Instituto Politecnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas Departamento de Bioquimica Alunmnos: Gmez De La Luz Samara Amaris, Lpez

Castro Eduardo. Grupo 4QM2 Seccin: 3 Practica N 3 Precipitacion, separacion y punto isoelectrico de las proteinas.

Introduccin PUNTO ISOELECTRICO Todas las macromolculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una caracterstica de las protenas y otros biopolmeros es que la carga total que adquieren depende del pH del medio. As, todas las protenas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminocidos que la componen, as como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la protena de forma covalente (irreversible). Debido a la composicin en aminocidos de la protena, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catinicos, neutros y aninicos. Cualquier protena tendra una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente cido debido a que los grupos COOH de los aminocidos asprtico y glutmico estaran en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lysina estaran protonados (-NH3+). De igual forma si la protena se encuentra en un medio con un pH muy alto estara cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estaran desprotonados(COO-) y los grupos amino estaran en su forma neutra (NH2). De lo anterior se deduce que las protenas tienen un pH caracterstico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoelctrico (pI). En el punto isoelctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la protena presenta su mxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregacin. Si suponemos una protena formada nicamente por aminocidos sin grupos laterales ionizables la carga neta de la protena dependera exclusivamente de la protonacin /desprotonacin de los grupos amino y carboxilo terminal. En la realidad las protenas estn formadas por multitud de aminocidos unidos mediante enlaces peptdicos y la carga va a depender de los grupos ionizables que poseen los aminocidos que la componen (anexo I) y del pH del medio. Objetivos
El alumno observara el efecto que producen algunos agentes fisicoqumicos sobre la solubilidad de las protenas.

El alumno determinar el punto isoelctrico de la insulina, basndose en sus propiedades de solubilidad a diferentes valores de pH.

Fundamento y Precipitacin:

El agua es el disolvente biolgico por excelencia. En disolucin acuosa, los residuos hidrofbicos de las protenas se acumulan en el interior de la estructura, mientras que en la superficie aparecen diversos grupos con carga elctrica, en funcin del pH del medio. En torno a los grupos cargados, los dipolos del agua se orientan conforme a la carga elctrica de cada grupo, de tal manera que la protena presenta una capa de solvatacin formada por el agua de hidratacin, que es el agua retenida por las cargas elctricas de la superficie de las protenas. Cualquier factor que modifique la interaccin de la protena con el disolvente disminuir su estabilidad en disolucin y provocar la precipitacin. As, la desaparicin total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralizacin de las cargas elctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrgeno facilitarn la agregacin intermolecular y provocar la precipitacin. La precipitacin suele ser consecuencia del fenmeno llamado desnaturalizacin. y Capacidad amortiguadora:

Esta propiedad se debe a la existencia de: Grupos ionizables de las cadenas laterales de los aminocidos Asp, Glu, Lys, Arg, His, Tyr, Cys. Grupos COOH y NH2 terminales. Por este motivo, las protenas poseen un considerable poder amortiguador en una amplia zona de pH. Aunque cada AA tiene unos grupos ionizables con unas constantes de ionizacin (pKa) caractersticas, el valor de dichas constantes puede verse ligeramente modificado por el entorno proteico. El grupo imidazol del AA histidina es el principal responsable del poder amortiguador de las protenas a pH fisiolgico, ya que su pKa est prximo a 7.

Punto isoelctrico:

Tabla de Resultados de Precipitacin por metales pesados Reactivo Cloruro Mercrico Nitrato de Plata Acetato de Plomo Cloruro de Bario Cloruro de Sodio Agua Observaciones Blanco turbio y precipita Blanco turbio y precipita Sobrenadante translucido y pp blanco Muy poco (Pequeos cogulos) No hubo pp Lquido traslucido No precipito

Cuando el pH es bajo, los grupos ionizables estn protonados, y la carga neta de la protena es de signo positivo. Cuando el pH es alto, los grupos ionizables estn desprotonados, y la carga neta es de signo negativo. Entre ambas zonas, habr un pH en el cual la carga neta de la protena es nula. Es el pH isoelctrico o punto isoelctrico, y es caracterstico de cada protena. A valores de pH por debajo del pH isoelctrico la carga neta de la protena es positiva, y a valores de pH por encima del pH isoelctrico, la carga neta de la protena es negativa. La mayora de las protenas intracelulares tienen carga negativa, ya que su pH isoelctrico es menor que el pH fisiolgico (que est prximo a 7). Se llaman protenas cidas a aquellas que tienen un punto isoelctrico bajo (como la pepsina), y protenas bsicas a las que tienen un punto isoelctrico alto (como las histonas). Resultados Tabla de Resultados (Salting Out) Biuret (+) Violeta (+) Violeta (-) Azul (-)Azul Interpretacin Aun presenta protenas Ya que es pp de protenas Ya no hay protenas Ya no hay protenas

Tabla de Resultados Determinacin del punto isoelctrico de la Insulina Vase en Tabla 1.2 Interpretacin y Conclusiones de Reaccin Discusin Conclusiones Bibliografa http://www.freelibros.com/2009/06/lehninger-principios-enbioquimica-4ta-edicion.html

Filtrado 1 Precipitacin1 Filtrado 2 Precipitacin 2

http://www.ehu.es/biomoleculas/proteinas/prot2.htm http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/bi otec_FQbiomol/Practica3FQB.pdf

Tabla de Resultados precipitacin por efecto del pH y de solventes

Tubo # Clara de Huevo filtrada, dil1:3 (ml) HCL 0.1 (ml) NaOH 0.1 (ml) Regulador de acetatos 0.1 M pH 4.7 (ml) Observaciones Etanol 96 (ml) 1 3.0 1.0 Se torna blanco opaco con residuos en la pared 3.0 El lquido es blanco homogneo 2 3.0 1.0 3 3.0 1.0 Se torna blanco opaco con pp 3.0 Blanco con grumos o coagulac iones

Preguntas Extras

Se transparenta 3.0

Observaciones

Permaneci transparente