Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamn Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas

Dra. Ana Mara Lugo-Chinchilla Enero 2007

Agradecimientos Agradezco la ayuda de todos estudiantes, profesores y tcnicos de laboratorio que de una manera u otra colaboraron en la produccin de este manual. En especial agradezco a las siguientes personas: Dra. Zulma Rivera, Catedrtica Asociada, Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas, Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamn. (Editora). Dr. Juan Manuel Barbosa, profesor a tiempo parcial, Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas, Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamn. (Editor). Dr. Oscar Ruiz, Catedrtico Auxiliar, Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas, Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamn. (Bioinformtica). Sra. Hilda Cedeo, Tcnico de Laboratorio de Biologa, Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas, Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamn. (Asistencia en General). Srta. Irma Soto, estudiante, Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas, Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamn. (Asistencia en General). Srta. Yarelys Robles, estudiante, Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas, Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamn. (Fotografa y Asistencia en General). Srta. Silkia Rivera, estudiante, Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas, Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamn. (Asistencia en General).

Tabla de Contenido Pgina Agradecimientos Tabla de contenido Prontuario del curso BIOL 4605 Reglas de seguridad Informes de Laboratorio Ejercicio #1: Medicin, Instrumentacin, Presentacin de Resultados Ejercicio #2: Tcnicas para el establecimiento de cultivos celulares Ejercicio # 3: Fraccionamiento Celular Ejercicio # 4: Transformacin Bacteriana Ejercicio # 5: Purificacin de Protenas GFP Ejercicio # 6: Electroforesis de Protenas Ejercicio # 7: Extraccin de DNA Ejercicio # 8: PCR Ejercicio # 9: Efecto del alcohol en la Membrana Ejercicio # 10: DNA Fingerprinting Ejercicio # 11: Enzimas Ejercicio # 12: Ensayo de Fagocitosis Ejercicio # 13: Bioinformatica Ejercicio # 14: Biorremediacin 2 3 4 7 9 12 14 18 29 33 38 42 44 53 56 60 64 78 81

UNIVERSIDAD INTERAMERICANA DE PUERTO RICO Recinto de Bayamn Divisin de Artes y Ciencias Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas PRONTUARIO I. TTULO DEL CURSO: Laboratorio de Destrezas II: Tcnicas de Biologa Celular y Molecular. II. CDIGO Y NMERO: Biol. 4605 III. REQUISISTOS: Laboratorio de Destrezas II (Biol. 2013) IV. DESCRIPCIN DEL CURSO: Uso de tcnicas de biologa celular y molecular aplicables a la biotecnologa y a la investigacin cientfica. Se incluye la bioremediacin y la bioinformtica. Cuatro horas semanales. 2 crditos V. OBJETIVOS A. TERMINALES: 1. Manejar las tcnicas para el estudio de las biomolculas. 2. Comparar los resultados obtenidos del estudio de las biomolculas. 3. Evaluar la(s) tcnica(s) apropiada(s) para la solucin de un problema cientfico o proceder en una investigacin. B. OBJETIVOS CAPACITANTES: 1. Utilizar las siguientes tcnicas: electroforesis, transformar bacterias, purificacin de protenas, extraccin y amplificacin de DNA. 2. Practicar procesos de bioremediacin. 3. Valorar la importancia de la bioremediacin en el manejo de crisis ambientales. 4. Analizar los resultados obtenidos en un experimento. 5. Formular conclusiones basadas en el anlisis de los resultados. 6. Preparar un informe cientfico. 7. Identificar la tcnica apropiada para el anlisis del DNA o de las protenas. 8. Anlisis de macromolculas utilizando tcnicas computacionales. VI. CONTENIDO: 1. 2. 3. 4. Reglas de seguridad en celular y molecular; Formato de los informes de laboratorio Repaso de medicin e instrumentacin; Presentacin e interpretacin de resultados Extraccin de DNA: genmico Aislamiento de plasmidios

5. Bioinformtica 6. Enzimas de restriccin y metilacin 7. Transformacin de bacterias 8. Purificacin de protenas mediante columna de separacin 9. Extraccin de protenas y SDS-PAGE I 10. SDS- PAGE II 11. PCR 12. Bioremediacin VII. EVALUACIN: A. Criterios de Evaluacin: 1. Trabajo diario: Puntualidad y Asistencia; Dominio del procedimiento a realizarse; Seriedad en clase; Observar reglas de seguridad (bata, zapatos, guantes); Trabajo en equipo 10% 2. Informes de laboratorio 3. Examen Final 4. Trabajo de Investigacin B. Curva: 100-90 89-80 79-70 69-60 59-0 A B C D F 50% 25 % 15%

VIII. RECURSOS Y MATERIALES DIDCTICOS A. Texto: Manual de Laboratorio de Destrezas III: Diseado por la Dra. Ana Mara Lugo en colaboracin de facultad del Recinto de Bayamn. Se requiere el uso de bata de laboratorio, zapatos cerrados y pelo recogido. B. Referencias: www.accsessexcelence.org/AE/AEC/AEF/1994/brown_oil.html (Proyecto de Bioremediacin

Itinerario de Laboratorios Perodo 1 2 3 Actividad INTRODUCCIN Discusin de: Prontuario, Reglas de seguridad, formato informes de laboratorio LABORATORIO 1 Repaso de medicin e instrumentacin Presentacin e interpretacin de resultados LABORATORIO 2: Cultivo de Clulas Eucariotas: Tcnicas aspticas y preparacin medios de cultivo LABORATORIO 3: Fraccionamiento Celular LABORATORIO 4: Transformacin bacteriana (GFP) LABORATORIO 5: Purificacin de la protena GFP Crecimiento bacterial y Concentracin bacterial LABORATORIO 5 Parte II c. Lisis bacterial LABORATORIO 5: Parte III Cromatografa de columna LABORATORIO 6: Extraccin de protenas de msculo LABORATORIO 6 Parte II: Electroforesis de protenas (SDS-PAGE) LABORATORIO 7: Extraccin DNA de fresas Electroforesis de DNA y PCR (Traer fresas frescas) LABORATORIO 8: Efecto del alcohol en membranas biolgicas LABORATORIO 9: Enzimas REPASO EXAMEN Asignacin Traer bata y zapatos cerrados; traer sus laptops

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Entrega inf. Lab #1 (100pts) Traer coliflor y espinaca frescas Entrega inf. Lab #2 (100pts) Entrega inf. Lab #3 (100pt) Entrega inf. Lab #4 (100pt)

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Entrega inf. Lab #5 (200pt)

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Entrega inf. Lab #6 (200pts) Traer remolacha fresca y de pote Entrega inf. Lab #7 (100pt) Entrega inf. Lab #8(100pts) Entrega inf. Lab #9(100pt)

Informes de Laboratorio Una parte importante del desarrollo cientfico es la divulgacin de los hallazgos. Mediante esta divulgacin, conocemos lo que otros han hecho y podemos fortalecer nuestra gestin, como cientficos. La base de la divulgacin es el informe tcnico o informe de laboratorio. A travs de este informe puedes resumir lo que hiciste para contestar, al menos, cinco preguntas clave: Cul es la situacin sobre la cual quieres experimentar? (Introduccin) Por qu se hizo el ejercicio de laboratorio? (Objetivos) Cmo se llev a cabo el ejercicio? (Materiales y mtodos) Cules fueron los datos obtenidos (Resultados) Qu importancia o significado tienen los resultados? (Discusin y conclusiones)

Es importante sealar que en cualquier experimento podrs obtener resultados diferentes a los esperados. Despus de todo, si supieras los resultados de antemano, para qu experimentar? Bajo ningn concepto esto debe entenderse como un fracaso. Ms an, es mediante el anlisis y la experimentacin repetida que estamos tratando de entender. Muchos hallazgos de valor en las ciencias naturales se dieron por accidentes o casualidades que ocurrieron a estudiosos que supieron determinar el significado de los experimentos que condujeron. El informe de laboratorio es el material que presentars a tu instructor como prueba de que hiciste el experimento. Dicho informe debe basarse en los datos y observaciones que hayas anotado en tu libreta de laboratorio. Dicho informe deber ser entregado en la fecha acordada por el profesor. El informe se entregar digital. La libreta de laboratorio que utilizars durante todo el semestre y que tu instructor podra recoger en cualquier momento del semestre deber: 1. Estar identificada con tu nombre, nmero de seccin y nombre del instructor. 2. Tener las pginas enumeradas de antemano y cosidas (no de hoja suelta) y no tener pginas arrancadas. 3. Escrita con tinta (azul o negra), nunca con lpiz. Si es necesario corregir algn dato que ya escribiste, debers tacharlo pasando una sola raya sobre el error (de modo que el dato permanezca legible) escribiendo el dato correcto al lado del dato errneo y colocando tus iniciales sobre ambos datos (ver ejemplo en el Apndice). 4. Estar siempre en tu posesin. De esta manera, la podrs utilizar cada vez que necesites anotar datos y evitars tener que anotarlos en hojas de papel sueltas o en tu mano, de donde se pueden perder o borrar fcilmente. 5. Recoger los datos que generen otros miembros del grupo al que pertenezcas y que sean necesarios para tus anlisis fuera del saln de clases. En este curso se te requerir someter informe de laboratorio siguiendo los formatos cientficos utilizados ms comnmente. El informe recoge los puntos ms significativos del trabajo que realizaste y establece claramente qu se hizo, quin lo hizo, por qu se hizo, cmo se hizo, cules fueron los resultados y cul es el significado de esos resultados. El informe debe contener alguna informacin general que tu instructor solicitar. 7

Las partes de un informe tcnico del laboratorio son: 1. Ttulo: refleja en el contenido del experimento de forma que el lector pueda interesarse en la lectura. El ttulo debe ser corto pero informativo. 2. Lista de autores: todos aquellos que participaron en la redaccin, diseo o realizacin del experimento deben aparecer como autores del trabajo. Es importante que todos los miembros del grupo sean reconocidos. 3. Resumen: el resumen debe contener informacin suficiente sobre la introduccin, los materiales y mtodos, los resultados y la discusin. No debe pasar de un prrafo. 4. Introduccin: debe ser una descripcin breve de lo que se conoce con relacin al problema bajo estudio, de modo que el lector sepa qu se ha hecho y qu se sabe con relacin al problema. La introduccin debe exponer claramente por qu es necesario completar el experimento que te propones realizar e incluir los objetivos. Estos objetivos deben ser redactados antes de hacer el experimento, y deben ser realistas en trminos de tiempo y capacidad analtica del laboratorio. 5. Materiales y mtodos: esta parte del informe recoge la manera en que se condujo el experimento para contestar las preguntas formuladas o alcanzar los objetivos propuestos. La manera en que redactas esta parte del informe debe ser tan clara como para que cualquier otra persona, con acceso a los mismos reactivos y materiales, pueda obtener resultados similares. Este concepto se conoce como reproducibilidad y es una idea clave en las ciencias naturales. Los materiales y mtodos deben aparecer de forma resumida detallando lo que se hizo, cmo se hizo y en qu forma se hizo (por ejemplo, aad 5 mL de agua al tubo que contena el reactivo de cobre y mezcl por 30 segundos). Si utilizas un instrumento especifico (puede haber ms de uno en el saln) debes mencionar en tu informe cul fue el modelo utilizado. 6. Resultados: esta parte del informe recoge, precisamente, los datos que generamos del experimento. Es importante reconocer que no necesariamente estos resultados deben concordar con lo que esperamos. Siempre que puedas, debes presentar los datos en forma grfica (tablas o cuadros, grficas o dibujos). Estos permite la representacin concisa y clara de muchos datos en poco espacio. En la medida en que puedas, debes incluir en el informe de laboratorio las frmulas y clculos matemticos utilizados para obtener los resultados. 7. Discusin de los resultados: en esta parte del informe debes explicar los resultados y cul es su significado. Siempre que sea posible, debes comparar los resultados obtenidos con los resultados esperados y tratar de explicar las posibles razones para las discrepancias entre las cifras. Es aqu que podrs demostrar tu capacidad analtica e intuitiva. 8. Referencias: debes citar las referencias de todo lo que hayas usado para comparar, obtener informacin o guiarte en la realizacin del experimento. Mnimo 2. Es importante sealar que el trabajo de laboratorio en este curso te permitir desarrollar destrezas analticas que te servirn para entender mejor los procesos biolgicos y te prepararn adecuadamente para cursos futuros. En algunos casos dependers de tus compaeros de grupo para obtener e interpretar los datos obtenidos. Es muy importante que intercambies y discutas con ellos tus resultados. Scale el mejor provecho a tu experiencia y acude a tu instructor en caso de dudas.

Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamn Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas NOMBRE___________________ #SS________________________ FECHA____________________ Biologa Celular y Molecular Dra. Ana Mara Lugo Laboratorio 4605

Ejercicio #1: Repaso de medicin e instrumentacin; Presentacin e interpretacin de resultados OBJETIVOS DEL LABORATORIO 1. Aprender a manejar correctamente micropipetas, pipetas, probetas con el propsito de preparar soluciones. 2. Preparacin de soluciones dado por cientos de concentraciones 3. Preparacin de soluciones de determinada molaridad. 4. Preparacin de diluciones en serie. 5. Repaso de Excel y preparacin de grficas MATERIALES: Los estudiantes formaran grupos de 4/ mesa. MATERIAL CANTIDAD

Marcadores* 1 por estudiante * Micropipetas (1000, 200, 100, 10, 2 ul) 1 /mesa Puntas para micropipetas (1000,200 y 10) 1 caja de c/u por mesa Agua destilada 1 tanque por saln Colorante vegetal concentrado 1/mesa Vasos (Beakers) de 100 ml 2/mesa Microtubos no estriles de 1.5 ul 50/ mesa Alcohol 95 % 1 litro por saln Probetas de 100 ml 2/mesa Goteros 2/mesa Pipetas Pasteur con bulbos 2 por mesa Sal (NaCl) 100 gramos /saln Balanza (previamente calibradas) 4 Papel de pesada 1 caja Patos para pesar la sal 8 Papel parafina / tijera 1 rollo por saln Matraces de 100 ml con 100 ml solucin con Colorante rojo 8 matraces (800 ml solucin) Tubos con 5 ml de agua (rotular Pen/Str) 8 tubos ( 40 ml) Tubos con 10 ml solucin amarilla (rotular FBS) 8 tubos ( 80 ml)

Pipetas de 10 ml/ con su pipeteador mecnico Pipetas de 1 ml/con su pipeteador mecnico Tubos de 10 ml * Materiales a ser trados por los estudiantes

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Ejercicio 1: Presicin en tus medidas de volumen. Utilizacin de micropipetas: Luego de que el profesor d una breve explicacin sobre el manejo de las micropipetas realice el siguiente ejercicio: 1. Prepara en un beaker de 100 ml, una solucin de tinte vegetal. Mezcla 100 ml de agua destilada y adele algunas gotas de tinte vegetal para que coloree el agua. Esta solucin ser utilizadaza por todos los miembros de tu grupo. 2. Cada estudiante deber rotular varios microtubos con los siguientes volmenes: a. 1000 ul = 1 ml b. 500 ul c. 250 ul d. 200 ul e. 100 ul f. 50 ul g. 10 ul h. 1 ul 3. Utilizando la micropipeta de 1000 para llenar con la solucin de tinte los tubos a, b y c. 4. Utilizando la micropipeta de 200 para llenar el tubo d. 5. Utilizando la micropipeta de 100 llena los tubos e y f. 6. Utilizando la micropipeta de 10 llena el tubo g. 7. Utilizando la micropipeta de 2 llena el tubo h. 8. Compara el volumen de tus tubos con el de los tubos controles preparados por el profesor. De esta forma podrs estar seguro (a) de que utilizas bien este instrumento. Si alguna de tus medidas est mal tomada, hazla nuevamente. Ejercicio 2: Preparacin de soluciones Ha realizar en grupo. Preparars 100 ml de alcohol 70 % a partir de alcohol 95 %. 1. Con ayuda de tus compaeros realiza los cmputos necesarios para hacer esta solucin. Confirma tus clculos con el profesor. 2. Utiliza la probeta de 100 ml para hacer tu solucin. Espacio para cmputos:

Explica:_________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________

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______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ________________ Ejercicio 3: Preparacin de Soluciones Ha realizar por grupo: Prepara 100 ml de una solucin de sal al 10 %. 1. Con ayuda de tus compaeros realiza los cmputos necesarios para hacer esta solucin. Confirma tus clculos con el profesor. 2. Utiliza la probeta de 100 ml para hacer tu solucin. Espacio para cmputos:

Explica:_________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______

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Ejercicio 4: Preparacin de medio de cultivo En este ejercicio simularemos la preparacin de un medio de cultivo. Haremos esto ya que los materiales verdaderos son muy costosos y debemos manejarlos de forma estril. Preparars con tu grupo el medio de cultivo conocido como RPMI. Este medio deber ser suplementado con 1% de Penicilina-Estreptomicina/antimictico y con 10 % de FBS (suero fetal bovino). Materiales: 1. 100 ml del medio RPMI (matraces de 100 ml con solucin colorante rojo) 2. Solucin de 100 % de Penicilina /Estreptomicina/antimictico (tubos de 5 ml solucin transparente). 3. FBS puro (tubos con 10 ml solucin amarilla) 4. Pipetas de 10 ml 5. micropipeta de 1000 ul 6. Parafina Realiza los clculos para hacer 100 ml de RPMI, 1 % Pen / Strep y 10 % FBS. Confirma tus cmputos con el profesor. Cmputos:

Explica como hars tu medio ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ________

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Ejercicio 5: Diluciones en serie. A partir del medio RPMI que preparaste, prepara diluciones 1/10, 1/100, 1/1000 y 1/10,000. Utiliza 4 tubos, 1 pipeta de 10 ml y 4 pipetas de 1 ml (o 4 puntas azules y la micropipeta de 1000 ul), 40 ml de agua destilada y por supuesto tu stock del medio RPMI. Explica como hars las diluciones de tu medio. Puedes hacer un diagrama. Consulta tu racionamiento con tu profesor. ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ _________________________________ Ejercicio 6: Preparacin de una solucin x molar. a. Eres un bilogo y trabajas en cultivo de clulas. Suponte que tienes que preparar una solucin de la droga Nx a una concentracin de 1 (molar) M. El peso molecular (PM) de Nx es de 363.8. Quieres preparar 10 ml totales. Explica cmo lo haras. Recuerda que : 1M = PM/1 litro.

b. Cmo prepararas 10 ml de un stock 10-3 M (mM) de la misma droga (Nx). PM=363.8 Recuerda que 1 gramo = 1000 mg.

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Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamn Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas Laboratorio de Destrezas III Autor: Dra. Ana Mara Lugo Tcnicas para el establecimiento de Cultivos Celulares: Tcnicas aspticas y preparacin medios de cultivo Propsito: El propsito de esta experiencia de laboratorio es que el estudiante: 1. Se familiarice con las tcnicas de cultivo de clulas eucariticas 2. Conozca el manejo de animales de laboratorio en especial ratones 3. Conozca las principales tcnicas aspticas 4. Prepare medios de cultivo suplementados con suero y antibiticos/antimictico 5. Aprenda a lavar clulas por centrifugacin 6. Conozca como contar clulas utilizando el hemocitmetro 7. Siembre e incube clulas eucariticas 8. Conozca los equipos y cuidados de trabajar en un cuarto de cultivo 9. Se familiarize con equipo tales como: extractores laminales de cultivo (laminal flood hood, incubadoras de CO2, centrfugas refrigeradas, baos para mantener temperatura constante, filtros para medios Nalgene, hemocitmetros, micropipetas, contadores de clulas, pipetiadores automticos. Parte 1: Extraccin de las clulas Materiales/Equipo Alcohol 70 % en botellas de lavado Lancetas/gasas con alcohol Tubo de 15 ml estril PBS 1X fro en hielo Pipetas estriles de 10 ml Pipeteador automtico instalado en hood Hood de cultivo Para grupos de 4 estudiantes 1 botella/mesa 1/mesa 1/mesa 200 ml 1paquete/saln 1 1

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Guantes Marcadores negros Caja para descartar lancetas usadas *** Materiales trados por los estudiantes Procedimiento 1. 2. 3. 4. 5.

*** *** 1/saln

Prender el Hood. Lavar el Hood con alcohol 70 %. Lavar todo lo que entra al Hood inclusive las manos. Filtrar el PBS 1X utilizando un filtro Nalgene para esterilizar la solucin. Llenar con 10 ml de PBS 1X fro los tubos de 15 ml estriles. Un estudiante voluntario por mesa se sacar sangre del dedo y la echar dentro del tubo de 10 ml de PBS. Deber obtener aproximadamente 0.1cc de sangre/tubo (100 ul= 5-8 gotas

Parte 2: Lavados de las clulas Materiales/Equipo Beakers de 400 ml Micropipetas de 1000 ml y 200 ml Puntas de micropipetas estriles (1000 y 200) Centrfuga refrigerada a 4 grados C, 1000 rpm (usaremos la del cuarto de cultivo) Para grupos de 4 estudiantes 1/mesa 1 de cada/mesa 1 caja de cada/saln 1/saln

Procedimiento

1. Una vez obtenida la sangre y resuspendida en los 10 ml de PBS 1X estril, se centrifugar a 100 rpm por 10 min. a 4 grados C de temperatura. 2. Se descartar el sobrenadante dentro del hood en los beakers de 400 ml provistos para esto. Tener cuidado de no perder el pellet. Lo mejor es remover el sobrenadante con una pipeta estril. 3. Se resuspender el pellet en 10 ml de PBS estril fro y se volver a centrifugar como antes. 4. Al finalizar este lavado se resuspender la sangre en el medio de cultivo RPMI suplementado con penicilina y estreptomicina y antimictico. 5. En lo que se centrifuga (10 min.)se har el medio de cultivo uno por saln.

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Parte 3: Preparacin del medio de cultivo Materiales/Equipo RPMI medium FBS (suero fetal bovino) Penicilina/Streptomicina/antimictico Filtros de 0.2 um/ 500 ml Bao a 37 grados C (preparado previamente) Pipeta de 25 ml estril Procedimiento 1. Hacer 500 ml de RPMI al 10% de FBS y al 1% de pen/strep 2. Consulta tus cmputos con el profesor 3. Esterilizar el medio utilizando un filtro Nalgene 0.2 um de 500 ml Clculos: Por saln 500 ml 50 ml 10 ml 1 1/saln 1

Parte 4: Sembrar clulas Materiales/Equipo Hemocitmetros Papel de lente Kimwipes pequeos Microscopios Compuestos Microtubos Calculadoras Tubos de 50 ml estriles Placas estriles de 24 pozos *** Materiales trados por los estudiantes Por mesa 1/mesa 1 paquete/saln 1 caja/saln 8 2/mesa *** 1 paquete/saln 1/mesa

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Procedimiento 1. Preparar una dilucin de 1/10 de la sangre. Para esto toma 40 ul de la sangre y 360 ul de medio de cultivo RPMI y mzclalos dentro de un microtubo estril. Puedes pipetear suavemente con la micropipeta de 1000. 2. Prepara una dilucin de 1/100 de tu sangre. Para esto haz una dilucin de 1/10 de la dilucin anterior. Es decir estas realizando diluciones en serie. 3. Consulta tu procedimiento con el profesor. 4. Prepara el hemocitmetro. Limpia con alcohol y mntale el cubreobjeto. OJO de no perder el mismo pues es muy delicado y caro. 5. Llena uno de los lados del hemocitmetro con la dilucin de 1/100 que preparaste. 6. Cuenta en el hemocitmetro las clulas que estn en los 4 cuadrantes. 7. Determinar el # de clulas por ml que tienes en el tubo original de sangre. ________#de clulas contadas/4 (10dilucin) (104) = # clulas / ml Si la dilucin es 1/100 el exponente ser 2.

8. Sembrar 1.5 x 104 clulas por pozo. En cada pozo debers colocar un volumen total de 1 ml. Sembrars 10 pozos de la placa de 24 pozos totales. Determinar cuantas clulas totales necesitas para tu cultivo. #cel x # pozos= Cuanto volumen total necesitas para tu cultivo. # pozos x volumen en ml/ pozo= Determina cuanto del tubo original necesitas tomar donde tengas el # total de clulas para tu cultivo

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La mezcla que necesitas hacer para tu cultivo ser de: __________ml del tubo con sangre + __________ml de RPMI

9. Luego de hacer la mezcla deposita en cada pozo las clulas a sembrar. 10. Visita el cuarto de cultivo para que las coloques en la incubadora de CO2 a 36 grados. 11. Debers apagar y recoger todo. Debers lavar el HOOD con alcohol antes de irte.

NOTAS al Tcnico del Laboratorio: 1. Preparar con anticipacin un bao a 37 grados C. La temperatura debe ser constante. 2. Prender el hood con 30 min. de anticipacin. 3. Prender con anticipacin ( 30 min.) la centrfuga refrigerada del cuarto de cultivo a 4 grados C. 4. Preparar una bomba de succin para poder realizar la filtracin del medio de cultivo dentro del hood.

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Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamn Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas Fraccionamiento Celular Introduccin La fraccionacin celular es utilizada por los bilogos celulares para investigar la bioqumica y fisiologa de organelos celulares sin el complejo ambiente de una clula intacta. Esta metodologa se desarroll en el 1930 por Bensley y Hoerr cuando aislaron mitocondrias y por Granick al aislar cloroplastos. En general el mtodo consiste en romper la membrana plasmtica para liberar el contenido total de la clula seguido por centrifugaciones diferenciales para separar los diferentes organelos. La observacin por el microscopio compuesto de la fraccin se utiliza para confirmar su pureza. El propsito principal de este proyecto es el que los estudiantes aislen cloroplastos, ncleos y mitocndrias de tejido vegetal utilizando el mtodo de fraccionacin celular. HOMOGENIZACIN Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender en un medio apropiado(una solucin amortiguadora, salina azcar isotnica). Para mantener la integridad de los organelos y enzimas durante el procedimiento de la fraccionacin , todas las soluciones y cristalera debe mantenerse fras. Despus de rebanar las hojas, el tejido est preparado para la homogenizacin, procedimiento que rompe los enlaces celulares y libera el contenido celular, sin daar el medio en suspensin. La suspensin de clulas constituyentes se llama homogenado. Para los tejidos de plantas, la homogenizacin se debe realizar con un mortero(fig.1), al cual se le aade arena como abrasivo. En este proyecto los cloroplastos se aislarn de la espinaca; ncleos y mitocondria se aislarn de la coliflor. CENTRIFUGACION Debido a las diferencias en tamao y densidad, cada componente celular est sujeto a una fuerza centrfuga. La fuerza generada por la centrfuga se expresa como fuerza centrfuga relativa(RCF)en unidades de g. La RCF es una funcin de velocidad de centrifugacin en revoluciones por minutos (rpm) y la distancia de partculas desde el eje de rotacin. Conociendo esta distancia (x) y el (rpm), se puede determinar el RCF de la ecuacin : RCF = 1.19 x 10-5 (rpm)2x, donde x se toma como la distancia (en cm) desde el eje de rotacin hasta el margen de afuera del tubo de centrfuga.

CENTRIFUGACION DIFERENCIAL En la centrifugacin diferencial, el homogenado es centrifugado repetidas veces a altas velocidades ,sedimentndolo progresivamente en pequeas partculas. El mtodo est ilustrado en la fig. 2. La primera centrifugacin es a 600g por 10 minutos, el cual sedimenta la fraccin nuclear. Este pellet contiene el ncleo, clulas intactas y tejido.. L prxima separacin es el sobrenadante postnuclear partculas suspendidas en lquido sobre el pellet nuclear, el cual es tranferido a

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otro tubo de centrfuga y se centrfuga a 10,000 g por 30 minutos en una centrfuga refrigerada. El material sedimentado se conoce como fraccin mitocondrial ; ste contiene mitocondria y micro cuerpos. Los cloroplastos de las clulas de espinaca se aislarn utilizando el mtodo modificado de F.R Whatley y D.I.Arnon (1962). La espinaca se homogeniza en un amortiguador de sal. Despus que el tejido de la planta se macera en un mortero, el homogenado se filtra a travs de una gaza para remover los pedazos grandes de tejidos. El filtrado es centrifugado a 200 g por 1 minuto. El sobrenadante se centrfuga a 1300 g por 5 minutos, sedimentando los clorosplastos. La fraccin nuclear y mitocondrial de las clulas de las clulas de la coliflor se obtendrn utilizando una centrifugacin diferencial escrita por W.D. Bonner (1967). El tejido se homogeniza en una solucin amortiguadora de mannitol. Despus se la filtracin a travs de una gaza, el homogenado es centrifugado como se ilustra en la fig. 2, paso 3. 

EXAMINACION MICROSCPICA Todas la s fracciones aisladas se examinarn microscpicamente para identificar los organelos presentes. Cloroplastos. Los cloroplastos son relativamente rganelos grandes, por lo tanto, se algunos detalles internos se observan con el microscopio de luz. Luego de examinar la morfologa normal de los cloroplastos de la espinaca, se estudiarn los efectos de dos compuestos orgnicos. Los cloroplastos sern tratados con una solucin saturada de urea y una solucin acuosa de Triton X-100, el cual es un detergente fuerte. Urea es conocida para desnaturalizar protenas, alguna de las cuales salen de la membrana de los cloroplastos.

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Ncleo. Para la observacin de los ncleos se debe realizar una tincin. El tinte a utilizar ser lacto-aceto-orcein, el cual tie de rojo la cromatina. Cada nucleolo aparece como un rea prominente, redonda y clara. Mitocondria. Las mitocondrias son teidas con el tinte Janus green B. Despus de la tincin, la mitocondria tie azul-verdosa, la cual es el color del tinte en su forma oxidada; en su forma reducida, el tinte es incoloro. El Janus green se mantiene en estado oxidado por el sistema de oxidasa citocromo de la mitocondria. Equipo y materiales: Balanza Hojas de Espinacas frescas (no de lata) Navajas o bisturis Amortiguador Tris-NaCl fro Arena Morteros Gasa para filtrar Tubos de centrfuga de 15 ml Tubos de centrfuga de 50 ml Reglas milimetradas Probetas de 10 ml Pipetas de 10 ml/pipeteadores Pipetas Pasteur Parafina en pedazos Bano con hielo Microscopios compuestos con vernier par medir Laminillas y cubreobjetos Goteros Aceite de inmersin Papel de lente Solucin de Urea Solucin de Triton X-100 2% Coliflor Medio mannitol frio esptulas tubos de ensayo tinte nuclear lacto-aceto-orcein papael secante Tinte verde Janus Cantidad 2 por saln 1 paqte/grupo 8 300 ml 100 g 8 30 10 20 8 10 10 10 20 8 8 1 caja 8 8 1 10 ml 10 ml 1pqte 500 ml 10 10

PROCEDIMIENTO: DETERMINACIN DE LAS VELOCIDADES DE CENTRIFUGACION REQUERIDAS PARA EL AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS 1. Mide el radio del rotor ( la distancia en centmetros desde el centro del rotor hasta el extremo inferior de un tubo de centrfuga colocado horizontalmente). Anote este dato en la tabla de la pg. 125.

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1. Calcula las rpm requeridas para cada una de las centrifugaciones (200g y 1300g) para obtener una fraccin conteniendo cloroplastos, usando la frmula RCF= 1.119 x 10-2 (rpm)26 x. Anote los datos en la tabla de la pgina 125. 2. Usando los datos obtenidos en el paso anterior ajusta el tacmetro en la centrfuga con el propsito e obtener los rpm requeridos equivalentes a 200 g y a 1,300 g. II. AISLAMIENTO DE LA FRACCION DE CLOROPLASTOS Pese 4 g de hojas frescas de espinaca, a las cuales se les removieron las venacentrales. 1. Corte las hojas en pequeos pedazos y colquelas en un mortero fro. 2. Aada 15 ml de la solucin amortiguadora de Tris-NaCl fra y arena purificada. Macere el tejido por 2 minutos. 3. Filtre la suspensin a travs de varias capas de gaza a un tubo de centrfuga de 15 ml fro. 4. Centrifuge el lquido filtrado a 200 g por 1 minuto. Verifique que los tubos de centrfuga estn balanceados. 5. Decante el sobre nadante a un tubo fro y centrifuge a 1300 g por 5 minutos. 6. Despus de la centrifugacin, mida las distancias A y B (Fig. 10.3). A es la distancia en centmetros desde el extremo inferior del tubo de centrfuga al tope del pellet. Anote los datos en la pgina 125; stos se utilizarn para calcular el Coeficiente de Sedimentacin. 7. Decante y descarte el sobre nadante y usando una probeta , asda 10 ml de la solucin amortiguadora fra de Tris-NaCl al pellet que qued en el tubo de centrfuga. Resuspenda el pellet con una pipeta Pasteur. 8. Tape el tubo de centrfuga, e invierta el mismo para mezclar su contenido. Colocar en hielo.

III.

OBSERVACIN MICROSCPICA DE LA FRACCION DE CLOROPLASTOS 1. Con una pipeta Pasteur remueva una gota de la suspensin de cloroplastos y lleve a cabo una preparacin hmeda wet mount. Use una pequea gota de modo que no tenga que ejercer presin sobre el cubreobjetos, daando los cloroplastos. 2. Examine los cloroplastos bajo el objetivo de alta potencia y luego y luego bajo el objetivo de inmersin en aceite. 3. Mida el largo de y el ancho de 5 cloroplastos. Anote los datos en la pgina 12 4. Observa la morfologa de varios cloroplastos. Identifica los cloroplastos que tengan una morfologa interna poco homognea y contesta las preguntas de las pgina 12. 5. En el espacio provista en la pgina 1, represente con un diagrama los cloroplastos que muestren detalles internos e identifique sus estructuras.

IV.

OBSERVACIN MICROSCPICA DE LOS CLOROPLASTOS TRATADOS CON UREA

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1. Coloque una pequea gota de la suspensin de cloroplastos en una laminilla limpia. Aada una gota de la solucin de urea saturada y coloque un cubreobjetos. Cuidado de no presionar el cubreobjetos. 2. Examine los cloroplastos bajo el objetivo de alta potencia y el de inmersin de aceite por 5 minutos y conteste las preguntas de la pgina 12 3. Dibuje los cloroplastos que presenten una morfologa alterada.

V.

OBSERVACIN MICROSCPICA DE LOS CLOROPLASTOS TRATADOS CON TRITON 1. Prepare un montaje hmedo usando una pequea gota de la suspensin de cloroplastos y una gota de solucin de Triton X-100 al 2%. 2. Examine la preparacin bajo el objetivo de alta potencia y el de inmersin de aceite y conteste las preguntas de la pgina 12. DETERMINACIN DEL COEFICIENTE DE SEDIMENTACIN 1. Determine el coeficiente de sedimentacin para los cloroplastos que inicialmente estaban en la parte superior de la suspensin y luego de la centrifugacin se movieron al tope de l pellet. Para determinar S, calcule la distancias X1 y X2. Como de se demuestra en la fig. 10.3; X1= radio del rotor- A; y X2= radio del rotor-B. Anote los valores para X1 y X2 en la tabla de la pg. 11. 1. Anote los valores para rpm y (t2-t1) (en segundos). Calcule S usando la ecuacin : S= 210 log(x2/x1) (rpm)2 (t2-t1)

VII.

VIII. AISLAMIENTO DE FRACCIONES CELULARES Y MITOCONDRIALES 2. Remueva 20 g de la parte externa del coliflor con un escalpelo. 3. Coloque el tejido en un mortero fro con 40 ml de medio de maceracin de Mannitol (Mannitol grinding medium) y 5 g de arena purificada. Macrelos tejidos por 4 minutos. 4. Filtre la suspensin a travs de 4 capas de gaza a un tubo de centrfuga. Deje reposar el tubo por 2 minutos. 5. Decante cuidadosamente el sobre nadante a un tubo y centrifuge a 600 g por 10 min. a 0-4 C . 6. Decante el sobre nadante post nuclear a un tubo de centrfuga y coloque el pellet nuclear en un bao de hielo. 7. Centrifuge el sobre nadante post nuclear a 10,000 g por 30 min a 0-4 C. Durante la centrifugacin examine microscpicamente .

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8. Decante y descarte el sobre nadante post mitocondrial y aada 5 ml del medio e mannitol fro al pellet mitocondrial. 9. Con una esptula remueva el pellet mitocondrial de las paredes del tubo de centrfuga y luego con una pipeta Pasteur, resuspndalo en el medio de mannitol. 10. Transfiera la suspensin mitocondrial a un tubo de ensayo y colquelo en un bao de hielo. IX. OBSERVACIN MICROSCPICA DE LA FRACCION NUCLEAR

1. Con una esptula remueva una pequea cantidad del pellet nuclear y aplquelo en una laminilla. Aada varias gotas del tinte para ncleo lacto-aceto-orceina. Luego de 15 seg, aada un cubreobjetos y remueva usando un poco de presin el exceso de tinte con papel toalla. 2. Examine la preparacin bajo el objetivo de alta potencia usando un filtro verde. Luego de identificar los ncleos, utilice el objetivo de inmersin en aceite. Mida sus dimetros y antelos en el espacio provisto en la pg. 12 3. Represente con un diagrama los ncleos observados e identifique los nuclelos. X. OBSERVACIN MICROSCPICA DE LA FRACCION MITOCONDRIAL

1. Coloque 5 gotas de la suspensin mitocondrial en un tubo pequeo. Aada 5 gotas del tinte verde Janus (Janus green stain), agite y espere 10 minutos. 2. Coloque una gota de la mezcla en una laminilla limpia y observe bajo el objetiva de alta potencia y el de inmersin en aceite del microscopio. Identifique las mitocondrias. 3. Mida el largo y ancho de 5 mitocondrias. Calcule la media de los valores. Anote los datos en la pg.12 4. Observe la morfologa de las mitocondrias y conteste las preguntas de la pg.13.

Referencias: Bregman, Allyn. Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. 3d Ed. 1990. John Wiley & Sons, N.Y.

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INCLUIR EN EL INFORME DE LABORATORIO

Nombre
Fecha: Ejercicios y Preguntas:

Seccin:

DETERMINACIN DE VELOCIDADES DE CENTRIFUGACION REQUERIDA PARA AISLAR CLOROPLASTOS

RCF 200 g 1300 g

Radio del Rotor(cm)

rpm requerido

AISLAMIENTO DE LA FRACCION DE CLOROPLASTOS

A=_______ cm; B= ________ cm

DETERMINACIN DEL COEFICIENTE DE SEDIMENTACIN

x1 x2 rpm (t 2 - t1 ) s S

Compare el valor de S para el sedimento de cloroplastos en agua pura a 20C, es el valor obtenidos de S en el amortiguador de Tris-NaCl un bajoestimado sobreesstimado? Explique

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Nombre:
Fecha: Observaciones y Preguntas:

Seccin:

EXAMINACION MICROSCPICAS DE LA FRACCION DE CLOROPLASTOS Largo y ancho de los cloroplastos(m) Cloroplasto Largo Ancho 1 2 3 4 5 X=_______(m) X=_______(m)

Cul es la forma de un cloroplasto individual ?

Qu estructuras son visibles en los cloroplastos ?

EXAMINACION MICROSCPICAS DE LOS CLOROPLASTOS TRATADOS CON UREA Qu cambios morfolgicos ocurren en los cloroplastos?

En presencia de luz qu sabe usted de la accin de la urea, explique sus observaciones.

EXAMINACION MICROSCPICAS DE LOS CLOROPLASTOS TRATADOS CON UREA Qu cambios morfolgicos ocurren en los cloroplastos?

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En presencia de luz qu sabe usted de la accin de Triton X-100, explique sus observaciones.

EXAMINACION MICROSCPICAS DE LA FRACCION NUCLEAR Dimetro nuclear (m)

Ejercicios: Determinacin de la velocidad centrifugada requerida para cloroplastos: RCF 200 g 1300 g Isolacin de los Cloroplastos: A = ______________ cm B = ______________ cm Observaciones y Preguntas: Examinaci microscpica de la fraccionacin de Cloroplastos: Cloroplastos Longitud Ancho Cmo es la forma de cada cloroplasto? 1 2 3 4 5 X = ____ um X = ____ um Rotor del radio en cm rpm requeridos

Qu estructuras son visibles dentro de los cloroplastos? Microscopa de fraccin nuclear: Diametros (um)

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Ncleos Longitud Ancho

5 X = ____ um X = ____ um

Fraccin Mitocondrial:

Mitocondrias Longitud

5 X = ____ um

Todas las mitocondrias tienen la misma forma?

Describe su morfologa.

Preguntas: 1. 2. 3. Cul alcohol daa membrana vegetal la remolacha a menor concentracin? Cul de los 3 alcoholes afecta ms la membrana? Cul es la relacin entre el tamao de la molcula de alcohol y el dao a la membrana? Realice una hiptesis al respecto.

Referencias: www.galeon.com/melaniocoronado/ALCOHOLES.pdf

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TRANSFORMACIN BACTERIANA (Bacterial Transformation Kit- BIO-RAD) En este laboratorio se realizar una transformacin gentica. Un gen es un pedazo de DNA el cual provee las instrucciones para hacer (o codifica para) una protena. Esta protena le da a un organismo una caracterstica particular. La transformacin gentica ocurre cuando una clula incorpora dentro de ella y expresa un nuevo pedazo de material gentico ( DNA). Esta nueva informacin gentica muchas veces provee al organismo de una nueva caracterstica que se puede identificar luego de ocurrida la transformacin Transformacin gentica literalmente significa cambio causado por genes e involucra la insercin de uno o ms genes en el organismo en orden de cambiar las caractersticas del organismo. La transformacin gentica es utilizada en muchas reas de la biotecnologa. En la agricultura genes que codifican para caractersticas como la resistencia en contra de descomposicin, congelacin y alimaas pueden ser transformadas genticamente en las plantas. En la biorremediacin, bacterias pueden ser genticamente transformadas con genes que le permiten digerir derrames de petrleo. En la medicina, enfermedades causadas por genes defectuosos se estn empezando a tratar con terapia gentica; en otras palabras se transforma genticamente la clula de una persona enferma con copia sana del gene defectuoso que causa la enfermedad. Los genes pueden ser sacados del genoma humano, animal o vegetal y puestos dentro de una bacteria. Por ejemplo, la hormona insulina humana es producida ahora por bacterias, purificada y vendida en nuestras farmacias para el tratamiento de la diabetes ya que en los pacientes con esta enfermedad sus genes no funcionan normalmente. En este laboratorio se utilizar un procedimiento que transformar la bacteria E. coli con un gene que codifica para una protena fluorescente de color verde (GFP). Este gene ha sido extrado de una medusa o agua viva que es fluorescente y bioluminiscente, su nombre: Aequorea victoria. La protena fluorescente verdosa causa que la medusa florezca y brille en la oscuridad. Seguido del proceso de transformacin, la bacteria expresa el gene de medusa adquirido y produce la protena fluorescente, la cual causa que la colonia brille de un verde brillante bajo la luz ultravioleta. En esta actividad usted aprender el proceso de mover un gene de un organismo a otro con la ayuda de un plasmido. Las bacteria dems de poseer un cromosoma grande, comnmente poseen pequeos pedazos circulares de DNA llamados plsmidos (uno o mas de estos). El ADN del plasmido usualmente contiene genes para una o mas caractersticas que pueden ser beneficiosa para la sobre vivencia de la bacteria. En la naturaleza las bacterias pueden transferir plasmidos entre ellas permitiendo as compartir genes beneficiosos. Este mecanismo en la naturaleza le permite a las bacterias adaptarse a nuevos ambientes. En este ejercicio usted utilizara el plasmidio pGLO que contiene el gene para hacer la GFP. Usted introducir el pGLO a la bacteria E coli. Osea realizar una transformacin bacterial. 29

Los plasmidos pGLO nicos de Bio-Rad contienen adems un gene de resistencia al antibitico ampicilina (amp). El pGLO tambin incorpora un sistema especial de regulacin gentica. Este sistema puede ser usado para el control de la expresin de la protena fluorescente en clulas transformadas. El gene para GFP puede ser activado o prendido en clulas transformadas al aadir el azcar arabinosa al medio de cultivo donde crecen las clulas. Luego de realizar la transformacin se crecen las clulas en medio LB y en presencia de ampicilina. La ampicilina evita que bacterias no transformadas crezcan en el plato de cultivo. Las colonias de clulas transformadas aparecen de color blanco en los platos que contienen medio LB y ampicilina. Para inducir la expresin del gene de GFP tenemos que crecer las bacterias en presencia de arabinosa. Las bacterias crecidas en LB con arabinosa y con ampicilina se vern fluorescentes de color verde en lugar de blancas. Procedimiento: 1. Identifique un micro tubo con +DNA y otro con DNA. Anote sus iniciales. Coloque los micro tubos en el estante de foam. 2. Abra los tubos y utilizando una pipeta de transferencia estril, aada 250 L de la solucin de transformacin (CaCl2). 3. Coloque los tubos en hielo. 4. Con un loop estril tome una colonia aislada del plato que contiene el cultivo bacteriano. Colquelo en el micro tubo rotulado +DNA, verifique que la colonia se disperse en la solucin de transformacin. Coloque el tubo nuevamente en el hielo. Repita este procedimiento con el tubo rotulado DNA. 5. Observe la solucin del DNA pGLO bajo la luz ultravioleta. Anote sus observaciones. Sumerja un loop estril en el tubo con el plasmido, observe que tenga solucin y mezcle en el tubo rotulado +DNA. Cierre el tubo y coloque nuevamente en hielo. No aada el plasmido al tubo rotulado DNA. 6. Incube los tubos en hielo por 10 minutos 7. Mientras los tubos estan en el hielo; rotule los platos de agar en la parte inferior,no como se muestra en la figura. 8. Realice el choque de calor. Usando la gradilla de foam transfiera ambos tubos en el bao de agua ajustado a 42 C , por exactamente 50 segundos. Asegurse que todos los tubos estn sumergidos en el agua. Cuando pase el tiempo requerido, coloque los tubos en hielo. Para mejores resultados el cambio el cambio de hielo (0C) a 42C y luego colocarlo en hielo debe ser rpido. Incube los tubos en hielo por 2 minutos. 9. Remueva la gradilla que contiene los tubos del hielo. Usando una pipeta estril, aada 250 l del caldo LB en cada tubo y cirrelo. Repita lo mismo con el otro tubo e incube ambos tubos por 10 minutos a temperatura ambiente.

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10. Tape los tubos y mezcle. Usando una pipeta nueva, transfiera 100 l de las suspensiones de transformacin y el control. 11. Utilice una pipeta estril para cada plato. Esparza cada superficie de los platos. 12. Invierta los platos y cbralos con cinta adhesiva. Rotule con su nombre y coloque en la incubadora a 37C hasta el prximo da. 13. Favor de limpiar las mesas con lisol y recoger todo material en el carrito de la tcnica.

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Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamn Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas
PURIFICACION DE LA PROTEINA GFP UTILIZANDO CROMATOGRAFIA DE COLUMNA (Green Fluorescent Purification Protein Kit-BIO-RAD) En este ejercicio de laboratorio los estudiantes utilizarn la bacteria transformada con el plasmido en el ejercicio anterior. La bacteria transformada , la cual produce una protena verde flouescente , es purificada de contaminates bacterial utilizado una columna de cromatografa . La purificacin de la protena lleva varios pasos: Inoculacin: Crecimiento de cultivo bacterial Fase 1 de Purificacin: Concentracin y Lsis bacterial Fase 2 de Purificacin: Remocin del debris bacterial Fase 3 de Purificacin: Cromatografa de Protena

Aislamiento de colonias puras: En esta actividad los estudiantes tomarn una colonia blanca del plato rotulado LB/amp y una colonia verde del plato LB/amp/ara para su aislamiento en medio de cultivo lquido. El gen de la protena fluorescente requiere una temperatura de incubacin de 32C para mantener la fluorescencia. Concentracin y lsis bacterial: La centrifugacin es una tcnica que se utiliza para separar molculas en base a su tamao con al alta velocidad. La lisozima se utilizar para degradar la clula de la pared bacterial. Cromatografa de Protenas: La cromatografa es una tcnica utilizada para separar protenas en una mezcla compleja. Las bacterias contienen miles de protenas de la cual la protena GFP puede ser separada.

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Parte 1: Crecimiento del cultivo bacterial 1. Remueve los platos de transformacin del incubador y examnalas utilizando luz ultravioleta. Identique las colonias verdes en el plato LB/amp/ara. Identifica bastante colonias del plato LB/amp. 2. Prepare dos tubos de cultivo que contengan el medio cultivo LB/amp/ara. Rotule uno de los tubos como + y el otro -. Utilizando un asa estril, levemente toca el asa para la colonia verde y sumrjalo en el tubo +. Usando una nueva asa estril, repita lo mismo para la colonia blanca y sumrgelo en el tubo - (es importante que slo selecciones una colonia). Dale vueltas al asa para dispersar la colonia completa. 3. Tape los tubos y pngalos en una incubadora de agitacin o una plataforma de agitacin y cultivarlos toda la noche a 32C o 2 das a temperatura ambiente. 4. Tape los tubos y agtalos vigorosamente con la mano. Colcalo en el incubador de forma horizontal a 32C por 24-48 horas. Remueve y agite a mano peridicamente cuando sea posible.

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Parte 2: Concentracin bacterial 1. Identifique un microtubo como + con tu nombre y curso. Remueve el cultivo lquido del agitador y observe con luz UV. Note los cambios en color entre los dos cultivos. Usando una pipeta nueva, trasfiera 2 ml del cultivo lquido + dentro del microtubo +. Dle vueltas al microtubo por 5 minutos en la centrfuga a velocidad mxima. La pipeta usada en este paso se puede enjuagar varias veces en un beaker de agua y utilizado para los siguientes pasos de este periodo de laboratorio. 2. Vierta fuera del supernatante y observe el pelotilla (pellet) bajo luz UV. 3. Utilizando una pipeta, aada 250l de la solucin TE al tubo. Resuspenda la pelotilla del fondo pipeteando rpidamente para arriba y para abajo varias veces. 4. Usando una pipeta, aada 1 gota de lisosoma a la pelotilla bacterial resuspendida para iniciar digestin enzimtico de la pared celular bacterial. Mezcle los contenidos agitando el tubo. Observe el tubo bajo luz UV. 5. Coloque el microtubo en el congelador hasta el prximo periodo de laboratorio. El congelamiento ocasiona la ruptura de la bacteria por completo.

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PARTE III: Lsis Bacterial: 1. Remueva el microtubo del congelador y descongele usando el caliente de la mano. Coloque el tubo en la centrfuga y centrifuge por 10 minutos a velocidad mxima. 2. Mientras el tubo se mantiene girando, prepare la columna de cromatografa. Remueva la tapa y abra el broche de presin al fondo de la columna de HIC. Permita que todo el lquido drene por la columna (3-5 minutos). 3. Prepare la columna aadiendo 2 ml de Buffer Equilibration en la columna, aadiendo dos alcuotas de 1 ml con una pipeta. Drene el buffer hasta la marca de 1 ml de la columna. Tape arriba y abajo y almacene la columna a temperatura ambiente hasta el prximo perodo de laboratorio. 4. Centrifuge por 10 minutos . Examine el tubo con luz UV. Utilizando una pipeta transfiera 250 l del supernatante + dentro de un microtubo nuevo nombrado +. 5. Utilizando una pipeta nueva, transfiera 250 l del buffer de almacenado intermediario obligatorio (binding buffer) al supernatante +. Coloca el tubo en el refrigerador hasta el prximo perodo de laboratorio.

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PARTE IV Cromatografa: 1. Rotule 3 tubos (1-3) y colquelos en una gradilla de foam . Remueva las tapas de arriba y debajo de la columna y ponga la columna en el tubo #1. Cuando lo ltimo del buffer haya llegado a alcanzar la superficie del matriz HIC, proceda al prximo paso #2. 2. Utilizando una pipeta, cuidadosamente cargue 250 l del supernatante + por la parte superior de la columna. Aguante la punta de la pipeta en una de las paredes de la columna, justo arriba de la superficie del matriz y permita que el supernatante baje por el lado de la pared de columna. Examine la columna usando la luz UV. Anote sus observaciones. Despus que termine de drenar, transfiera la columna al tubo #2. 3. Utilizando una pipeta , aada 250 l del buffer limpiador y permita que el volumen completo fluya por la columna. Examine la columna con luz UV. Anote sus observaciones. Despus de que termine de drenar, transfirelo al tubo #3. 4. Utilizando una pipeta, aada 750 l del Buffer TE y permita que el volumen entero fluya por la columna. Examine la columna utilizando luz UV. Anote sus observaciones. 5. Examine los tres tubos y anote cualquier diferencia en color entre los tubos.

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Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamn Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas
Electroforesis de Protenas (Protein Fingerprinting Kit-BIO-RAD) La biologa molecular a descubierto secretos de nuevas enfermedades, dandonos las herramientas para la definicin de la identidad biolgica.Proteomics es el estudio de las protenas, particularmente su estructura y funcin.Este trmino es analogo al genoma por lo que es mas complicado.El proteome difiere de clula e clula y esta cambiando constantemente a travs de las interacciones bioqumicas con el genoma y el ambiente.En la evolucin de este tema el descubrimiento de la estructura qumica del DNA nos ha dado el entendimiento de como el codigo de las bases nitrogenadas permite la sntesis de protenas.El dogma central de la biologa molecular ( DNA- RNA- Protena) nos da la explicacin de como la informacin codificada por nuestro DNA es traducida y utilizada para hacer un organismo. Proteomics fue inicialmente definido como el esfuerzo por catalogar todas las protenas expresadas en todas las clulas en todas las etapas del desarrollo.Esta definicin ha sido expandida al incluir el estudio de las funciones de las protenas, las interacciones entre las protenas, la localizacin celular, los niveles de expresin y las modificaciones post transcripsionales estas incluyen editar el RNA, sntesis y degradacin de mRNA, degradacin de protenas, interacciones entre protenas , glucosilacin y fosforilacin. En este ejercicio los estudiantes realizarn una de las tcnicas utilizada en las investigaciones de biotecnologa, la electroforesis de protenas. Utilizando la electroforesis para examinar las protenas de las especies de pescados, los estudiantes identificaran las diferencias y similitudes entre ellos. En trminos de masa, el tejido muscular consiste principalmente de dos protenas: actina y miosina. Mientras que la actinia y miosina son altamente a travs de todas las especies animales, la examinacin de protenas de otros msculos revelan variaciones entre especies relacionadas muy cercanas. El propsito de este ejercicio es guiar a los estudiantes a travs del proceso de investigacin cientfica en el laboratorio. Los estudiantes se preguntarn: Puede la evidencia molecular ser utilizada para determinar diferencias y similitudes entre las especies? En su anlisis, los estudiantes compararan similitudes y diferencias entre las protenas de los peces y su rbol genealgico. Utilice la siguiente figura para escoger el tipo de pescado a analizar. Se recomienda seleccionar algunos que estn estrechamente relacionados, como el salmn y la trucha, como tambin los que estn distantes como el tiburn y el atn.

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Procedimiento 1. Monte la cmara de electroforesis. 2. Rotule cada microtubo donde colocar las muestras de los pescados. 3. Aada 250 L del Laemmli sample buffer a cada microtubo. 4. Corte un pequeo pedazo del msculo del pescado, cerca de 0.25 x 0.25 cm3 y transfiera cada pedazo en un microtubo y cirrelo. 5. Golpee el microtubo 15 veces para agitar el tejido en el buffer. 6. Incube por 5 minutos a temperatura ambiente para extraer y solubilizar las protenas. 7. Cuidadosamente transfiera el buffer en un microtubo con rosca. No transfiera el pedazo de pescado. 8. Obtenga los estndares pre-teidos(KS) y la actina y miosina. 9. Caliente las muestras y los estndares de actina y miosina en tubos con rosca por 5 minutos a 95C.

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Preparacin de la GEL Running gel- la primera que se prepara

Material Agua Resolving Buffer 8.8 30 % Poliacrilamida 10% APS TEMED

Al 12 % 2. 7 ml 2 ml 3.2 ml 80 l 3 l

Stacking Gel capa de arriba Material Agua 4 X stacking buffer pH 8.8 30 % acrilamida 10 % APS fresco TEMED Cantidad 4. 6 ml 2.0 ml 1.3 ml 68 l 5 l

10. Llene el tanque con el buffer de corrida. 11. Llene los carriles de la manera: Lnea Volumen Muestra 1&2 3 4 5 6 7 8 9 10 vaco 10 l 10 l 10 l 10 l 10 l 10 l 10 l vaco vaco estndar (KS) muestra 1 muestra 2 muestra 3 muestra 4 muestra 5 estndar actina y miosina vaco

12. Prenda la cmara y deje correr por 30 minutos a 200V .

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13. Luego de la corrida, saque la gel del tanque y transfiera a un envase que contenga 40 ml del tinte (Coomasie Blue) y tia por 1 hora, con agitacin para mejor resultado. 14. Descarte el tinte y destia la gel con gran cantidad de agua por al menos 30 minutos. Las bandas se vern azules.

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Extraccin y electroforesis de DNA y PCR

I. Parte terica: Conocer la estructura del DNA, su replicacin y funcin. Conocer las partes de un cromosoma. dominar los trminos relacionados con el tema. Motivar e interesar a los estudiantes en el conocimiento de la gentica hacindola amena y menos abstracta. Visualizar la molcula de DNA. II. Parte prctica: Extraccin de DNA en forma sencilla, usando cebollines, frutas, hgado detergentes, sal y alcohol. El objetivo: al finalizar esta actividad el estudian:te a. conoce la estructura y funcin de un cromosoma. b. entiende y conoce la estructura, replicacin y funcin del DNA. c. domina y entiende el proceso de una de las tcnicas mas sencillas de Extraccin de DNA y de hacer visual la molcula. Entiende conoce el proceso que se lleva a cabo en el laboratorio. Materiales y Procedimientos. Materiales: - 2 beaker (vasos de precipitado) de 250ml - 2 bolsas ziplot - hielo - 1 tubo de ensayo - 1 embudo - gasa - agitador de cristal (opcional) - HCL 0.1molar (opcional) - 4-5 fresas (cualquier fruta madura y que sea fcil de triturar - hielo - alcohol al 95% - solucin desestabilizadora de enzimas: 900 de H20 :100 detergente + 2 cucharaditas de sal sin yodo. -1 hgado de pollo - 1cucharada de arena - papana - 1 mortero Procedimiento: Extraccin de DNA de frutas - Triturar las fresas - a 2 mililitros del triturado aadir 5ml de solucin 44

- mezclar por inversin - filtrar y luego aadir alcohol fro al 90% o 70% Sobre Hielo mezclar - observar el precipitado. Extraccin de DNA de hgado - coloque en el mortero el hgado y una cucharada de arena y la papana - tritrelo bien - aada 5 mililitros de solucin desestabilizadora - triture de nuevo hasta cuando observe que se ha formado una pasta suave - filtre por varias veces - aada el doble del volumen de alcohol fro al 90 0 100% - mezclar - observe el precipitado Nota: este mismo protocolo se puede hace con cualquier fruta y con cebolla. Preguntas Cul es la funcin del detergente? Por qu desestabiliza la membrana? Qu es una solucin quelante? Cul es la funcin del alcohol? Por qu se precipita el DNA? Por que se usa para el laboratorio el hgado y las fresas, para la extraccin de DNA?

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Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamn Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas Extraccin del DNA Genmico Objetivos: 1. Valorar el proceso de la extraccin de cidos nucleicos en el estudio de la gentica molecular. 2. Enumerar las aplicaciones en los diversos campos de la investigacin cientfica contempornea. 3. Explicar los pasos bsicos en la extraccin de DNA 4. Distinguir los procesos de purificacin de DNA para los distintos tipo de clulas. 5. Practicar las destrezas bsicas de biologa molecular para aislar DNA genmico de bacteria. Materiales y Equipo: Enterobacter aerogenes cepa ATCC 13048 o ( American Type Culture Collection- www.atcc.org) 40 ml de caldo nutriente o de tripticasa de soya estril Incubadora a 37 C Definfectante Mechero Pipetas serlogicas con capacidad para 2 o 5 ml Micropipetas de 10- 100 l Microcentrifuga Microtubos estriles Bolsas pequeas de desperdicios biolgicos Guantes Hielo Etanol absoluto fro Etanol 70 % fro NaCl 5M ( 70 l por preparacin) 1x- Tris EDTA ( TE) Cloroformo Amortiguador de extraccin ( edvotex # catalogo 627) Solucin de cloro al 10 % Frascos de cristal o envases de precipitado pequeos kimwipes Papel toalla Rnasa ( opcional)

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Procedimiento: 1. El da antes del ejercicio se inocula la bacteria en 40 ml de caldo nutriente o de tripticasa de soya (TSA).Incubar a 37 C overnight( el cultivo no debe ser muy viejo) 2. Desinfectar el rea de trabajo.Colocar papel impregnado en desinfectante en el rea donde se va a trabajar con el cultivo de bacterias. 3. Encender el mechero.Regular la llama para que no sea mayor de tres pulgadas y sea de color azul. 4. Utilizando una pipeta serlogica desechable esterilizada, aadir 1. 5 ml de cultivo de bacterias a un microtubo y una centrifuga a mxima velocidad por 5 minutos. 5. Descartar el sobrenadante en un frasco que contenga solucin de cloro. Utilizando una micropipeta con capacidad mxima de 100 l, terminar de remover el sobrenadante.( el precipitado es pequeo, de color cremoso y contiene las bacterias de donde se obtendr el DNA.Si no se tiene cuidado puede perderse al succionar con la micropipeta .Por eso se recomienda inclinar el tubo y aspirar el sobrenadante colocando la punta de la micropipeta del lado contrario donde se encuentra el precipitado) 6. Aadir 200 l de amortiguador de extraccin.Este amortiguador contiene detergentes para lisar las clulas y agente quelante para evitar que las Dnasas degraden el DNA.Mezclar utilizando la micropipeta.( Se debe bajar el pistn de la micropipeta antes de introducir la punta en el lquido dentro del tubo. As evitar introducir burbujas y contaminantes que puedan estar presentes en lel cilindro de la micropipeta.) 7. Aadir 66 l de sal.Mezclar utilizando una micropipeta de 100 l.Evite la introduccin de burbujas al mezclar.( Si se ha mezclado correctamente se observa una solucin turbia pero uniforme) 8. Centrifugar a la velocidad mxima por 10 min. Para separar el DNA del debris celular.(Asegure que el volumen total sea igual en todos los tubos, y que los tubos estn bien equilibrados antes de encender la centrfuga). 9. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio utilizando una micropipeta de 100 l .Es importante calcular el volumen del sobrenadante obtenido. Descartar el tubo que contiene el precipitado en una bolsa de desperdicios biolgicos.( El siguiente paso debe realizarse dentro del hood.Antes de continuar el procedimiento, se debe repasar las reglas de seguridad relacionada con cloroformo.Debe tener la vestimenta de seguridad completa, incluyendo guantes y gafas de seguridad). 10. Una vez determinado el volumen de sobrenadante obtenido de la centrifugacin , se debe aadir un volumen igual de cloroformo. 11. Mezclar 10 veces gentilmente y por inversin( no utilizar vortex) 12. Centrifugar a una mxima velocidad ( Al terminar la centrifugacin , se deberan observar tres fases, 1- fase acuosa superior que contiene el

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DNA, 2- interfase centro de la solucin que contiene protenas desnaturalizadas, 3- fase orgnica contiene lpidos). 13. Transferir la fase acuosa superior a un tubo limpio.Utilizar la micropipeta de 100 l y determinar el volumen del sobrenadante obtenido. Comenzar a extraer la parte acuosa siempre con la punta tocando la superficie de esta. 14. Una vez determinado el volumen del sobrenadante obtenido de la fase acuosa en el paso anterior, se debe multiplicar por dos para calcular el volumen de etanol fro al 95%.Incubar en hielo por 30 min. Al aadir el alcohol se debe poder observar el DNA si se coloca el tubo a la altura de la vista. 15. Centrifugar a mxima velocidad por 10 min..descartar el sobrenadante en un frasco.Abrir el tubo y descartar el contenido en un envase de precipitado. 16. Aadir 1 ml del alcohol 70% fro por cinco minutos e incubar por cinco minutos en hielo.Centrifugar a mxima velocidad por 5 minutos.Remover tanto el sobrenadante como se pueda evitando tocar el precipitado. 17. Abrir el tubo y decantar el contenido en un envase de precipitado. 18. Utilizar una micropipeta de 100 l para extraer el exceso de alcohol.Deja que seque al aire por 5 o 10 minutos.Se puede colocar el tubo invertido sobre papel servilleta. 19. Observar el precipitado. 20. Resuspender el precipitado en 50 l de agua destilada, agua deionizada o de amortiguador TE estril( 1X Tris EDTA) 21. Aadir RNAsa 5 l e incubar en bao de agua a 37C por 30 min.Este paso es opcional, si se lleva a cabo no se observaran bandas correspondientes a RNA en la electrforesis de DNA.

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Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamn Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas PCR El PCR ( polymerase chain reaction) transform la biologa molecular en una herramienta multidisciplinaria de busqueda.Algunas tcnicas de la biologa molecular usadas antes de del PCR requerian una labor intensa, requeria mucho tiempo y un alto nivel de experiencia en la tcnicaAdems de trabajar con pequeas cantidades de DNA era dificil para los investigadores en distintos campos biolgicos( patologa, botanica,zoologa y farmacia etc) para incorporar la biologa molecular a sus esquemas de investigacin. El PCR ha tenido un impacto en cuatro reas principales de Biotecnologa: mapa de genes, clonacin , secuenciacin de DNA y deteccin de genes.El PCR es usado en estos momentos para diagnosticos medicos, como herramientas para la deteccin de mutaciones especficas que pueden causar enfermedades genticas.En investigaciones criminales para identificar sospechosos en un nivel molecular y en la secuenciacin del genoma humano. Antes de PCR el uso de las tcnicas de la biologa molecular para los propsitos de diagnstico teraputicos, forenses, farmacuticos, o mdicos no era prctico o rentable.El desarrollo de la tecnologa del PCR ha cambiado varios aspectos de la biologa molecular desde lo dificil de la ciencia hasta una de las herramientas mas usadas en la gentica y la investigacin medica. La amplificacin del PCR requiere la presencia de al menos una hebra template de DNA.En este kit el DNA genomico humano es aislado de sus propias clulas y debe ser una hebra template.Una de las principales razones por las que el PCR es una herramienta tan poderosa es por ser especfica y simple.Todo lo que requiere son buffers de reaccin economicos, cuatro subunidades de DNA ( deoxinucleotido, trifosfato de adenina, guanina, timina y citosina), una DNA polimerasa, dos primers de DNA,una cantidad de la hebra templada que uno quiere amplificar.La especificacin sale de la habilidad para llegar al blanco target y amplificar un segmento especfico del DNA. El PCR hace uso de dos procesos bsicos en la gentica molecular. 1- Hibridacin complementaria de una hebra de DNA. 2- Sntesis de una hebra va la DNA polimerasa En el caso de PCR, la hebra complementaria de hibridacin toma lugar cuando dos diferentes primers de oligonucleotido se alinea con cada una de sus respectivas pares de base de la secuencia templada.Los dos primers estn designados y sintetizados en el laboratorio con una secuencia especfica de nucletidos se pueden pegar a los terminales opuestos y a las hebras opuestas del estiramiento de la doble hebra del DNA a ser amplificado.

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Antes de la regin a ser amplificada, uno debe identificar y determinar la secuencia de una pieza de DNA a favor y en contra de la regin de inters. Estas reas son luego usadas para determinar la secuencia de los primers de lo oligonucleotidos que van a ser sintetizados y usados como puntos de inicio para la replicacin del DNA.Los primers son complementarios a las regiones a favor y en contra de la secuencia a ser amplificada asi que se pega a esas regiones.Los primers son necesarios porque las DNA polimerasas solo puede unirse a los nucleotidos de la cadena pre-existente. La DNA polimerasa usada en el PCR debe ser termalmente estable porque los ciclos del PCR fluctua entre temperaturas de 60 C y 94 C.La DNA polimerasa termoestable ( taq) usada en el PCR fue insulada de thermophilic bacterium , Thermus aquaticus, que vive en altas temperaturas como las encontradas en el Parque Nacional Yellowstone. Dos nuevas hebras son creadas de la doble hebra original, en la cual un ciclo completo de la sntesis de la hebra.Esto causa crecimiento exponencial en el nmero de molculas templadas, el nmero de hebras dobles de cada ciclo.De cualquier manera despus de 30 ciclos puede que se obtenga sobre 1 billn de copias que al principio.Una vez la hebra templada ha sido suficientemente amplificada, esta puede ser visualizada.Esto permite a los investigadores determinar la presencia o ausencia del producto deseado y determinar las similitudes y diferencias entre el DNA de los individuos.Dependiendo de la secuencia de DNA analizada , diferencias entre los individuos puede tan grande como cientos de bases de pares o tan pequeo como un par de base o un solo punto de mutacin. Los genes y el DNA Se estima que los 23 pares de cromosomas (46 cromosomas en total) del genoma humano contiene alrededor de 30,000 50,000 genes. Cada gene tiene el codigo para una protena particular .Estos 30,000- 50,000 genes compone aproximadamente 5% del DNA cromosomal.El 95% es DNA no codificado.Este DNA se encuentra no solo entre sino en los genes convirtiendolo en segmentos.En eucariotas , estas secuencias dentro de los genes se conocen como intrones son transcritas en el RNA pero al final no hace un protena.Las secuencias que no codifican para protenas se conocen como exones.Ambos intrones y exones son inicialmente transcritos, luego los intrones son llevados fuera del RNA para crear el mRNA. En eucariotas, DNA genomico se transcribe en molculas de RNA que contienen ambos intrones y exones de un gen en particular.Cuando el RNA se mantiene en el ncleo los intrones deben ser removidos del RNA con exones que son puestos juntos para formar el codigo completo se la secuencia de una protena. Este proceso de llama RNA splicing. Algunos genes pueden contener algunos intrones otros pueden contener docenas.

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Dibujo del RNA splicing, pcr, El PCR conlleva varios pasos: Parte 1: Preparacin del DNA de la mejilla Parte 2: Amplificacin PCR Parte 3: Electroforesis de las muestras en geles de agarosa Parte 4: Analisis e interpretacin de resultados Procedimiento: Parte 1: Materiales: InstaGene matrix Micropipeta de 20 l Tips de filtro ( 2 20 l) Micropipeta (20- 200 l) Tips de filtro ( 20- 200 l) Volterex Microtubos de prueba Tazas Procedimiento: 1. Rotula un microtubo de 1.5 ml contus iniciales.Rotula uno de los tubos que contienen 200 l de InstaGene matrix con tus iniciales. 2. Obtenga una taza que contenga una solucin salina de su Instructor.Pon la salina en tu boca y enjuaga vigorosamente por 30 segundos.Escupa la solucin salina de vuelta en la taza. 3. Transfiere 1 ml de tu solucin salina a un microtubo con tus iniciales.Si una micropipeta de 1000 no esta disponible, cuidadosamente transfiere 1 ml de tu enjuague a tu microtubo. 4. Gira tu tubo en una centrifuga balanceada a mxima velocidad por 2 minutos.Cuando la centrifuga termine remueve el tubo.Se supone que puedas observar pellet y las clulas al fondo del tubo.Si no ves el pellet, decanta la salina, vuelve a hechar de tu salina en el tubo y centrifuga. 5. Despus de tener el pellet, descarta la salina.Ten cuidado de no perder el pellet, coloca el tubo brevemente en un papel toalla.Esta bien para una pequea cantidad de salina ( < 50 l, del tamao de tu pellet) para mantenerlo en el fondo del tubo. 6. Resuspende el pellet por medio de vortex para que el terron de las clulas se mantega. 7. Usando una micropipeta de 2- 20 l, transfiere 20 l de tus clulas resuspendidas al tubo que contiene InstaGene.

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8. Cierra cuidadosamente el tubo.Agita o dale vortex al tubo para mezclar el contenido del tubo. 9. Cuando los miembros de tu equipo hayan colectado las muestras, coloca los tubos en el foam de los microtubos, e incuba a 56 C por 10 minutos en bao de mara.A los 5 minutos, agita o vortex los tubos delicadamente, luego ponlos de vuelta en el bao de maria a 56 C por los otros 5 minutos. 10. Remueva los tubos, agitelos y ponlos en agua hirviendo.Incubar a 100 C por 5 minutos. 11. Remueve los tubos del agua hirviendo y agita el contenido para resuspenderlo.Gira a 6,000 x g por 5 minutos en una centrifuga. 12. Guarda el tubo en el refrigerador hasta el proximo laboratorio.( o procede al paso 2). Parte 2: Amplificacin del PCR 1. Busca el tubo con tu DNA que estaba en la nevera.Gira el tubo por dos minutos a 6,000 x g ( 5 min. A 2,000 xg). 2. Rotula el tubo de PCRy rotula el tubo con tus iniciales, coloca el tubo de PCR en otro tubo sin tapa como se muestra y coloca ambos en el tubo de los microtubos. 3. Transfiere 20 l del DNA templado ( supernadante) del tubo con rosca al final del tubo de PCR.Ten cuidado de NO transferir cualquier porcin de la matriz al tubo del PCR. 4. Localiza el tubo con la mezcla amarilla en el hielo y transfiere 20 l de la mezcla maestra al tubo de PCR.Mezclalo pipetiando 2-3 veces, tapa el tubo del PCR ajustado.La mezcla debe verse amarilla. 5. Coloca el tubo del PCR en thermal cycler .Las reacciones de control preparadas por el Instructor tambin deben ser colocadas en la maquina de PCR en este punto.Las reacciones deben ser sometidas a 40 ciclos para la amplificacin de PCR. Parte 3: Electroforesis de las muestras amplificadas en geles de Agarosa 1. Obtenga sus tubos de PCR del Thermal cycler y colocalo en un microtubo sin tapa, mueve el tubo por 3 segundos a 2,000 x g. 2. Aada 10 l dePV92 XC loading dye en el tubo de PCR y mezlalo suavemente. 3. Coloca la Gel de agarosa en el aparato de electroforesis.Verifica que las paredes de las geles de agarosa esten cerca del electrodo negro (-) y la base de la gel este cerca al electrodo rojo( +). 4. Llena la camara de electroforesis y cubre la gel con 1x TAE buffer.Esto requiere 275 ml del buffer 1x 5. Usando una punta limpia para cada muestra, llena las muestras en los 8 pozos de la gel en el siguiente orden:

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Carril 1 2 3 4 5 6 7 8

Muestra MMR DNA standard Homocigoto( +/+) control Homocigoto (-/-) control Heterocigoto( +/-) control Estudiante 1 Estudiante 2 Estudiante 3 Estudiante 4

Volumen 10 l 10 l 10 l 10 l 20 l 20 l 20 l 20 l

6. Asegura la tapa de la caja del gel.La caja debe estar unida a la base solo en una orientacin.Roja- roja y negra negra.Conecta los cables a la bateria. 7. Enciende la bateria comienza la electroforesis de tus muestras a 100 V por 30 minutos. Tincin Overnight a) Aade 120 ml de 1x Fast Blast DNA stain a tus bandejas. b) Deja las geles con el tinte toda la noche, moverlo suavemente para mejores resultados. c) Al da siguiente, bota los desechos del tinte en una beaker de desechos. d) Coloca la gel en la luz y observa los resultados.Con un marcador permanente traza los pozos y los patrones de las bandas en una hoja limpia de plastico o acetato. e) Con la ayuda de tu instructor,donde estan los homocigotos y los heterocigotos para la insercin Alu. f) Recorta cualquier lnea vacia de la gel con un cuchillo o una navaja g) Para obtener un record permanente usa dry-air para la gel.Coloca en una papel de la libreta de laboratorio la gel.Evita la exposicin de la gel teida a la luz directa, esto podria causar que se afecten las bandas.

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EFECTO DEL ALCOHOL EN LAS MEMBRANAS BIOLGICAS El objetivo de este experimento es determinar el efecto de diversos alcoholes y detergentes en la membrana celular. En este experimento se estar obteniendo informacin de tres diferentes alcoholes (metanol, etanol y propanol ) en las membranas. Una razn del por qu los alcoholes son tan perjudiciales a los organismos vivientes podra estar relacionado con el dao celular. Para este experimento se estar utilizando la remolacha ya que su pigmento rojo puede salir al exterior celular si la membrana est afectada. La intensidad del color fuera de la clula ser proporcional a la cantidad de dao celular en presencia de los alcoholes y detergentes. Para medir la intensidad de color se estar utilizando un espectrofotmetro. Las soluciones de alcoholes son claras, por lo tanto si el pigmento se libera, este teir el alcohol alrededor de la muestra de rojo. Una concentracin alta de solucin con color absorber ms luz que una solucin de baja concentracin. Los valores se podrn leer como absorbancia. La absorbancia es directamente proporcional a la cantidad de pigmento rojo en la solucin. Se prepararn cinco soluciones de diferentes concentraciones de alcohol ( 0%,10%, 20%, 30% y 40%) para cada uno de los tres alcoholes. Un pedazo pequeo de remolacha se colocar en cada solucin. Luego de 10 minutos, cada solucin de alcohol es transferido a una cuveta para ser leda a travs del espectrofotmetro. Se realizar una grfica del % de alcohol versus la cantidad de pigmento (que es absorbancia). Materiales: Espectrofotmetro 1-Propanol Etanol Metanol Tubos de ensayo Matraz de 100 ml Remolacha Ispos Pinzas Bulbos Regla Agua destilada Reloj Palillos de dientes

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Navajas Microplatos de 24 pozos Guantes Pipetas de 2 ml Procedimiento: 1. Coloque : 10 ml de metanol en un tubo de ensayo y rotule como M 10 ml de etanol en un tubo de ensayo y rotule como E 10 ml de 1-propanol en un tubo de ensayo y rotule P 2. Rotule los pozos del microplato con el nombre de cada % de alcohol. 3. Prepare cinco soluciones de metanol (10%, 20%, 30% y 40%). 4. Utilizando diferentes pipetas aada 3 ml de alcohol en cada uno de los pozos. 5. Realice el mismo procedimiento del paso 2 y 3 para las soluciones de etanol y propanol. 6. Corte 15 pedazos cuadrados con las siguientes dimensiones de tamao: 0.5 cm X .05 cm X 0.5 cm. Coteje de que todos los pedazos sean del mismo tamao y que no posean la cubierta externa de la remolacha. 7. Lave los pedazos de remolacha con agua varias veces y djelos secar. Esto eliminar la presencia de pigmento liberado durante el proceso de corte. 8. Utilizando las pinzas coloque los pedazos de remolacha a cada uno de los 15 pozos que contienen las diferentes soluciones de alcoholes. Anote el tiempo de exposicin. 9. Mueva los pedazos de remolacha con un palillo de diente. Tenga cuidado de no insertar el palillo en el pedazo de muestra y causar dao mecnico a la remolacha. Uso del espectrofotmetro: 10. Use el largo de onda de 470 nm. 11. Prepare un blanco, utilizando agua destilada colocada en una cuveta. 12. Calibre el espectrofotmetro utilizando 0% de absorbancia y 100% de transmitancia. 13. Luego de 10 minutos, remueva los pedazos de remolacha de los pozos. Remueva los mismos en el mismo orden que fueron colocados. Mantenga las soluciones con color y descarte los pedazos de remolacha. 14. Coloque el contenido del primer pozo en la cuveta utilizando una pipeta y lea la absorbancia. 15. Descarte el contenido de la cuveta. Squela bien y llene la cuveta con la prxima solucin. Anote la absorbancia. 16. Realice el mismo procedimiento de los pasos 13,14 y 15 con las prximas muestras.

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17. Prepare una grfica con su data. Coloque la concentracin en el eje de X y la absorbancia en el eje de Y. Coloque la informacin del metanol y conecte sus resultados con una lnea. Haga lo mismo con la informacin de etanol y propanol.

Prueba 1 2 3 4 5 Preguntas:

Concentracin (%) 0 10 20 30 40

Absorbancia Metanol

Absorbancia Etanol

Absorbancia 1-Propanol

1. Cul alcohol daa la remolacha a menor concentracin ? 2. Cul de los tres alcoholes afecta ms a la membrana? 3. Cul es la relacin entre el tamao de la molcula de alcohol y el dao a la membrana? Realice una hiptesis al respecto.

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Electroforesis de DNA Aplicacin en las ciencias forenses
(DNA Electrophoresisi Kit -BIO-RAD)

La electroforesis es utilizada rutinariamente para resolver crmenes. En aos recientes, nuevas historias se han reportado con pequeas cantidades de DNA y se han utilizado para identificar individuos envueltos en incidentes. La electroforesis de protenas se utiliza para en procedimientos mdicos y forenses. Este kit permite a los estudiantes jugar en un rol de cientfico forensico y hacer una identificacin positiva. En esta actividad los estudiantes analizaran 6 diferentes muestras de plsmido de DNA. Una muestra se colecta de una escena del crimen hipottico y cinco muestras obtenidas de los sospechosos que son digeridas con dos enzimas de restriccin. Los fragmentos de DNA son separados y visualizados en una gel de azarosa usando una solucin de tinte. Basado en los patrones de los fragmentos de restriccin, los estudiantes compararan la evidencia con las muestras de DNA de los sospechosos con la escena del crimen.

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Procedimiento: 1. Mantenga en hielo el microtubo que contiene la mezcla de enzimas de restriccin. 2. Rotule los microtubos de color siguiendo este orden: verde = escena del crimen Azul = sospechoso 1 Anaranjado = sospechoso 2 Violeta = sospechoso 3 Rojo = sospechoso 4 Amarillo = sospechoso 5 3. Colquelos en una gradilla de foam. 4. Con una micropipeta tome 10 L de cada muestra de DNA y transfiera al tubo del color correspondiente. 5. Eche 10 L de la mezcla de las enzimas de restriccin a cada tubo. Utilice una punta por tubo. 6. Cierre los tubos y dle un pulso con la microcentrfuga. 7. Coloque los tubos en un bao de Mara a 37C por 45 minutos. 8. Aada 5 L de Loading Dye a cada tubo y mezcle. 9. Llene la cmara con el buffer de eletroforesis (aprox. 250 mL).

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10. Transfiera 10 L de la muestra a cada pozo de la gelatina. 11. Coloque la tapa a la cmara de electroforesis. 12. Coloque los electrodos en el power supply. 13. Prenda y deje correr por 30 minutos a 100 V. 14. Saque cuidadosamente la gelatina y transfirala a un envase plstico. 15. Eche 60 mL del tinte Coomasie Blue.

16. Deje Agitando hasta el prximo perido de laboratorio.

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LAS ENZIMAS Al finalizar este ejercicio Los estudiantes debern: 1.1 Introduccin 1. Definir una enzima, discutir su funcin y explicar el rol del sitio activo en la especificidad y la actividad de la enzima 2. Identificar el sustrato, la enzima y el producto de las colinesterasas 1.2 El efecto de la temperatura 1. Predecir el efecto del a temperatura 1.3 El efecto de la concentracin en la actividad enzimtica 1. Predecir el efecto de la concentracin de sustrato y de enzima en una reaccin enzimtica Efecto del pH en la actividad enzimtica 1.4 1. Predecir el efecto del pH en la actividad enzimtica 1.1 Introduccin Las enzimas son generalmente son protenas cuya funcin es acelerar las reacciones qumicas. Debido a que poseen esta caracterstica se dice que son catalizadores orgnicos. Las enzimas acomodan el sustrato formando un complejo enzima-sustrato a manera de cerradura y llave. Esto determina la especifidad de la enzima. Ya que la reaccin toma lugar en el lugar de contacto entre el sustrato y la enzima, esta regin se llama el sitio activo. El sustrato es la sustancia que reacciona con la enzima para formar los productos finales. Las enzimas son como refers en un cuadriltero de boxeo. Ellas no toman parte en la reaccin sino que son rehusadas por la clula una y otra vez. Las molculas no reaccionan una con la otra a menos que sean activadas de alguna manera. Podemos activar una molcula calentndola en un vaso para que choquen unas con las otras. La energa que hay que aadirle para que reaccione se llama energa de activacin (Ea). Las enzimas generalmente trabajan en un medio ambiente controlado donde la temperatura y el pH permanecen estables en un rango muy estrecho. Temperaturas o pH extremos tienden a desnaturalizar las enzimas cambiando su estructura qumica. Esto previene que se forme el complejo enzima-sustrato y se dice que la enzima est inactiva. En este ejercicio de laboratorio, usted va a determinar cual es efecto de la temperatura, el tiempo, la concentracin y el pH en la colinesterasas. Las colinesterasas son enzimas esenciales para la vida. Hay dos clases, dependiendo del sustrato que utilicen. Las acetilcolinesterasas usan

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acetilcolina como sustrato y actan en la conduccin de los nervios y en la interaccin msculo y nervio. Si se inhiben las acetilcolinesterazas los organismos sufren de parlisis. Dependiendo de si son inhibidores reversibles o no, las parlisis pueden ser temporeras o permanentes. La otra clase de colinesterasas son las pseudocolinesterasas o butirilcolinesterasas ya qu se usan como sustrato butirilcolina. Si se inhiben temporeramente, se produce un malestar y una bobera. Si se inhiben permanentemente producen la muerte. En la Guerra del Golfo usaron inhibidores reversibles y se vean las tropas enemigas como idiotas. Se culpa a insecticidas como los causantes del sndrome de la Guerra delGolfo. Los genes de estas enzimas tambin se encuentran cerca de los genes que producen Alzheimer ya que un nivel alto de colinesterasas se usa como una ayuda en el diagnstico de sta condicin. La reaccin sera como sigue: Acetilcolina + agua + Enzima colina + acetil + 2H+ Colina-DTNB + anin de DTNBColina + DTNB (cido dinitrobenzoico) Amarillo

El color amarillo se mide a 412 nm en el espectrofotmetro. En este experimento usted reconocer el color amarillo que resulta cuando la colinesterasa convierte l sustrato en colina-DTNB y libera el color amarillo del anin del DTNB. Usted tambin trabajar con dos muestras controles. Una muestra que contriene todo lo que las otras muestras excepto la enzima, la otra carece de sustrato. Qu usted predice que pasar con esos tubos? Usando un marcador o un lpiz de cera marque tres tubos limpios con los nmeros 1,2 y 3. Procedimiento Experimental: 1. Actividad Enzimtica de la Colinesterasa Tubo 1 1. 881 L de buffer de fosfato (0.1M) a pH 8 2. 33 L de DTNB 0.1 M 3. 20 L de sustrato acetil o butirilcolina a 0.075M 4. 66 L agua 5. Ponga el tubo en el espectrofotmetro y mezcle con un palito o tubo de cristal y lea a 412 nm inmediatamente (tiempo cero) cada minuto por 3 minutos anotando los resultados en la tabla 1. Tubo 2 1. 881 L de buffer de fosfato (0.1M) a pH 8 2. 33 L de DTNB (0.1M) 3. 20 L de sustrato acetilcolina o butirilcolina a 0.075M 4. Ponga el tubo en el espectrofotmetro y aada (66 L) 2 gotas de la enzima colinisterasa (tejido homogenizado) 5. Mezcle con un palito o tubo de crista y lea a 412 nm inmediatamente (tiempo 0) y cada minuto por 3 minutos y anote los resultados en la tabla 1.

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Tubo 3 Aada: 1. 881 L de buffer de fosfato (0.1M) a pH 8 2. 33 L de DTNB 0.1 M 3. 20 L agua 4. 66 L de la enzima colinesterasas (tejido homogenizado) 5. Ponga el tubo en el espectrofotmetro y mezcle el contenido inmediatamente y cada minuto por 3 minutos y anote los resultados en la tabla 1.

Tabla 1.Actividad Enzimtica de las colinesterasas Tubo Contenido Lectura al Principio (1 min.) Lectura al Final (2 min.) Diferencia Lectura Final menos inicial 1 2 3 Explicacin

Conclusin: Cul tubo mostr ms cambio en color segn lo

esperado?_________________________ Por qu este tubo mostr buenos resultados? Escriba su explicacin en la tabla 1.

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Cules tubos son controles?______. Si estos tubos hubiesen mostrado resultados en cambio de color, cul hubiese sido su conclusin del procedimiento? _______________________________________________________ _______________________________________________________ _____________________________________________________. Explique en la tabla 1 por qu estos tubos no mostraron resultados.

2. El Efecto de la Temperatura en la Reaccin Enzimtica

En general, temperaturas fras desaceleran las reacciones qumicas y las temperaturas clidas las aceleran. Calentar a ms de 50C desnaturaliza a muchas protenas, inactivndolas. Al hervirlas, casi todas las enzimas desnaturalizan. En este procedimiento usted podr reconocer cuando la enzima est activa. Usted tambin trabajar con un control, una muestra que contenga otras sustancias o pase por el mismo procedimiento excepto el que es probado. Con un lpiz de cera o un marcador, rotule 4 tubos de ensayo limpios y repita el experimento del tubo 1. se

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A Temperatura ambiente Tubo 1 1. 881 L de buffer de fosfato a pH 8 2. 20 L de sustrato acetil o butirilcolina a 0.075M 3. Aada 33 L de DTNB 4. Ponga el tubo en el espectrofotmetro, aada la 66 L de enzima (tejido homogenizado) y mezcle el contenido con un palito o tubo de cristal. 5. Lea a 412 nm inmediatamente y luego a 1, 2, y 4 min. o hasta que la misma lectura se repita 2 3 veces. Anote los resultados en la tabla 2.

Tubo 2 1. Repita los pasos 1 al 3 del procedimiento anterior, calentando el tubo en un beaker previamente colocado en un bao de Mara. 2. Caliente por 5 minutos a 35C. Luego adale los 33l de DTNB y 66 l de la enzima. 3. Lea a 412 nm a 1,2,4 y 8 minutos. Anote los resultados en la tabla 2 y haga lo mismo con los tubos 3 y 4.

Tubo 3 1. Repita los pasos 1 al 3 del procedimiento anterior, calentando en un bao de Mara en un beaker a 50C. 2. Caliente por 5 minutos a 50C. Luego adale los 33L de DTNB, 2 gotas de enzima, mezcle y lea en el espectrofotmetro.

Tubo 4 1. Repita los pasos 1 al 3 del procedimiento anterior, hirviendo a 100C por 5 minutos en una bao de Mara en un beaker. 2. Adale los 33 L de DTNB , 66 L de la enzima mezcle y lea como anteriormente se hizo.

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Tabla 2. efecto de la Temperatura en la actividad enzimtica de las colinesterasas Tubo Temperatura Tiempo (Min.) 1 25C 0 1 2 3 4 2 35C 0 1 2 3 4 3 50C 0 1 2 3 4 Lectura Explicacin

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100C

0 1 2 3 4

Conclusiones:
El grado de color corresponde al grado de actividad enzimtica. Explique el grado de actividad enzimtica por cada tubo en la tabla 2. Compare las actividades. Muestre el efecto de al temperatura en la actividad enzimtica haciendo la siguiente figura: A C T I V I D A D E N Z 0 1 2 4

TIEMPO (Minutos) Fig. 1 Actividad enzimtica de las colinesterasas a diferentes temperaturas. = 25C = 35C = 50C = 100C

En cul tubo se observ la reaccin ms rpida? Por qu?

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 En qu tubos o tubo la reaccin fue negativa? A qu usted cree que se debieron esos resultados?

3. El Efecto de la Concentracin Enzimtica en la Actividad enzimtica

Utilizando un lpiz de cera o marcador rotule tres tubos de ensayo y trtelo de la siguiente manera: Tubo 1 1. 88 L de buffer de fosfato (0.1M) a pH 8 2. 20 L de sustrato acetil o butirilcolina a 0.075M 3. Ponga el tubo en el espectrofotmetro, aada 66 L de la enzima y mezcle con un palito o tubo de cristal 4. Aada 33 L de DTNB 0.1 M, mezcle. 5. Lea a 412 nm inmediatamente y luego a 1,2 y 4 minutos

Tubo 2 1. 815 L de buffer de fosfato (0.1M) a pH 8 2. 20 L de sustrato acetilcolina o butirilcolina a 0.075M 3. Ponga el tubo en el espectrofotmetro y aada 132 L de la enzima y mezcle con un palito o tubo de cristal. 4. Aada 33 L de DTNB (0.1M), mezcle 5. Lea a 412 nm inmediatamente y luego a 1,2 y 4 minutos

Tubo 3 1. 683 L de buffer de fosfato (0.1M) a pH 8 2. 20 L de sustrato acetilcolina o butirilcolina a 0.075M

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3. Ponga el tubo en el espectrofotmetro , aada 264 L de la enzima y mezcle con un palito o tubo de cristal. 4. Aada 33 L de DTNB 0.1 M, mezcle 5. Lea a 412 nm inmediatamente y luego a 1,2 y 4 minutos

Tabla 3. El Efecto de la concentracin enzimtica en la actividad enzimtica de las Colinesterasas Tubo 1 66 L 2 gotas Cantidad de enzima Tiempo Lectura (min.) (nm) 0 1 2 3 4 2 132 L 4 gotas 0 1 2 3 3 264 L 8 gotas 4 0 1 2 3 4 Conclusiones: El grado de color corresponde al grado de la actividad enzimtica por cada tubo en la tabla 2. Compare las actividades. Muestre el efecto de la temperatura en la actividad enzimtica haciendo la siguiente figura. Explicacin

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A C T I V I D A D E N Z 0 = 66 L Conclusin El grado de cambio de color corresponde al grado de actividad enzimtica. Explique en la tabla 3 el grado de actividad enzimtica de cada tubo en el transcurso del tiempo. Si el tiempo fuera ilimitado, seran los mismo resultados en todos los tubos? Explique por que s o por que no. Esperara usted resultados similares si la concentracin de sustrato variara e la misma manera que la concentracin de enzima? Por que s o por que no 1 2 =132 L 4 = 264 L

4. Efecto del pH en la actividad enzimtica Cada enzima tiene un (o varios) pH al cual la velocidad de reaccin es ptima. Cualquier alteracin en pH afecta los enlaces de hidrgeno y la estructura de la enzima reduciendo la actividad enzimtica.
Rotule 5 tubos limpios con pH 6,7,8,9 y10 y someta al siguiente tratamiento

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Tubo 1 1. 881 L de buffer de fosfato a pH 6 2. 20 L de sustrato acetil o butirilcolina a 0.075M 3. Ponga el tubo en el espectrofotmetro, aada 66 L de la enzima y mezcle el contenido con un palito o tubo de cristal. 4. Aada 33 L de DTNB, mezcle. 5. Lea a 412 nm inmediatamente y luego a 1,2y 4 minutos. resultados en la tabla 4. Tubo 2 1. 881 L de buffer de fosfato a pH 7 2. 20 L de sustrato acetil o butirilcolina a 0.075M 3. Ponga el tubo en el espetrofotmetro, aada 66 L de la enzima y mezcle el contenido con un palito o tubo de cristal. 4. Aada 33 L de DTNB, mezcle. 5. Lea a 412 nm inmediatamente y luego a 1,2 y 4 minutos. resultados en la tabla 4. Tubo 3 1. 881 L de buffer de fosfato a pH 8 2. 20 L de sustrato acetil o butirilcolina a 0.075M Anote los Anote los

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3. Ponga el tubo en el espectrofotmetro, aada 66 L de la enzima y mezcle el contenido con un palito o tubo de cristal. 4. Aada 33 L de DTNB, mezcle. 5. Lea a 412 nm inmediatamente y luego a 1,2 y 4 minutos. resultados en la tabla 4. Tubo 4 1. 881 L de buffer de fosfato a pH 7 2. 20 L de sustrato acetil o butirilcolina a 0.075M 3. Ponga el tubo en el espectrofotmetro, aada 66 L de la enzima y mezcle el contenido con un palito o tubo de cristal. 4. Aada 33 L de DTNB, mezcle. 5. Lea a 412 nm inmediatamente y luego a 1,2 y 4 minutos. Anote los resultados en la tabla 4. Anote los

Conclusiones:
El grado de color corresponde al grado de la actividad enzimtica. Explique el grado de actividad enzimtica por cada tubo. Compare las actividades.

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Tabla 4. El Efecto del pH en la actividad enzimtica de las Colinesterasas Tubo 1 6 pH Tiempo (min.) 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 Lectura (nm) Explicacin

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Nota al Tcnico y al Instructor

Preparacin de Reactivos: 1. Buffer de Fosfato 0.1 M : Pesar 3.44 g de fosfato de sodio monobsico en 250 mL de agua destilada. Pesar 3.54 g fosfato de sodio dibsico en 250 mL de agua destilada. Preparar los buffer a distintos pH siguiendo la siguiente tabla: pH 5 6 7 8 Fosfato de Sodio Monobsico 5 mL Fosfato de Sodio Dibsico 95 mL

95 mL

5 mL

2. Buffer de Tris-HCl: Se utiliza para hacer pH 9 y 10 . El buffer de fosfato de sodio no llega a estos pH. Pesar 1.21 g de Tris en 85 mL de agua destilada y ajustar el pH con HCl concentrado. Completar a100 mL con agua destilada. 3. Sustrato Acetylthiocholine Iodidde 0.075 M : 21.67 mg/ ml agua destilada. Esta solucin dura 15 das en la nevera 4. Dithiobisnitrobenzoic Acid (DTNB) .01 M : buffer de fosfato pH 7. Aadir 15 mg de bicarbonato de sodio. 39.6mg en 10 ml de

5. Enzima: Se puede comprar la enzima en sigma o usar cualquier tipo de msculo con alto contenido de nervios. Homogenizar en 1% de gelatin o en buffers de pH mayores de 7.5

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Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamn Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas Biologa Celular y Molecular Laboratorio Ensayo de Fagocitosis: Parte I. Propsito: Realizar una curva de tiempo de fagocitosis opsnica utilizando cultivos de macrfagos peritoneales de ratn. Materiales: Cultivos de macrfagos Medio RPMI 10 % FBS y 1% Pen/Strep a 37 grados C Sangre de oveja (SRBC) en hielo PBS 1X esteril en hielo PBS 10X esteril a temperature ambiente Agua esteril a temperature ambiente cada una Anticuerpo contra SRBC diludo 1/1000 Methanol una Alcohol (etanol) 70 % Hielo en una neverita Jeringuillas de 1cc Tubos de 15 ml estriles Tubos de 50 ml estriles Micropipetas de 100- ml Micropipetas de 200 ml Puntas para micropipetas de 1000 y 200 ml estriles Microtubos estriles Beakers de 250 ml Pipetas Pasteur estriles/ bulbos Pipetas Pasteur no estriles Pipetas de 10 ml estriles Gradillas para microtubos Gradilla para tubos de 50 ml y 15 ml Gradilla de foam para microtubos Papel de aluminio Hood esterilizado con alcohol 70 % Bano a 37 grados C 3 laminillas por grupo (24) 200 ml 1 ml 200 ml 10 ml 8 botellas con 50 ml en 8 alcuotas de 1 ml 8 botellas con 100 ml cada 2 botellas de lavado llenas 1 8 un paquete un paquete 8 8 8 cajas de cada 3 beakers de 250 ml llenos 8 8 8 un paquete 8 8 4 1 rollo 1 1 Dra. Ana Mara Lugo

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Centrfuga refrigerada a 4 grados C Microcentrfuga Incubadora a 37 grados C y 5% de CO2 Microscopio de cultivo Hemocitmetros Contadores Relojes cronmetros en minutos Procedimiento:

1 1 1 1 8 8 8

A. Antes de comenzar el laboratorio lo siguiente deber estar preparado: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Prender el hood y lavarlo con etanol 70% Colocar en el hood el pipetiador automtico y provar que succione Prender el bano a 37 grados C Poner el medio de cultivo en el bano a 37 grados C Prender centfuga a 4 grados C Conestar la microcentrfuga, el microscopio Mantener en hielo la sangre, los anticuerpos y el PBS 1X

B. Lavar sangre de oveja: 1. Con una jeringuilla de 1 cc, tomar 0.1 cc de sangre y hecharlo en un tubo de 15 ml que contenga 10 ml de PBS 1X fro. LLevar a cabo todo este proceso en el hood utilizando tcnicas aspticas. 2. Resuspender la sangre en el PBS y centrifugar a 1000 rpm a 4 grados C durante 10 min. 3. Remover el sobrenadante utilizando una pipeta de 10 ml esteril. Resuspender el pellet en 10 ml de PBS 1X fro y centrifurar 10 min a 1000 rpm a 4 grados C. 4. Al finalizar este lavado hacer 2 lavasos mas. El pellet del ultimo lavado centrifugarlo en 10 ml de medio RPMI. C. Determinacin de # de SRBC/ml: 5. Hacer una dilucin de 1/10 de esta sangre lavada. Para esto toma un microtubo esteril y hecha 360 ul de RPMI y 40 ul de suspencin de SRBC lavados. 6. Hacer una dilucin 1/10 de la dilucin anterior. Es decir que estas haciendo una dilucin 1/100 de la sangre lavada. 7. Lavar el hemocitmetro con alcohol y llenarlo con una muestra de sangre de la dilucin 1/100. Determinar el # de SRBC/ ml en la solucin original.

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Recuerda: (# de clulas contadas en los 4 cuadrantes del hemocitmetro) dilucin 4 __________________________________________________ X 10 X 10 4

D. Calcular el # de SRBC que necesitamos para opzonizar. 8. Asumiremos que por cada macrfago vamos a anadir 100 SRBC. Recuerda que tenemos 1.5x104 macrfagos por pozo. Cuantos SRBC necesitamos opzonizar? (#de laminillas) x (# de pozos por laminilla) = # total de pozos (# total de pozos) x 1.5 x 104 = # total de clulas del experimento (# total de clulas ) x 100 SRBC/clula = # total de SRBC que necesito opsonizar Si en 1 ml tengo _________ SRBC; entonces en cuantos ml tengo _______ SRBC que necesito opsonizar?

E. Opsonizacin de SRBC 9. Tomar el volumen de sangre donde tengo los RBC y centrifugarlo en un microtubo esteril en la microcentrfuga unos segundos a 1000 rpm. 10. Descartar el sobrenadante y resuspenderlo en 1 ml de anticuerpo. 11. Incubar a 37 grados en el bano por 20 minutos, agitando de cada 5 minutos. 12. Al finalizar esta incubacin, centrifugar en la microcentrfuga por unos segundos y descartar el ml de anticuerpo. Resuspender en RPMI. Calcular el volmen segn lo que necesitemos en el experimento.

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Ej.j Si tengo 3 laminillas 3 laminillas X 8 pozos/laminilla X 0.4 ml de medio /pozo = volumen total en que debo resuspender los SRBS

F. Curva de tiempo de fagocitosis: 13. Tienes 6 hileras de pozos en tus tres laminillas. Incubar los siguientes tiempos de fagocitosis: 0, 5, 10, 15, 20 y 30. Para esto sincroniza todas tus laminillas para que terminen a la vez. Ej: En este experimento todos los tiempos termina a la misma hora (2:30 pm). Los SRBC se van a anadir alos cultivos a distintos tiempos. La fagocitosis de cada grupo comienza a distintos tiempos. TIEMPO DE FAGOCITOSIS: flecha indica cuando le vas a anadir los SRBC opsonizados. 2:00 2:10 2:15 2:20 2:25 2:30 pm 0 5 min---------10 min----------------15 min-------------------------20 min----------------------------------30 min-------------------------------------------14. Para parar la fagocitosis coloca las laminillas sobre hielo. 15. Realiza un choque hipotnico para eliminar todos aquellos SRBC que no han sido fagocitados. Para esto vierte el contenido de las laminillas en un beaker, anade agua con una pipeta Pasteur, rapidamente descarta el agua y anade PBS 1X. 16. Lava 2 veces con PBS 1X . G. Fijacin con methanol. 17. Descarta el PBS 1x y desmonta los pozos de la laminilla. Moja las laminillas con methanol gota a gota. OJO: no toques el methanol ya que es txico. 18. Guarda las laminillas en la bandeja tapadas con papel de aluminio para que no les caiga polvo. Este laboratorio continuar.

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Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamn Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas
Bioinformtica: Introduccin al uso de BLAST Esta herramienta disponible de forma gratuita en el Internet y se puede acceder desde cualquier computadora.El Instituto Nacional de Salud como NIH por sus siglas en Ingls junto con la Biblioteca Nacional de Medicina son responsables de este portal.La pgina que se utiliza es la conocida como National Center for Biotechnology Home Page.Antes de utilizar este programa se debe obtener la secuencia de una base de datos como el Gen Bank.Este programa permite realizar comparaciones de secuencias de aminocidos , cidos nucleicos as como genomas y mensajeros.Por ejemplo, si se tiene una secuencia de datos que se han obtenido de un proceso de secuenciacin al buscar la homologa se obtiene informacin importante que puede arrojar luz sobre la funcin del gen o la protena. Existen diversos tipos de BLAST por lo que debe tenerse especial cuidado en el tipo de programa que se utiliza.Por ejemplo, si la secuenciacin es de aminocidos el BLAST que se debe utilizar es BLASTP.Si por error se incluye una secuencia de cidos nucleicos el programa no procesar la informacin y el mensaje que obtendr es de error.Otro cuidado especial que debe observarse es al copiar la secuencia que se desea analizar no se cometan errores como alterar u omitir la secuencia.El programa puede analizar secuencias en formato de FASTA y en formato de GenBank, por lo que no es necesario hacer ninguna modificacin a la secuencia de este banco de datos. Obtenga una secuencia de cidos nucleicos del GenBank Direccin electrnica http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST Al abrir la pgina electrnica esta es la imagen que se podr observar en la pantalla aparecen varias opciones de BLAST Escoger en el menu de nucleotide,Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) en la pantalla aparece un recuadro con un search, en ese punto es donde copias tu secuencia Seleccionar BLAST Aparece un nmero de solicitud Para saber resultados o estatus seleccionar format

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Aparece un aviso de tiempo de espera de resultados Este tiempo puede fluctuar entre varios segundos hasta ms de una hora, todo depende del trfico que haya en internet No es necesario esperar los resultados si el tiempo de procesamiento es demasiado largo.Puedes anotar el nmero peticin y ms tarde obtener los datos La segunda parte de la pgina presenta un esquema que representa las secuencias que fuern ms homlogas a la secuencia que se proces. Una escala que indica aproximadamente cuantos nucletidos concuerdan con la secuencia sometida.En tu pgina de Internet vers que tienen colores diferentes. Debajo hay una lnea ms gruesa que representa la secuencia que se proces La escala sealada en la tercera flecha est acorde con el tamao de la secuencia que se trabaj. Una serie de lneas que representan secuencias que guardan cierto grado de identidad con tu secuencia En la primera flecha, un recuadro donde aparece una informacin breve del gen cuando se coloca el ratn sobre una de las lneas. Los resultados se presentan en orden de homologa Mayor homologa primero Seleccione con el ratn la primera lnea y obtendr una pantalla que le dar informacin de la secuencia representada. El orden en que aparece la informacin es igual que el orden de las lneas en la pantalla anterior Las secuencias estn ordenadas de forma tal que las que tienen mayor identidad con la secuencia blanco estn en la parte superior. En la pgina se observa la siguiente informacin: Codificacin- parte izquierda, identifica la secuencia Nmero de acceso Nmero de identificacin del GenBank Si la selecciona con un clic lo lleva al GenBank Descripcin: Indica la especie a la que pertenece y a que gen corresponde Score:

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Medida de alineamiento entre la secuencia de estudio y las secuencias en los bancos de datos Mayor score, mayor homologa E value Expectation value Nmero de posibles alineamientos Mientras mas bajo el valor mejor homologa Recuadros en colores lo llevan a distintos bancos de datos Unigene Geo Informacin general del gen Detalles sobre el programa se pueden conseguir en BLAST program selection guide en la siguiente direccin electrnica http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/productable.shml

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Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamn Departamento de Ciencias Naturales y Matemticas Biorremediacin
Introduccin: La introduccin en nuestro ambiente de contaminantes producidos por el ser humano presenta un problema complejo e importante que requiere atencin.La biorremediacin es una opcin que algunos cientficos han considerado para atender dicho asunto.El proceso de biorremediacin no debe confundirse con biodegradacin.A travs de la biodegradacin los microorganismos pueden degradar compuestos preexistentes en la naturaleza.Sin embargo existen contaminantes qumicos sintetizados artificialmente cuyas estructuras qumicas son nuevas.Por esta razn algunos microorganismos no los reconocen y por tanto, no los pueden degradar.Muchos de estos compuestos qumicos pueden resultar recalcitrantes y concentrarse en la cadena alimentaria.Al llegar a los humanos, a travs del consumo de alimentos contaminados, pueden causar problemas de salud incluyendo el desarrollo del cncer. A travs del proceso de biorremediacin se identifican microorganismos que degraden estos contaminantes y los convierten a compuestos inocuos para el ser humano.Es importante tener mucho cuidado, pues puede ocurrir que el organismo genere un producto mas daino que el contaminante que nos preocupa.Lo que se busca es identificar microorganismos que utilicen el contaminante como su nica fuente energtica.Los microorganismos tienen una tendencia natural a utilizar el compuesto que le sea ms facil degradar.Por lo tanto,si tiene que escoger entre una fuente complicada( contaminante) y una mas sencilla (glucosa), utilizara la glucosa, an teniendo la capacidad de degradar el contaminante.Algunos tiposde sustratos que se estudian son el petrleo, la gasolina, el diesel y los pesticidas. Es sumamente importante evitar la incorporacin de una fuente de carbono en el procesod de biorrremediacin.Por lo que es conveniente utilizar medios enriquecidos o medios que contengan peptonas, carbohidratos u otros compuestos similares como fuentes de energa para el microorganismo.Sin embargo es posible bioaumentar o ayudar a los microorganismos a degradar el compuesto proveyendo nutrientes con nitrgeno o fosfatos, sea en los medios que utilicen o en el rea contaminada.Otra posibilidad para bioaumentar es incorporando oxgeno en el medio o en el rea de estudio.Esto se hace cuando el rea es anaerbica pero se necesita que los microorganismos aerbicos sean los que trabajen sobre el contaminante.

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El proceso de biorremediacin ocurre en un periodo de tiempo prolongado y est definido, entre otros, por cientos de factores fsicos- qumicos. Adems , no todos los contaminantes que existen en el ambiente pueden ser degradados.Basta con utlizar de ejemplo un derrame de petrleo de la Prince William en Pudget( mejor conocido como el Caso Exxon Valdez) en Alaska, uno de los derrames ms estudiados.A pesar de que el mismo ocurri en el 1989, todava existen reas contaminadas; so levantan rocas encontraremos petrleo sin degradar. Inicialmente se trabaj con la idea de utilizar microorganismos recombinantes para tratar reas contaminadas con derrames de petrleo.Los resultados fueron desalentadores puesto que los microorganismos transformados genticamente no sobrevivieron ante la competencia con otros microorganismos endgenos.Los microorganismos que son exitosos en este proceso provienen de lugares que han sido expuestos a la contaminacin de forma prolongada.El trabajo de degradar el compuesto es muchas veces recae en consorcios de microorganismos Objetivos: 1. Explicar los conceptos bsicos de la biorremediacin. 2. Contrastar biodegradacin y biorremediacin 3. Evaluar la importancia de la bioremediacin Medidas de seguridad: Utilizar bata de seguridad, zapatos cerrados y gafas de seguridad Trabajar bajo condiciones aspicas.Las muestras que van a analizar son muestras de suelo No pipetiar con la boca Materiales: Aceite nuevo Aceite usado Medio deficiente en carbono ( caldo: 2ml por tubo) Fosfato de potasio dibsico y monobsico Sulfato de amonia 99% Cloruro de sodio Sulfato de magnesio Agua Cultivo de bacterias en caldo Pseudomonas Acinetobacter Suelos o Contaminado con aceite de automovil o De cerca de garajes viejos o De lugares donde haya ocurrido derrames de petrleo

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o o o o o o o o o o o

No contaminado con aceite Composta Patio de casa Posibilidad de estar contaminado Arena o tierra de ro Cuatro placas de almidn por grupo Pipetas de 1 ml Agua de dilucin o salina 0.85% Varilla de cristal en forma de L Mechero Vaso con alcohol

Procedimiento: En la primera parte del ejercicio analizaremos las muestras para detectar posibles biodegradadores de hidrcarbonos.En la segunda parte del ejercicio, analizaremos las muestras para detectar la posible presencia de biodegradadores de almidon en el ambiente. Deteccin de biodegradadores de carbono: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Pesar un gramo de suelo Diluir uno en diez en una botella o tubo de agua de dilucin Mezclar 25 veces de forma uniforme Inocular dos tubos que contienen medio mnimo de nutrientes ( 0.1ml) Aadir 20 l de aceite nuevo a cada uno de los tubos de la dilucin Repetir el procedimiento con los restantes dos tubos pero con aceite usado Incubar a temperatura ambiente hasta el final del semestre.

Deteccin de posibles biodegradadores de almidn en el ambiente Cada grupo necesitara 4 placas de cultivo 1. Esparcir en la placa de agar de almidn 0.1 ml de muestra de bacteria. Tres tipos diferentes de suelo 2. Vertir en la superficie de la placa 0.1 ml de la muestra o el sustrato utilizando una pipeta estril. 3. Sumergir el spreader en alcohol 4. Encender con alcohol y esperar que enfre 5. Esparcir la muestra, en mivimiento circulares 6. Incubar a temperatura ambiente 7. Aadir unas gotas de yodo a la superficie de la placa 8. Estimar la proporcin de biodegradadores a base de la intensidad del color pardo en la placa a. Negro o violeta : almidn no utilizado ( implica ausencia de biodegradadores) b. Pardo : almidn utilizado ( implica presencia de degradadores)

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