ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS Parte 2 Tatyana Linero

PROCESAMIENTO Y ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUA

MICROORGANISMOS INDICADORES ESTUDIO DE DIFERENTES POBLACIONES MICROBIANAS
La presencia de microorganismos, en un alimento, no siempre constituye una situacin de peligro. La mayora de productos de consumo no son estriles, albergan poblaciones microbianas diferentes relacionadas con el tipo de sustrato y el tratamiento recibido. Cuando en la produccin o preparacin de alimentos, se violan principios de higiene y desinfeccin, o estos se mantienen en condiciones inadecuadas, se favorece la llegada de agentes infecciosos y/o la proliferacin exagerada de microorganismos que pueden encontrarse en dicho alimento, pero a niveles menores. Es por esto, que existe un grupo de microorganismos llamados microorganismos INDICADORES que en forma indirecta evalan: *La seguridad de un alimentos con relacin a presencia de patgenos como estafilococo, salmonella *El peligro potencial de un alimento como vehculo de microorganismos peligrosos. *Deficiencias en el proceso de tratamiento. *Indican prcticas no sanitarias. Para estos fines son utilizados poblaciones indicadoras como: mesoaerobios y coliformes, entre otros. MESOAEROBIOS: Su recuento es utilizado para determinar el nmero de clulas viables o de unidades formadoras de colonias (ufc) en un alimento. Es el indicador ms amplio en alimentos, ya que incluye todos los grmenes aerobios y facultativos que crecen en medios simples a una temperatura entre 20C y 45C. Este recuento: *se considera como indicador del grado de contaminacin de los alimentos en cualquier etapa del proceso de produccin. *permite obtener informacin sobre la alteracin incipiente de los alimentos y su probable vida til. Evala la calidad de la materia prima y el tratamiento en los productos estables. *Determina condiciones inadecuadas de almacenamiento en productos perecederos. *Indica la presencia de microorganismos peligrosos, ya que es en este rango donde crecen la mayora de patgenos vehiculados por alimentos. COLIFORMES TOTALES: Este grupo de microorganismos comprende varios grmenes de la familia enterobactericea; est ampliamente difundido en la naturaleza, agua y suelo. Tambin son habitantes normales del tracto intestinal del hombre y animales de sangre caliente. Su presencia en los alimentos es signo de mala calidades el proceso, falta de higiene de los manipuladores, recontaminacin despus del proceso y an de contaminacin fecal. COLIFORMES FECALES: Se utiliza para diferenciar los coliformes de origen fecal (procedentes de intestino del hombre y de animales de sangre caliente) de los coliformes de otros orgenes. Su presencia indica generalmente una contaminacin directa o indirecta de origen fecal y por consiguiente existe el riesgo de que hayan podido llegar al alimento microorganismos patgenos de procedencia entrica.

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PROCESAMIENTO Y ANALISIS MICROBIOLOGICO

PREVIA CONSULTA DE LAS TECNICAS PARA ANALISIS MICROBIOLOGICO, TIPOS DE MEDIO Y USO/ TIPOS DE SIEMBRA
El procedimiento comnmente empleado para el aislamiento y recuento de los microorganismos presentes en los alimentos consiste en la preparacin de los homogenizados de alimentos y de microorganismos que permita la preparacin de las diluciones que posteriormente sern utilizadas en diversos mtodos de recuento. Reactivo: Diluyente: Agua peptonada al 0.1% (reactivo1) se utiliza para tratar de recuperar los posibles microorganismos presentes en las muestra sin producirles dao celular.

Procedimiento: 1. Mezclar bien la mezcla para asegurar su homogenizacin, antes de preparar las diluciones. Si se trata de productos grasos, llevarlos al bao mara a 45-50 C, para fundir la muestra, agitando frecuentemente. Desinfectar con alcohol al 70% el sitio por donde se vaya a extraer la muestra. Abrir asptica y adecuadamente la muestra. Preparar diluciones consecutivas de la muestra (10-1, 10-2, 10-3 ) segn el criterio establecido para cada una de ellas. Preparar la dilucin 10-1 de muestras lquida, midiendo 11 ml de la muestra en un frasco de dilucin que contenga 99 ml del agua peptonada al 0.1% Para alimentos con un alto contenido en grasa (superior al 20%), es necesario aadir un 1% de tween 80 o de otro tensoactivo no txico. Mezclar y pesar 11g representativos de la muestra total, en el frasco de dilucin conteniendo 99 ml de agua peptonada al 0.1% previamente tarado para obtener una dilucin 10-1 Agitar vigorosamente el frasco, dejar reposar por 10 min. Preparar la dilucin 10-2, transfiriendo 1 ml de la dilucin 10-1, con pipeta de 1 ml a un tubo de dilucin que contenga 9 ml de agua peptonada al 0.1%, agitar cuidadosamente. Repetir estos pasos hasta obtener el nmero de diluciones necesarias. Cada dilucin sucesiva disminuir 10 veces la concentracin.

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6. 7.

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El rango de diluciones preparadas puede modificarse en funcin a la cifra de microorganismos esperada.

RECUENTO DE MESOAEROBIOS

Medio de cultivo: Agar plate count (medio 1)

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS Parte 2 Tatyana Linero Procedimiento: 1. 2. 3. 4. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado. Transferir alcuotas de 1ml. De cada una de las diluciones consecutivas en cajas de petri estriles. Verter en las cajas de petri 15 ml. De Agar plate count fundido y mantenido a 45C. Mezclar el inculo con el medio de cultivo fundido. No debe transcurrir ms de 20 minutos entre la realizacin de las diluciones y el vertido del medio. La manera mas indicada de mezclar el inculo con el medio es la siguiente: a) Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces. b) Rotar la caja 5 veces en el sentido de las agujas de reloj. c) Mover la caja 5 veces haciendo ngulo recto sobre el movimiento (a). d) Rotar la caja 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj. Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga agar Plate Count. Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0.1% incubando una caja que contenga 1 ml de agua peptonada y Agar Plate Count. Una vez solidificado el medio, invertir las placas e incubarlas a 35C 2C durante 48 horas.

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RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES

Tcnica: Recuento en placa Medio de cultivo: Agar Cromocult (medio 2) Procedimiento: 1. 2. 3. 4. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado. Transferir alcuotas de 1ml. De cada una de las diluciones consecutivas en cajas de petri estriles. Verter en las cajas de petri 15 ml. De Agar Cromocult fundido y mantenido a 45C. Mezclar el inculo con el medio de cultivo fundido. No debe transcurrir ms de 20 minutos entre la realizacin de las diluciones y el vertido del medio. La manera mas indicada de mezclar el inculo con el medio es la siguiente: a) Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces. b) Rotar la caja 5 veces en el sentido de las agujas de reloj. c) Mover la caja 5 veces haciendo ngulo recto sobre el movimiento a). d) Rotar la caja 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj. Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga agar Cromocult.

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ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS Parte 2 Tatyana Linero 6. 7. Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0.1% incubando una caja que contenga 1 ml de agua peptonada y Agar Cromocult. Una vez solidificado el medio, invertir las placas e incubarlas a 35C 2C durante 48 horas.

DETERMINACIN DE COLIFORMES Tcnica: Nmero ms probable Medios de cultivo: Caldo lactosado bilis verde brillante al 2% (Medio 7) Agar Eosina azul de metileno (EMB) (medio 8) Agar violeta rojo neutro bilis (VRBA) (medio 10) Agar Endo (medio 9) Procedimiento:

Preparar las muestras y las diluciones de los homogenizados como se ha recomendado. El nmero de diluciones depende del grado de contaminacin supuesto en la muestra y/o de los estndares microbiolgicos del producto. Si no se tiene experiencia con el tipo de muestra a analizar que indique el nmero apropiado de diluciones, se recomienda preparar un nmero de 5. Prueba presuntiva
1. Pipetear 1 ml de cada una de las diluciones del homogenizado del alimento en tubos que contengan tubos de Durhan con caldo lactosado bilis verde brillante al 2% previamente esterilizados, utilizando tres tubos por cada dilucin. 2. Agitar suavemente los tubos e incubarlos a 35C 2C por 24 - 48 horas. 3. Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que muestren produccin de gas, que se observa por el desplazamiento del medio en el tubo de Durhan. Si a las 24 horas, todos los tubos muestran produccin de gas, continuar con la prueba confirmatoria.

Criterios de lectura: La lectura del NMP depende del medio de cultivo utilizado y del microorganismo investigado. Son parmetro frecuente: *Turbidez: Su presencia es indicadora de crecimiento bacteriano. Si la muestra genera turbidez en el medio, es necesario emplear otro parmetro de lectura o utilizar necesariamente para todos los tubos pruebas complementarias. *Produccin de gas: Los gases producidos por los microorganismos son capturados y observados colocando tubos de Durhan en el medio antes de su esterilizacin. En una reaccin positiva se observan burbujas de gas que desplazan el tubo de Durhan.

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Prueba confirmatoria
1 Confirmar que los tubos con produccin de gas en el caldo lactosado bilis verde brillante al 2% de la prueba presuntiva, son positiva a organismos del grupo coliforme, sembrando por estra una asada de cada uno de los tubos en la superficie de una placa de agar Eosina azul de metileno (EMB), agar violeta rojo neutro bilis (VRBA), agar Endo. Incubar las placas invertidas a 35C 2C por 24 horas. Pasado este tiempo se hace la lectura de las colonias tpicas de coliformes. Anotar el nmero de tubos confirmados como positivos para organismos coliformes en cada dilucin.

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DETERMINACIN DE COLIFORMES FECALES Tcnica: Nmero ms probable Medios de cultivo: Caldo lactosado bilis verde brillante al 2% (Medio 7) Caldo triptfano (medio 11) Reactivo de Kovacs (Reactivo 10) Procedimiento: Prueba de Mac-Kenzie:

1. A partir de los tubos positivos, con produccin de gas de la prueba presuntiva del NMP de coliformes, transferir de cada tubo una asada de cultivo en: a) Caldo lactosado bilis verde brillante al 2% conteniendo un tubo de fermentacin de Durhan b) Caldo triptfano 2 Mezclar suavemente los tubos e incubarlos a 44.5C 0.5C por 48 horas, en bao de agua con rotacin, teniendo cuidado de que el nivel de agua del bao sobrepasa el nivel del medio de cultivo.
Accidente de laboratorio: Spreader Se considera Spreader, el crecimiento que se caracteriza por la dispersin de un microorganismo a travs del agar, sta puede ocupar la totalidad de la caja o parte de ella. Si el Spreader cubre solo la mitad de la caja, y el rea restante presenta colonias bien distribuidas, haga el recuento en esta porcin de la caja. Si cubre ms de la mitad reporte Spreader o accidente de laboratorio. En cuyo caso habra que repetir la muestra.

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS Parte 2 Tatyana Linero MESOAEROBIOS, COLIFORMES TOTALES Y FECALES

TCNICA: Recuento en placa Clculo e interpretacin de resultados: Se reporta como Unidades formadoras de colonias (ufc)/g ml.

Seleccionar la caja que presente entre 30 y 300 colonias. Contar todas las colonias de la caja y multiplicarla por el factor de dilucin. Si las cajas de diluciones consecutivas estn dentro del rango de 30-300 colonias, se hace el recuento de cada una de las diluciones y se reporta la medida aritmtica de los dos valores obtenidos, a menos que el recuento mayor contenga dos veces al menor, en este caso se reporta el recuento menor. Ejemplo: (a) 10-1 = 290 colonias = 2900 10-2 = 40 colonias = 4.000

4.000 2.900

= 1.3 (menos de 2)

Reportar la medida aritmtica:

4000+2900 = 2

3.450

Reportar el recuento como: 3.450ufc/g ml.

(b) 10-1 = 170 colonias = 1.700 10-2 = 35 colonias = 3.500

3.500 1.700

= 2.05 (mayor de 2)

Reportar el recuento como: 1.700 ufc/g ml.

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS Parte 2 Tatyana Linero Si las cajas de diluciones consecutivas presentan recuentos menores de 30 y mayores de 300 colonias, contar las dos cajas, calcular el recuento para cada dilucin y sacar el promedio entre las dos. Ejemplo:

10-1 =330 colonias = 3.300

10-2 = 26 colonias = 2.600

Medida aritmtica: 3.300 + 2.600 = 1.780 2

Reportar el recuento como: 1.780 ufc /g ml.

Si no hay colonias en las cajas correspondientes a la dilucin de mayor concentracin, informar el recuento como menor de 1 multiplicado por el factor de dilucin ms concentrada.

10-1 : Ausencia de colonias Reportar el recuento como <10 ufc /g ml.

TCNICA: Filtracin por membrana Clculo e interpretacin de resultados: El reporte se hace en UFC/100 ml. Ya que la cantidad de mililitros de muestra filtrada puede modificarse en funcin a la cifra de microorganismos esperada; haga el clculo del reporte y lleve a 100 ml.

NMP COLIFORMES Clculo e interpretacin de resultados:

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS Parte 2 Tatyana Linero 1 Para obtener el NMP, proceder de la siguiente manera: Ver en cada una de las tres diluciones seleccionadas el nmero de tubos en los que se confirm la presencia de coliformes. Buscar en la tabla del NMP (Tabla 1) y anotar el resultado correspondiente al nmero de tubos positivos de cada dilucin. 2 Para calcular el NMP de organismos coliformes por gramo o ml de alimento utilizar la siguiente frmula:

NMP de la tabla x factor de dilucin intermedio

100

= NMP /g ml

Ejemplo: Si se obtuvieron los siguientes datos en la prueba confirmativa: 2 tubos positivos en la dilucin 10-1 1 tubo positivo en la dilucin 10-2 1 tubo positivo en la dilucin 10-3

Tabla NMP 2:1:1 =20

Aplicando frmula 20 x 100 = 20 coliformes /g ml 100

Expresar los resultados como NMP de coliformes /g /ml

NMP DE COLIFORMES FECALES Leer la prueba de Mac-Kenzie de la siguiente manera: a) Observar la produccin de gas en el caldo lactosado bilis verde brillante al 2% b) Revelar el caldo triptfano, de los tubos gas positivo, adicionando 0.2 ml del reactivo de kovacs, agitar suavemente y observar la presencia de un anillo rojo cereza en la superficie de la capa de alcohol amlico indicando la presencia de Indol cuando la prueba es positiva o el color original del medio cuando la prueba es negativa.

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS Parte 2 Tatyana Linero 1. Considerar como coliformes de origen fecal los que demuestren positividad en ambas pruebas: gas positivo e Indol positivo 2. Confrontar los resultados con la tabla del NMP (tabla 1)

Expresar los resultados como NMP de coliformes fecales g /ml