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Les allergnes recombinants aident comprendre les bases molculaires : des ractions croises entre allergnes inhals et allergnes

s alimentaires. Bet v 1 et Mal d 1, Pru a v1, Api g 1, Dau c 1, Pyr c 1 Cor a 1, Sam m 2, Ara h 8, Pru a r1 Bet v 2 et Cor a 2, Lit c 2, Ly e 1, Ara h 5, Gly m 3, Api g 4, Pyr c 4, Pru a v4, Ana c 1, Pru p 4 Cap a 2, Mal d 4 Bet v 6 Pyr c 5 Art v 3 Pru p 3 Ractions croises potentielles entre les composants molculaires du pollen de bouleau et diffrents allergnes alimentaires. Bet v 1 Mal d 1 (pomme) Pru av 1 (cerise) Api g 1 (cleri) Dau c 1 (carotte) Pyr c 1 (poire) Cor a 1 (noisette) Sam m 2 (soja) Ara h 8 (arachide) Pru a r 1 (abricot) Bet v 2 Cor a 1 (noisette) Lit c 1 (litchi) Lyc e 1 (tomate) Ara h 5 (arachide) Gly m 3 (soja) Api g 4 (cleri) Pyr c 4 (poire) Pru av 4 (cerise) Pru p 4 (pche) Cap a 2 (piment) Mal d 4 (pomme) Ana c 1 (ananas) Bet v 6 Pyr c 5 (poire) Au cours des deux dernires dcades, les progrs concernant les connaissances molculaires des allergnes ont t considrables. En 1988, der p1, un allergne majeur des acariens, fut le premier allergne clon. Depuis, un grand nombre d'allergnes ont t produits sou forme de protines recombinantes, issus de systmes d'expression varis : systme procaryote bactrien (Escherichia Coli), levures (Pischia pastoris), cellules d'insectes ou cellules vgtales. I) Rappels sur la raction allergique et les allergnes La raction allergique de type I, encore nomme hypersensibilit mfie par les IgE, survient aprs le contact entre un patient atopique et un allergne. L'antigne allergnique qui est capt par les cellules prsentatrices d'antigne (cellules dendritiques essentiellement) est dgrad en peptides qui participent une activation des lymphocytes T. A leur tour, ils vont stimuler les lymphocytes B qui, une fois activs vont se transformer en plasmocytes scrteurs d'IgE. Les IgE (immunoglobuline 5 domaines) comportent deux chanes lourdes et deux chanes lgres, ayant chacune une partie constante et une parties variable. Ce sont les parties variables des deux chanes qui constituent le para tope. Le para tope reconnat l'antigne au niveau d'un pitrope (pitrope B). Cette surface de contact est de 650 900 A. les IgE produites se fixent par leur fragment FC (partie constante des chanes lourdes) sur les basophiles circulants et sur les mastocytes tissulaires. La peau, riche en mastocytes tissulaires, permettra la rvlation d'IgE spcifiques membranaires lors de la pratique des tests cutans raliss par intradermoractions ou prick-tests. En effet, le deuxime contact avec l'allergne, chez un patient pralablement sensibilis (par voie inhale, digestive ou

cutane), permet le dclenchement d'une raction allergique en 15 20 minutes aprs activation des rcepteurs IgE et libration par les basophiles et les mastocytes de mdiateurs prforms telle que l'histamine, et de mdiateurs noforms (leucotrines, prostaglandines). On distingue l'heure actuelle : Les sources ou producteurs d'allergnes tels que les aliments, les pollens, les acariens, les mammifres.. Les extraits allergniques obtenus par extraction d'une matire premire qui constitue la source des allergnes (par exemple le milieu de culture des acariens, les pollens) L'allergne ou molcule allergnique (protine, glycoprotine), nomm selon une nomenclature internationale : les trois premires lettres sont celles du taxon, puis suit la premire lettre du genre L'pitrope B qui est reconnu par le para tope : il constitue une partie de la molcule allergnique (ensemble d'acides amins). On distingue les pitropes linaires (succession d'acides amins) et les pitropes conformationnels (regroupement d'acides amins en fonction de leur configuration dans l'espace, directement li la structure tridimensionnelle de la molcule d'allergne) Diffrentes molcules allergniques peuvent avoir des pitropes en commun, ce qui constitue le support molculaire des ractions croises. Des molcules ayant plus de 50% d'homologie de squences des acides amins sont souvent responsables d'allergies croises. Mais c'est le degr de similarit des pitropes conformationnels (exposs la surface de la molcule) qui est prdominant par rapport au degr de similarit des squences d'acides amins (pitropes linaires). Par exemple, l'homologie de squences entre l'allergne majeur du bouleau (Bet v la) et l'allergne majeur de la pomme (Mald 1) est de 56%, mais l'homologie des pitropes exposs (ou conformationnels) est de 71% Parmi les sources allergniques on peut distinguer des systmes multi allergniques (par exemple le pollen de gramines : 13 allergnes identifis, le pollen d'olaces : 11 allergnes identifis) et des systmes pauci allergniques (le chat : 4 allergnes identifis, le pollen de paritaire : 3 allergnes identifis). A la notion du nombre de composants molculaires issus d'une source allergnique viennent s'ajouter deux autres caractristiques : d'une part la frquence des sensibilisation observes dans la population allergique qu permet de distinguer les allergnes dits mineurs et majeurs (une molcule reconnue par les IgE d'au moins 50% des patients est un allergne majeur), d'autre part, la contribution des IgE spcifiques diriges contre ces molcules allergniques au taux d'IgE spcifiques diriges contre l'extrait global. Ainsi, deux allergnes majeurs des acariens (Der p1 et Der p 2) induisent au moins 5 fois plus d'IgE anti-acariens que l'ensemble des allergnes mineurs. L'valuation de cette rponse IgE se fait par le dosage des IgE diriges contre les molcules allergniques individuelles (une trentaine de dosages sont possibles in vitro), ainsi que par des techniques d'inhibition (inhibition des IgE diriges contre l'extrait global par les molcules allergniques) II) Extraits allergniques et allergnes recombinants Les extraits allergniques dfinis prcdemment sont utiliss actuellement pour le diagnostic et les traitements de dsensibilisation. Ils contiennent un mlange complexe de molcules allergniques

et non allergniques. Leur teneur en molcules allergniques dpend du choix de la matire premire, des procds d'extraction, de purification et de stockage utiliss. Certains allergnes sont labiles, ou ne rsistent pas aux procds utiliss pour leur prparation sous forme d'extrait commercial, ce qui concerne surtout les allergnes alimentaires d'origine vgtale. Les extraits allergniques ont bnfici de processus industriels de fabrication automatiss, de mthodes de standardisation, et plus rcemment, pour les extraits utiliss frquemment, de dosage de leur contenu en allergnes majeurs. Cependant, plusieurs tudes ont montr des variations du contenu en molcules allergniques dans des extraits commerciaux ayant la mme dnomination en poids/volume Les extraits naturels purifis comprennent variants molculaires (iso formes) et sont souvent des molcules protiques glycosides. Leur purification exige d'avoir des matires premires en quantit et qualit adquates. Les processus d'extraction et de purification ayant de faibles rendements, leur production grande chelle ne pourrait tre envisage. Ils sont nanmoins la base des connaissances molculaires et immunochimies des allergnes. Il est vident que les molcules allergniques produites sous forme recombinante devront toujours tre values par rapport aux allergnes naturels purifis correspondants. Les allergnes recombinants sont produits dans des systmes d'expression varis (systmes procaryotes bactriens (Escherichia Coli), levures (Pischia Pastoris, S. cerevisiae), des cellules d'insectes ou des cellules vgtales (plants de tabac)). Ils correspondent un variant molculaire prcis. Les systmes d'expression bactriens ne permettent pas la glycosilation post-traductionnelle des polypeptides, ce qui pourtant peut jouer un rle majeur dans l'acquisition de la structure tridimensionnelle dfinitive de la molcule d'allergne. Les tudes in vitro ralises chez l'homme ont eu pour but de prouver la capacit des allergnes recombinants induire des tests cutans positifs, stimuler les organes cibles (test de provocation oculaire, nasale et bronchique). Les concentrations d'allergnes recombinants donnant des ractions positives aux pricks tests se situent entre 1 et 100 ug/ml selon les protines recombinantes testes dans diverses tudes cliniques, et entre 10- ug/ml et 10 ug/ml lorsque les tests sont effectus par des intradermoractions. Les tests cellulaires (histaminolibration, activation des basophiles en cytomtrie de flux) ont galement confirm l'activit biologique des allergnes recombinants. Au plan pratique, seuls les dosages des IgE spcifiques vis--vis d'une trentaine d'allergnes recombinants sont actuellement disponibles. Les allergologues ne disposent pas pour l'instant d'allergnes recombinants, ni pour les tests cutans, ni pour les tests de provocation. Seules les directives europennes pourront dfinir la rglementation de la production d'allergnes recombinants pour l'usage in vivo. Ds prsent il faut souligner qu'un des avantages majeurs des allergnes recombinants est l'obtention de prparations ayant des qualits pharmaceutiques constantes III) Application au diagnostic allergologique 1) amlioration des extraits utiliss pour le diagnostic Les allergnes naturels purifis ainsi que les allergnes recombinants ont permis d'obtenir des anticorps monoclonaux ou poly clonaux spcifiques qui peuvent tre utiliss pour quantifier le contenu en allergne majeur des extraits allergniques actuels Les extraits allergniques utiliss pour le diagnostic devraient contenir toutes les

molcules allergniques auxquelles le patient est expos dans son environnement lorsqu'il s'agit de pneumallergnes, ou mises en contact avec ses muqueuses digestives lorsqu'il s'agit de trophallergnes (allergnes alimentaires). Un cocktail rassemblant toutes les molcules allergniques provenant des acariens, ou toutes les molcules provenant des squames, pithlial, urines de mammifres, permettrait d'avoir des mthodes diagnostiques plus pertinentes. Ainsi, dans les extraits d'acariens, certains allergnes mineurs sont peu ou pas reprsents. Pour les sources d'allergnes alimentaires il a t dmontr que certaines espces vgtales comestibles ont des contenues en allergnes majeurs variables, nettement plus importants selon le degr de maturation ou selon l'espce considre. Un exemple prcis est fourni par les pommes, plus riches en allergnes majeur Mal d 1 lorsqu'elles sont de maturit avance ou si elles appartiennent aux espces Golden ou Granny Smith 2) Amlioration du diagnostic positif des allergies : Pour les sources allergniques, frquemment responsables de raction allergiques, l'utilisation de molcules recombinantes correspondant des marqueurs spcifiques pourrait amliorer la qualit du diagnostic. On admet que les extraits provenant de dix sources importantes d'allergnes dans une rgion gographique donne permettent de porter le diagnostic de plus de 80% des sensibilisations aux pneumallergnes. Dans le tableau I , les molcules allergniques spcifiques de quelques sources d'allergnes particulirement frquentes sont indiques. Pour les sources allergniques plus rares pour lesquels l'obtention d'extraits est difficile, l'utilisation de molcules recombinantes correspondant des marqueurs spcifiques, rendrait le diagnostic plus sr. Ainsi dans les ractions anaphylactiques svres induites par des piqres de tiques de pigeon (Argas reflex us) la dtection des IgE spcifiques vis--vis d'Arg r 1 s'est rvle tre une mthode diagnostique trs fiable 3) Dtermination des profils de sensibilisation des patients (spectrotypes) avec quantification des IgE spcifiques diriges contre les composants molculaires Un test cutan positif ou la dtection d'IgE spcifiques vis--vis d'un extrait allergnique classique, mme standardis, indique que le patient est sensibilis au moins une des molcules allergniques prsentes dans cet extraits. L'utilisation d'allergnes recombinants ou de molcules d'allergnes naturels purifis, permettra de distinguer, parmi les IgE spcifique poly clonales diriges contre l'estrait allergnique classique, les anticorps IgE spcifique d'un composant molculaire dfini. Ils permettent ainsi d'tablir pour chaque patient le spectre des spcificits des IgE. La dtermination des spectrotypes de reconnaissance des IgE permet d'optimiser la slection des patients en vue d'une immunothrapie spcifique en choisissant le compos molculaire le plus pertinent, en cartant les patients poly sensibiliss qui souvent ne bnficient pas du traitement de dsensibilisation. La concentration des IgE spcifiques et des IgE spcifiques peut galement tre suivie au cours de l'immunothrapie Le tableau IIA montre le spectrotype d'un patient ayant surtout dvelopp des IgE spcifiques vis--vis des allergnes majeurs 1 et 2, et des quantits plus faibles vis-vis de l'allergne majeur 3 et de l'ensemble des allergnes mineurs. En parallle, le tableau IIB indique la rpartition des molcules allergniques dans un extrait global.

Les rsultats sont exprims en pourcentage de la totalit des protines allergniques prsentes dans l'extrait. Un allergne fortement reprsent dans une source allergnique pourra donc plus facilement sensibiliser les patients Un patient peut ventuellement n'tre sensibilis qu' un allergne mineur. Les mesures quantitatives des IgE spcifique par la technique d'immunocap permettent d'identifier parmi le rpertoire des IgE spcifiques celles qui traduisent une rponse IgE trs prononce, ce qui statistiquement est plus en faveur d'une pertinence clinique 4) Application aux tudes pidmiologiques La sensibilisation d'un individu vis--vis d'un composant molculaire dfini dpend la fois du terrain gntique et des spcificits environnementales. Ainsi, les prvalences des sensibilisations observes vis--vis des principales molcules allergniques du pollen de gramines peuvent varier de 65 95% selon les continents. Pour l'olivier, des diffrences de prvalence de sensibilisation certains composants molculaires sont lie sa culture intense dans certaines rgions. Les diffrences Nord-Sud sont trs marques pour certains allergnes alimentaires : elles s'expliquent par des sensibilisations prfrentielles des composants molculaires tels que les lipotransfrases (LTP) responsable de ractions anaphylactiques svres certains fruits : dans le sud les pches, alors que dans le nord et l'est de l'europe, la sensibilisation sous forme de syndrome oral la pomme s'explique par l'important prvalence de sensibilisation Bet v 1 en cas de pollinose au bouleau 5) Apport aux bases molculaires des ractions croises L'homologie entre les composants molculaires issus de diffrentes espces peut tre trs importante : pour les gramines on observe une quasi identit des allergnes produits par les diffrentes espces. Dans d'autres cas, des composants molculaires ayant de fortes homologies sont prsents dans des espces loignes sur le plan taxonomique, c'est--dire appartement des classes botaniques diffrentes (par exemple les pollens provenant des gramines et ceux provenant des arbres) ; ils sont alors responsables de tests simultanment positifs, ces familles molculaires sont communment appeles allergnes croissants, responsables de sensibilisations croises (IgE et tests cutans simultanment positifs), et parfois d'allergies croises (symptomatologie clinique induite par les deux sources d'allergnes) La figure 1 montre quelques exemples typiques de communauts pi topiques complets ou partiels. Certains composants molculaires, comme les profilines ou les protines liant le calcium sont parfois considrs comme des pans allergnes car ils peuvent tre issus de sources allergniques trs varies, avec un pourcentage d'homologie structurale pourtant trs lev. Les allergies croises sont ont t identifies initialement par les cliniciens (cas cliniques isols, identification de groupements de co-sensibilisations ou de co-allergies) avant les identifications des composants molculaires des allergnes. Les syndromes les plus connus sont : le syndrome bouleau - pomme- noisette (Bet v1), Bouleau - ombellifre - carotte (Bet v1), Armoise - cleri - pices (Bet v 1 et profiline), le syndrome latex - avocat - kiwi - chtaigne - banane (Hvamine, profiline, chitinase),

le syndrome porc - chat (albumine), le syndrome uf - oiseau (a-livetine), le syndrome acarien - escargot - crevette (tropomyosine et autres molcules) Les progrs de la biologie molculaire ont certes permis de mieux comprendre les ractions croises entre allergnes inhals, entre allergnes alimentaires mais aussi entre allergnes inhals et allergnes alimentaires. Nanmoins, une complexit de plus en plus grande est apparue : l'ventail largi des composants molculaires connus d'une source d'allergnes augmente en effet le nombre de supports molculaires potentiels de nouvelles ractions croises. Le tableau III montre les ractions croises potentielles entre les composants molculaires du pollen de bouleau (Bet v 1, Bet v 2, Bet v 6) et diffrents allergnes alimentaires IV) application la prise en charge diagnostique et thrapeutique 1) meilleure interprtation des poly sensibilisations diagnostiques par les tests cutans ou le dosage d'IgE spcifiques Les sensibilisations multiples sont frquentes chez le sujet atopique et elles ne sont pas toujours pertinentes sur le plan clinique. Certaines peuvent s'expliquer par le biais d'allergnes croisant (voir ci-dessus) : par exemple les molcules Bet v 1 like prsentes dans tous les pollens de fagales (bouleau, noisetier, aulne, charme, chne), dans les fruits de la famille des rosaces (pomme, cerise, pche, etc), les pan allergnes comme les profilines, les protines liant le calcium, les tropomyosines, les albumines L'absence d'expression clinique de certaines sensibilisations explique les difficults rencontres lors de l'interprtation des examens complmentaires en allergologie 2) interprtation de ractions d'hypersensibilit sans contact sensibilisant pralable Le composant molculaire dclenchant la raction allergique peut en effet avoir sensibilis le sujet allergique par l'intermdiaire d'une autre source allergnique. Des observations de ractions anaphylactiques svres survenant lors de la premire consommation d'escargots chez des sujets sensibiliss aux acariens ont t dcrites 3) tableaux cliniques vocateurs de sensibilisation des molcules d'allergnes spcifiques On observe des ractions anaphylactiques svres chez 20 30% des patients sensibiliss aux LTP dans l'allergie aux fruits, des sensibilisations concomitantes certains composants molculaires de l'arachide en cas de raction grave. Les enfants allergiques au bl prsentent une anaphylaxie l'effort, reconnaissent l'omega-5-gliadine 4) reconnaissance de certains composants molculaires spcifiques selon le mode de sensibilisation Ceci a t pour l'allergie au latex chez les enfants atteints de spina bifida sensibiliss par des interventions chirurgicales itratives, qui ne reconnaissent pas les mmes composants molculaires que le personnel de sant prsentant une allergie au latex d'origine professionnelle 5) consquences envisageables pour le futur de l'immunothrapie Les dsensibilisations devraient tre mieux cibles, bases sur le spectrotype des IgE de chaque patient, ce qui est galement dsign par les termes de componentresolved-immunothrapy. Ceci permettrait de privilgier dans les indications de

l'immunothrapie les sujets mono sensibiliss et pauci sensibiliss. Certains extraits actuels pourraient tre remplacs par une seule molcule recombinante : titre d'exemple rBet v 1 pour les pollens de fagales, rFel d 1 pour le chat, la frquence des mono sensibilisation ces deux allergnes majeurs ayant t dmontre dans des sries incluant de nombreux patients. On viterait ainsi l'injection de protines non allergniques, de protines auxquelles le patient n'est pas sensibilis, ainsi que d'autres composants non souhaitables comme les endotoxines. On viterait galement le risque de contamination virale lors de l'utilisation de matire premire d'origine animale. La dose d'allergne injecte pourrait tre rellement quantifie. Pour d'autres allergnes (acariens, gramines) un cocktail de molcules allergniques serait souhaitable car plusieurs allergnes majeurs sont produits par ces sources allergniques. Des rsultats significatifs par rapport au placebo ont t obtenus rcemment chez des patients allergiques aux gramines et traits par un mlange de molcules recombinantes de gramines, et chez des patients allergiques au bouleau et traits par l'allergnes recombinant rBet v 1. de nombreux travaux de recherche sont actuellement raliser pour obtenir des molcules hypoallergniques, rduisant la capacit des allergnes recombinants se lier avec les IgE tout en conservant leur capacit stimuler les cellules T : molcules avec dltion ou mutation ponctuelle pour modifier les pitropes B, polymres ou fragments d'allergnes, molcules recombinantes conjugues avec un compos ayant une action co-stimulatrice. La slection de telles molcules serait intressante pour diminuer le risque d'effects secondaires qui peuvent survenir au cours de l'immunothrapie. Cependant, seuls des essais cliniques contrls, effectus selon les bonnes pratiques de la dsensibilisation, permettront de confirmer leur intrt dans le futur. En conclusion, il est indiscutable que les apports de la biologie molculaire ont chang la prise en charge de l'allergie. Face au patient, l'allergologue peut ds prsent, au vu des nombreuses connaissances acquises ces 15 dernires annes, modifier son raisonnement et apporter de nouvelles interprtations aux rsultats des examens complmentaires. Il dispose de nouveaux outils pour le diagnostic in vitro qui pour l'instant se limite la dtermination des IgE spcifiques d'une trentaine de composants molculaires dfinis. La technique des micros chips nous promet pour un futur proche la dtection simultane de prs de 5000 allergnes et pitropes diffrents. Cependant, l'expertise des cliniciens restera essentielle pour confirmer la pertinence clinique des sensibilisations dtectes Lexique : Atopie : terrain gntique prdisposant la scrtion d'IgE vis--vis des allergnes de l'environnement et des trophallergnes Prick-test : test le plus frquemment utilis pour dtecter les allergies IgE mdies. Il consiste piquer l'aide d'une lancette travers une goutte d'extrait d'allergne applique au niveau de la peau de l'avant-bras. La survenue d'un rythme et d'une papule est value 15 20 minutes plus tard Test cutan par intradermoraction : l'intradermoraction consiste injecter l'aide d'une seringue tuberculine 0.02 0.05 ml d'une solution dilue de l'allergne en intradermique

Allergne majeur : allergne induisant une rponse IgE chez plus de 50% des sujets allergiques un extrait allergnique tel que le pollen, les acariens Allergne mineur : allergne induisant une rponse IgE chez moins de 50% des sujets allergiques un extrait allergnique tel que le pollen, les acariens Bibliographie : 1. Pauli G. Evolution in the understanding of cross-reactivities of respiratory allergens : the role of recombinant allergens. Int Arch Alergy Immunol, 2000 ; 123 : 183-195 2. Linhart B, Valenta R. Molecular design. Of allergy vaccines. Current opinion in immunology 2005 ; 17 : 646-655 3. Mothes N, Valenta R, Spitzauer S. allergy testing : the role of recombinant allergens. Clin Chem Lab Med 2006 ; 44 : 125-132 4. Pauli G, Metz-Favre C, Fontaine JF. Allergnes alimentaires croisant avec les allergnes des pollens. Rev Fr Allergol Immunol Clin, 2006, 46 ; 153-157 5. Pauli G. les allergnes recombinants : leur apport l'allergologie en 2006. Rev Fr Allergol 2007 (sous presse) 6. Pauli G. Allergnes recombinants et immunothrapie. Rev Fr Allergol 2007 (sous presse) 7. Allergnes et ITS. Publication du laboratoire Stallergnes 2002 8. Native and recombinant allergen components. H. Steinmann, S. Ruben. Allergy Resources International. Phadia AB 2006, 88 pages Tableau I : Marqueurs de sources allergniques frquences Pollens de gramines : r Phl p1 R Phl p13 Pollens de fagales : r Bet v1 Pollens d'olaces : r Fra e1 R Ole e 1 Acariens : r Der p1 R Der f1 Moisissures : r Alt a1 Allergnes de mammifres : r Can f1