UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE QUMICA
BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL - BIOQUMICA









Espectrometria de Absoro

Determinao da concentrao de leveduras em uma suspenso aquosa






Alunos:

Igor Tannuri Brando
Jorge Eduardo Dias Cruz
Nathalia Salles Vernin Babosa
Rafaela Silva do Nascimento

Turma: 04







Rio de Janeiro, 30 de agosto de 2010

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1. INTRODUO
Vrias tcnicas analticas so utilizadas diariamente na quantificao de substncias
soluo. Uma das tcnicas que mais se destacam a espectrofotometria de absoro na regio
do ultravioleta e visvel.
O equipamento utilizado nesta tcnica o espectrofotmetro, um diagrama
simplificado deste equipamento encontrado na figura 1 e suas principais partes so:
y Fonte Para emisso de radiao contnua.
y Monocromador Responsvel pela seleo de uma faixa estreita de comprimento de
onda que vai atingir a soluo.
y Cubeta Compartimento transparente a radiao, usado para posicionamento da
amostra. Geralmente confeccionado em quartzo ou vidro.
y Detector Responsvel pela medida da quantidade de radiao que atravessa a
amostra.
y Amplificador Aumenta o valor do sinal eltrico gerado no detector.
y Indicador e/ou Registrador Para visualizao do sinal geral. Atualmente muitos
instrumentos utilizam um microcomputador para manipulao e armazenagem dos dados.

Figura 1. Esquema simplificado de um espectrofotmetro ultravioleta-visvel.
1.1. Lei de Lambert-Beer
Diversas substncias quando submetidas luz ultravioleta ou visvel so capazes de
absorver essa radiao para promoo dos eltrons para camadas mais energticas. Diz-se que
os eltrons passam do estado fundamental para um estado mais excitado (maior contedo
energtico).
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Seja I
0
a intensidade de radiao emitida por uma fonte luminosa (incidente na
amostra).
Seja I a intensidade de energia resultante aps passagem pela substncia (energia no
absorvida).
Define-se como transmitncia (T), a razo entre a intensidade de energia no absorvida
e a intensidade de energia incidente na amostra.



A transmitncia varia entre 0 e 1 (ou 0 e 100, quando em notao percentual) e, como
se pode observar, trata-se da medida da quantidade de energia que no absorvida pela
amostra.
Outra forma de comparar a intensidade do feixe incidente com a intensidade do feixe
transmitido atravs da absorvncia (A). A absorvncia est matematicamente relacionada
com a transmitncia atravs da expresso:



A absorvncia de uma soluo diretamente proporcional a sua concentrao (c) e ao
caminho ptico (b) que contm a amostra (comprimento da cubeta). Essa relao conhecida
como Lei de Lambert-Beer, em homenagem aos cientistas que estudaram esse fenmeno.



A constante de proporcionalidade (a) denominada coeficiente de absortividade.
Quando a concentrao dada em mol.L
-1
e o comprimento da clula em centmetro esta
constante chamada de absortividade molar () e especfica para cada substncia, variando
a cada comprimento de onda, podendo ser encontrada tabelada em manuais e compndios.
Uma limitao da Lei de Lambert-Beer notada em relao concentrao das
solues empregadas. Como se pode observar a concentrao possui uma relao linear com a
absorvncia, no entanto, verifica-se, experimentalmente, que solues muito concentradas
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apresentam desvios de linearidade, enquanto solues muito diludas, devido a rudos de
fundo do prprio equipamento, perdem a exatido e a repetitividade das medies. Existe,
portanto, uma concentrao mnima e mxima onde linearidade pode ser empregada. Esta
faixa, uma vez estabelecida, denominada de faixa de trabalho.
1.2. Curva Analtica
Conforme descrito, a Lei de Lambert-Beer relaciona linearmente a absorvncia com a
concentrao. No entanto, para sua utilizao em anlises quantitativas necessrio obter
experimentalmente esta relao. Para isso, prepara-se uma srie de solues de concentraes
conhecidas (solues padro), podendo ou no haver replicatas e, aps ajuste do equipamento
para o zero e o 100% de transmitncia, faz-se as leituras das absorvncias dessas solues e
calcula-se a equao da reta que rege a relao.
Geralmente, utiliza-se o mtodo dos mnimos quadrados para o clculo dos
coeficientes angular e linear da reta. E clculos adicionais servem para calcular as incertezas
associadas a cada um desses coeficientes.
Alm de obter a equao, importante observar nvel da relao linear entre as duas
variveis atravs do coeficiente de correlao (r). O valor deste coeficiente prximo a -1 ou a
1 um indicativo de linearidade.
Um valor derivado do coeficiente de correlao chamado coeficiente de
determinao e obtido elevando-se r ao quadrado (r
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). Este coeficiente, quando multiplicado
por 100, indica o percentual de valores de y que podem ser explicados pelos valores de x.
As equaes estatsticas para os clculos dos coeficientes angular, linear e correlao
so bastante complexas, porm existem uma srie de programas estatsticos que facilitam o
clculo e so normalmente utilizados para este fim em substituio ao clculo manual.
2. OBJETIVO
Familiarizao com uso do espectrofotmetro ultravioleta-visvel, atravs da
elaborao de uma curva padro para determinao da concentrao de leveduras em uma
suspenso aquosa.

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3. MATERIAIS E MTODOS
3.1. Materiais
y Bales volumtricos dos seguintes volumes: 50, 100, 200, 250 e 500 mL.
y Pipetas graduadas de 1 mL.
3.2. Reagentes e Solues
y Suspenso aquosa de levedura na concentrao de 150 g/L (Saccharomyces
cerevisiae).
y Suspenso aquosa de levedura de concentrao desconhecida Soluo A.
y Suspenso aquosa de levedura de concentrao desconhecida Soluo B.
y gua destilada.
3.3. Instrumentao
y Espectrofotmetro Biospectro - Modelo SP-22.
y Cubeta de 1 cm.

3.4. Parte Experimental
Empregando-se pipetas graduadas, transferiu-se um mililitro da suspenso aquosa de
levedura, recentemente homogeneizada, para cada um dos bales volumtricos (50, 100, 200,
250 e 500 mL) e avolumou-se com gua destilada. Rotulou-se devidamente as solues para
preparo da curva analtica.
No espectrofotmetro, selecionou-se o comprimento de onda correspondente a 570
nm.
Utilizando-se de uma barreira luminosa e de uma cubeta com gua destilada, ajustou-
se o equipamento para os valores correspondentes ao zero de transmitncia e zero de
absorvncia, respectivamente.
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Fez-se as leituras de absorvncias das suspenses de levedura para o preparo da curva
padro, bem como das solues de concentrao desconhecidas (soluo A e soluo B).
4. RESULTADOS E DISCUSSO
Os resultados experimentais para confeco da curva padro esto apresentados na
Tabela 1.
Tabela 1. Absorvncias obtidas para as solues de calibrao.
Concentrao (g/L) Absorvncia
0,00 0,000
0,30 0,147
0,60* 0,365
0,75 0,361
1,50 0,639
3,00 1,101

O resultado de absorvncia encontrado para a concentrao de 0,6 g/L no seguiu a
tendncia normal de crescimento linear esperado e encontra-se muito prximo do valor
correspondente a concentrao de 0,75 g/L. Isso foi resultado da utilizao de um balo
volumtrico sem identificao de volume e portanto foi desprezado para confeco da curva
padro, apresentada no grfico 1.


Grfico 1. Curva padro para determinao da concentrao de leveduras numa suspenso aquosa.

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Logo

(Equao 1)

Observando a incerteza associada ao coeficiente linear, pode-se concluir que a origem
(0,0) dos possveis coeficientes desta reta e que forar a passagem da reta pela origem no
ocasiona alterao significativa nos resultados (grfico2).


Grfico 2. Curva padro para determinao da concentrao de leveduras numa suspenso aquosa, passando
pela origem.


(Equao 2)

Como a cubeta utilizada foi de 1 cm, pode-se concluir que o coeficiente angular
corresponde, numericamente, ao coeficiente de absoro da levedura.

Coeiciente ue absoio L cm

y = 0.3845x
R = 0.9831
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
A
b
s
o
r
v

n
c
i
a

e
m

5
7
0

n
m
Concentrao de levedura (g/L)
7



Uma vez estabelecida a equao da curva de calibrao, substituiu-se os valores de
absorvncia obtidos para as solues de concentrao desconhecida (A e B) na equao. A
tabela 2 apresenta os resultados j calculados, utilizando-se das duas equaes (passando ou
no pela origem)

Tabela 2. Absorvncias e concentraes obtidas para as solues A e B.
Amostra Absorvncia Concentrao (g/L)
Equao 1
Concentrao (g/L)
Equao 2
Soluo A 0,539 1,4 1,4
Soluo B 0,855 2,2 2,2
5. CONCLUSO
A espectrometria de absoro ultravioleta e visvel, que tem ampla aplicao na
determinao quantitativa de uma grande variedade de espcies inorgnicas e orgnicas,
tambm serve como ferramenta analtica para a bioqumica e microbiologia, podendo ser
utilizada para investigao de uma srie de experimentos nessas reas.

6. REFERNCIAS

MONTGOMERY, D.C.; RUNGER, G.C. Estatstica Aplicada e Probabilidade para
Engenheiros. 2.ed. Rio de Janeiro: LTC, 2003.

SKOOG, D. A.; HOLLE, F. J.; NIEMAN, T. A. Princpios de Anlise Instrumental 5. ed.
Porto Alegre: Bookman, 2002.