Clulas y tejidos focalizacin de los cidos nucleicos para la revista Cancer Gene Therapy

Resumen. Tumor de la orientacin-por definicin-incluye cualquier estrategia para mejorar la especificidad de la cidos nucleicos teraputicos hacia el sitio del tumor, mientras que la mayor actividad biolgica se debe mantener. Seleccin de beneficiarios ha sido alcanzado con xito en el nivel de la transcripcin, transduccin o el parto. para especfico de tumor del parto, los mtodos de seleccin fsicas como la electroporacin, la hipertermia, magnetofection, internalizacin fotoqumica o una ecografa, y sistemas biolgicos de fijacin de objetivos, incluidos los activos y tumoral pasiva focalizacin, se han desarrollado. Los efectos teraputicos se ha podido demostrar con varios dirigidos formulaciones de cidos nucleicos, tales como plsmidos de ADN tumoral orientados expresan p53 o tumor El factor de necrosis alfa, ARN interferente pequeo derribando la expresin de genes especficos de un tumor translocaciones cromosmicas o la expresin gnica de los tumores neoangiogenic procesos, as como dos ARN de cadena poli inosina-citosina, que desencadena la apoptosis en las clulas tumorales especficos. INTRODUCCIN Generalmente, el trmino de la terapia Bgene pulgadas alude a transferir de material gentico en clulas para una finalidad teraputica. la concepto se ha investigado para el tratamiento de la inherente enfermedades genticas, como pe, fibrosis qustica o grave inmunodeficiencias combinadas. La mayora de la terapia de genes presentes estudios se refieren al tratamiento del cncer (1). ya sea como monoterapia o en combinacin con otros regmenes como radiacin y / o la quimioterapia, la terapia gnica ofrece un alternativa para el tratamiento no resecable, metastsico o terapia

tumores slidos refractarios. Los cidos nucleicos con potencial teraputico que han sido investigado extensivamente para terapia gnica del cncer incluyen ADN plsmido (pDNA) o sintticos tales como los cidos nucleicos oligonucletidos antisentido, pequeos ARN de interferencia (siRNA), la u otros ARNs de doble hebra como poli inosina-citosina (PIC). Los diversos tipos de cidos nucleicos lograr diferentes efectos a nivel gentico molecular. As, pDNA vectores se utilizan principalmente para intra-nuclear de entrega para reemplazar o para sustituir una funcin gentica especfica en la clula diana resultando en una Bgain de la funcin gnica.'' En Bloss contrario, de '' gen funcin es a menudo mediada por intra-citoplasmtica entrega de los oligonucletidos antisentido o sintticas de siRNA reducir la expresin de genes endgenos en un sequencespecific manera (2). Por lo tanto, los mecanismos de teraputico efectos son la inhibicin de la neoangiognesis diversa, incluyendo (3Y5), la activacin de la respuesta de citoquinas o inmunoestimulante (6), la induccin de la apoptosis (7,8), la reduccin de las clulas tumorales proliferacin (9Y11) o estrategias para reemplazar los genes eliminados o que sobre-expresan genes beneficiosos (12). Para tener xito en la terapia gnica contra el cncer, la eficiencia entrega de genes teraputicos a un sitio diana es un importante tela de juicio. Varios sistemas de suministro de genes se han desarrollado como vectores virales y no virales y sus ventajas potenciales y desventajas se han definido. Mientras que los virus son muy sistemas eficaces de suministro de genes, que estn limitados en su uso debido a la inmunogenicidad de las protenas virales, el riesgo de oncognesis y creacin inadvertida de partculas virales infecciosas. No viral

vectores tienen varias ventajas con respecto a razones de seguridad (falta de inmunogenicidad) y las cuestiones farmacuticas (facilitan la sntesis y la produccin a gran escala), sin embargo, tienden a mostrar los pobres eficacias de transfeccin en comparacin con vectores virales. Dentro de las ltimas dcadas, la entrega numerosos genes no virales se han desarrollado sistemas. Comprenden desnudo y modificar qumicamente los cidos nucleicos, as como de partculas basado vectores. Estos vectores compactos cidos nucleicos para protegerlos de la degradacin por nucleasas suero y para facilitar celular captacin por las interacciones mediadas de carga con la superficie celular. Los investigados partculas basadas en sistemas se pueden dividir en grupos threemain: (1) Bpolyplexes'' formados por cidos nucleicos y polmeros policatinicos como polilisina (PLL), polietilenimina (PEI) o poliamidoamina (PAMAM), dendrmeros (13Y16), (2) Blipoplexes pulgadas que contienen lpidos catinicos como DOTMA o cidos nucleicos y DOTAP (13,17,18) y nanopartculas (3) que se unen o encapsular cidos nucleicos a Bnanoplexes'' (19Y25). La eficiencia de transferencia de genes vara fuertemente entre el diferentes formulaciones. En cuanto a las formulaciones Bpolyplex pulgadas polietilenimina (PEI) es el ms popularmente utilizados policatinico debido a su excelente transfeccin y consistente polmero niveles de eficiencia en varias lneas celulares. La capacidad de tamponamiento del PEI ofrece la oportunidad de escapar del endosoma (Efecto esponja Bproton'' (26)). Inconvenientes de PEI son significativos toxicidad y ausencia de degradabilidad. Polilisina (PLL), en contraste, es biodegradable, es ineficaz en la transfeccin menos

endosomal agentes perturbadores o la cloroquina est incluido. La formacin de BLipoplex'' depende de varias condiciones fsicas (PH, la carga), as como sobre las caractersticas estructurales de los lpidos de modo que la especificidad y las exigencias estructurales para la transfeccin con xito estn determinados por la variacin en la disposicin liposmica. Al menos in vitro, PAMAM, PEI y algunas formulaciones liposomales son el gen ms eficaz transfectar agentes. La prestacin eficiente y expresin de cidos nucleicos slo puede xito en la terapia si bien dirigido hacia el sitio del tumor. As, la focalizacin es uno de los principales cuellos de botella en el gen del cncer terapia. Los informes de revisin en curso sobre una variedad de logros de las formulaciones especficas de cidos nucleicos, con un nfasis en la las opciones para la orientacin fsica y biolgica del tejido canceroso. ORIENTACIN DE ENTREGA DE CIDO NUCLEICO TargetingVper definitionVincludes cualquier estrategia para mejorar la especificidad de la expresin gnica y / o entrega de los cidos nucleicos hacia el sitio del tumor, mientras que ms de transfeccin los niveles deben ser alcanzados. Diferentes polticas dirigidas a tener ha investigado en el pasado, incluyendo la entrega selectiva de cidos nucleicos, as como la transduccionales y transcripcional focalizacin en el sitio intracelular de las clulas tumorales (ver fig. 1). La orientacin de transduccin se compone de todos los mtodos que mejorar la liberacin intracelular y el transporte de los transgenes hacia el ncleo de la clula diana. Se activa endosomal la liberacin, el trfico de mayor citoslica y nuclear especfica importacin de transgnicos (27) son los principales objetivos de este estrategia de focalizacin. Tan pronto como los genes son entregados en el

ncleo que slo se pueden expresar, si el promotor adecuada y / o elementos potenciadores estn incluidos en la expresin gnica casete. La orientacin de la transcripcin que hace uso de tumorspecific promotor / potenciador de los sistemas a travs del cual especficamente altos niveles de expresin del transgn transcripcin controlada Se puede obtener dentro de la clula tumoral diana (28Y31). La captacin celular de la entrega de genes basada en partculas sistemas por lo general ocurre a travs de interacciones mediadas por carga con la superficie celular, seguido por endocitosis. Al sistmica administracin, sin embargo, tales interacciones no especficas tambin llevar a cabo con los componentes sanguneos y los tejidos no objetivo y obstaculizar la entrega de genes. La entrega especfica de la lipo-, nano-o polyplexes hacia el sitio del tumor puede ser mediada por fsico o biolgico dirigido tecnologas. ORIENTACIN DE FSICA La orientacin fsica consta de una serie de fsica tcnicas para mejorar la prestacin de cido nucleico en un sitio especfico. La especificidad se realiza generalmente mediante la accin localizada de fuerzas fsicas. Estos pueden ser por ejemplo, fuerzas mecnicas, un elctrico o un campo magntico, los efectos de luz o trmico. Mecnico fuerzas son explotadas por ejemplo, con la pistola de genes (32,33) o la entrega hidrodinmica, especialmente con hidrodinmico miembros de entrega vena (34Y36). Mtodos comnmente utilizados se describen en los prrafos siguientes. La electroporacin En la electroporacin, los pulsos elctricos se usan para mejorar

la captacin celular de cidos nucleicos. Aunque la detallada mecanismo an no est claro, se cree que el elctrico impulsos desestabilizar las membranas celulares y permitir la directa migracin de los cidos nucleicos en el citosol, evitando el endocitosis va (37). Brunner y col. encontr que elutriados clulas muestran una expresin de genes del ciclo celular independiente, lo que indica que la importacin nuclear y la transcripcin de los transgenes es menos limitando con electorporation que con los mtodos basados en partculas (38). La electroporacin se considera que es seguro, econmico y fcil de manejar. Este mtodo ha sido utilizado eficientemente desde hace mucho tiempo para el transporte de ADN en las clulas vivas in vitro (39). Recientemente, utilizando electroporacin en tejidos in vitro con desnudo en pADN multicelulares esferoides tumorales (MCT) ms de un 10-pliegue la expresin gnica mejorada en comparacin con el policatin polietilenimina PEI 22 kDa se observ que comprende clulas quiescentes (40). En la inyeccin in vivo, locales de pDNA seguido por electroporacin de tejido muscular, el tumor o de la piel Se ha demostrado que mejora la transferencia de genes 100 - 1000-a veces durante la inyeccin del plsmido solo (41Y45). Intramuscular pDNA electroporacin dio excelentes niveles de expresin gnica en ratones y la expresin se puede mantener durante varios meses (46). Goto y col. encontrado mediante electroporacin en CT26 cojinete ratones que despus de la aplicacin intratumoral de herpes simplex virus de la timidina quinasa o BA gen toxina de la difteria'' gen una siginificant disminucin en el crecimiento tumoral se produce la bsqueda de hasta 90% de retraso del crecimiento tumoral compard con los ratones control (43).

Los efectos teraputicos se observaron con un plsmido que codifica granulocitos y macrfagos factor estimulante de colonias (GMCSF) y la molcula B7-1 coestimuladora inmune en el modelo de tumor de ratn que resulta en total y permanente regresin del tumor de ms de 60% de los ratones tratados (47,48). Tambin a la electroporacin intratumoral de la IL-12 plsmido en el modelo de melanoma B16F10 en ratones (49) del tumor regresin se observ en la ausencia de efectos secundarios importantes. La simplicidad y la alta eficiencia de la electroporacin de ADN llev a los primeros ensayos clnicos a finales de 2004 (50). Clnico estudios de fase I para el melanoma intratumoral de IL-12 ADN electroporacin se han realizado encontrar alentador resultados, incluyendo hasta reguladas IL-12 niveles, la necrosis del tumor y la infiltracin de linfocitos. Se necesitan ensayos clnicos conel melanoma relativo ya han empezado a utilizar una intralesionalaliado de codificacin electroporated plsmido IL-2. Estudios de fase I para el electroporacin apoyados vacunas para el cncer de prstata y tumores que expresan HER-2 y / o antgeno carcinoembrionario Se han iniciado (50). Magnetofection Magnetofection es una tcnica que muestra prometedores resultados tanto para in vitro e in vivo en la entrega del gen objetivo (51). En este mtodo, el cido nucleico se reversiblemente unido a nanopartculas superparamagnticas que luego se centraron en el sitio de destino a travs de un campo magntico de alta energa. In vitro magnetofection promueve la transfeccin rpida y excelente niveles de expresin gnica, as. En la misma se demostr en in vivo cuando se aplica en el tracto gastrointestinal y en la sangre vasos (51). Recientemente prometedores resultados in vivo de genes transfeccin de epitelio de las vas han sido reportados por

Xenariou et al. (52). En cuanto al mecanismo se demostr que el campo magntico en s no altera la absorcin de PEI-ADN polyplexes que estaban asociadas fsicamente con el paramagntica nanopartculas. Se propone que el magntico las fuerzas de conducir a una acumulacin acelerada de los complejos de la superficie celular, pero no a la traccin en la clula (53). Ultrasonido Ultrasonido (EE.UU.) puede provocar efectos no trmicos a travs de cavitaciones acsticos. La cavitacin es un resultado de la interaccin entre las ondas ultrasnicas y una inclusin gaseosa en un medio acuoso que conduce a las burbujas de cavitacin (54). Este efecto causa un dao de la membrana celular que conduce a una mayor permeabilidad para las macromolculas, seguido por una membrana sellado y la supervivencia celular (55). Este documento US-mediada aumento de la permeabilidad celular se denomina tambin Bsonoporation'' y se utiliza para la entrega de genes (54). En la base de prometedores resultados in vitro, in vivo, EE.UU. tratamiento tambin ha demostrado que aumenta la transferencia de genes. Despus de pADN inyeccin en el tumor, la eficacia de transfeccin era mejorado en la prstata (56) y carcinoma de colon (57). Sistmico aplicacin de pDNA desnudo en combinacin con EE.UU. fue ineficiente, probablemente debido a la degradacin de ADN desnudo por nucleasas suero y bajas concentraciones de ADN en los alrededores de clulas sonoporated (56). Los complejos de pDNA con lpidos catinicos (Blipoplexes'') mostr despus iv la inyeccin combinada con sonoporacin una transferencia de genes mejorada en un SCCVII modelo de tumor highlightening el uso de partculas basado sistemas fsicos en combinacin con tcnicas de orientacin (58).

Otro enfoque en relacin con EE.UU. es utilizar los llamados microburbujas que son clnicamente establecidos como contraste agentes. El ADN fue bien directamente unida a las superficies de las microburbujas o simplemente mezclados con ellos anteriores a administracin. En algunos estudios demostraron que estos vehculos mejorada pADN eficacia de transfeccin tanto in vitro como in in vivo (59Y63). Adems, llenos de gas micropartculas (PGMF) Se desarrollaron como sistemas de suministro de genes. La incorporacin de cidos nucleicos en el PGMF debe proporcionar una mejor proteccin contra la degradacin por nucleasas suero. Gene expresin en modelos de roedores de tumores de colon despus de carcinoma PGMF / EE.UU. el tratamiento se ha demostrado recientemente (64,65). La internalizacin fotoqumica (PCI) Fotoqumica internalizacin (PCI) es una tecnologa que mejora y se centra entrega de genes para un determinado expuesta a la luz de destino del sitio. Fotosensibilizadores cidos anfiflicos (PS) se localizan en las membranas endosomal donde se encuentran con el portador del gen despus de endocitosis. Iluminacin conduce a fotoqumica daos y rotura de las membranas endosomal, liberar el gen realizacin complejos en el citosol. In vitro, el PCI ya mostr resultados alentadores en mejorar la prestacin de genes de polyplexes (66,67). Para lipoplexes el efecto de PCI fue variable y depende de los liposomas utilizada (68). Por otra parte, mediada por el receptor del gen ms entrega PCI ha funcionado muy bien, combinando de este modo biolgico y fsico focalizacin principios. Kloeckner et al. mostraron una 2 - a 600-veces

eficacia de transfeccin mejorada de EGF dirigido a los receptores polyplexes in vitro en comparacin con las transfecciones sin PCI tratamiento (69). Ndoye et al. recientemente puso de manifiesto prometiendo efectos teraputicos en un modelo in vivo con CECC PEImediated transferencia del gen p53 combinado con PCI (70). La hipertermia La hipertermia con aumento controlado de la temperatura en el rea objetivo se aplica en diferentes conceptos para el tumor tratamiento. La hipertermia es ya en uso clnico. Adems de el efecto citotxico directo de la hipertermia (> 42,5-C) en el tejido calentado, efectos inmunomoduladores, as como la radiacin y las propiedades de quimioterapia sensibilizante se encontraron (71). Adems, se ha demostrado que la aplicacin de calor en el sitio diana aumenta la permeabilidad de tumor buques a una gran variedad de macromolculas (72Y74). Uno de los principales hiptesis asume que, debido al estrs por calor la endotelial las clulas de tumor de neovasculatura pierden su estructura cytosceletal y el contrato, lo que provoca el ensanchamiento de la brecha intercelular uniones. De acuerdo con la administracin de frmacos citostticos, los liposomas adems de la hipertermia son bien investigados (72,73). Local la hipertermia tambin ha sido utilizado con xito para los sistemas de focalizacin virus vaccinia recombinante a los tumores (75). La combinacin de la terapia gnica no viral con la hipertermia era de reciente creacin, con resultados alentadores in vitro (76). Polyplexes de ADN con PNIPAM/PEI- basados en copolmeros de bloque se formaron y despus del tratamiento con hipertermia transitoria (30 min, 42-C, seguido por incubacin a fisiolgica temperatura) estas partculas experimentar una transicin de fase y agregado. Se encontr que despus de la expresin gnica del

hipertrmica rgimen se increment en dos rdenes de magnitud presumiblemente debido al hecho de que despus de la internalizacin las partculas agregadas muestran una versin ms eficaz desde el endosoma debido al efecto de esponja de protones mejorada inducida por acumulado PEI (76). ORIENTACIN BIOLGICA Biolgicos estrategias de focalizacin hacia el sitio del tumor puede llevarse a cabo tomando ventaja del tumor especial la arquitectura y las propiedades nicas del tumor. Bsicamente, estos estrategias se pueden dividir en dos grupos principales: pasivos y tumor activo de orientacin. Para aprovecharse de estas estrategias, y lipoplexes nanoplexes o polyplexes se pueden modificar con el superficie del blindaje y tumorales molculas dirigidas. Tumor Pasivo Orientacin El tumor imperfecta y con fugas vascular, debido a neovascularizacin anormal obligados a servir de rpido crecimiento los tumores, junto con un drenaje linftico inadecuado resulta en un efecto llamado permeabilidad y Benhanced retencin'' (efecto EPR) (77). Para tomar ventaja de esto para tumor de la orientacin, las partculas deben poseer ciertas propiedades. En primer lugar, debe mostrar un tiempo de plasma de la circulacin alargada con el fin de aumentar la capacidad de las partculas de extravasacin en el sitio del tumor. En segundo lugar, las partculas deben ser hidrfilo para evitar el RES (78,79) y tercero, el peso molecular del los vectores debe superar aproximadamente. 50 kDa de eludir la excrecin renal. Modificaciones hidrfilos superficiales de lipo-y polyplexes por ejemplo, con polietilenglicol (PEG) son necesarios para beneficiarse del efecto EPR. PEG-lpidos se han incorporado en lipoplexes (80,81) y tambin polyplexes han sido modificar mediante diferentes estrategias PEGilacin. PEGilacin

de las partculas Polyplex se puede hacer despus de la compleja formacin con los cidos nucleicos (PEGilacin Bpost'') (82,83) o antes de la formacin de complejos (PEGilacin Bpre'') (84Y86). Mientras PEG blindaje es beneficioso para orientacin pasiva al sitio del tumor, que es desfavorable para la liberacin intracelular de cidos nucleicos porque la interaccin de policationes con membranas como la membrana endosomal se reduce y en la liberacin endosomal consecuencia de los complejos se reduce. A lo sumo, el PEG pueda proteger los complejos durante sistmica la circulacin y desmontar despus de alcanzar el sitio de destino. Para esto, los diferentes mtodos para desencaden desapantallamiento han sido establecido en el pasado teniendo ventaja de fisiolgico dado parmetros en la celda que incluyen cambios en el pH, la enzima concentracin o potencial redox (81,87 Y91). Por ejemplo, Szoka et al. desarrollado un lpido PEG sensible al pH que consta de un grupo de cabeza hidrfilo PEG que est conectada mediante un ortoster con una cola hidrfoba. Ortosteres puede fcilmente se descomponen bajo condiciones cidas, como en el endosoma. Se demostr que el pH sensible al PEG-lpido fue capaces de liberar rpidamente encapsulada en liposomas carga til cuando el pH se redujo a pH endosomal de 5Y6 (92). Adems optimizacin llevado a lipoplexes con alta eficiencia de transfeccin a baja citotoxicidad (93). Walker et al. (86) investigaron hidrazona bonos como sensibles al pH engarces en pegilado polyplexes. Con tales polyplexes un 10 - a 100 veces mayor eficacia de transfeccin estables en comparacin con PEG blindados polyplexes fue hallado in vitro as como in vivo en un tumor de carcinoma hepatocelular modelo. Otros bioresponsive enlazadores se investigaron por Shin et al. teres de vinilo utilizando como sensibles al pH bonos en liposomas (88). Murthy et al. estudiado lbiles cido-acetales en formulaciones Polyplex (94,95).

Ambegia et al. introdujo una nueva estrategia para pegilar liposomas reversible (81). Se reunieron en el PEG estabilizado plsmidos de lpidos partculas (SPLP) utilizando hidrfobo difusible anclas que son capaces de ser extrado de un bicapa liposmica en condiciones fisiolgicas. Su hiptesis es que la longitud del anclaje PEG determina el la disociacin tasa de PEG y por lo tanto, la farmacocintica de SPLPs. In vitro, observaron altos niveles de expresin gnica con el ancla ms corta debido a la rpida difusin del PEG blindar resulta en una mayor complejo de clulas interaccin. En Por el contrario, los datos in vivo mostraron que una cadena de mayor longitud aumento de los niveles de expresin gnica en un neuroblastoma de ratn modelo debido a la acumulacin en el sitio del tumor debido a persistente blindaje por las anclas ms grandes y renal disminuida despacho. Por otra parte, para estos SPLP conjuga un tumor orientacin selectiva se observ. MacLachlan et al. recientemente encontrado resultados muy alentadores, con nucleico estable similar partculas de lpidos y aminocidos (SNALP) de la apolipoprotena B (apoB) entrega de siRNA. Una inyeccin de un solo resultado en siRNA mxima APOB ARN mensajero silenciamiento de> 90% y reducciones significativas en las lipoprotenas ricas en colesterol srico y de baja densidad los niveles de lipoprotenas (96). Un enfoque completamente diferente a las partculas pegilar Los sistemas basados fue tomada por Oishi et al., que ligado PEG directamente a los oligonucletidos antisentido o siRNA (97,98). Para esto se utiliza un enlazador thioproprionate cido-lbil y mezclaron el oligonucletido injertado despus con polilisina para formar micelas poliion complejos (PIC). Dirigida lbil en medio cido PICs mostr una inhibicin significativa superior de la expresin gnica en comparacin con los PICs estables en un carcinoma de hepatoma

humano lnea de clulas in vitro.