PRACTICA # 7 CULTIVO DE AMEBAS DE VIDA LIBRE POTENCIALMENTE PATOGENAS OBJETIVO: Aplicacin de algunas tcnicas para cultivo y estudio microscpico

de amibas de vida libre potencialmente patgenas. INTRODUCCION. Algunos protozoarios parsitos son relativamente fciles de cultivar en medios de laboratorio que contengan bacterias, como en el caso de amebas de vida libre Naegleria fowlerii y Acanthamoeba sp., mismos que se desarrollan en el ambiente, principalmente en aguas templadas con poco movimiento, como las de albercas, lagunas y estanques, a partir de las cuales se pueden aislar. N. fowlerii es causante de Meningoencefalitis Amibiana Primaria (MEAP) y en la mayora de los casos, el paciente se zambull, lo que provoca entrada brusca de agua en fosas nasales y el posterior paso de los protozoarios a travs de la lmina cribosa del etmoides. Las amibas del gnero Acanthamoeba afectan con mayor frecuencia a pacientes inmunodeficientes, provocando encefalitis amebiana granulomatosa (EAG) o lceras cornales en usuarios de lentes de contacto. MATERIALES Y METODOS I. AISLAMIENTO DE Naegleria Y Acanthamoeba DE AGUA DE ALBERCA. 1. Colecta de muestras de agua de alberca: a) A partir de agua de alberca se obtienen muestras de agua de 800 a 1000 ml, en botellas estriles, tomadas en horas de atencin al pblico. b) Se obtienen dos muestras de la superficie, dos a 30 cm de profundidad, dos del fondo, una en la canaleta lateral de desage y una a la salida del filtro. c) Se tapan hermticamente y se rotulan convenientemente. 2. Anlisis de las muestras mediante examen directo en fresco. a) Primeramente se dejan sedimentar las muestras de agua durante tres a cuatro horas, en botellas de centrfuga estriles con fondo cnico, tapados. b) Se elimina el sobrenadante y se centrifuga el sedimento a baja velocidad (1.000 r.p.m.). c) Del centrifugado se realiza el examen directo en fresco, entre lmina y laminilla y se deja el resto para el inculo en la siembra del cultivo. La lectura directa (4 preparados por muestra) se efecta al microscopio ptico de luz, a aumentos de 10x y 40x. d) Este anlisis al microscopio es con la finalidad de una orientacin sobre la posible presencia de amibas de vida libre. e) El resto del sedimento se guarda para el cultivo.

3. Anlisis de las muestras por cultivo para confirmacin y aislamiento: a) Para la siembra, se dejan caer dos gotas del sedimento respectivo en cuatro placas de Petri preparadas con medio de agar no nutritivo (ANNE), habiendo extendido previamente en la superficie una pelcula de Escherichia coli inactivada, con la finalidad de servir como nutrientes para las amibas. De cada muestra, dos de las placas se incuban a 37C y otras dos a 45C, durante siete das, examinndolas cada 24 horas bajo el microscopio. b) Si a los siete das de observacin no hubo multiplicacin de amebas, la muestra se considera negativa. En cambio, si existi desarrollo, se procede al aislamiento de las colonias. c) El aislamiento de colonias de amibas se efecta bajo un microscopio esteroscpico (lupa), mediante un bistur fino y esterilizado. Se cortan trozos de agar conteniendo las colonias y se transfieren a otras placas nuevas preparadas en la misma forma ya mencionada para obtener el cultivo puro. d) Una vez logrado lo anterior, se procede a estudiar las caractersticas morfolgicas de los trofozotos y/o quistes al microscopio, con el fin de diagnosticar el gnero y/o la especie. e) Naegleria tiene capacidad para crecer a 45 C (termorresistencia) y para producir flagelos a 37 C. II. AISLAMIENTO DE Naegleria Y Acanthamoeba DE AGUA DE LOS APARATOS DOMSTICOS DE AIRE ACONDICIONADO (AIRE ENFRIADO CON AGUA). 1. Se obtienen muestras de agua de 800 a 1000 ml, en botellas estriles, a partir del agua del depsito del aparato. 2. Anlisis de las muestras mediante examen directo en fresco. Desarrolle el mismo procedimiento que en el agua de alberca. 3. Anlisis de las muestras por cultivo para confirmacin y aislamiento. Igualmente, como en el agua de alberca efectu las siembras. RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES Bibliografa: Huizinga, W.H. and G L McLaughlin (1990). Thermal ecology of Naegleria fowleri from a power plant cooling reservoir. Appl Environ Microbiol. July; 56 (7): 2200 2205. Muoz, V., H. Reyes, P. Toche, C. Carcamo y B. Gottlieb (2003). Aislamiento de amebas de vida libre en piscinas pblicas de Santiago de Chile. Parasitol Latinoam 58: 106 111. Woodworth, WT., D T John, and S G Bradley (1982) Biological factors affecting enflagellation of Naegleria fowleri. J Bacteriol. November; 152(2): 803 808.