http://es.scribd.com/doc/32178036/Restauracion-tincion-y-montaje-de-laminillas-citologicas-danadas Tcnicas de colecta y tincin de parsitos Prctica 3 Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Facultad de EstudiosSuperiores Zaragoza, UNAM. Av.

Guelatao 66, Col. Ejrcito de Oriente, 09230Mxico D.F.Laboratorio de Microbiologa L-121Prez Prez Jos Manuel, Equipo 1, Grupo 1701 Introduccin: MTODOS DE COLORACIN: Se utilizan para diferenciar fcilmente la morfologa yestructura de los organismos en observacin.Los colorantes modifican el ndice de refraccin de lassustancias que colorean. COLORACIN DE GIEMSA : se emplea en Hematologapara observar los elementos sanguneos normales y enMicrobiologa para identificar parsitos (protozoarios dela sangre y los tejidos), espiroquetas, levaduras y hongos (Chlamydia).Observacin: Los ncleos de clulas y protozoarios seobservan en color, el citoplasma en color azul claro. Loseritrocitos en color gris claro.Utilidad: se emplea principalmente en frotis sanguneospara observar a los agentes patgenos junto a las clulassanguneas y mostrar las diferencias entre ambos. Seponen en evidencia lamorfologa y estructura de los microbios. Estas diferencias pueden ayudar aldiagnstico certero de varias enfermedades infecciosasde la sangre.Nota: El colorante de Giemsa es un colorante compuestoya que es una mezcla de varios colorantes. Por esto sedice que la coloracin de Giemsa es una coloracincompuesta o diferencial (ya que emplea ms de uncolorante).Fundamento: se basa en la distinta afinidad quedemuestran las clulas y sus componentes a los distintoscolorantes incluidos en el colorante de Giemsa.Tcnica: se realiza el extendido de la gota de sangre (gotagruesa del pulpejo del dedo gordo). Se deja secar, secubre con la solucin de Giemsa, se lava con agua y seobserva. El fijador (metanol o etanol) se usa cuando secuentan con muestras de tejidos, no debe usarse conextendidos de sangre.Resultados errneos: se deben principalmente a erroresdurante el extendido sanguneo o durante la aplicacindel fijador.La tincin de Giemsa emplea como colorantefundamental, una mezcla de ticinicos catdicos, como elazur A,B y azul de metileno, que colorean el ncleo,mientras que la eosina para coloracin citoplasmtica,estas sustancias estn disueltas en alcohol metlico. Sufundamento est en la disociacin controlada de las salesde eosinato, que ocurre por la mezcla de Giemsa conagua destilada. La cromatina nuclear adopta la tincinazul violcea algo distinta a la habitual para loscolorantes tiacnicos y que recibe la denominacin deefecto GiemsaResultaos e interpretacin:Los eritrocitos se tien de rosaLas plaquetas de violetaLos ncleos de los leucocitos de violetaEl citoplasma de los leucocitos es rosa.La tincin de Giemsa al igual que la tincin de Wrightsirven para la identificacin de parsitos tales como elPaludismo en los cuales es conveniente un tiempo de 30minutos hasta una hora para Giemsa y de tres a cincominutos para Wright aunque se podran obtener mejoresresultados si se le deja a ste ultimo hasta por 15minutos. El mtodo de Wright brinda buenos resultadosy requiere de muy poco tiempo, pero se obtiene detallesms precisos con la tincin de Giemsa.El mtodo de Wright solo se puede aplicar a frotisdelgados mientras que en Giemsa se pueden usar frotisdelgados y frotis de gota gruesa omitiendo el paso defijacin con alcohol metlico.Las preparaciones en fresco son utilizadasprincipalmente para la identificacin de Tripanosomas ymicrofilarias; los frotis teidos (delgados) sirven paraidentificar diferencias morfolgicas de protozoarios enclulas sanguneas, mientras que la gota gruesa esutilizada cuando escasean los parsitos o cuando enfrotis delgados los resultados son negativos, pero es muydifcil la identificacin estructural de estos; estos tambinse utilizan para la identificacin de Tripanosomas,microfilarias, plasmodios y leishmanias.Uno de los inconvenientes del uso de canastillas durantelas tinciones es la cantidad de colorante que se requiere para llenar hasta el borde superior de los portaobjetos yla contaminacin de los reactivos (figura 1y 2), as comotambin la posibilidad de formacin de espacios libres decolorante por la presencia de aire entre los portaobjetosimpidiendo la tincin.*Tincin de WrightFundamento:La tincin de Wright es una tincin de tipo Romanowsky.Es extremadamente importante en el laboratorio dehematologa este tipo de tincin, ya que puedeobtenerse una cantidad abundante de informacin apartir del examen de un frotis de sangre perifrica bienteido.Una tincin de Romanowsky consiste en azul de metilenoy sus productos de oxidacin, as como eosina Y o eosinaB.La accin combinada de estos colorantes produce elefecto Romanowsky y da una coloracin prpura a losncleos de los leucocitos y a los grnulos neutroflicos yde color rosado a los eritrocitos. Los componentes deeste efecto son el azul B y la eosina YLas propiedades de tincin de Romanowsky dependendel enlace de los colorantes a las estructuras qumicas yde las interacciones del azul B y la eosina Y. Losagrupamientos de cidos nucleicos, las protenas de losncleos celulares y el citoplasma

inmaduro reactivo, fijanel azul B, colorante bsicoLa eosina Y, colorante cido, se fija a los agrupamientosbsicos de las molculas de hemoglobina y a lasprotenas bsicas.La naturaleza cida o bsica de las estructuras celularesdetermina su avidez por los componentes del colorantepolicromtico de Wright; es as como los cidos nucleicosse tien con azul B que es el bsico y la hemoglobina conla eosina Y que es cida. Otras estructuras se tien poruna combinacin de ambos y se denominan neutrfilas.ObservacionesUna tincin satisfactoria debe dar los siguientesresultados:Glbulos Rojos: rojo amarillento.Neutrfilos: cromatina prpura oscuro, citoplasma rosaplido y grnulos lila.Eosinfilos: cromatina prpura oscuro, citoplasma azulplido y grnulos rojo brillante.Basfilos: cromatina prpura oscuro, grnulos azuloscuro. Linfocitos: cromatina prpura oscuro, citoplasmaazul cielo.Monocitos: cromatina prpura medio, citoplasma azulgrisceo y grnulos lila Plaquetas: centrmero violeta oprpura, hialmero azul claro.Causas de error en la tincin del frotis sanguneo.Una extensin excesivamente azul (basfila).Extensin gruesa.Lavado insuficiente.Tiempo tincin excesivamente prolongado.Empleo de colorante excesivamente alcalinoUna coloracin excesivamente rosada (acidfila).Extensin delgada.Exceso de buffer.Empleo de colorante excesivamente cido.Solucin colorante de GiemsaLa solucin colorante de Giemsa se usa tanto paramanchas de sangre como para manchas de bacterias.Una parte de la solucin base concentrada se deberdiluir en diez partes de agua destilada.Utilice una mancha de sangre secada al aire y fije lapelcula al portaobjeto colocndola en alcohol metlicode 70% de tres a cinco minutos. Seque el portaobjeto alaire. Luego coloque el portaobjeto en un plato o frasco(en el frasco de Coplin, si se cuenta con uno) quecontenga solucin colorante de Giemsa de 15 a 30minutos. Finalmente lave el portaobjeto en aguadestilada y squelo.Muchas soluciones colorantes (generalmente aquellasque son tintes bsicos de anilina, como la fucsina bsica,el violeta cristal, el azul de metileno y la safranina) puedeser usadas para colorear la bacteria. Se deber diluir lasolucin colorante; vierta una parte de la solucin baseconcentrada en diez partes de agua. Se deber aplicar lasolucin colorante de uno a dos minutos, lavando luegoy, por ltimo, secando con papel secante. Loscubreobjetos no son necesarios a menos que quieravolver sus portaobjetos en permanentes. En tal caso,aada una gota de blsamo cuando el portaobjeto estseco y luego aada un cubreobjeto.FILARIASSon un tipo de gusanos de aspecto filamentoso, largos ydelgados, que suelen aparecer en el tejido linfticoenrollados unos a otros.La hembra puede tener distintas localizaciones en elorganismo y es la que produce las microfilarias quealcanzan el torrente circulatorio. Cuando el individuo espicado por un mosquito, le transfiere las microfilarias yen su interior desarrolla el ciclo infeccioso de las larvas.Cuando este mosquito vuelve a pica a otra persona, letransmite las larvas.La deteccin se lleva a cabo en sangre perifrica y sernecesario realizar varias tomas ya que la presencia ensangre es variable.Las dos especies ms importantes desde el punto devista clnico son: (infecta los vasos linfticos y regininguinal) yTcnicas para la coloracin de protozoosMtodo de Klein modificado (impregnacin de plata paratri codnidos)Preparar frotis delgados tanto de piel como de lasbranquias en un portaobjeto bien limpio.Se deja secar al ambiente. Cubrir el portaobjeto con una solucin acuosa al 2% denitrato de plata durante 7 minutos. Para tricodnidosmarinos o estuarinos se recomienda utilizar la solucin auna temperatura de 4C.Lavar con agua destilada o con agua de lluvia.Exponer el portaobjeto al sol entre 10 30 minutos segnel espesor del frotis. Puede verse al microscopio a los 5minutos. Se deja secar.Chequear las muestras al microscopio.Colocar la lmina en alcohol absoluto y despus llevarlo axilol.Montar con blsamo de Canad.Tcnicas para la fijacin y coloracin de helmintosComo regla general los metazoos parasitarios pueden serpreservados para su posterior identificacin en unasolucin fijadora que contenga 10 ml de formol, 20 ml dealcohol al 95% y 15 ml de agua; inmediatamente antes deusarse, se agregan 5 ml de cido actico glacial a lasolucin fijadora. No obstante, se recomienda el empleode las siguientes tcnicas para la fijacin y coloracin demetazoos pertenecientes a diferentes clases: obre un portaobjetos limpio se coloca unagota de sangre y se extiende, con una de lasaristas de un portaobjetos formando uncuadro de aprox 1.5 cm se deja secar. El siguiente paso es el lacado o lisado delos eritrocitos en agua destilada durante 8-10 minutos se seca y se tie se observa. Se observ al microscopio en seco dbil yseco fuerte e inmersin b) Tcnica frotis fino en sangre. Para las preparaciones fijas se realizo el siguienteprocedimiento. Esquema B Se deposita una gota de sangre en uno delos extremos del portaobjetos, y con elborde de otro porta se realiza la extensinde la sangre. Se mueve rpido este segundoporta el cual debe de formar unngulo de aprox. 30 grados.Se deja secar, se tie y se observaal microscopio en 10X, 40X,100X aumentos.

2.- Bsqueda y estudio deectoparsitos.

Localizar y obtener parsitos del sapoSacrificar ectoparasitosObservaciones del artrpodoRealizar preparaciones, utilizarcolorantes de contraste 3.- Obtencin de protozoarios yhelmintos Se realizo el siguiente procedimiento. Obtencin y fijacinConservacin tincinMontaje y observacinIdentificacin Al animal sacrificado se realizo el siguientetratamiento. Sacrificar al animal y hacer una incisinen la lnea media ventralBusqueda de en la superficiede los organos internos ymenbranas serosas lapresencia de quistesExtrae cada organo y se pone ensolucin salinaSe cotara y/o desmenuzara cadaorgano en busca de helmintos yprotozoariosLimpiar al helminto y conservarlos enAFA Resultados: Tabla 1: Organismos encontrados en la practica organismo Clase Genero Especie Acaro Ciliophora* Balantidium sp Ascaris Secernentia Ascaris lumbricoides Faciola Trematoda Fasciola hepatica Sapo: Figura 1. Se muestra el pulmn de sapo en solucinsalina. En la parte inferior izquierda se puede observaruna Filaria. Cabe sealar que el pulmn se encontrinfestado con estar larvas.Figura 2. Filaria observada bajo el estereoscopioobtenido de pulmn de sapo, cabe sealar la estructura,la terminacin en punta y el intestino caractersticos.Figura 3. Filaria observada bajo el estereoscopioobtenido de intestino de sapo, cabe sealar la estructura,la terminacin en punta y el intestino caractersticos.

TINCIONES
Hematoxilina frrica modificadaLa hematoxilina es un colorante natural, cuyo productode oxidacin (la hematena) cumple la funcin decolorante. La hematena por s sola tiene poca afinidadpor los tejidos por lo tanto debe utilizarse con unmordiente. De acuerdo al mordiente tendremos lasdistintas hematoxilinas, entre ellas la frrica y lafosfotngstica.Hematoxilina Frrica >

Es una coloracin muy estable,que resulta til para estudiar detalles celulares finos puesbrinda una tincin ntida y bien diferenciada (ej.Extraccin muscular).En este caso se usan como mordientes sales de hierro,las que actan a la vez como agentes oxidantes. La lacafrrica que forman estas hemotoxilinas presenta colornegro o azul negro.Hematoxilina Fostotngstica > Esta tcnica se utiliza parael estudio del sistema nervioso central y tejidoconjuntivo, en particular estras musculares y fibras. Eneste caso el mordiente utilizado es el cidofosfotngstico. Resultados: cromatina, eritrocitos y ciliasse colorean azul oscuro, las estriaciones musculares azulcasi negro y los citoplasmas se colorean rosa plido.Para obtener buenas tinciones se recomienda usar elfijador Schaudinn.Solucin concentrada AHematoxilina 10.0gEtanol absoluto 1000.0mLSolucin concentrada BSulfato ferroso de amonio 10.0gSulfato frrico de amonio 10.0gcido clorhidrico 10.0mLAgua destilada 1000.0mLLas soluciones se almacenan a temperatura ambiente ysu vida media es de 6 meses.Solucin de trabajoSolucin concentrada A 15.0mLSolucin concentrada B 15.0mLPROCEDIMIENTOHacer un frotis en un portaobjetos y emulsionarlo consolucin salina isotnica; es necesario que la capa quededelgada. Antes de que las heces se sequen, se fija conSchaudinn durante sesenta minutos. (se puede dejartoda la noche en el fijador).Para eliminar los cristales del cloruro de mercurio secolocan las preparaciones en una solucin de etanol al70%-yodo durante cinco minutos . (la solucin alcoholyodo se prepara aadiendo unas gotas de yodo a 3% aletanol a 70%). Posteriormente, en etanol al 95% y enetanol al 70% (en ambos pasos durante cinco minutos).Se lavan al chorro de agua, dejando que el agua fluyadurante 10 minutos.Los portaobjetos se colocan en la solucin de trabajodurante cinco minutos.Se lavan al chorro de agua durante 10 minutos.Se deshidratan en etanol al 70%, 95% y etanol absoluto(cada paso ser de 5 minutos).Se transfieren las laminillas a xileno durante 10 minutos.Se cubren las laminillas con blsamo de Canada se colocaun cubreobjetos del nmero 1 y se dejan secar.Negro de ClorazolEsta tincin se usa para teir el esqueleto cuticular delos insectos, entero o en partes aisladas. El negro declorazol en un colorante que se fija extraordinariamentea la cutcula dando diferentes tonos de coloracin quehacen aparecer los ms finos detalles. Se recomiendautilizarla con muestras de materia fecal sin fijador.Solucin AEtanol 90% 170.0mLMetanol 100% 160.0mLcido actico glacial 20.0mLFenol lquido 20.0mLcido fosfotngstico 1% 12.0mLAgua destilada 618.0mLSolucin BNegro de clorazol 5.0gSolucin A 1000.0mLSe tritura el colorante (negro de clorazol) con algunosmililitros de la solucin A, y se sigue triturando hastaobtener una pasta sin grumos; se aade ms solucin A,se muele, se deja sedimentar y se vaca el sobrenadanteen otro recipiente. Se sigue moliendo y se vaca hastaque todo el colorante est en solucin. El colorante sealmacena de 4-6 semanas antes de usarse.PROCEDIMIENTOSe hace un frotis con las heces, y se evita que se seque.Se sumerge en el colorante durante 1-2 horas.Se coloca en etanol al 95%, durante 5 minutos. Despusen etanol al 100% por cinco minutos (se repite este pasouna vez ms).Se pasa al tolueno o xileno durante cinco minutos(repetir una vez).Se cubren las preparaciones con resina o blsamo deCnada, se coloca un cubreobjetos del nmero 1 y sedeja secar.Resultados: la cutcula toma el color de azul a negrosegn el grosor de la cutcula y el tiempo de exposicin alcolorante (Fig. 2A, 2B). Si no se quiere hacer el montaje

definitivo en blsamo de Canad, las piezas se puedenguardar indefinidamente en lactofenol o en alcoholbenzlico para observar directamente en el microscopio,slo hay que evitar que el lactofenol o el alcoholbenzlico se evaporen.3.- Nombre y desarrolle el ciclo biolgico de dosnemtodos hematfagos y parsitos del humano.NEMATODOS HEMATOFAGOS. W. bancrofti Wuchereria bancrofti es unparsitonemtodo,causante de la parasitosis humana llamadafilariasis linfticaytransmitida por variasespeciesdemosquitos.Su nombre fue dado por razn de los cientficosOtto WuchereryJoseph Bancroft,afecta a ms de 120 millones depersonas, principalmente enfrica, Suramricay otros pasestropicalesysubtropicales.De no tratarse la infeccin,puede resultar en unaenfermedaddenominadaelefantiasis. Ciclo de vidaW. bancrofti completan su ciclo de vida en doshospedadores:losseres humanossirven como el hospedador definitivo y los mosquitos son loshospedadores intermediarios. Los parsitos adultosresiden en elsistema linfticoy sonvivparos,es decir, sus cras se desarrollan en elvientrede la hembra.MicrofilariaEl primer estadio del parsito se denomina microfilaria yestn presentes elsistema circulatorio.Las microfilariascontinuamente migran de la circulacin profunda hastala circulacin perifrica. Durante el da estn presentesen lasvenasprofundas y durante la noche migran a lacirculacin perifrica, desde donde elgusanoestransferido alvector.Los vectoresartrpodosms comunes son los mosquitos de las especiesCulex, Anopheles, Aedes,yMansonia.Dentro de su segundo hospedador, la microfilaria madura a lalarvamotil. Unmosquito, delgneroArmigeres ingiriendo sangre de undedohumano.LarvaCuando el mosquito infestado se alimenta, deposita en lasangredel hospedador humano, la forma larval delgusano. La larva migra hacia losganglios linfticos, predominantemente a nivel de laspiernas(la ingle) y elreagenital,lugar donde se desarrolla en la forma adultadel parsito en el curso de aproximadamente un ao.Para entonces, lashembrasadultas pueden producirnuevas microfilarias. ovacunaspreventivas.Onchocerca volvulusLa oncocercosis es un padecimiento producido en elhombre por un nematodo: Onchocerca volvulusCiclo de onchocercaTrichuris trichiuraCiclo de vidaA: Eliminacin por materia fecal de huevos inmaduros .B: En presencia de condiciones optimas (25 - 30 C yelevada humedad) el huevo se torna maduro (larvadesarrollada) e infectante en el lapso de 2-4 semanas. C:Este huevo infectante es vehiculizado hasta el hombre(nico hospedero) a travs de tierra y alimentoscontaminados con la misma. D: El hombre ingiere loshuevos maduros producindose la liberacin de la larvaen el intestino delgado y su migracin hasta el ciegodonde se diferenciar a gusano adulto y luego de que lahembra se encuentre fecundada comenzar la liberacin de huevos al tubo digestivo para que estos seaneliminados con la materia feca
fuente : http://es.scribd.com/doc/15558712/Tecnicas-de-colecta-y-tincion-de-parasitosMicrobiologia-II

Tcnica de montaje
Las bacterias , junto con los protozoarios, algas microscpicas, hongos microscpicos (incluyendo levaduras) y virus, constituyen los llamados microorganismos. El trmino microorganismos no tiene un significado taxonmico preciso sino que agrupa a todos los organismos de dimensiones microscpicas (< 0.1mm) aunque presenten grandes diferencias entre si. As por ejemplo incluye organismos procariotas (bacterias), eucariota (hongos, protozoarios, algas) y virus. Tambin difieren notablemente en el tamao aunque sean todos microscpicos; en una escala comparativa tenemos: Protozoarios levadura bacterias - virus

Aunque existen miles de especies de bacterias diferentes, los organismos individuales presentan una de las tres formas generales siguiente: Elipsoidal o esfrica Cilndrica o en forma de bastn Espiral o helicoidal La bacterias esfricas o elipsoidales se denomina COCOS. Muchas bacterias con esta forma presentan modelos de agrupacin que derivan de los diversos planos de divisin celular. As tenemos: Cocos en pares (diplococos) ..Ej. Neisseria Cocos en cadena.Ej. Streptococcus Cocos en racimo..Ej. Staphylococcus Cocos en ttradas Ej. Pediococcus Cocos en cubo.Ej. Sarcina Cocos sin distribucin especial

Las clulas bacterianas cilndricas se denominan BACILOS o BASTONES y presentan otros modelos de agrupacin. As tenemos: Bacilos en cadenaEj Bacillus Bacilos en empalizadasEj. Corynebacterium Bacilos sin distribucin especial Las bacterias helicoidales se presentan en general como clulas individuales, independientes; pero las clulas de las distintas especies presentan notables diferencias de longitud, nmero y amplitud de las espiras y rigidez de la pared.

Muestr a

Porta