Judith Melndez Titulo: Evaluacin y Optimizacin del medio casero para micropropagacin de Orqudea Sun Bulb Orange

Introduccin: Las orqudeas, pertenecen a la familia Orchidaceae, la cual es la ms grande de todas las plantas que producen flores. El clculo flucta entre 17.000 y 35.000 especies conocidas de monocotiledoneas, herbceas y perennes. Se estima, que esto representa un 10% de todas las plantas superiores; las mismas que se agrupan dentro de 650 a 900 gneros (Murguia, 2007).

Las Orqudea Cattleya segn Albert P. Hollingsworth, son las ms fciles de cultivar debido a sus requerimientos climticos. Son plantas muy sensibles a los cambios climticos, por lo que es necesario cultivarlas bajo invernadero con calefaccin (17-18C durante la noche y 28C durante el da, con una humedad relativa del 70%), siendo preciso una buena aireacin en verano. Su pH flucta entre 5-6. Estas orqudeas son originarias de las partes intermedias a altas de Amrica Central y Sur Amrica. La Cattleya ha sido llamada la Reina de las orqudeas. En el mundo se encuentran cerca de 65 especies diferentes. Bajo esta denominacin se encuentran los hbridos intergenricos: Laeliocattleya, Brassocattleya, y Brassolaeliocattleya. La mayora de plantas de este grupo crecen como epfitas en el lindero de los bosques o en la copa de los rboles, donde reciben luz fuerte pero moteada (Hollingsworth,2001).

La micropropagacin de las orqudeas se puede dividir en dos grupos importantes, basados en el objetivo de trabajo y la fuente del explante. Estos grupos son: micropropagacin sexual y micropropagacin asexual (Murguia,2007).

En la propagacin de las orqudeas por medio de la semilla, aseguramos la variabilidad del material gentico. Su aplicacin se justifica totalmente cuando se producen hbridos de gran valor, pero que su semilla de otra forma no germinara, adems se sabe que bajo condiciones naturales la germinacin de las diminutas semillas de orqudeas es muy baja, alrededor de un 5%, comparado con el gran nmero de stas que se producen por cpsula. Lo cual, implica que de una sola cpsula es posible obtener de 50000 a ms de un milln de plantas, dependiendo del gnero a especie que se trate, lo anterior, puede ayudar a fortificar los esfuerzos de la conservacin de los recursos naturales al ofrecer una mayor cantidad de plantas a un menor precio, con ella evitar el saqueo de las pocas plantas que quedan an en los bosques. Adems, es un importante instrumento que junto con la polinizacin controlada ayudan en la investigacin gentica ( Murguia, 2007).

La micropropagacin asexual de las orqudeas, se realiza partiendo de diferentes tipos de explantes segn sea el tipo de crecimiento de la orqudea; debiendo considerarse adems otros factores fundamentales como son, la facilidad que presenta para ser cultivable, tanto desde el punto de vista de comportamiento celular como asptico (Murguia, 2007). Como ejemplo de estudios de multiplicacin in vitro tenemos el de Mauro, M., et al, que en 1994, probaron la influencia de diferentes dosis de benzilaminopurina (BA) y cido a naftaleneacetico (ANA), en el medio de cultivo Murashige y Skoog (MS) en Cattleya aurantiaca. Ellos sugirieron que para la multiplicacin de brotes se utilizara el medio suplementado con la combinacin de 10mg/l de BA y 0.1 mg/l de ANA, y para el desarrollo de plntulas con el incremento de biomasa de hojas y raz, se utilizara el medio suplementado con 10mg/l de ANA.

Como parte de esta investigacin se busca mejorar el medio de cultivo

para

micropropagar orqudeas de manera asexual. Se utilizara el medio de cultivo Murashige & Skoog para evaluar y optimizar medio de cultivo apropiado para propagacin de orqudeas.

Resumen de la Metodologa:

Procedimiento Experimental:

I.

Preparacin de medio de M&S para producir callos de Cattleyas

Pesar 2.48 gr de Medio para Catleya

Anadir 100 ml de H20 destilada al beaker

Ajustar pH a 5.8. Utilizar un stire para mezclar la solucin.

Anadir 0.1ml de la solucin 2-4D stock de reguladores de crecimiento al beaker.

Anadir 0.8 gr de agar al beaker

Calentar solucin hasta que se observe transparente, luego autoclave, 15 min.

Preparar placas petri, utilizando tcnicas asepticas

II.

Envolver en parafilm y almacenar en la nevera , hasta prximo uso.

III.

Mtodo para la preparacin del medio casero

Agregar 1ml de la soln 2-4D de stock de reguladores de crecimiento

Formula de Yamada

Aadir 25 ml de agua de coco al beaker

0.47g de peptona granulada

0.47g de abono Aadir 75ml de agua orgnico destilada

Aadir 2.38 g de azucar

4.28g de pasta de tomate

Ajustar pH a 5.8. Utilizar un stire para mezclar la solucin.

Esteriliza por 15 min a 15psi-121 grados C

Calienta y disuelva hasta que la soln se torne clara.

Luego aade 0.8 g de agar

Envolver en parafilm y almacenar en la nevera , hasta prximo uso.

IV.

Micropropagacin a partir de hojas:

Lavar hoja de orqudea con agua de la pluma y agua destilada

Utilizando tcnicas aspticas, con mechero buchmen

En un beaker aade etanol 70%

Descarta y aade H2O2 3% por 5 seg.

Descarta el etanol y agrega H20 estril por 1 min.

Aade un pedazo de la hoja por 30 seg.

Descarta y aade H20 estril por 1 min.

Descarta la soln. Y aade NaOCl 10% por 5 min.

Descarta la soln y aade H20 estril por 5 min.

Cultivar los explantos en el medio utilizando tcnicas aspticas

Cortar la hoja y quedarme con el centro

Repetir paso anterior 3 veces.

Titulo: Preparacin de medios de cultivo para orqudeas Cattleya trinae

Propsito:

1- Preparar medio de cultivo Murashige & Skoog con hormona para la formacin de callos. 2- Preparar medio de cultivo casero para evaluar su efectividad.

Procedimiento Experimental:

A. Preparacin de medio de M&S para producir callos de Cattleyas Pesar 2.48 gr de Medio para Catleya por cada 100 ml de medio a preparar. 100 ml de agua destilada Aadir 0.1 ml. 0.1 ml ( 100ul) del stock de reguladores de crecimiento del stock de 24D Ajustar pH a 5.8 0.8 gr de agar por cada 100 ml de medio Calentar , esterilizar y preparar placas

Procedimiento para Preparar Medio para Callos: 1- Completa con agua destilada hasta 50ml. Una vez mezclados y disueltos los componentes aadidos ajusta el pH a 5.8. 2- Luego de ajustado el pH aade 0.8 gramos de agar, disuelve, completa con agua destilada hasta 100ml y calienta hasta la solucin se torne clara. 3- Coloca en matraz de 125ml, tapa con papel de aluminio, coloca cinta indicadora de esterilizacin y esteriliza por 15 minutos 15psi-121 grados C en autoclave.

4- Una vez esterilizado el medio, dispensa en placas petri pequeas, utilizando tcnicas aspticas, tapa y deje enfriar. Con el volumen utilizado rinde para aproximadamente 10 placas petri.

C. Mtodo para la preparacin del medio casero

Formula de Yamada

Medir la cantidad correcta del medio en polvo utilizando una botella de 1 litro y evitando el contacto con el polvo del ambiente. Aadir lo siguiente en un beaker de 1000ml

Aadir en un beaker 250 ml. de agua de coco. 750ml de agua destilada 5 cucharaditas de azcar (cuantos gramos es 1 cucharadita) 1 cucharadita de peptona granulada 1 cucharadita de abono orgnico como ortho gro 3 cucharadas de pasta de tomate sin sal. 15-20 gramos de agar

Para 100 ml.

Aade 25 ml de agua de coco 75ml de agua destilada

 2.38 gramos de azcar 0.47g de peptona granulada 0.47g de abono orgnico como ortho gro 4.28g de pasta de tomate sin sal.

1- Una vez mezclados y disueltos los componentes aadidos ajusta el pH a 5.8. 2- Luego de ajustado el pH aade 0.8 gramos de agar, disuelve y calienta hasta la solucin se torne clara. 3- Coloca en matraz de 125ml, tapa con papel de aluminio, coloca cinta indicadora de esterilizacin y esteriliza por 15 minutos 15psi-121 grados C en autoclave. 4- Una vez esterilizado el medio, dispensa en placas petri pequeas, utilizando tcnicas aspticas, tapa y deje enfriar.

D. Micropropagacion a partir de hojas:

Soluciones: H2O esteril Etanol 70% H2O2 3% NaOCl esterilizante 100ml de NaOCl 0.5 ml triton x 100 Completar a 1000ml

1- Lavar hoja pequea con agua potable y luego agua destilada

2- En una placa petri aadir etanol 70 % y aade la hoja por 30 segundos. 3- Luego pasa la hoja a agua estril por 1 minuto. 4- Colocar hoja en H202 3% por 5 segundos. 5- Colocar hoja en agua estril por 1 minuto. 6- Colocar hoja en NaOCl 10 % de 10- 12 min. 7- Finalmente agua estril por 5 minutos con un total de 3 repeticiones. 8- Cortar hojas, cortar los extremos y quedarme con el centro donde tengo las venas. 9- Cultivar los explantos en los medios con tcnicas aspticas.

Referencias:

Murguia, J. (2007). Cursos de Capacitacin: Cultivo de Orquidea. Universidad Veracruzana Fundacion Produce Veracruz A.C.[ versin electrnica]. Murguia, J. (2007). Cursos de Capacitacin: La Orqudea y su ambiente. Universidad Veracruzana Fundacin Produce Veracruz A.C.[ versin electrnica]. Murguia, J. (2007). Cursos de Capacitacin: Micropropagacion de semillas. Universidad Veracruzana Fundacion Produce Veracruz A.C.[ versin electrnica]. Hollingsworth A. (2010). Cultivar Orqudeas es Divertido. Cattleyas Estados Unidos. Edicion 28, pag 36-40 Kyte, L. & Kleyn, J.(1996). Plants from test tubes: An Introduction to Micropropagation. Portland & London. Third Edition.