INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA CARRILLO DEL ANGEL JOSE DE JESUS 4IM2

SECCION III 2011500079 SEPARACION DE UNA MEZCLA DE AZUL DE METILENO Y FLUORESCEINA USANDO CROMATOGRAFIA POR ADSORCION OBJETIVO Aplicar la tcnica de Cromatografa por Adsorcin para la separacin de dos colorantes. Comprobar la separacin en base a un Perfil de Elucin. INTRODUCCION Existen ciertas sustancias slidas, qumicamente inertes, que tienen la propiedad de adsorber o fijar dbilmente en su superficie a una gran cantidad de compuestos. La fortaleza con la que se adsorben las sustancias sobre un adsorbente dado vara de un compuesto a otro. Entre los adsorbentes ms usuales: slica Gel (xido de silicio), almina (xido de aluminio), celulosa, fluorosil (silicato de magnesio) y sulfato de calcio. La separacin se realiza por la diferente tendencia de adsorcin de los compuestos orgnicos por la fase estacionaria. La fase mvil desplaza y disuelve a los componentes de la mezcla segn sea su afinidad por la fase estacionaria es decir, los componentes ms polares estarn adsorbidos con ms fuerza y sern ms difciles de separar de la fase estacionaria que los componentes poco polares. Los menos polares no presentan una interaccin importante con la fase estacionaria (gel de slice) y no sern retenidos. En un proceso de adsorcin los componentes de la mezcla son adsorbidos por la fase estacionaria con diferente intensidad de tal forma que el proceso adsorcin desorcin hace que unos componentes avancen ms rpidamente que otros. La adsorcin es un proceso de superficie mientras que la absorcin es la penetracin de una sustancia en el seno de otra (al escribir el papel adsorbe tinta mientras que la esponja absorbe agua). En cualquier fenmeno de adsorcin influyen tres variables independientes: el adsorbente, el disolvente y las sustancias a separar. Por tanto, s una molcula tiene una gran afinidad pasar muy lentamente mientras que otro componente con menos afinidad lo har ms rpidamente. RESULTADOS PERFIL DE ELUCION Volumen de Elucin (mL) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 Absorbancia 493 nm 0.003 0.471 1.231 0.535 0.25 0.143 0.087 0.054 0.045 0.028 Absorbancia 668 nm 0.049 0.025 0.011 0.011 0.018 0.018 0.009 0.006 0.008 0.009 Volumen de Elucin (mL) 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 Absorbancia 493 nm 0.002 0.011 0.014 0.012 0.01 0.012 0.015 0.017 0.015 0.012 Absorbancia 668 nm 0.075 0.096 0.148 0.154 0.194 0.331 0.451 0.532 0.502 0.394

33 36 39 42 45 48 51

0.075 0.02 0.012 0.014 0.025 0.018 0.014

0.037 0.011 0.008 0.006 0.005 0.004 0.025

84 87 90 93 96 99

0.007 0.006 0.007 0 0 0

0.305 0.232 0.176 0.099 0.036 0.024

1.4 1.2 ABSORBANCIA 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 20 40 60 80 100 VOLUMEN DE ELUCION (mL)
AZUL DE METILENO 668 nm FLUORESCEINA 493 nm

Podemos observar por medio de la grafica que la separacin delos solutos fue eficaz ya que las crestas de las curvas es decir, sus puntos mximos no se traslaparon lo que indica que la separacin fue primero para la Fluoresceina y luego el Azul de Metileno. Los elementos del sistema cromatografico son: Eluato: Lquido que es colectado por elucin en la cromatografa en columna. Elucin: Es la migracin de los solutos a lo largo de la columna desde el punto de aplicacin. Eluyente: Es la Fase Mvil que ocasiona la elucin.

ELUYENTE

ELUCION

ELUATO

Para invertir el orden de elucin de los colorantes podemos cambiar la fase estacionaria que tenga mayor afinidad por la Fuoresceina que por el Azul de Metileno. La regla general es elegir la polaridad del disolvente anloga a la de la muestra a emplear y en la mayora de los casos adsorbentes poderosos (activos) para sustancias no polares y adsorbentes con menos actividad para sustancias ms polares. Las fuerzas intermoleculares que actan son de atraccin en el caso de la almina y el Azul de Metileno y de repulsin o menor atraccin con la Fluoresceina por lo que esta eluir primero En que otros compuestos se aplica la Cromatografa por Adsorcin. La cromatografa de adsorcin es particularmente adecuada para el anlisis de molculas no ionizantes, insolubles en agua y relativamente simples, que frecuentemente son ismeros o compuestos muy relacionados. El intervalo de compuestos que pueden separarse se extiende desde los hidrocarburos muy polares hasta compuestos polifuncionales fuertemente polares. Esta cromatografa se ve poco influida por las diferencias en peso molecular y ms por los grupos funcionales especficos. En consecuencia, la separacin por adsorcin de compuestos que difieren solamente en el grado o tipo de sustitucin alguilo, como en los miembros de las series homlogas, es pobre. Esta cromatografa se utiliza en la separacin de la vitamina D3 y sus metabolitos las vitaminas A, D y E (y compuestos muy relacionados a estas vitaminas), muchas drogas de abuso (LSD, por ejemplo), antidepresivos tricclicos, bloqueadores beta y los PTH - aminocidos. Los aceites naturales y los extractos de esencias se analizan fcilmente y los pigmentos menos polares de las plantas, tales como los carotenoides y las porfirinas, se han separado con xito durante muchas dcadas. Los steres tambin son factibles de ser separados, siendo los glicridos y los ftalatos tpicos de esta clase de compuestos. Tambin han sido separadas en columnas de slice las aflatoxinas y otras micotoxinas. DISCUSIONES La separacin de los solutos fue ptima ya que las graficas no se traslaparon lo que indica que el primer colorante que eluyo fue la Fluoresceina debido a que su afinidad es menor con la fase estacionaria que es la almina y a su afinidad con el agua por lo que el colorante separado contiene agua , mientras que el Azul eluyo despus al cambiar la fase mvil que es alcohol acido , esto se observa con mas detalle al analizar cada fraccin de eluato a travs de medir las absorbancias de cada fraccin en el espectrofotmetro a longitides de onda de 493 y 688 nm donde absorben la luz la Fluoresceina y el Azul de Metileno respectivamente. Podemos observar que casi en todos los tubos hay trazas de los colorantes debido a que a lo mejor se cambio antes de tiempo la fase mvil de agua a alcohol acido. CONCLUSIONES Para lograr una correcta separacin debemos elegir la fase mvil y estacionaria dependiendo de la afinidad de la muestra con estos, por lo que tenemos que tener informacin previamente acerca de la muestra si es polar o no polar, presenta cargas o no etc. E l Perfil de Elucin nos permite evaluar si el la Cromatografa por Adsorcin se llevo adecuadamente, si necesitamos cambiar nuestra fase mvil o estacionaria. BIBLIOGRAFIA Mariana Lpez Snchez, Jorge Triana Mndez, Francisco Javier Prez Galvn, Mara Esther Torres Padrn. Mtodos Fsicos de Separacin y Purificacin de Sustancias Orgnicas. Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Febrero de 2005. ISBN: 84 689 - 1114 3. Pg. 22-24