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Agronoma Tropical. 44(2): 299-315.1994

OBTENCION DE AISLADOS PROTEINICOS DE GIRASOL POR HIDROLISIS CON BROMELINA Y PAPAINA, COMPOSICION QUIMICA Y PROPIEDADES FUNCIONALES Emperatriz Pacheco de Delahaye* ; Mariela Snchez A.** ; Rosa Girlando** ; Eliezer Snchez**

Profesor Asociado. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Agronoma. Apado. 5081. El Limn. Aragua. Venezuela. ** Universidad Central de Venezuela. Facultad de Agronoma. Apdo. 5081. El Limn. Aragua. Venezuela. RECIBIDO: febrero 12, 1993

RESUMEN Harina de girasol desgrasada industrialmente fue molida a 60 mallas y utilizada de base para obtener aislados de girasol por va alcalina y por hidrlisis con bromelina (0.4%) y papana (0.2%), logrndose aislados que contenan entre 88% y 92% de protena. La hidrlisis enzimtica mejor notablemente el ndice de blancura de los aislados protenicos de 33% a 53%. Igualmente se incrementaron las propiedades funcionales de absorcin de agua (2.1 a 3.4 ml agua/ g muestra); absorcin de aceite (2.0 a 3.2 ml aceite/g); actividad de la emulsin (74% a 90%). La solubilidad de la protena soluble fue mayor en los aislados enzimticos en todo el rango de pH estudiado (3-9). La hidrlisis con papaina demostr ser ms eficaz en trminos de rendimiento. Los aislados obtenidos presentaron buenas propiedades funcionales y podran ser utilizados para enriquecer productos de consumo masivo, ampliando el uso potencial del subproducto del aceite de girasol. Palabras Claves: Helianthus annuus L.; propiedades funcionales; uso po-tencial; subproducto; papana; bromelina. INTRODUCCION Las harinas desgrasadas de oleaginosas de soya, ajonjol, girasol y algodn representan una importante fuente de protenas, sin embargo, su empleo directo en la alimentacin humana se ve impedida por la presencia de componentes antinutricionales como por ejemplo: resduos de cscara que provocan problemas de sabor y olor, inhibidores enzimticos, fitatos y oxalatos. Por ello se hace necesario la aplicacin de procesos tecnolgicos dirigidos a la remocin parcial o total de estos contaminantes (BRESSANI y ELIAS, 1968 y CHOI et al., 1981). El cultivo de girasol se destaca por el valor nutritivo de la semilla, debido al alto contenido de aceite en la almendra (58-63%); adems, es una fuente de protenas,

vitaminas y minerales que puede ser utilizada como complemento en la alimentacin humana por presentar varias alternativas de usos en la agroindustria (COBIA y ZIMMER, 1975 y DENCH et al., 1981). El mayor problema que presenta la harina de girasol en la alimentacin humana es la presencia de cscara y polifenoles de difcil remocin dando como resultado una harina de color verde oscuro (VOLKERT y KLEINI, 1979; WANG y KINSELLAS, 1976). Para la incorporacin en productos alimenticios de harinas y aislados protenicos a partir de semilla de oleaginosas, estos deben poseer ciertas propiedades funcionales, cuyos requerimientos varan con los diferentes tipos de alimentos. Las propiedades funcionales de las protenas son aque-llas caratersticas fsico-qumicas que influyen de un modo caracterstico sobre la apariencia fsica y el comportamiento de un producto alimenticio, siendo los ms importantes las propiedades emulsificantes, solubilidad, capacidad de gelatizacin, absorcin de agua, absorcin de aceite y propiedades organolpticas especialmente color y sabor (FRAZEN, 1976; KINSELLA et al., 1979). Los tratamientos enzimticos en la preparacin de aislados aumentan el rendimiento de extraccin y modifican la estructura protenica, mejorando as sus propiedades funcionales y ampliando el rango de alimentos en los cuales podran ser incorporados. La eficiencia de este proceso depender de la enzima utilizada y de los parmetros que afectan el proceso qumico-enzimtico (DENCH et al., 1981; FUJIMAKI et al., 1977 y PACHECO, 1985). En Venezuela, el cultivo comercial del girasol presenta un nivel de desarrollo agronmico relativamente avanzado, observndose en los ltimos aos (1988-1990) un aumento sustancial en la produccin, situndose segn los datos publicados por el MINISTERIO DE AGRICULTURA Y CRIA (1987; 1990) como una de las principales oleaginosas en el pas. Es importante conocer las caractersticas qumicas y propiedades funcionales que presenta la harina de girasol producida por la industria nacional, con el objeto de evaluar su potencial como suplemento en alimentos. Con base en los argumentos planteados anteriormente, el presente trabajo tuvo los siguientes objetivos: evaluacin qumica de la harina y la obtencin de aislados protenicos de girasol mediante hidrlisis enzimtica con papana y bromelina. MATERIALES Y METODOS Materiales La torta de girasol utilizada en este estudio fue obtenida industrialmente mediante un proceso de extraccin mecnica y extraccin con solvente (hexano), usado por la empresa LAURAK situada en la ciudad de Maracay, estado Aragua, Venezuela. La torta fue obtenida de la mezcla de semilla de hbridos de girasol tipo aceitera de las variedades Contiflor II y Dogri, procedentes de los Llanos Orientales de los estados Monagas y Anzotegui. La torta comercial de girasol fue sometida a una operacin de molienda y tamizado, para ello se utiliz un molino de martillo marca Willey, modelo 4, con tamiz de 60 mallas, obtenindose una harina que sirvi de base para la experimentacin. Las enzimas empleadas fueron de la marca comercial Sigma. Preparacin de los aislados protenicos por va alcalina y por va enzimtica a partir de harina desgrasada de girasol.

El aislado protenico por va alcalina fue obtenido aplicando el mtodo sealado por PACHECO (1985). Los aislados protenicos por va enzimtica se obtuvieron siguiendo el esquema de la Figura 1, previa fijacin de la concentracin ptica de las enzimas bromelina y papana para lo cual se sigui el mtodo publicado por BEUCHAT (1977).

FIGURA 1. Preparacn de os aislados enzimticos a partir de la hidrlisis de a harina de girasol con bromelia o papaina.

Anlisis qumico Los contenidos de grasa, cenizas, protenas (% N x 6.25) y polifenoles totales fueron determinados segn la tcnica sealada en el A.O.A.C. (1975) y se analiz la fibra diettica por el mtodo de ASP et al., (1983). Estos anlisis se realizaron por triplicado. Propiedades funcionales La solubilidad de las protenas de los aislados de girasol fue determinada segn la tcnica de RIVAS et al., (1981). Para el clculo de porcentaje de protena soluble (PS), se emple la relacin siguiente: Protenas soluble a pH determinado % PS = -----------------------------------------------------x 100 Protena en la muestra El color fue determinado por la medida del ndice de blancura analizado en un colormetro triestmulo marca Gardner XL-10. El instrumento fue calibrado previamente con una placa estndar blanca, cuyos valores fueron L = 92.83; a = -1.1 y b = + 0.3. Se calcul en ndice de blancura (IB) mediante la ecuacin IB = Valor L de la muestra/valor L de la placa estndar blanca x 100. Absorcin de agua La absorcin de agua se determin segn el mtodo de WANG y KINSELLA (1976), con algunas modificaciones: 100 ml de agua destilada se aadieron a 1 g de muestra, dentro de un tubo de centrfuga graduado de 50 ml. La mezcla se agit por 1 minuto con agitador Vortex modelo K-500-Y para dispersar la muestra y seguidamente se coloc en Shaker (Wrest Action) marca Burrel, modelo 75, durante 30 minutos a la mxima velocidad para luego ser centrifugada a 3700 r.p.m durante 25 minutos en una centrfuga IEC HN-5 rotor 215. El volumen de agua liberada fue medido y el agua absorbida por gramo de muestra se calcul como ml H2O absorbida por la muestra. Los clculos fueron hechos mediante la ecuacin siguiente: Agua absorbida (ml) x 100 Agua absorbida = ----------------------------------------------------... Peso de muestra (g) Las determinaciones fueron hechas por triplicado. Absorcin de aceite La absorcin de aceite fue determinada por el mtodo descrito por DENCH (1981), con algunas modificaciones: a 0.5 g de muestra se le adicion 3 ml de aceite de maz en un tubo de centrfuga graduado de 50 ml. El contenido fue agitado por 1 minuto con agitador Vortex modelo K-500-Y para dispersar la muestra. Se dej en reposo la muestra durante 30 minutos y el volumen de aceite libre fue ledo. El volumen de aceite retenido fue calculado; luego se centrifug a 3700 r.p.m, por 25 minutos y el volumen de aceite retenido fue calculado por diferencia y los resultados fueron expresados en ml de aceite absorbido por 1 g de muestra. Los ensayos fueron

realizados por triplicado. Propiedades emulsificantes Para determinar la actividad emulsificante y la estabilidad de la emulsin se utiliz el mtodo descrito por DENCH (1981) con algunas modificaciones. En el primer caso se pesaron 2.5 g de muestra, los cuales fueron transferidos a un beaker de 100 ml y suspendidos en 30 ml de agua destilada; el pH de la suspensin se ajust a 7.0 con NaOH 0.1N y se agit magnticamente durante 15 minutos a media velocidad en un agitador a temperatura ambiente; el pH fue chequeado y ajustado en los casos necesarios, el volumen fue llevado a 50 ml con agua destilada. La suspensin fue pasada al vaso de licuadora donde se adicion 50 ml de aceite de maz para ser emulsionada durante 3 minutos a mxima velocidad. La emulsin fue dividida en 2 tubos de centrfuga graduado de 50 ml para ser centrifugada a 2 900 r.p.m por 5 minutos en una centrfuga IEC-HN-5 rotor 215. La actividad de la emulsin fue calculada como: Altura de la capa emulsificada (ml) x 100 % Actividad emulsificante = ----------------------------------------------------------Altura total del contenido en el tubo (ml) Para calcular la estabilidad de la emulsin se repiti el mtodo utilizado para determinar actividad emulsificante con la siguiente variacin: antes de la centrifugacin, se calent la emulsin a 80oC por 30 minutos y se enfri con hielo durante 15 minutos. Los resultados fueron expresados de acuerdo a la siguiente manera: Altura de la capa emulsificada (ml) x 100 % Actividad emulsificante = -----------------------------------------------------------Altura total del contenido del tubo (ml) Anlisis estadstico Los resultados de los anlisis qumicos y propiedades funcionales fueron determinados a travs del anlisis de varianza y prueba de DUNCAN (1955). El anlisis de varianza (Anavar) se realiz segn SOKAL y ROLHJ (1979) donde siguiendo el modelo completamente aleatorio, el cual es apropiado para comparar ms de dos medias, permitiendo cotejar todas las observaciones simultneamente en funcin de las medias de cada grupo. RESULTADOS Y DISCUSION Efecto de concentracin de las enzimas sobre la extraccin de protenas. Con la finalidad de fijar las concentraciones ptimas de las enzimas de bromelina y papana, empleadas en este trabajo para la extraccin de protenas para obtener aislados protenicos a partir harina de girasol, se determin el porcentaje de protena soluble producido por la hidrlisis a diferentes concentraciones de las enzimas

comerciales (0.05; 0.1; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8 g de enzima/100 g de harina), y se fij el pH 9; temperatura 25oC y relacin harina-solvente (1:20). Los resultados se presentan en el Cuadro 1, donde se aprecia que la hidrlisis con papana soluble es mayor a cualquier concentracin de enzima. Por otra parte, al agregar 0.6 g de bromelina/100 g de harina de girasol se obtuvo 30 % de PS en agua para luego disminuir, y fue a 0.4% donde se observ un cambio drstico de extraccin de protena. En el caso de la papana 0.2 g de enzima/100 g de harina de girasol, sta es la concentracin donde prcticamente se estabiliza el porcentaje de extraccin de protena (48%). En funcin de los resultados observados y tomando en cuenta que el costo de las enzimas podra encarecer el aislado protenico, se escogieron las concentraciones mnimas de enzimas con las cuales se logra una mayor extraccin; en tal sentido, se escogi la concen- tracin de 0.4 g de bromelina y 0.2 g de papana por 100 g de harina de girasol para efectuar la hidrlisis y obtener los aislados enzimticos. Diferentes autores han demostrado que la hidrlisis enzimtica mejora la extraccin de las protenas y la digestibilidad de los productos como aislados e hidrolizados debido posiblemente al cambio de estructura de la protena original, dando como resultado de la hidrlisis una mezcla de polipptidos de alto peso molecular (HENDERSON, 1979; Ma y WOOD).
CUADRO 1. Efecto de la concentracin de Bromelina y Papana sobre la extraccin acuosa de las protenas de la harina de girasol. Concentracin (g de enzima/100 g de harina) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 * Promedio de tres determinaciones. Protena extrada (%)(g protena/100 g harina)* Bromelina Papana 10.94 27.34 30.08 29.39 28.44 48.26 50.25 51.12 50.89 50.73

Es conveniente conocer el rendimiento de extraccin de protenas para la produccin de aislados o concentrados a escala industrial ya que de ello depende la factibilidad econmica del proceso. El Cuadro 2 presenta los rendimientos en peso de los procesos de obtencin de los aislados por va alcalina y por va enzimtica, donde se puede resaltar que tanto los rendimientos en extraccin de protena como en peso fueron superiores al emplear las enzimas, y prcticamente el rendimiento fue el doble al compararlo con el aislado alcalino donde la harina de girasol no fue hidrolizada. Resultados similares fueron encontrados al obtener aislados e hidrolizados protenicos de algodn y de ajonjol (CHILDS y FORTE, 1976; SOSULSKI y BAKAL, 1969). Composicin qumica de la harina y aislados protenicos de girasol obtenidos por va alcalina y enzimtica Los anlisis de protena, grasa, cenizas, fibras diettica total y polifenoles se detallan en el Cuadro 3. La cantidad de protena y grasa de la harina de girasol encontrada coincide con valores mostrados por BAIRD (1981); sin embargo, la cantidad de ceniza es un poco ms elevada quizs por el alto contenido de cscara en la semilla que durante el proceso industrial no fue totalmente descascarada, hecho que se resalta en el contenido de fibra diettica total el cual es elevado (38%). La hidrlisis elimina

durante el proceso de extraccin de protenas la mayor parte de fibra diettica, cenizas y grasas.

CUADRO 2. Rendimiento en peso y porcentaje de protena extrada en la elaboracin aislados de girasol: alcalino y enzimticos con bromelina y papana. Aislado Alcalino EnzimticoBromelina(0.4 g enzima/ 100 g harina) EnzimticoPapana(0.2 g enzima/ 100 g harina) * Promedio de 6 determinaciones. Rendimiento en peso* Protena extrada (g aislado/100 g harina) (g protena/100 g harina) 12.65 0.75 17.18 0.45 20.15 0.88 32.45 1.32 48.52 0.56 55.55 1.17

Se logr obtener aislados en base seca con ms de 90% de protena; se determinaron diferencias significativas entre el aislado alcalino y los aislados enzimticos en el anlisis qumico. Los aislados enzimticos presentan menor cantidad de protena probablemente porque durante la hidrlisis de la harina de girasol se aumenta el nmero de polipptidos solubles que son descartados en el sobrenadante luego de la centrifugacin, disminuyendo por lo tanto el contenido de protena en el precipitado (Figura 1). En cuanto al contenido de polifenoles, resulta beneficioso la hidrlisis con las proteasas bromelina y papana, ya que se puede apreciar que los aislados enzimticos contienen 60% menos de polifenoles que el aislado alcalino. Al minimizar o destruir la cantidad de los polifenoles (capaces de formar complejos con las protenas que reducen su valor biolgico) es posible mejorar la digestibilidad de los aislados. Es lo que ocurre probablemente durante la protelisis enzimtica, al destruir la estructura terciaria de ciertas protenas (BRESSANI y ELIAS, 1968; BRESSANI et al., 1987).

CUADRO 3. Composicin qumica de la harina y de los aislados protenicos de girasol: alcalino y enzimticos con bromelina y papana. Muestra Harina* Aislado* alcalino Aislado* enzimticoBromelia Aislado* enzimticoPapaina Protena 37.80 0.20 92.76 1.32a** 88.12 0.68b 89.25 0.72b Grasa 0.80 0.18 0.38 0.07a 0.21 0.03b 0.22 0.04b Ceniza 6.34 0.28 4.48 0.02a 1.96 0.02b 1.98 0.02b FDT*** 34.12 1.10 4.63 0.05a 2.24 0.04b 2.30 0.03b Polifenoles Totales 0.42 0.80 0.48 0.05 0.20 0.05 0.20 0.04

* Porcentaje en base seca. ** Letras diferentes indican diferencias estadsticamente significativas al nivel P = 0.01 (Test de Duncan) *** FDT = Fibra diettica total.

Propiedades funcionales de los aislados protenicos de girasol

El anlisis de las propiedades funcionales de los aislados alcalinos y los enzimticos se expone en el Cuadro 4. Es notable el efecto de la hidrlisis enzimtica sobre el color de los aislados, resultando stos ms claros (beige), con una diferencia en el ndice de blancura de 20% al compararlos con el color del aislado alcalino (verde oscuro). El color es una de las propiedades funcionales ms importantes ya que el contacto visual es el primero que se tiene con el producto alimenticio que se va a consumir, siendo en efecto uno de los principales indicadores de la calidad de un producto. El color debe tomarse muy en cuenta cuando se van a enriquecer harinas de cereales (maz, arroz, trigo) con aislados protenicos ya que stos no deben modificar el color visible de las harinas para preparar, por ejemplo, panes, arepas, galletas, etc. Se ha observado que durante la produccin de concentrados o aislados protenicos de semilla de girasol tipo aceitera, los polifenoles oxidados forman enlaces covalentes con las protenas, impartiendo un color verde al producto (VOLKERT y KLEINI, 1979 y CHERYAN, 1980). El color aislado alcalino producto de este trabajo se debe quizs a la disminucin de los polifenoles por la hidrlisis enzimtica. Como pueder notarse en el mismo Cuadro 4, la absorcin de agua de los aislados enzimticos mostr valores significativamente ms elevados que el aislado alcalino. Probablemente la disociacin de las protenas nativas por la accin enzimtica incrementa la capacidad de absorcin de agua de las protenas, debido al aumento de puentes de hidrgeno, grupos carbcilos y aminos libres que se producen al romper las protenas con enzimas (SOKAL y ROLHT, 1979). La absorcin de aceite es una propiedad que debe tomarse en cuenta especialmente al incorporar concentrados de protenas a productos de panaderas ya que los mismos contribuyen a la textura de tortas y galletas (DENCH et al., 1981). Los aislados enzimticos muestran valores superiores de absorcin de aceite que el aislado alcalino. La protena al ser hidrolizada por una proteasa (en este caso bromelina o papaina) produce cadenas polipeptidicas cada vez de menor tamao, aumentando as los extremos no polares y a su vez la absorcin de aceite. Los valores obtenidos son superiores al compararlos con los datos de la bibliografa para harina y aislado de soya. Esto supone que las protenas de girasol contienen ms grupos lipoflicos que puedan enlazar cadenas parafinadas de grasa contribuyendo as a la absorcin de aceite. Cuando se realiz el anlisis de las propiedades emulsificantes se observ que la actividad de la emulsin aumenta en los aislados enzimticos, debido a la hidrlisis enzimtica de las protenas que incrementan el nmero de pptidos disponibles en la interfase aceite-agua, dando como resultado una mayor emulsificacin de aceite tal como lo explican KINSELLA et al., 1979 y PACHECO y RIVAS, 1992. Todas las emulsiones formadas por las diferentes muestras estudiadas fueron estables al calor y el volumen de la emulsin aument durante el calentamiento, debido quizs a que la hidrlisis de las protenas aumenta el rea superficial y en consecuencia se incrementan los residuos polares expuestos.

CUADRO 4. Propiedades funcionales de los aislados protenicos de girasol: alcalino y enzimticos con bromelina y papana.

Aislado

Indice de blancura

Absorcin** Absorcin** agua (ml de aceite (ml de Actividad agua aceite **emulsificante absorbido/g de absorbido/g de (%) aislado) aislado) 2.10 0.10b 3.50 0.10b 3.46 0.15b 2.06 0.09b 3.20 0.12a 3.25 0.10a 74 0.8b 91 3a 90 4a

Estabilidad** emulsificante (%) 77 10b 92 5a 93 4a

Alcalino EnzimticoBromelina EnzimticoPapana

33.3 0.00 53.15 0.22 52.08 0.28

* X ds ** Letras diferentes indican diferencias estadsticamente significativas al nivel de P = 0.01 (Test de Duncan).

Solubilidad proteinica de los aislados de girasol El efecto del pH en la solubilidad protenica de los aislados alcalinos y enzimticos de girasol se presentan en el Cuadro 5, se aprecia que en todo el rango de los pH estudiados, los aislados enzimticos mostraron mayor solubilidad que el aislado alcalino. Este incremento en la solubilidad podra explicarse por la accin enzimtica que genera al romper la estructura molecular, pptidos ms pequeos que aumentan la solubilidad en agua y la resistencia a la precipitacin en medio cido (FUJIMAKI et al., 1977 y PACHECO, 1985). CONCLUSIONES El presente trabajo de investigacin demuestra que es posible mejorar las propiedades funcionales de los aislados protenicos de girasol aplicando la tcnica de extraccin alcalina e hidrlisis con bromelina y papana. Los aislados obtenidos representan una buena fuente de protena y una alternativa para el aprovechamiento de un subproducto el cual slo es destinado a la alimentacin animal y que podra ser utilizado en la formulacin de productos de consumo masivo, especficamente galletas, panes, productos crnicos. Sin embargo, cabe sealar que este trabajo contina con estudios nutricionales. En lo referente al rendimiento de extraccin y propiedades funcionales es ms conveniente obtener aislados protenicos de girasol mediante hidrlisis con papana.

CUADRO 5. Efecto del pH sobre la solubilidad protenica de los aislados de girasol: alcalino y enzimticos con bromelina y papana. Aislado Alcalino Enzimtico-Bromelina Enzimtico-Papana pH 3 26.2 44.9 42.5 4 7.7 30 35.2 PS (%)* 5 7.6 25.6 28.7 6 7.8 15.6 16.8 7 20.6 28.5 47.3 9 38.5 53.8 58.3

PS (%) = Porcentaje de protena soluble. * Promedio de 3 determinaciones.

AGRADECIMIENTO Los autores agradecen el financiamiento parcial otrogado por el CONICIT Proyecto S12266 y al Consejo de Desarrollo Cientfico y Humanstico de la UCV, Proyecto 01.37.2490-91. Los investigadores expresan su agradecimiento a la seora Gloria de Pinto por su ayuda tcnica. SUMMARY Sunflower kernel industrially unfatted, was ground to 60 mesh and used to obtain sunflower isolates via alkaline and by hydrolisis with bromeline (0.4%) and papain (0.2%). Isolates obtained contained from 88% to 92% protein. The enzymatic hydrolisis remarkably improved the whiteness index of the protein isolates from 33% to 53%. In the same way, the functional properties increased: the water absorption (2.1 to 3.4 ml water/gr. sample); oil absorption (2.0 to 3.2 ml oil/gr.): emulsion activity (74% to 90%). Soluble protein solubility was greater on the enzymatic insolates in the whole rank of pH (3-9) studied, The hydrolisis with papain showed to be more efficient in terms of yield. The isolates obtained showwed good functional properties and may be isolates to enrich products of massive consumption, increasing therefore the potential use of the sunflower oil by-product. Key Words: Helianthus annus L.; functional properties; potencial use; subproducts; bromeline and papain. BIBLIOGRAFIA A.O.A.C. 1975. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 12 th. Ed, Washington, D.C. ASP, N.G., C.G. JOHANSSON, H. HALLMER and M. SILJESTROM. 1983. Rapid enzymatic assay of insoluble and soluble dietary fiber. J. Agric. Food Chem. 31:476-482. BAIRD, D. and M. SUNFLOWER. 1981. Sevine applications. Feed Mgt. 32 (6):32. BEUCHAT, R.L. 1977. Functional and electrophoretic characteristics of succinylated peamunt flour protein. J. Agric. Food Chem/25:258. BRESSANI, R.L. y G. ELIAS. 1968. Cambios en la composicin qumica y en el valor de algodn durante su elaboracin. Arch. Latinoamer. Nutr. (18) 319-328. BRESSANI, R., R. G. BRENES, A. GARCIA and L.G. ELIAS. 1987. Chemical composition aminoacid content and protein quality of Canavalia spp. J. Sci. Food Agric. 40, 1723. CHERYAN, M. 1980. Pytic and interaction in food sytems crit. Rev. Food. Sci. Nutr. 13:297. CHILDS, E.A. and J.F. FORTE. 1976. Enzymatic and ultrasonic techniques for

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