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ENZYMOLOGIE

Pr Layachi CHABRAOUI Pr Wafae KABBAJ

Cours1re Anne Mdecine

Rabat 2011-2012

ENZYMOLOGIE?
L'enzymologie est la partie de la biochimie qui tudie les proprits structurales et fonctionnelles des enzymes. Elle sintresse aussi dcrire la vitesse des ractions catalyses par les enzymes (cintique enzymatique).

Introduction
Les organismes vivants sont le sige dinnombrables ractions biochimiques. Ces ractions constituent le mtabolisme cest dire la biosynthse et le catabolisme dun grand nombre de molcules biologiques. Ces ractions se droulent dans des conditions physiologiques (pH:7,4 et temprature :37oC) grce la prsence des enzymes Sans la prsence des enzymes, la vie serait impossible Les enzymes ont donc un rle vital

Contenu du cours

Structure et proprits des enzymes Cintique enzymatique Mcanisme de la raction enzymatique

Chapitre 1 Structure des enzymes


Objectifs: lissu de lenseignement ltudiant doit tre en mesure de:

Expliquer les diffrents types de classifications des enzymes et dresser les diffrents groupes Dcrire la structure des enzymes et des coenzymes Expliquer le mode daction des enzymes Citer les facteurs qui influencent la cintique enzymatique Expliquer le mode daction des diffrents facteurs influenant la cintique enzymatique

1- Dfinitions 1.1- Les enzymes


Des protines spcialises dans la catalyse de ractions.

Catalyseurs biologiques trs puissants Elles augmentent la vitesse des ractions chimiques, sans en modifier lquilibre.
A + B C +D

Les protines enzymatiques sont synthtises par des tres vivants. Cette synthse est dtermine gntiquement. Chaque enzyme est le produit dexpression dun gne Parfois 2 gnes

1.2- Un substrat (S):est la molcule qui est transforme sous laction


de lactivit de lenzyme

1.3- Un produit (P): est la molcule qui apparat au cours dune


raction catalyse par lenzyme Site actif S
S Enzyme Enzyme Enzyme P

S + E substrat

ES

P + E produit

1.4- Le site actif : la partie de lenzyme qui fixe le substrat.

2- Historique
1730: La digestion est un phnomne plus chimique que mcanique 1850: Pasteur dmontra que la fermentation du sucre en alcool par la levure est catalyse par une substance qui existe dans la levure

En zyme
dans 1897: 1929: levure

Buchner a extrait de la levure les premires enzymes La 1re enzyme purifie et cristallise est lurase Ure Urase

CO2 + 2NH3 Depuis, plus de 3000 enzymes sont dcrites

3- PROPRIETS ET CARACTRISTIQUES DES ENZYMES 3.1- Agissent en trs faible quantit: une molcule de catalase peut hydrolyser 5 millions de molcules dH2O2 en une min dans des conditions de pH et de temprature physiologiques 3.2- Ne sont pas consommes au cours de la raction: comme les catalyseurs chimiques, elles se retrouvent intactes la fin de la raction 3.3- Sont spcifiques: Une enzyme transforme un S donn (spcificit de substrat) grce une raction donne (spcificit de raction)

Spcificit lie la raction : Spcificit troite Exemple: dcarboxylation


R CH NH2 COOH

oxydase

oxydation dsamination HK et GK

AA (S)

Spcificit vis vis du substrat:

Spcificit troite Certaines E peuvent distinguer entre la forme D et L ou entre la forme et Spcificit large R-P HK, PAL Phosphatase alcaline = strospcificit

R+ P

3.4- Mode daction des enzymes S nergie tat de transition sans catalyseur Energie dactivation catalyseur enzyme tat initial tat final Les enzymes abaissent lnergie dactivation droulement de la raction P

exemple H2O2 O 2 + H2O

Sans catalyseur : 18 kcal/mole dH2O2 Catalyseur chimique (le platine) : 11,7 kcal/mole dH2O2 Enzyme (catalase) : 2 Kcal/mole dH2O2 Les enzymes abaissent lnergie dactivation Elles ne modifient pas lquilibre Elles augmentent la vitesse de raction 3.5- Les enzymes sont rgulables Lactivit catalytique de nombreuses enzymes varie en rponse des signaux mtaboliques (inhibiteurs, activateurs)

4- Structure des enzymes


- Enzymes entirement protiques
= holoprotines totalit

ex: Chymotrypsine

- Enzymes formes de deux parties htroprotines


Une partie protique: apoenzyme

cofacteur apoenzyme

Une partie non protique: cofacteur - ion mtallique - coenzyme, groupement prosthtique

Apoenzyme: intervient dans la spcificit, thermolabile Cofacteur: effectue la raction chimique, thermostable

4.1- Les enzymes holoprotiques: Les enzymes sont des protines globulaires. Elles peuvent tre formes: - dune seule chane polypeptidique Exemple: le lysozyme

- de plusieurs chanes identiques ou diffrentes Exemples: Isoenzymes (LDH, CPK) enzymes allostriques

4.1.1- Le site actif


- Dfinition: = enzymatique: 4-1 La protine acides amins qui entrent en contact avec le S site actif - le site de fixation qui se combine au substrat - le site catalytique qui agit sur le substrat pour lui faire subir la raction chimique.
S

- Constitution: serine, cystine, histidine, tyrosine

- Mise en vidence des AA du site actif: a- Utilisation des composs qui se fixent spcifiquement un AA Diisopropylfluorophosphate (DFP): Serine Parachloromercuribenzoate: Cystine Drivs arsenicaux: Cystine b- Mthodes de gnie gntique

4.1.2- Relation entre la structure spatiale et la fonction catalytique Exemple: : la trypsine: enzyme pancratique

Zymogne
Trypsinogne Nt Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (inactif)
His His

49

29
Ser

183
S S

entrokinase : E intestinale
Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys

Site actif
His His 29 49 183

Trypsine (active)

Ser S S

Le dpart de lhexapeptide, fortement charg (-) par les 4 Asp, modifie la conformation de la protine, en favorisant la formation dhlice .

4.1.3- forme du site actif

1890:

Fischer a propos que la forme du substrat est complmentaire de la forme du site actif de lenzyme = modle de la cl et de la serrure

1958:

Koshland a propos que lenzyme et le substrat adaptent mutuellement leurs formes respectives Une molcule denzyme nest pas rigide mais flexible = modle de lajustement induit (comme la main et le gant)

4-2 Enzymes htroprotiques: Cofacteurs


- de nature inorganique: les ions mtalliques, - de nature organique: les

coenzymes

Lorsque le coenzyme se lie la protine enzymatique par une liaison covalente, on parle de groupement prosthtique Lorsque la liaison est faible on parle de cofacteur apoenzyme

cosubstrat 4-2-1 Ions mtalliques


Mg2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+ Exemples: Fer: les cytochromes Zn2+ dans lalcool dshydognase forme un pont entre lenzyme et son substrat

4-2-2 Coenzyme
Molcule indispensable la raction enzymatique. La raction se produit avec le coenzyme et non avec la protine (coenzyme = site catalytique) Lapoenzyme intervient dans la spcificit (site de fixation) Mode daction des coenzymes

A-X + Co Co-X + B A-X + B


Exemple:

A + Co-X B-X + Co A + B-X


dshydrognase hydrognase

AH2 + FAD FADH2 + B

A + FADH2

BH2 + FAD

Le coenzyme nest pas spcifique: plusieurs enzymes diffrentes peuvent avoir le mme coenzyme certaines enzymes ont besoin dun ion mtallique et dun groupement prosthtique: cas des cytochromes: noyau porphyrique + Fe2+

5- NOMENCLATURE ET CLASSIFICATION DES ENZYMES


Avant 1961 : les enzymes ont t dnommes selon le nom du S sur lequel elles agissent en ajoutant le suffixe "ase" Exemple: Substrat amidon ure Enzyme amylase urase

E1 Dcarboxylase Acide amin E2 Aminotransfrase E3 Oxydase 1961: lunion internationale de biochimie (UIB) : nouvelle classification des enzymes selon le type de raction catalyse

6 classes denzymes

5.1- Les oxydorductases


ncessitent un coenzyme (NAD, NADP, FAD ou FMN)

Aox + Bred
Hydroxylases: (=monooxygnases) -CH2OH -CHOH-CH3 -CH2 Dshydrognases:

Ared + Box
catalysent la fixation dun atome doxygne

lactate dshydrognase CH3- CHOH-COOH + NAD+ CH3-CO-COOH ac. pyruvique ac. lactique

+ NADH + H+

Cytochromes: ont un coenzyme hminique avec un ion, qui prsente 2 tats doxydation, ce qui en fait un transporteur dlectrons. Fe2+ Fe3+ + 1erduit oxyd

5.2- Les transfrases catalysent le transfert de groupement autre que lhydrogne entre deux substrats ncessitent un coenzyme

A-X + B

A + B-X

les transaminases: transfrent les radicaux amins -NH2 dun AA un acide ctonique accepteur. Le coenzyme est le phosphate de pyridoxal. les phosphokinases ou kinases: transfrent un P sur une molcule dADP. Lion Mg++ est indispensable. ATP + glucose Les transactylases: ADP + glucose 6P

transfrent les radicaux actyles(-CH2COOH), le coenzyme est CoA transfrent les radicaux mhyles (-CH3), dune molcule une autre, le coenzyme est lacide tetrahydrofolique.

Les transmthylases:

5.3- Les hydrolases


Catalysent la rupture dune liaison avec fixation des lments dune molcule deau. A-B + H2O A-H + B-OH

Les estrases: hydrolysent les esters en acides gras et en alcool RCOO-CH2-R + H2O RCOOH + RCH2OH

Les lipases : hydrolysent les glycrides en glycrol et en acides gras Les osidases: hydrolysent les osides glucosidase, galactosidase Les enzymes protolytiques: hydrolysent les liaisons peptidiques R-CO-NH-R + H2O RCOOH + NH2-R

5.4- Les lyases


catalysent la rupture des liaisons C-C, C-N, C-O, C-S - dcarboxylase dacide ctonique: le coenzyme est la thiamine pyrophosphate (TPP) R-CO-COOH R-CHO + CO2

- dcarboxylase dacides amins:

le coenzyme est le phosphate de pyridoxal

CH NH2

COOH

R-CH2-NH2 + CO2

Cas de la pyruvate dshydrognase: 5 coenzymes TPP, NAD+, FAD, Coenzyme A et Lipoate

5.5- Les isomrases


catalysent le dplacement de groupes lintrieur dune molcule sans que la formule brute varie Epimrases: provoquent des interconversions doses galactose Mutases: glucose

catalysent le transfert dun radical dune partie dune molcule une autre
CH3 H C CO CoA COOH

CH2 CH2 CO CoA

COOH

Methyl malonyl CoA

Succinyl CoA

5.6- Les ligases:

catalysent la condensation de 2 molcules. A-B ATP AMP + P-O-P

A+B

6- PRINCIPAUX COENZYMES
Origine des coenzymes 1- mtabolisme 2- Vitamine (ATP, S adnosyl mthionine)

(= amine vitale)

Un certain nombre de coenzymes drivent de vitamines, notamment de vitamines hyrosolubles et en particulier les vitamines du groupe B

- Coenzymes intervenant dans les ractions doxydorduction (4 coenzymes) - Coenzymes intervenant dans le transfert de groupement (6 coenzymes)

6.1- Coenzymes intervenant dans les ractions doxydorduction 6.1.1- Nicotinamide adnine dinuclotide (NAD+) et NADP+ Structure NAD+
CO- NH2

Nicotinamide (Vit B3ou Vit PP)

nuclotide

O HO P O H H OH O H

N+

H OH

O N

NH2 N

nuclotide
HO P O O H H OH O H

Adnine
N

H OH

centre actif
CO- NH2 O HO P O H H O OH O H H OH NH2 N N HO P O O H H OH HO O H O P O H N N N+

NAD+

NADP+

OH

Mcanisme ractionnel AH2 + Substrat rduit NAD+ (ou NADP+) A + NADH + H+ (ou NADPH) Substrat oxyd
H H CO- NH2 N

H CO- NH2 N+

AH2 +

+ H+

NADH + H+ (ou NADPH)

Substrat oxyd

BH2 + NAD+ + (ou NADP ) Substrat rduit

Ce sont des coenzymes de type Cosubstrats

Spectre dabsorption Mesure de la densit optique en fonction de


DO NAD+ (forme oxyde)

NADH (forme rduite)

260

350

Longueur donde (nm)

dosage des enzymes NAD+ ou NADP+ Exemple: LDH

Spcificit NAD+ Localisation mitochondriale Coenzyme doxydation NADP+ Localisation cytoplasmique Coenzyme dhydrognation, de biosynthse

[NAD+]

>

[NADP+]

La plupart des enzymes sont spcifiques soit du NAD+ soit du NADP+ sauf qq exceptions comme la glutamate dshydrognase Origine Le NAD+ et le NADP+ sapparentent la vitamine B3 ou PP (pellagre preventive) Lavitaminose PP entrane une maladie appele pellagre

6.1.2- Flavine mononuclotides (FMN) et Flavine adnine dinuclotide (FAD) Structure Flavine mononuclotides: FMN ribitol
O CH2 CH3 (CHOH)3 CH2 O P OH N N O OH

NH CH3 N O

Noyau isoalloxazine = flavine = vit B2

Flavine Adnine Dinuclotide: FAD FMN


CH2 CH3 (CHOH)3 CH2 OH O P O

NH CH3 N O

OH

P O

NH2 N N N

Ac adenylique

N CH2 O H H OH H H OH

Mcanisme ractionnel

E
A +
N

AH2 +
N

FAD ou FMN jaunes

FADH2 ou FMNH2 incolores

Les FMN et FAD sont appels ferments jaunes FMN et FAD sont lis lenzyme: groupements prosthtiques

Origine Le FAD et le FMN drivent de la flavine ou vitamine B2

Les dshydrognases FAD les plus importantes sont les NADH dshydrognases qui permettent la roxydation du NADH

Dshydrognase FAD NADH + H+ NAD+

FAD

FADH2

6.1.3- Les ferroporphyrines: Coenzymes associs aux cytochromes grpt prosthtique + Fe Structure
CH3 CH2-CH2

CH3

N N Fe N N

CH3 CH2-CH2 CH2

Cyt C

CH2 CH2 COOH CH2 CH2 COOH

CH3

Rle Jouent un rle important dans le transfert dlectron Fe2+ Fe3+ + 1erduit oxyd

6.1.4- Acide lipoque Structure Ce coenzyme a la structure dun Acide gras satur 8 C avec un pont disulfure entre C6-C8. 7 1
COOH

2
CH2

3
CH2

4
CH2

5
CH2

6
CH S

CH2

8
CH2 S

+ 2H

SH

SH

Rle:

Transporteur dH2

Lacide lipoque est attach par covalence lenzyme par son carboxyle un reste lysine de lenzyme : groupement prosthtique

6.2- Coenzymes intervenant dans le transfert de groupement 6.2.1- Thiamine pyrophosphate (TPP) Structure:
NH2 N CH2 N N+ CH2 CH3 CH3 CH2 O

driv de la vitamine B1 ou thiamine


H C

centre actif
S OH P O O OH P O OH

Cycle pyrimidique

Cycle thiazole

Thiamine = vitamine B1 Rle: Transporteur dactaldhyde dans les ractions de dcarboxylation COOH Ex: Pyruvate DH
C=O CH3

O H

CO2 + CH3

Actaldhyde

Ac. pyruvique La carence en vitamine B1 entrane une maladie : le Bri-bri

Structure
O CH2 H H O O O P O O P O CH2 CH3
H

NH2 N N H H OH OH N N

6.2.2- Coenzyme A (CoA-SH) ou Coenzyme dAcylation Drive dune vit amine du groupe B: ac pantothnique Rle Transporteur dactyle et dacide gras

O P OH

OH OH

CH3

OH C O C NH CH2 CH2 C NH CH2 CH2 O

Acide pantothnique CoA-SH + CH3COOH CH3CO-SCoA actyle CoA CoA-SH + R-COOH Thiothylamine ou mercaptoethylamine RCO-SCoA acyl CoA

SH

6.2.3- Acide tetrahydrofolique Structure:

(FH4)

drive de la vitamine B9: acide folique


OH

Acide folique

N 4

2
NH2

5 6 8 7
N

CH2 NH

10

CO NH

CH COOH

CH2 CH2 COOH

N. pteridine
OH H N H H N H CH2

Ac. Para amino benzoque

Glu

FH4

N NH2

NH

CO NH

CH COOH

CH2 CH2 COOH

Rle

: transporteur dunits un C (CH3) CH2 Sur N5 Sur N10 N CH2 5 entre N5 et N10

10

6.2.4- S adnosyl mthionine


COOH

Structure: Met

NH2

CH NH2 CH2 N CH2 N N S+ N

adnosine

CH3

CH3 H H OH

O H H OH

Rle: transporteur de radicaux mthyles (donneur)

6.2.5- Adnosine 5 triphosphate


NH2

Structure:
O HO P OH O O P OH OO O P OH H O H OH O H

N N

adnine

H OH

AMP ADP ATP Rle: transfert de groupements ATP ATP ATP ADP AMP + P + P-P + P + P-P

adnosyl

6.2.6- Phosphate de pyridoxal Structure:


CH2OH CH2OH OH CH3 N CH2OH

drive de la vit B6

= vit B6
CHO CH2OH OH CH3 N N OH CH3 CH2-NH2

pyridoxine Rle:

pyridoxal

pyridoxamine

Transport de groupement amin: NH2 Pyridoxal = vit B6

O HO P OH O CH3

O CHO

CH2-NH2 O CH3 OH CH3 N

NH3
OH CH3 N

HO

P OH

Phosphate de pyridoxal

Phosphate de pyridoxamine

Phosphate de Pyridoxal Transamination Dcarboxylation

Chapitre 2:
Objectifs:

La cintique enzymatique

Reconnatre la cintique dune enzyme

Dfinir la vitesse maximale (Vmax) et la constante de Michaelis (KM) Reprsenter graphiquement la cintique dune enzyme en fonction des diffrentes variables

1- RAPPEL DE LORDRE DUNE REACTION


A A- raction dordre 0 [A] V V= -d[A] dt P

=k

t B- raction dordre 1 [A]


V

[A] -d[A] = k[A] dt

V=

[A]

Rappel de calcul de la vitesse dune raction A K1 P

V = V de disparition de A (dapparition de P):

V=

d[ A] d[P ] = K 1 [ A] = dt dt

K1 K2

V de lalle = V de disparition de A (apparition de P): = V

d[ A] d[P] = K [ A] = 1 dt dt

V de retour = V dapparition de A (disparition de P): V =

d[P ] d[ A] = K 2 [P] = dt dt

quilibre

K1[A] = K2[P]

Keq =

K1 [P ] = K 2 [A ]

K1 A+B K2 P

V de lalle= V de disparition de A et B (apparition de P ): V = K1[A][B] V de retour= V dapparition de A et B (disparition de P): V = K2[P] quilibre K1[A][B] = K2[P]
K1 [P] = Keq= K 2 [ A ][B]

K1 A +B K2 C+ D V de lalle= V de disparition de A et B (apparition de C et D): V=K1[A][B] V de retour= V dapparition de A et B (disparition de C et D): V=K2[C][D] K1[A][B] = K2[C][D] Keq=
K1 [C][ D] = K 2 [ A ][B ]

2- CINETIQUE DES REACTIONS ENZYMATIQUES


Ce qui est fondamental dans les ractions enzymatiques, cest la combinaison E-S. Aprs formation du complexe, le substrat est transform en produit et lenzyme retrouve sa structure initiale.

S +E

K1 K2

ES

K3 K4

P +E

La V de la raction enzymatique est influence par: [S], [E], temprature, pH, effecteurs.

2.1- V de la raction en fonction de [S] Ltude de la cintique enzymatique a t ralise essentiellement par Michaelis et Menten en 1913. 2.1.1 Courbe de Michaelis-Menten [E] fixe et faible V V=Vmax [E] =[ES] Saturation de lenzyme Vmax Ordre 0

Courbe de Michaelis-Menten

Ordre 1
S S S S S S S S S S S S S

[S]

S S S S

Interprtation de la courbe de MM

- Aux faibles conc de substrat, la vitesse de la raction est proportionnelle celle du substrat (raction dordre 1)

- Lorsque la conc de S augmente, la vitesse ne saccrot plus dans les mmes proportions (raction dordre mixte)

- Aux fortes conc de S la vitesse devient constante, indpendante de cette concentration (raction dordre 0): lenzyme est sature par son substrat. Ce phnomne est particulier la cintique enzymatique.

1.1.2- Dtermination de lquation de Michaelis-Menten S+ E K1 K2 K1 K2 ES K3 K4 P +E Conditions initiales

V= f([S]) ?

S +E ES K3

ES (rapide)

[E] = concentration totale de lenzyme [ES] = concentration du complexe Enz-Sub [E]L = concentration de lenzyme libre [E] = [E]L+ [ES] [E]L= [E] - [ES]

P + E (lente)

V= K3[ES] Vitesse de formation de [ES] = Vitesse de disparition de [ES] = d[ES] = K1[E]L[S] = K1([E]-[ES])[S] dt - d[ES] = K2[ES] + K3[ES] = [ES] (K2+K3) dt

Etat stationnaire: V de formation de [ES] = V de disparition de [ES] K1([E]-[ES])[S] = [ES] (K2+ K3)

K1([E]-[ES])[S] = [ES] (K2+ K3) ([E]-[ES])[S] [ES] (K2+K3) = KM = K1 [E][S] - [ES][S] = [ES] KM

[E] [S] [ES](KM+[S]) = [E][S] Or, V = K3[ES] Vmax = K3 [E] Vmax [S] KM+[S] [ES] = KM+[S] = K3 [E] [S] KM+[S] V=Vmax [E]=[ES]

V=

Equation de M-M

V=

Vmax [S] KM+[S]

Cas particulier Si V= Vmax 2 Vmax = Vmax [S] 2 KM+[S]

2[S]= KM +[S]

KM = [S]

Vmax

Vmax 2

KM 1.1.3- Signification de Vmax et de KM Vmax est atteinte lorsque toute lenzyme est sature par le substrat

[S]

KM est la valeur de S pour laquelle la vitesse de la raction est Vmax/2 KM est une grandeur exprimentale qui peut varier avec la structure du S, le pH, la temprature. Chaque enzyme a un KM caractristique pour un S KM indique laffinit de lenzyme pour le S KM affinit

1.1.4- Reprsentation de Linweaver et Burk [S] KM 1 = KM +[S] = + V Vmax [S] Vmax [S] Vmax [S]

V=

Vmax [S] KM+[S]

1 V

1 1 + 1 KM = V Vmax [S] Vmax Y = a x + b KM/Vmax

1/Vmax 1 [S]

-1/KM

Cette reprsentation offre lavantage de permettre la dtermination plus prcise de KM et Vmax. De plus, tant une droite, elle ncessite moins de points exprimentaux.

1.2- Influence de la concentration en enzyme

V E3 E2 E1 V

[S]

[E]

La vitesse dune raction est proportionnelle la quantit denzyme

1.3- Influence de la temprature

to optimale Mouvement des molcules

Dnaturation de la protine

temprature
20 30 40 50 60

1.4- Influence du pH

pepsine

cholinestrase

La plupart des enzymes

10

12

pH

Le pH agit:

Conformation de la protine Association E-S Action catalytique de lenzyme

1.5- Effet des effecteurs Rle des effecteurs: Physiologique: Rgulation du mtabolisme cellulaire Biochimique: Permettre de mieux comprendre le mode daction des enzymes comptitive rversibles inhibiteurs activateurs effecteurs allostriques irrversibles non comptitive incomptitive

1.5.1- Inhibiteurs 1.5.1.1- Inhibition rversible 1.5.1.1.1- Inhibition comptitive Exerce par un compos dont la structure ressemble celle du S E + S E + I KI = ES E + P S i

K1 K2

EI (Inactif) [EI] = [E] [I] KI

[E] [I] [EI]

[E] = [E]L + [ES] + [EI] Vmax [S] V = KM(1+[I]/KI) + [S] KM

KM= KM(1+[I]/KI)

V = KM(1+[I]/KI) + [S] V Vmax

Vmax [S]

1 V

[I] 1 1 + (1+ ) = KI [S] Vmax Vmax KM

Sans I [I]

1/ V

[I]

Vmax/2
1/Vmax

KM KM KM

[S] KM affinit

-1/KM -1/KM -1/KM

1/[S]

Quand [S] augmente , leffet de linhibiteur disparat: Linhibition comptitive est leve par un excs de substrat Vmax nest pas modifie

Exemples: La succinate dshydrognase


COOH

COOH

Succinate dshydrognase
CH2 CH2 COOH

CH CH COOH

FAD

FADH2

succinate
COOH
COOH

Fumarate

CH2
CH2

CO
COOH

Inhibiteurs comptitifs de la succinate dshydrognase

malonate

COOH

oxaloactate

Inhibition par le produit de la raction Glucose 6 phosphatase Glucose 6P + H 2O glucose + H3PO4

Les amines quaternaires sont des inhibiteurs comptitifs de la cholinestrase actylcholinestrase Choline + ac. actique CH3

CH3 CH3 CH3 N+ CH2 CH2 O CO

actylcholine
R1 R2 R3 N+ R4

Amines quaternaires

Antimtaboliques
En sintroduisant dans lorganisme, ils donnent naissance des composs anormaux et ralentissent certains mtabolismes. fluorouracile 2-amino adnine Action anti-cancreuse

La sulfamide bactrie
N-ptridine +Ac. para amino-benzoque + Glu

NH2

NH2

E
COOH

SO2-NH2

Ac. folique X des bactries

Ac. para aminobenzoque

sulfamide Action antibactrienne

1.5.1.1.2- Inhibition non comptitive E + S E + I ES + I Vmax V= ES EI ESI E + P S i


Cu2+, Ag2+

inactifs [E]= [E]L [ES] + [EI]+ [ESI] +

Vmax [S] 1+ [I]/KI KM + [S]

1 1 (1+[I]/KI) + (1+[I]/KI) = [S] Vmax Vmax V 1 1/V sans i [i]

KM

V Vmax Vmax a Vmax b

1/Vmax 1/Vmax 1/Vmax

[S]

1/[S] -1/KM

Ce type dinhibition nest pas lev par un excs de substrat KM est inchang, laffinit de E pour S nest pas affecte Vmax est diminue par linhibiteur Le type le plus courant de cette inhibition se produit avec des ractifs capables de se combiner rversiblement avec les groupement SH des radicaux Cys indispensables lactivit enzymatique comme les mtaux lourds (Cu2+, Ag2+, Hg2+..) Certaines enzymes par contre, ont besoin de certains ions comme Mg2+, cet ion peut tre chlat par EDTA (thylne diamine ttra actique).

1.5.1.1.3- Inhibition incomptitive E + S ES + I ESI [E]= [E]L+ [ES] + [ESI] V E +P

l'inhibiteur ne se lie que sur ES


S

Vmax

1+[I]/KI V= KM + [S] 1+[I]/KI


sans I i

[S]

1 1 1 = KM (1+[I]/KI) + V Vmax [S] Vmax 1/V

Vmax Vmax

1/V max 1/Vmax

[S]

-1/KM -1/KM

1/[S]

Cet inhibiteur dplace leq, abaisse KM. Une partie de ES reste bloque sous forme ESI, donc Vmax est diminue

Tableau rcapitulatif des inhibitions rversibles

KM
Comptitive Non comptitive Incomptitive

Vmax

Pente

1.5.1.2- Inhibition irrversible: 1er exemple: E-SH + ICH2CONH2 E Cys liodoactamide

inactivation totale de lenzyme E-S-CH2-CONH2 + HI Complexe inactif

raction irrversible 2me exemple: Diisopropyl fluorophosphate (DFP) : arme biologique


E - CH2

F
CH3

E-CH2OH + E Ser

CH CH3

P O

CH

CH3 CH3

CH3 CH CH3 O

O P O O CH CH3 CH3

+ HF

DFP

raction irrversible Complexe inactif

Ex. enzyme srine: actylcholinestrase 3me exemple: Acide cyanhydrique (HCN): Poison respiratoire Forme un complexe stable avec le fer des cytochromes (enzymes respiratoires cellulaires) et provoque leur inhibition

1.5.2- Activateurs 1.5.2.1- Activation par protection de lenzyme Des composs qui protgent les enzymes contre les oxydations dans les enzymes Cys se comportent comme des activateurs E-SH + SH-G E Cys Glutathion E-S ------ SG + H2

1.5.2.2- Activation par les ions Concerne les enzymes qui ncessitent des ions pour leur activit Exemple: Mg2+ est un activateur des kinases

1.5.2.3- Activation par action sur les subunits enzymatiques Protine kinase protine + ATP Protine-P + ADP

Les protines kinases sont actives par lAMPc

Site actif Site de fixation de lactivateur

AMPc

AMPc

E inactive

Subunit catalytique active

3- ENZYMES ET EFFECTEURS ALLOSTERIQUES


3.1- Cintique des E allostriques 3.1.1- V en fonction de [S] Interprtation de la courbe des E allostriques V E michaelienne - Les petites quantits de substrat sont transformes lentement - La vitesse augmente partir dun seuil E allostrique - Effet coopratif

[S] Contrairement aux enzymes michaeliennes, les enzymes allostriques nexercent leur action qu des concentrations en substrat leves

ont une structure quaternaire, formes dun nombre pair de sous units.

La fixation de S au 1er site entrane un changement A de conformation des autres sites, ce qui modifie laffinit pour le S. On dit quil y a un effet coopratif.

En plus du site actif o se fixe le substrat, lenzyme possde un ou plusieurs sites allostriques o peuvent se fixer des effecteurs allostriques (activateurs ou inhibiteurs). Ces effecteurs nont aucune analogie structurale avec le substrat.

2.2- Action des effecteurs allostriques Ce sont des substances qui agissent comme activateurs ou inhibiteurs en modifiant la conformation des sites de liaison au substrat, ce qui change laffinit pour le substrat Activateurs allostriques Augmentent laffinit de lenzyme pour le substrat, lui permettant dagir de faible concentration en substrat inhibiteurs allostriques
V

Activateur

Comme les inhibiteurs non comptitifs diminuent laffinit de lenzyme pour le substrat Vmax 2 Inhibiteur

KM(a)KM KM(I)

[S]

2.3- Model des E allostriques S S i A

Model de Monod Wyman et Changeux (MWC) 1- possdent 2 sites: site actif et des sites rgulateurs (activateur et inhibiteur) 2- formes de plusieurs sous units identiques (= protomres) 3- existent sous 2 tats en quilibre: tat catalytique R et tat inhib T

A ou S

i Relch Tendu (actif) (inactif) transition allostrique

Allostrie
Autre forme

4- effet coopratif:du la prsence de plusieurs sous units (protomres) la fixation dune molcule de S sur un protomre dplace lquilibre vers la forme active

2.4- Importance des enzymes allostriques Ont un rle de rgulation trs important dans la cellule: Permettent ladaptation du mtabolisme au besoin de la cellule En gnral lenzyme allostrique catalyse la 1re raction, limitante dune voie mtabolique Son activit peut tre contrle par des activateurs ou inhibiteurs appartenant cette voie mtabolique

E1

E2

E3

X X= inhibiteur allostrique

E allostrique Inhibition feed back ou retroinhibition

Les effecteurs allostriques ont une action spcifique sur les enzymes allostrique, en se fixant sur leur sites allostriques

MECANISME DE LA REACTION ENZYMATIQUE 1- Chymotrypsine: hydrolyse les peptides au niveau de la Tyr et de Phe
R-CO-NH-R + H2O RCOOH + NH2-R

Le site actif : His 57, Asp 102 et Ser 195

1re tape: acylation


peptide
H
H
O C O H N (Asp102) N H O-

O C R C O O- H N (Asp102)

R'

R'

O N C O R

(His 57)

CH2 (Ser 195)

(His 57)

CH2 (Ser 195)

Enzyme

Enzyme

acylchymotrypsine

2me tape: dsacylation

H
O C O
-

O
H N N

O
O C O R

OH

H N N H O(His 57)

(Asp102)
(His 57)

(Asp102)

CH2
(Ser 195)

CH2
(Ser 195)

Enzyme

Enzyme

acylchymotrypsine

2- Actylcholinestrase
enzyme

Site anionique His


CH2
CH3

NH Site estrasique N
O C

actylcholine

CH3

CH2

CH2

OH CH2
CH3

Ser

CH3

un dplacement dlectron va fragiliser la liaison ester et provoquer sa rupture


CH3 CH3 N+ CH3 CH2 CH2

HO

Tyr

H 2O
O

OH

HO

C CH3

choline

Ac. actique

3- Transaminases Permettent le transfert rversible du groupement amine dun AA un acide ctonique.

Le coenzyme des transaminases est le phosphate de pyridoxal

Site actif dune transaminase


OH CH3 OH CH3

HOOC CH NH2C HO R
CH2 O P N

HOOC CH N
CH2 O P N

H 2O

Base de schiff
COOH R

OH CH3

HOOC C R N
CH2 O P N

+ H 2O

C O

+
NH2

OH CH3

N CH2 O P

Ac. ctonique

Phosphate de pyridoxamine

DOSAGE DES ENZYMES


La quantit denzyme peut tre mesure par son activit enzymatique E A + B C Pour dterminer lactivit enzymatique, il faut connatre: 1- la stchiomtrie de la raction 2- les besoins de lenzyme en cofacteurs 3- KM 4- le pH optimum de lenzyme 5- la gamme de temprature olenzyme est stable 6- une mthode analytique permettant la dtermination de la concentration du substrat qui disparat ou du produit obtenu 1- Unit de lactivit enzymatique Unit internationale (UI) = la quantit denzyme qui produit la transformation dune micromole ( mole) de S par min 25oC Le katal (kat) = la quantit denzyme transformant une mole de substrat par sec Activit spcifique = le nombre dUI par mg de la protine enzymatique

DO

NAD+ (forme oxyde)

DO = [C] l

NADH (forme rduite)

260

350

Longueur donde (nm)

AH2

+ NAD+

A + NADH + H+

2- Intrt de dosage des enzymes


Le fonctionnement normal de lorganisme est le rsultat de laction harmonieuse de tous les systmes enzymatiques Dosage des enzymes dans les liquides biologiques et les tissus rvle des anomalies pathologiques: Phosphatase acide dans le srum Cancer de la prostate

La prsence de certaines enzymes dans le srum est le signe dune ncrose tissulaire Mais dans certains cas la mme activit enzymatique peut tre due a les enzymes diffrentes selon leur origine tissulaires. Cest le cas des isoenzymes Llectrophorse des isoenzymes permet de localiser lorigine de la ncrose

3- Les isoenzymes
Ce sont des enzymes qui ont la mme proprit catalytique mais qui diffrent par leur proprits physicochimique. Les isoenzymes peuvent diffrer dun tissu un autre. LDH Ac. pyruvique Ex.: Lactate dshydrognase (LDH): Ac. lactique LDH: 4 sous units de 2 types, H et M Forme H (coeur) Forme M (muscle et foie)

dpts 1 2 Coeur 3 4 5 Muscle et foie

En plus de ces anomalies, il existe des dficits hrditaires de certaines enzymes qui sont lorigine de maladies mtaboliques graves: Ex: maladie Enzyme altre Tyrosine hydroxylase Phnylalanine hydroxylase Cystathionine synthtase

Albinisme: Phnylctonurie: Homocystinurie: