Prctica 7.

Cultivos celulares primarios y de lneas celulares

Objetivo: Conocer y aplicar los principios de purificacin de clulas por el mtodo de perlas superparamagnticas acopladas a anticuerpos especficos.

INTRODUCCIN: El cultivo de tejidos y clulas comenz en 1907 con un experimento diseado para esclarecer una controversia en el rea de la neurobiologa. El investigador Dr. Ross Harrison, quien trabajaba en la Universidad Johns Hopkins, public un breve pero crtico artculo (Observaciones de la fibra nerviosa viva en desarrollo) que introdujo exitosamente una nueva tcnica, el cultivo de tejidos, para demostrar experimentalmente cmo se originan las fibras nerviosas. Los experimentos originales con fibras nerviosas se basaron en el cultivo de pequeos fragmentos de tejidos, llamados explantos. Utilizando tcnicas aspticas, Harrison tom fragmentos del tubo neural (tejido embrionario precursor del sistema nervioso) de un embrin de rana, y lo deposit en una gota de lquido linftico fresco (medio de cultivo) de rana colocada sobre un cubreobjetos estril. Una vez que la linfa coagul, invirti el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio que posea una depresin, creando as un cultivo en gota suspendida, tcnica utilizada por los microbilogos para estudiar las bacterias. Luego de peridicas observaciones al microscopio, pudo describir el desarrollo de fibras nerviosas in vitro a partir de las neuronas presentes en el tejido extirpado. As, adems de argumentar slidamente la doctrina neural, resolvi los problemas bsicos del cultivo celular, como el medio, la observacin y la contaminacin. Los cultivos celulares son el producto de la coleccin de clulas animales de diferentes rganos, colocadas en condiciones especiales propicias para su sobrevivencia y multiplicacin, manteniendo para esto todas sus funciones metablicas de una manera semejante a las que tena en el husped. Los cultivos de clulas animales se han clasificado de acuerdo a su capacidad de anclaje (adherencia), y as han sido aisladas recientemente de un rgano determinado o si provienen de clulas que han sufrido modificacin. De acuerdo a su capacidad de adherencia o no a una superficie determinada pueden crecer formando monocapa o en suspensin respectivamente, lo que est muy

asociado con el tipo de clula de la cual derivan: por lo general las clulas provenientes de rganos, crecen en monocapa; igualmente existen clulas que pueden crecer indistintamente tanto en monocapa como en suspensin, ejemplo son las clulas HeLa que son clulas transformadas derivadas de cultivos en monocapa. Cuando el cultivo proviene de clulas que han sido disgregadas de un tejido original tomado de un rgano de un animal recin sacrificado, reciben el nombre de Cultivo Primario; cuando ste cultivo primario es sometido a procesos de transformacin que le confiere capacidad ilimitada de multiplicacion, reciben el nombre de Lneas Celulares. CULTIVOS PRIMARIOS Los cultivos primarios tienen caractersticas especiales que los diferencian de las lneas celulares: conservan la morfologa de las clulas del rgano del que fueron aisladas, sus cromosomas tienen un nmero diploide (2n), su crecimiento in vitro es limitado y hay inhibicin por contacto. El estar ms cercanas a las clulas que las originaron, se ve reflejado en una mejor actividad y funcionalidad similar a su ambiente natural, por lo que en aislamientos primarios de cepas virales stas tienen mayor sensibilidad que una Lnea Celular ya establecida. Igualmente para la produccin de vacunas los cultivos primarios son recomendables por tener una baja probabilidad de que se transformen en malignos. Dentro de las desventajas est la de una mayor probabilidad de presentar virus adventicios o latentes, lo que implica el desarrollo de la adecuada tecnologa para el control de calidad. LINEAS CELULARES Las Lneas Celulares continuas estn formadas por clulas que se diferencian gentica y morfolgicamente de las clulas de las cuales se originaron. Pueden provenir de clulas que se derivan de tumores o de un proceso de transformacin de un cultivo primario mediante transfeccin con oncogenes o con tratamiento con carcinogenticos, lo que les confiere un nuevo fenotipo. Este tipo de cultivo tiene la caracterstica de ser aneuploides, de no tener inhibicin por contacto y de crecer de manera indefinida. El paso de un cultivo primario a lnea se denomina transformacin.

Una transformacin puede inducirse fisiolgicamente (interaccin celular, polaridad) a travs de hormonas como la hidrocortizona o utilizando inductores no fisiolgicos como el DMS. El cultivo celular es un mtodo para el estudio del comportamiento de las clulas animales libres de las variaciones sistmicas ocurridas dentro del organismo durante su normal homeostasis y bajo el estrs de un desarrollo experimental. En la actualidad pueden cultivarse en el laboratorio clulas procedentes de una amplia gama de tejidos y organismos diferentes, siendo esto posible ya que existen tres tipos de cultivo celular: cultivo primario (procede directamente de un rgano, se constituye de tipos celulares mezclados y no permiten un gran nmero de pases), lneas celulares (se constituyen de un tipo nico de clulas que permiten realizar un gran nmero de pases) y cepas celulares (lneas celulares inmortalizadas que pueden someterse a pases continuos sin envejecer). Tanto en los laboratorios de diagnstico clnico como investigacin, el cultivo de clulas constituye una gran herramienta de trabajo ya que es un modelo muy adecuado para el estudio de la comunicacin, desarrollo y diferenciacin celular, siendo de suma importancia para la inmunologa ya que mediante este mtodo se dilucidaron las funciones de las citocinas sobre los linfocitos, tipos de agentes mitgenos, curso de la respuesta autoinmune, etc.

DIAGRAMA DE FLUJO Obtencion de PBMCs

Tubo cnico con Ficoll/Hypaque Obtener sangre perifrica en un tubo con EDTA Estratificar la sangre sobre el Ficoll/Hypaque Centrifugar a 400G/ 20min

Diluir con PBS

R2

R1 11

. Recuperar las PBMC. Lavar con PBS Centrifugar 100G/ 10 min Resuspender con PBS o RPMI

R3

R4 11

R5 11

Preparar una dilucin 1:10 con azul de tripano

Contar en Neubauer

 Purificacion de clulas por perlas superparamagneticas (MACS)

METODOLOGA Material y equipo - Sistema Vacutainer para obtencin de sangre con anticoagulante. - Algodn (Torundas) - Centrfuga clnica - Micro pipetas de 10 y 100 L. con puntas - Equipo magntico para purificacin de clulas (MACS) Obtencion de PBMCs 1.- Con una pipeta dispense 3ml de ficoll en un tubo conico de 15ml 2.- Mezcle la muestra de sangre contenida en el vacutainer 3.- Con una pipeta serolgica dispense 5ml de sangre entera anticoagulada hacia el tubo conico de 15ml previamente cagado con 5ml de PBS 4.- Homogenice gentilmente por inversin la sangre con PBS 5.- Utilizando la misma pipeta tome 10ml de de la sangre entera con PBS y colquela cuidadosamente sobre la suprficie de Ficoll sin perturbar la interfase escurriendo la mezcla lentamente por la pared del tubo inclinado. Al terminar este paso el tubo conico presenta dos estratos; uno interior con Ficoll y uno superior con la mezcla de sangre y PBS 6.- Centrifugue a 400G por 20 minutos 7.- retire los tubos conicos de las camisas de la centriguga cuidadosamente sin perturbar los estratos en este momento existirn cuatro estratos diferentes; el primero de abajo hacia arriba contiene eritrocitos y granulocitos, el inmediatamente superior contiene Ficoll, el inmediatamente superior al Ficoll es el estrato mas discreto contiene CMN y por ultimo el estrato superior que contiene el plasma - Mezcla de bolas sensibilizadas con Ac anti citocinas - Mezcla de biotina y conjugado - Solucin Estreptavidina-PE Reactivos - Bfer (PBS-BSA-EDTA) - Estndares de citocinas

8.-Empleando una micropipeta transfiera las CMN a un tubo, de ser necesario puede eliminarse primero el estrato de plasma antes de ser cultivado CMN 9.-Coloque 10ml de PBS para hacer lavados y centrigugue a 100G por 10 minutos (esto se realizara dos veces) 10.- descarte el sobrenadande por decantacin a una solucin con hipoclorito de sodio 11.-Resuspender en PBS

Purificacin de clulas por perlas superparamagnticas (MACS) 1. De acuerdo al nmero de clulas contadas, ajuste una solucin de 1x10 7 clulas en -CD indicado en el instructivo del producto. (La finalidad de esto es familiarizar al estudiante con insertos en idioma ingls). 2. Incube 10 min. en hielo 3. Adicione 10 l de anticuerpos anti biotina acoplados a perlas magnticas mezcle y deje en incubacin por 15 min. 4. Mientras esta en incubacin la suspensin, coloque una columna LS sobre l magneto y lave tres ocasiones por adicin de 3 mL de PBS-albmina. 4. Adicione la suspensin en la columna y colecte el eluato en un tubo cnico, lave en tres ocasiones por adicin de 2 mL de PBS-albmina colectando el eluato en el mismo tubo (esta fraccin es rica en clulas purificadas). 5. Separe la columna del magneto y adicione en tres ocasiones 3 mL de buffer para sacar de la columna las clulas marcadas (Esta fraccin es rica en las poblaciones no purificadas). 6. Realice el conteo de ambas fracciones y calcule la eficacia del proceso, compare su resultado experimental con el terico esperado de acuerdo a la poblacin purificada. Cultivo Agregue al tubo 1ml de medio de cultivo bsico suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y resuspenda con golpeteo Se dejaran crecer los linfocitos en 1ml de este medio en una estufa a37Cy 5% de CO

RESULTADOS DISCUSIN CONCLUSIONES

REFERENCIAS Alzamora, L. et al. Produccin de IFN en cultivos de linfocitos humanos por efecto de los extractos metanlicos de cuatro ecotipos de Lepidium peruvianum, Chacn (Brassicaceae). Rev. peru. biol. nmero especial 13(3): 207 - 209 (Julio 2007) Universidad de la Javeriana. Cultivo celular. *En lnea+ http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/ cultivos.htm, obtenido el 05 de enerpo de 2012. Murray, P. et al. (2006) Microbiologa Mdica. 5 edicin. Elsevier. Espaa. pp. 516, 517.