9.

MICROBIOLOGIA
9.1 Introduo A microbiologia tem por objetivo o estudo de seres microscpicos, que so algas, bactrias, fungos, protozorios e tambm seres acelulares como vrus e prons. Os micrbios causam grande averso nas pessoas, pois so associados, na maioria das vezes, a doenas, mas somente cinco por cento destes seres so patolgicos, o restante participa da renovao da matria orgnica no ambiente, formam a microbiota dos animais, fixao do nitrognio no solo, fermentao de queijos e bebidas, po, medicamentos e produtos sintticos. Todavia, as patognicas causam prejuzos com doenas (perdas na produo) e com a deteriorao dos alimentos. Nesta seo, sero classificados estes seres, visando sua estrutura celular, alimentao, resistncia, patogenia, alm de como prevenir uma alta infeco e princpios de tcnicas de controle microbiolgico (esterilizao, antibiticos e agentes qumicos). 9.2 Bactrias As bactrias so seres procariotos, ou seja, no possui um envoltrio nuclear carioteca, por isso este se encontra desorganizado no citoplasma.

Figura 1. Clula procariota - Fonte: Wikipedia As estruturas celulares que uma bactria obrigatoriamente deve possuir so: Ncleo: fica centralizado no citoplasma e contm o cdigo gentico desta; Membrana citoplasmtica: membrana de bicamada de fosfolipdeo que a seletividade de substncias e participa de atividades metablicas da clula, como a cadeia fosforizao oxidativa (respirao); Citoplasma: meio intracelular delimitado pela membrana plasmtica, viscoso e rico em protenas; Ribossomos: sequncia 70S com a funo de sntese protica; Parede celular: uma estrutura rgida, constituda principalmente por peptidioglicano que confere forma bactria e a protege da presso osmtica evitando a lise celular. As bactrias podem assumir as seguintes formas: cocos so relativamente esfricos e se agrupam (esfilococos, em forma de cacho de uvas; estreptococos, em cadeia linear; sarcinas, em grupos compactos de oito; os diplococos (grupos de dois); bacilos so ligeiramente alongados, com

extremidades hemisfricas, podendo dispor ou no de flagelos; vibries so encurvados, em forma de arco ou de vrgula, com um flagelo numa das extremidades; e, espiroquetas que so alongadas e helicoidais, podendo dispor de vrios flagelos.

Figura 2 - Formato das bactrias. a: cocos; b: bacilos; c: espiroquetas; d: vibries. Fonte: http://www.dbio.uevora.pt/jaraujo/biocel/celulas.procarioticas.htm Tais estruturas permitem que as bactrias tenham, na maioria das vezes, vida independente de um hospedeiro, podendo sobreviver no ambiente, diferentemente dos vrus que dependem de um hospedeiro.
DNA => RNA => RIBOSSOMO => SNTESE PROTICA = RECEITA VITAL DA BACTRIA

Esses microrganismos compem a microbiota normal dos animais, ou seja, a diversidade deles interna e externamente no indivduo, podendo causar danos ou no ao animal. Tais seres auxiliam no metabolismo (sntese das vitaminas) ou protegem contra agentes patognicos. Contudo, os integrantes da microbiota podem causar danos outras pessoas (transmisso) ou ao prprio hospedeiro, quando h um desequilbrio nesta microbiota e quando os microrganismos so deslocados para um nicho diferente do seu habitual (ferimento, por exemplo). As bactrias se reproduzem por fisso binria, ou seja, uma clula me origina duas clulas filhas idntica. O tempo em que isso ocorre denominado de tempo de gerao, que varia entre 20 minutos a vrias horas.

Figura 3 - Reproduo bacteriana. Fonte: http://jmelobiologia.zip.net/ a) Esporos

Alm das estruturas citadas anteriormente, algumas bactrias possuem mecanismos de resistncia contra as adversidades do meio onde se encontram, os esporos. Estes esto presentes em Gram positivas dos gneros Clostridium e Bacillus.

Figura 4. Adaptado de Angert (2005) Nature Rev. http://vsites.unb.br/ib/cel/microbiologia/divisao/divisao.html

Microbiol.,

3:214-224.

Fonte:

Os esporos surgem de uma clula vegetativa contendo dois genomas, que formaram um filamento. Aps tal processo, h um septo assimtrico que divide o protoplasto em duas partes: o protoplasto menor chamado de pr-esporo e a membrana do protoplasto invagina e engloba o pr-esporo, que contm duas membranas. Entre essas duas camadas so sintetizadas camadas de peptidioglicano modificado, formando uma camada rgida chamada crtex. Em seguida, formam-se o exosporium e a capa do esporo contendo muitas protenas. Por fim, o esporo maduro liberado por desintegrao da clula vegetativa. Ao encontrar condies favorveis sua sobrevivncia, o esporo germina (pH e temperatura timos e substrato adequado). Tal processo ocorre quando um agente traumtico danifica a capa do esporo, ativando-o. Logo aps ocorre a germinao, promovida pela entrada de gua e de substrato. O peptidioglicano cortical quebrado, permitindo a entrada de muita gua na clula viva, fazendo com que perca toda a resistncia e refrigerncia. Por ltimo, a clula comea a crescer (se reproduzir), sintetizando protenas, RNA e DNA. Os endsporos bacterianos so altamente resistentes, por isso necessria muita ateno nos processos de esterilizao e higienizao de ambientes e materiais cirrgicos. Tal estrutura est presente nos agentes etiolgicos do botulismo, ttano e gangrena gasosa. A colorao utilizada a de Schaeffer-Fulton, onde os esporos so corados com o verde de malaquita e as clulas vegetativas de vermelho. Se numa lmina forem encontradas ambas as estruturas, significa que o meio est pobre e inadequado sobrevivncia da clula bacteriana. b) Parede das bactrias Gram positivas e Gram negativas A dificuldade de visualizao das bactrias levou o fsico dinamarqus Hans Christian Gram em 1884 a desenvolver uma tcnica que as diferenciassem, que ficou conhecida com Colorao de Gram. Esta tcnica associa o cristal violeta com lugol, lcool e fucsina. Esta uma tcnica diferencial que indica as diferenas entre as paredes celulares das bactrias. A tcnica de colorao de Gram consiste em expor as clulas bacterianas seguinte sequncia:

Corante primrio cristal violeta: independentemente do tipo de clula.

cora

citoplasma

de

prpura,

Mordente lugol (lcool+iodo): aumenta a afinidade entre o cristal violeta e a clula e forma com o corante um complexo insolvel dentro da clula. Agente descolorante lcool, acetona ou ambos: solvente lipdico. Contrastante fucsina bsica: cora o citoplasma de vermelho.

Figura 5 - Bactria Gram+. Fonte: http://www.prof2000.pt/users/biologia/tcolgram.htm

Figura 6 - Bactria G-. Fonte: http://www.prof2000.pt/users/biologia/tcolgram.htm

O principal componente da parede celular das bactrias que lhes confere esta distino na colorao o peptidioglicano. um heteropolmero rgido e insolvel na gua, constitudo por cadeias lineares de dois acares aminados NAG (cido n-acetilglucosamina) e NAM (cido n-acetilmurmico) ligados entre si por ligaes glicosdicas. As cadeias lineares ligamse entre si atravs de cadeias de quatro aminocidos, formando uma rede de sustentao ao redor da bactria. Gram positivas A parede celular das Gram + formada por uma espessa e rgida camada de peptidioglicano (acar e protena) que corresponde por volta de 90% de sua composio, cidos teicicos, fosfato e um lcool-glicerol.

Figura7- Esquema da parede celular de G+. Fonte: ttp://www.prof2000.pt/users/biologia/tcolgram.htm Gram negativa A parede das bactrias Gram so mais complexas do que as positivas, possuem alm de uma pequena camada de peptidioglicano, uma membrana externa (semelhante a membrana plasmtica) e no contm cidos teicicos. O peptidioglicano liga-se covalentemente a membrana externa por uma lipoprotena e est embebido no gel periplasmtico que contm alta concentrao de enzimas degradativas e protenas de transporte. Devido menor concentrao de peptidioglicano a parede das Gram so mais suscetveis a quebras, por isso que elas se coram com o vermelho na colorao de Gram, pois ao jogar o lcool sobre elas, este dissolve a camada lipdica da bactria, que perde a cor roxa por conseqncia dessa dissoluo.

Figura8-Esquema da parede celular de G-. Fonte: http://www.prof2000.pt/users/biologia/tcolgram.htm A membrana externa constituda por uma dupla camada fosfolipdica. Encontra-se tambm o LPS (lipopolissacardeo), que se liga ao lipdeo A (endotoxina), onde est ligado a duas regies de natureza polissacardica. O lipdeo A um glicofosfolipdeo cujo papel biolgico consiste na participao nos mecanismos de patogenicidade da clula bacteriana. O LPS o maior fator de virulncia, determinando efeitos biolgicos que resultam na amplificao das reaes inflamatrias. Esta endotoxina um antgeno fraco no especfico que pobremente neutralizado por anticorpos, sendo capaz de ativar a cascata do complemento. A ativao do complemento envolve a formao de cininas, outro importante mediador da inflamao. Alm do mais, ativa plaquetas, mastcitos, basfilos e clulas endoteliais. O LPS induz os macrofgos a secretarem outras protenas, as interleucinas (IL-1, IL-6 e IL-8), fator alfa de necrose tumoral (TNF ?), oxignio reativo, nitrognio intermedirio (xido ntrico), interferon ?, ? e ?, fatores ativadores de plaquetas e prostaglandinas. Estes so fatores importantes que causam reabsores sseas nas leses periapicais. Mesmo quantidades pequenas de endotoxinas so capazes de induzir a resposta inflamatria periapical (PCORA et al. 1997).

Entre o peptidioglicano e a membrana externa existe um espao denominado de espao periplasmtico que contm alta concentrao de protenas de transporte e degradativas, sendo responsveis pela quebra de macromolculas e inativao de drogas como a betalactaneases, inativa a penicilina. b) Bactrias sem parede Mycoplasma Possuem uma parede celular complexa e constitui-se principalmente por lipdeos.

Figura9 Parede de uma BAAR. http://dc394.4shared.com/doc/SjDFnATx/preview.html

Fonte:

BORTOZOLLI,

2001

altamente resistente sendo denominada como BAAR (Bactria lcool-cido Resistente) e o agente epidemiolgico da tuberculose e lepra. e) Crescimento bacteriano O crescimento bacteriano se caracteriza pelo aumento do nmero de clulas, garantindo assim a continuidade da gerao, o tempo que leva para cada diviso ocorrer chamado de tempo de gerao e varia conforme a espcie. Este processo ocorre por meio da fisso binria, onde diversas reaes acontecem, envolvendo as transformaes de energia, biossntese de molculas pequenas e polimerizaes que resultam em: 1 CLULA- ME

DUPLICAO DO DNA

ALONGAMENTO DA CLULA ME

SEPTAO

ROMPIMENTO DA PAREDE CLULAR

2 CLULAS FILHAS

As bactrias necessitam de quatro requisitos bsicos para o seu crescimento: tenso de oxignio, substrato, temperatura e pH timos. A partir do substrato, estes seres tambm realizam a sntese de ATP para fornecerem energia a suas funes metablicas, que ocorre por meio da respirao ou fermentao. Respirao h receptores externos de eltrons (fosforilao oxidativa). Os receptores externos de eltrons classificam a bactria em anaerbia (receptor diferente de oxignio, como nitrato, sulfato, etc.) e aerbia (o receptor o oxignio). A respirao aerbia conta de trs etapas para a formao de ATP: formao de piruvato, ciclo de Krebs e cadeia respiratria. Esta forma de respirao garante um saldo de 38 ATPs. A respirao anaerbia possui um rendimento energtico inferior: nenhum aceptor alternativo apresenta potencial to oxidante quanto O 2. O uso de aceptores alternativos permite os microrganismos respirarem em ambientes sem oxignio, sendo de extrema importncia ecolgica. Fermentao ocorre na falta de receptores externos de eltrons. A concentrao de NADH nas clulas baixo, precisando ser re-oxidado para no cessar a via glicoltica. A reduo do piruvato a etanol ou outros produtos que restabelece o NAD permitem a continuidade da gliclise. Produo lquida de apenas 2 ATP. Para analisar o crescimento bacteriano, foi estabelecido um grfico que indica a curva de crescimento das bactrias. O grfico indica as fases de adaptao (lag), desenvolvimento (log), extino de nutrientes (estacionria) e morte das bactrias (declnio).

Lag: fase sem diviso celular e alta atividade metablica. O tempo para iniciar a diviso celular vai depender da quantidade inoculada, se a cultura velha e se o substrato no for ideal. Log: diviso celular mxima em progresso geomtrica de razo 2. Estacionria: o nmero de clulas mortas igual ao de clulas vivas, isso se da pela falta de substrato, o que leva ao declnio. Declnio: caracteriza a morte celular devido s ms condies do meio.

importante considerar que este grfico indica uma cultura em meio artificial e que num organismo ele s vai ocorrer com a utilizao de antibiticos ou com a morte do hospedeiro, pois num organismo h substrato suficiente para elas continuarem a se multiplicar.

f) Controle do crescimento bacteriano Os microrganismos esto presentes em todos os tipos de ambientes e at associados a cada indivduo e nos animais, compondo a microbiota normal. Alm disso, essas bactrias consideradas nocivas, fora de seu habitat podem provocar doenas, por isso necessria a higiene pessoal e ambiental para evitar a proliferao destes seres, principalmente em lugares pblicos, restaurantes e hospitais. O controle realizado por meio de agentes fsicos (esterilizao, estufa de calor seco, pasteurizao e radiao) e agentes qumicos (desinfetantes e drogas). Tanto os agentes fsicos quanto os qumicos so classificados como bacteriosttico (no mata mas inibe o crescimento, exemplo o frio), bacterioltico (mata sem que ocorra a lise celular) e bactericida (destri totalmente a bactria, como a esterilizao). O controle microbiano pode sofrer influncia de muitos fatores ambientais, assim como de caractersticas biolgicas das clulas, por isso a escolha de uma tcnica de controle deve ser adaptada a situao particular, conforme os princpios da fisiologia bacteriana: Tamanho da populao microbiana quanto maior a populao, maior o tempo para mat-las; Intensidade ou concentrao do agente - quanto menor a concentrao, maior o tempo necessrio para matar os microrganismos; Tempo de exposio ao agente; Temperatura deve ser maior que o timo para mat-las, quanto maior menor o tempo; Natureza do material que contm os microrganismos; Caractersticas dos microrganismos que esto presentes. A morte bacteriana (ausncia de reproduo) ocorre exponencialmente, onde h uma relao constante, em dado perodo de tempo, por exemplo, a cada minuto morre 90% da populao, ou seja, se h 1 milho, logo restaro 100 000 e assim por diante. Agentes fsicos Altas temperaturas - Calor mido: causa desnaturao e coagulao das protenas vitais, como enzimas, alm de se difundir mais facilmente pelas ranhuras. Autoclave, banho-maria (no esterilizante), panela de presso. -Calor seco: oxida os constituintes das clulas (queima lentamente a clula). Estufa, incinerao. -Pasteurizao: processo pelo qual um determinado material (o leite, p. ex.) aquecido a temperatura no, por tempo relativamente prolongado, e, em seguida, submetido a resfriamento sbito, obtendo-se assim a morte, apenas, dos germes patognicos. Altas temperaturas so inviveis aos alimentos por diminuir sua qualidade nutricional. Tempos e temperatura: 63 - 30 min, 73 - 15s UHT 142 - 3s. Radiao A quantidade de energia de uma radiao inversamente proporcional ao comprimento de onda: a de menor comprimento tem maior contedo energtico. Podem ser raio X (rompe as molculas e destroem compostos celulares como DNA), UV (superfcies)e gama (alta penetrao). Filtrao Utilizao de membranas filtrantes que separam do meio, geralmente lquido, as bactrias e tem ao esterilizante. Agente qumicos Podem ter as seguintes aes:

-Esterilizante: destruio ou remoo de todas as formas de vida microscpica de um objeto ou ser. -Desinfetante: mata as formas vegetativas de microrganismos. -Anti-sptico: so agentes que diminuem o nmero de microrganismos em tecido vivo. -Desinfeco: o processo que utiliza um agente para destruir microrganismos infecciosos. -Assepsia: ausncia de germes e infeco. Caracterstica de um agente ideal Deve apresentar eficincia sob todas as condies do meio em que deve agir. -Atividade antimicrobiana: matar eficientemente concentraes e com amplo espectro de ao; -Solubilidade; -Estabilidade; -Ausncia de toxicidade; -Inativao mnima por material estranho: no pode interagir com matria orgnica para evitar que quantidades do agente seja perdido; -Temperatura; - Poder de penetrao; -No ser corrosivo sem colorir/descolorir; -Sem odor; -Capacidade detergente: remove mecanicamente os germes das superfcies; -Disponibilidade e baixo custo. os microrganismos em baixas

9.3 Fungos Fungos so seres uni ou pluricelulares eucariontes. Suas principais caractersticas so: no sintetizam clorofila, no possuem celulose, no armazenam amido, armazenam glicognio e sua parede celular composta basicamente por quitina e so ubquos (presentes m diversos meios). A parede celular destes organismos composta por glucanas, mananas, quitina, protenas e lipdeos, polissacardeos, que podem se associar. a) Morfologia As clulas fngicas so divididas em miclios e corpo de frutificao. O miclio composto por diversas hifas (clulas conectadas umas as outras), so estruturas visveis e especializadas: vegetativo sustentao e nutrio; reprodutivo miclio areo com funo reprodutiva, tambm chamada de corpo de frutificao. O corpo de frutificao cresce acima do meio de cultura, formado por diversos esporos ou condios, caracterizando a reproduo assexuada e permitem que os fungos se dispersem em longas distncias. O corpo de frutificao permite a identificao dos fungos, podendo ser classificados em pincel (figura 10), vescula (figura 11) e bolsa (figura 12).

Condios

Filades Conidiforo

Figura 10 - Penicillium sp. Fonte: http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Reinos/biofungos2.php

A vescula se caracteriza por uma dilatao da extremidade da hifa com presena de esterigmas e estas possuem os esporos que sero dispersos

Figura 11 - Aspergillus, exemplo vescula. Fonte: doctorfungus.org

Esporngio Esporangisporo Esporangifilo Os fungos com esse tipo de corpo de frutificao s libera os esporos uma nica vez, pois estes esto dentro de uma bolsa. Quando maduros, a bolsa se vira e rompe, liberando os esporos Rizide
Figura 12 - Mucor, Absidia e Rhyzopus so exemplos de bolsa. Fonte: clt.astate.edu

Cenoctico

b) Reproduo assexuada A reproduo fngica assexuada pode ocorrer em quatro modalidades: 1. Fragmentao de artrocondeo: so fragmentos de hifas em segmentos retangulares que ao atingir substrato ideal se desenvolve.

Figura 13 - Fonte: http://www.dbi.ufla.br/Ledson/LBMP/Fungo25.htm 2. Fisso de clulas somticas: 3. Brotamento ou gemulao do blastocondeo-me: presente em fungos unicelulares como as leveduras, onde nasce um broto (blastocondio) na clula-me que se desprende desta ao atingir a maturidade. Quando as condies do meio no so favorveis, os brotos no se soltam, formando uma pseudo-hifa e pode ser considerado como mecanismos de resistncia.

Figura 14 - Fonte: enq.ufsc.br 4. Produo de condios ou esporos: so produzidos pelas transformaes do sistema vegetativo do prprio miclio. As clulas que do origem aos condios so denominadas clulas conidiognicas. c) Resistncia Como as bactrias, os fungos podem criar condies que favoream sua sobrevivncia em meios adversos, como a formao de pseudo-hifas, j citado anteriormente e tambm a formao de clamidocondios e dimorfismo. Os clamidocondios tm funo semelhante a dos esporos bacterianos. So clulas arredondadas, de volume aumentado, com paredes duplas e espessas, nas quais se concentra o citoplasma. Sua localizao no miclio pode ser apical ou intercalar.

Figura 15 - Fonte: http://www.dbi.ufla.br/Ledson/LBMP/Fungo25.htm

Entre outras estruturas de resistncia tevem ser mencionados os esclercios ou esclerotos, que so corpsculos duros e parenquimatosos, formados pelo conjunto de hifas e que permanecem em estado de dormncia, at o aparecimento de condies adequadas para sua germinao. So encontrados em espcies de fungos das Divises Ascomycota, Basidiomycota e Deuteromycota O dimorfismo geralmente ocorre em fungos patognicos que mudam de forma conforme a temperatura, como a Candida albicans. FILAMENTOSO 25C d) Micotoxinas So substncias txicas produzidas por fungos em crescimento vegetativo secundrio, ou seja, ocorre aps a fixao e reproduo e no so imunognicos (no ativam o sistema imune por no serem proticos). Os principais fungos que produzem toxinas so Aspergillus, Fusarium e Penicillium. A contaminao dos animais ocorre geralmente pela ingesto de rao contaminada que foi mal acondicionada, favorecendo assim um ambiente ideal para a proliferao dos fungos, como temperatura, umidade e fonte de carbono. importante porque causa grandes perdas aos criadores de animais, pois causa morte em massa ou queda na produtividade. Preconizam-se a secagem, armazenamento adequado, substncias qumicas inibidoras de crescimento fngico e uso de absorventes para minimizar os riscos da micotoxina. LEVEDURA 37C

9.4 Vrus So parasitas acelulares, extremamente pequenos atingindo a ordem de nanmetro e picmetro, so intracelulares obrigatrios, ou seja, necessitam de uma clula que os alberguem para poderem se apossar de seu ribossomo, ocorrendo assim a sntese protica, pois estes microrganismos no possuem esta estrutura. A composio se d pela presena de cpsula e material gentico que permanece metabolicamente inerte at encontrar uma clula hospedeira. DNA RNA RIBOSSOMO SNTESE DE PROTENAS

Permite a multiplicao e traduo do material gentico Os vrus possuem especificidade pelas clulas, por isso um vrus que ataca as clulas do intestino no atacar as clulas do pulmo, pois em cada tecido h um receptor na membrana celular diferente. Portanto, os vrus se adaptaram a cada um desses receptores, confundindo a clula e por isso conseguem invadi-las. Assim, ao se administrar um antiviral, esse ir bloquear o metabolismo celular, inativando enzimas celulares. A entrada dos vrus no organismo se d por meio das mucosas, sangue, secrees e olho.