Streptococci mutans: Mtodo semicuantitativo para establecer el rango de riesgo de infeccin bucal en nios preescolares chilenos

Alfredo Linossier C1, Alex Vargas D1, Gisela Zillmann G1, Moiss Arriagada R1, Robinson Rojas A1, Rodrigo Villegas R2. A semi-quantitative method to assess oral infections with Streptococci mutans in preschool Chilean children

El grupo Streptococci mutans (incluido en el grupo Streptococci viridans)1-3, ha sido descrito recientemente como un constituyente de la flora bacteriana oral del hombre desde hace miles de aos4. Este grupo incluye alStreptococcus mutans, que es uno de los principales agentes responsables de la caries del esmalte dental 5,6. En nios, la colonizacin temprana y la infeccin por Streptococcus mutans es un factor clave en el riesgo de desarrollo de caries especialmente en pases en vas de desarrollo, donde estas lesiones tienen una alta prevalencia7,8. Es posible estimar a travs de tcnicas microbiolgicas, como son los mtodos cuantitativos y semi-cuantitativos, rangos de infeccin por Streptococcus mutans y relacionarla con el desarrollo de caries dental 9-11. En este estudio, validamos un mtodo semi-cuantitativo a travs de la medicin del rango de infeccin porStreptococci mutans en saliva, en nios preescolares entre 2 y 6 aos, usando un medio de cultivo lquido TYCBS (T= casitone; Y= extracto de levadura; C= cistina; S= sacarosa; B= bacitracina). Material y mtodo Poblacin en estudio: Este estudio fue llevado a cabo en 650 nios de los Centros Abiertos de la Ilustre Municipalidad de Santiago de Chile (350 varones y 300 mujeres) con edades entre 2 y 6 aos. Cada grupo fue sometido a un examen clnico oral, donde se evalu la historia de caries de acuerdo a los estndares OMS12 a travs del coed (dientes cariados obturados y exfoliados). Los resultados fueron registrados en una ficha clnica precodificada, incluyendo datos clnicos, microbiolgicos, bioqumicos y serolgicos. Estudio microbiolgico: Los niveles basales de se determinaron en muestras de saliva (0,5-1 ml) obtenidas dos horas despus del desayuno (sin cepillado dental previo). La secrecin salival fue estimulada por la masticacin de un trozo de parafina slida (0,9 gramos) durante dos minutos.

Mtodo cuantitativo: Las muestras de saliva (0,5-1 ml) fueron colectadas en un tubo de vidrio con la ayuda de un embudo de vidrio y guardada por una hora a 0C para el anlisis microbiolgico13. Posteriormente fueron agitadas por un mezclador (Max Mix II type 37600 Mixer), durante 60 s. Luego, 100 L de saliva fueron agregados a 900 L de una solucin tampn de fosfato de 0,2 M (pH 7,4). La solucin resultante fue nuevamente homogeneizada por sonicacin durante 2 min a 37C y un volumen de 100 L fue sembrado en una placa de Petri con agar TYCSB 14. Se incubaron utilizando un sistema de anaerobiosis (jarras Gas-Pack) con una mezcla de 95% N2, 5% CO2, durante 48 h a 37C. Las colonias fueron contabilizadas de acuerdo al mtodo descrito por Westergreen y Krasse12. Se construyeron 4 rangos de colonias segn cuartiles (3,0-4,9; 5,0-5,5; 5,66,0; 6,1-7,5. Log UFC/ml saliva Streptococci mutans) para hacer comparables estos recuentos con los rangos del mtodo semi-cuantitativo. Mtodo semi-cuantitativo: Las muestras de saliva fueron obtenidas desde el vestbulo labial inferior por medio de una esptula de plstico e inoculadas en caldo TYCSB selectivo para Streptococci mutans, y rojo neutro. Posteriormente se incubaron por 48 h a 37C, en condiciones aerbicas. Las colonias adherentes de Streptococci mutans fueron observadas por transiluminacin en un lente de magnificacin de Spencer. Cada muestra fue asignada de uno a cuatro rangos: 0: <104; 1: 104 105; 2: 105 106 y 3: 106 UFC/mL saliva15. Estudio bioqumico: Para identificar colonias, a travs del anlisis bioqumico, dos de estas colonias fueron incubadas por 18 h en un medio de cultivo lquido Todd Hewitt, y las bacterias desarrolladas fueron centrifugadas a 5.000 rpm por 5 min. El material obtenido fue diluido en una solucin tampn de fosfato (pH 7,4) a una concentracin N5 de MacFarland (1,5 x 109 CFU/mL)16. Esta suspensin fue usada para identificar biotipos de Streptococci mutans a travs del siguiente micromtodo: En un rectngulo de vidrio de 11,5 x 8 cm, dividido en 48 pocillos de 0,8 cm de dimetro cada uno, fueron colocadas separadamente 30 L de diferentes azcares, a una concentracin del 1%, diluidos en caldo de thioglycolato sin dextrosa y sin indicador de pH (manitol, sorbitol, sacarosa, melibiosa, rafinosa y almidn). Para determinar la sensibilidad a la bacitracina se utilizaron 0,2 unidades de bacitracina/ml, arginina y esculina17,18. El rectngulo de vidrio fue colocado en una caja plstica estril y cultivada en una cmara de cultivo celular durante 18 h. Estudio serolgico: El antisuero fue preparado en conejos hembras inmunizadas con S mutans (Ingbritt, serotipo c) o S sobrinus (OMZ 176 serotipo d), de acuerdo a la tcnica de inmunodifusin doble descrita por Ouchterlony19,20.

Anlisis estadstico: Los resultados fueron analizados usando la prueba de ANOVA, considerndose significativos aquellos valores que presentaron un p <0,05 y "t" de Student para datos no pareados, utilizando 2 colas y estimando como significativos aquellos valores con un p <0,05. Para correlacionar el nmero de caries con la cuantificacin salival de Streptococci mutans se utiliz el mtodo del valor predictivo, dado por la sensibilidad y la especificidad de la prueba21. Resultados El grupo fue aislado en las muestras de saliva obtenidas de los 650 preescolares mostrando clnicamente la presencia de caries dental (con edades de 2 a 6 aos), se encontr 99,3% de correlacin (r=0,9965) entre ambos mtodos cuantitativo y semicuantitativo (Figura 1). La historia de caries para el grupo de nios se estableci a travs del ceod. Este fue de 4,50,2, con un promedio de caries de 3,90,1, de un total de 20 piezas temporales (8 molares, 12 incisivos). A partir de este promedio, se separaron dos grupos: uno con menos de 4 caries y otro con ms de 4 de caries.

Figura 1. Correlacin entre los mtodos cuantitativo (Log UFC/mL saliva) y semicuantitativo (rango 0, 1, 2, 3; UFC/mL saliva) paraStreptococci mutans en saliva. Los valores en el eje de las X, indican los rangos, para: 0: <104 1: 104 105 2: 105 106 3: 106 UFC/ml de saliva Cada valor es el promedio ESM (error estndar de las medianas) de los nios

Se compar el promedio de caries con ambos mtodos microbiolgicos, encontrndose 97% y 90% de correlacin usando los mtodos cuantitativos (r=0,9877; Figura 2) y semi cuantitativo (r=0,9512; Figura 3), respectivamente.

Los lmites de deteccin variaron de acuerdo a las metodologas microbiolgicas utilizadas en la cuantificacin delStreptococci mutans. As tenemos que, cuando el valor fue inferior al log 3 (valor obtenido en 135 nios) para el mtodo cuantitativo o, menor de 104 (en 115 nios) en el mtodo semi-cuantitativo, estos antecedentes no fueron considerados en el anlisis de los datos mostrados en ambas figuras.

Figura 2. Anlisis de regresin lineal entre caries dental y el mtodo cuantitativo para Streptococci mutans. El eje de las X muestra los valores de los rangos obtenidos por Log UFC/streptococci mutans/mL en saliva de acuerdo a la metodologa cuantitativa, en la cual: 3,0-4,9 5,0-5,5 5,6-6,0 6,1-7,5 UFC/mL de saliva Cada valor es el promedio ESM de los nios.

Figura 3. Anlisis de regresin lineal entre caries dental y el mtodo semicuantitativo. Los valores en el eje de las X indican los rangos de la metodologa semi-cuantitativa para la cual: 0: <104 1: 104 105 2: 105 106 3:106 Cada valor es el promedio ESM de los nios.

Al contrastar las metodologas cuantitativa y semi-cuantitativa utilizadas a nivel poblacional, se obtuvieron los siguientes valores: para el mtodo cuantitativo la sensibilidad fue 78,53% (267/340) y la especificidad 46,77% (145/311), mientras que para el semi-cuantitativo la sensibilidad fue 80% (276/343) y la especificidad 50% (154/307) (Tablas 1 y 2). Los estudios bioqumicos demostraron los biotipos ms prevalentes, siendo el biotipo I el mayormente aislado, con 84%. El 6% correspondi al biotipo IV y otros. Un rango similar se obtuvo cuando se estudiaron los serotipos c (c, e, f) 80% y d (d, g, h) 4%.

Discusin

El grupo de microorganismos Streptococci mutans tiene un rol preponderante tanto en el inicio de la caries del esmalte que afectan a los dientes, como tambin en la caries que afecta la superficie de la raz del diente en el adulto6. Se han descrito diversos mtodos para cultivar y cuantificar al grupo de Streptococci mutans, tanto en placa bacteriana como en saliva11,13,15,22-29. En este estudio se valida un mtodo semi-cuantitativo para Streptococci mutans en saliva en nios preescolares, usando caldo TYCBS. Como gold standard de control se utiliz el recuento cuantitativo de Westergreen G y Krasse B15. Nuestros resultados mostraron una fuerte correlacin entre los mtodos cuantitativo y semi-cuantitativo, con un r=0,9965. Cuando el nmero de caries se analiz separadamente con cada mtodo la correlacin fue de r=0,9877 para el mtodo cuantitativo y de r=0,9512 para el semi-cuantitativo. Estos hallazgos sugieren que ambos mtodos son de utilidad para establecer el rango de riesgo a la infeccin bucal. Al comparar ambos mtodos, en relacin con el comportamiento en la poblacin estudiada, los valores encontrados fueron similares, lo que sugiere que el mtodo semi-cuantitativo es predictivo para detectar la presencia de caries en la poblacin. En general, la ausencia de Streptococci mutans parece ser un fuerte indicador de tener un bajo riesgo a caries dental (especificidad). Por el contrario, ante un alta cantidad de ellos el riesgo es mayor (sensibilidad)30. En relacin con otros mtodos semi-cuantitativos, como Cariescreen y Dentocult , se puede sealar que estos poseen un bajo grado de sensibilidad pero una especificidad relativamente alta, por lo tanto tienen un bajo valor predictivo de caries, aunque son eficaces en predecir un bajo riesgo de desarrollo de la enfermedad 31. Tal vez, esto se deba al medio de cultivo utilizado en los mtodos anteriormente sealados. En ellos se utilizamitis salivarius como medio selectivo para Streptococci mutans, mientras que nosotros usamos TYCSB, el cual es significativamente ms sensible para la cuantificacin de Streptococci mutans en relacin con el mitis salivarius14. Estudios tericos han sugerido que la suma de la sensibilidad y especificidad debe tener un valor de al menos 160% de precisin para dar la seguridad de ser un buen predictor32,33. En nuestros estudios, la suma de los valores de ambos mtodos mostraron un total de 130%, estableciendo un moderado valor predictivo al dicotomizar los mtodos con respecto al diagnstico clnico de caries dental y nivel de infeccin. Cabe mencionar que, dado que la caries dental es una enfermedad infecciosa, transmisible y multifactorial, debemos enfatizar que ste no es un mtodo de diagnstico, sino que slo representa un valor predictivo de riesgo a caries dental. Hay que tener presente, que el rango de infeccin basal permanece constante en el tiempo, el cual puede variar por accin de la dieta, cepillado dental, uso de antispticos, antibiticos, etc.

Las ventajas de este mtodo semi-cuantitativo son: no es invasivo, es simple, no es necesario tener un ambiente de anaerobiosis ni tampoco hacer diluciones de saliva como en el mtodo cuantitativo. La bacitracina es parte del medio de cultivo (TYCBS) y el medio de cultivo puede guardarse refrigerado por varios meses, siendo ms econmico que otros sistemas existentes en el mercado. Los criterios de validacin para el S mutans, a travs de pruebas bioqumicas y serolgicas, evidenciaron que el biotipo I o serotipo c (c, e, f) del S mutans y biotipo IV o serotipo d (d, g, h) de S sobrinus fueron los biotipos y serotipos ms prevalentes. Estos resultados son coincidentes con otros artculos de estudios en humanos donde el serotipo c es el ms aislado, con algunas variaciones en las poblaciones estudiadas6. Por lo tanto, el serotipo c tiene una alta prevalencia, por lo que tiene mayor probabilidad de transmisin a travs de la saliva en la poblacin. Por esta caracterstica podra servir para el control de caries dental en el humano, a travs de la aplicacin de tcnicas de inmunizacin activa o pasiva. Adems, la estructura antignica del S mutans ha sido muy estable en el tiempo, como fue demostrada por Linossier y col 4. Este mtodo semi-cuantitativo servira para establecer el estado de infeccin oral a nivel poblacional. Dado que el mecanismo de transmisin natural se produce a travs de la saliva de padres a hijos es conveniente considerar el realizar el estudio a nivel familiar y extra familiar34,35. Otro factor a considerar sera la oportunidad en que se aplique el mtodo, ya que para efectos de proteccin de la dentadura definitiva debera hacerse a edades tempranas. Otra utilidad que tendra esta tcnica microbiolgica es que servira para el seguimiento del nivel de infeccin salival de Streptococci mutans pre y post tratamientos odontolgicos, efectundose a los pacientes en clnicas dentales varias determinaciones en perodos predeterminados. El uso de esta metodologa semi-cuantitativa permitira hacer tamizajes poblacionales ms extensos para establecer un valor predictivo de riesgo de caries dental, siendo sta una herramienta de mucha utilidad en programas preventivos de salud oral. El mayor rendimiento se obtendra aplicndolo en el mbito de poblacin preescolar, permitiendo actuar oportunamente en el control de la caries dental. Referencias 1. Coykendall A. Classification and identification of the Viridans Streptococci. Clin Microbial Rev 1989; 2: 315-28. [ Links ] 2. Kilian M, Mikkelsen L, Henrichsen J. Taxonomic study of Viridans Streptococci: Description of Streptococcus gordonii sp. Nov and emended descriptions of Streptococcus sanguis (White and Niven 1946), Streptococcus oralis (Bridge and Sneath 1982), and Streptococcus mitis (Andrewes and Horder 1906). Int J Syst Bacteriol 1989; 39: 471-84. [ Links ] 3. Truong T, Mnard C, Mouton C, Trahan L. Identification of mutans and other oral streptococci by random amplified polymorphic DNA analysis. J Med Microbiol 2000; 49: 63-71. [ Links ]

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Correspondencia a: Dr. Alfredo Linossier C. Telfonos: (56-2) 5235062-4427128. E mail: alinossi@terra.cl