sulfrico

Con una misma cubeta ajustar el 0 de absorbancia del instrumento con la solucin de cido sulfrico de concentracin 0,005 mol L-1, utilizada para preparar las soluciones de referencia. Control en el rango UV: Realizar 6 lecturas consecutivas de la solucin de dicromato de potasio en cido sulfrico de concentracin 0,06 g L-1 a las longitudes de onda de 235, 257, 313 y 350 nm, registrando los valores y confrontndolos con los valores de referencia. Control en el rango Vis: Realizar 6 lecturas consecutivas de la solucin de sulfato de cobre en cido sulfrico a las longitudes de onda de 600, 650, 700 y 750 nm, registrando los

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Tabla 4. Clculos y evaluacin de resultados de verificacin de espectrofotmetros.

Parmetros Exactitud de la longitud de onda Exactitud fotomtrica Precisin fotomtrica Linealidad fotomtrica Clculos E = m- ref %Error = Am Aref 100 Aref CV% = SD .100 x Graficar Am vs Aref. Calcular con una regresin lineal el coeficiente de regresin (r). Resultados Aceptable: UV 1 nm Vis 3 nm Error entre 2% Optima Error entre 3% Aceptable CV%<0,5% optima CV%< 1% aceptable r 0,999 Aceptable

Luz difusa o T<0,01 A >2 parsita E = exactitud; m= longitud de onda medida; ref = longitud de onda de referencia; Am = Absorbancia medida; Aref = Absorbancia de referencia; CV% = coeficiente de varianza; SD = desvo estndar; x = media de los datos; T = tramitancia; A = absorbancia.

Duymovich, C., Acheme, R; Sesini, S; Mazziotta, D. (2005) Espectrofotmetros y fotocolormetros: Gua prctica de actualizacin. Acta Bioqumica Clnica Latinoamericana 39: 529-539 Herington ERG (1977) Recommendes Reference Materials for the realisation of physicochemical properties. Absorbance and wavelength. Pure and Applied Chemistry Vol. 49, 661-674. Herman, L. (2004) Performance verification of UV-Vis spectrophotometers. Analytical method validation and instrument performance verification. (Ed.) C.C. Chan, H Lam, Y.C. Lee, X.M.Zang. John Wiley&Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, USA.Captulo 10,153-172. IRAM 301/ISO 17025 (2005) Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibracin. Manual de Uso Metrolab 330. Espectrofotmetro 330-1000 nm. Marca Metrolab. Manual de Uso Metrolab Plus 1600. Espectrofotmetro 330-1000 nm. Marca Metrolab. Mavrodineanu R, Baldwin JR (1980) Metal-on-quartz filters as a standard reference material for spectrophotometry SRM 2031., NBS Special Publication 26068 , NIST, Gaithersburg, MD, USA. Varcoe J.S. (2001) Clinical biochemistry: techniques and instrumentation. A Practical Course. (Ed) Word Scientific Publishing Co.Pte. Ltd. Captulo 1, 1-63.

7. Conclusiones En la bibliografa consultada, la mayora de las verificaciones se realizan en el rango del espectro UV (200 400 nm), sto se debe a que la informacin disponible est orientada a la verificacin de espectrofotmetros destinados al anlisis de muestras farmacuticas y bioqumicas. Tambin esto influye sobre los valores de aceptabilidad de los resultados obtenidos para los equipos. La regin del espectro utilizada en la mayora de los anlisis qumicos de muestras de suelo y agua para uso agropecuario, es la regin del Vis (400 - 800 nm), por lo que es necesario proponer soluciones de referencia, que puedan preparse en el laboratorio, y demostrar, adems, que las mismas pueden ser utilizadas para evaluar en ste rango del espectro. Asimismo debera evaluarse la posibilidad de modificar los rangos de aceptabilidad de los parmetros propuestos. Esto se debe a que, al tratarse de muestras para uso agropecuario, tal vez pueda permitirse una mayor flexibilidad en los valores aceptados para los espectrofotmetros utilizados en sta disciplina.
BIBLIOGRAFIA ASTG-4 (2005) Technical guide: UV/Vis Spectrophotometers - Calibration Procedures. International Accreditation New Zealand (IANZ). http://www.ianz.govt.nz/publications2/pdfs/ASTG4_UVVIS_Spectro.pdf Blzquez, J. (2005) Calibracin de espectrofotmetros para la medida directa de absorbancias. III Congreso Virtual Iberoamericano. Gestin de Calidad en Laboratorios. http://www.iberolab.org/opencms/opencms/congreso/IberolabIII2005/ind ex.html Burke, R.W. y Mavrodineanu, R. (1977) Certification and use of acidic potassium dichromate solutions as an ultraviolet absorbance standard SRM 935. NBS Special Publication 26054, NIST, Gaithersburg, MD, USA. Clare J.L. (2005) Calibration of UV-vis spectrophotometers for chemical analysis. Accreditation and Quality Assurance 10: 283-288.