Vous êtes sur la page 1sur 72
TTTRRRAAAVVVAAAUUUXXX PPPRRRAAATTTIIIQQQUUUEEESSS dddeee PPPNNNVVV LLLSSSVVV222 2013 1
TTTRRRAAAVVVAAAUUUXXX
PPPRRRAAATTTIIIQQQUUUEEESSS
dddeee PPPNNNVVV
LLLSSSVVV222
2013
1

RREELLAATTIIOONNSS SSTTRRUUCCTTUURREESS -- FFOONNCCTTIIOONNSS CCHHEEZZ LLEESS VVEEGGEETTAAUUXX

OSMOSE ET PERMEATION (TP1)

A. INTRODUCTION

A première vue, les expériences groupées dans cette manipulation et le matériel biologique employé peuvent paraître disparates. En fait, il ne sera question ici que de certains types d'échanges cellulaires (osmose : eau ; perméation : ions) établis entre le vivant et son milieu.

ils ont été choisis parce qu'ils

Quant aux sujets d'analyse (tubercules, épidermes, protoplastes permettaient des expériences simples et de courte durée.

),

Le potentiel osmotique

Le potentiel osmotique, désignée par le symbole Ψs, est fonction de la température, de la concentration de la substance dissoute, et de ses caractéristiques de dissociation.

Le potentiel hydrique

La notion de potentiel hydrique a été largement discutée au cours.

Pour éclaircir des problèmes de terminologie, nous donnerons le tableau suivant :

Milieu intérieur

Milieu extérieur

 

=

int -

ext

Iso-osmotique

Isotonique

équilibre

 

= 0

Hypo-osmotique

Hypertonique

plasmolyse

   

> 0

Hyper-osmotique

Hypotonique

turgescence

   

< 0

B. Evaluation des paramètres osmotiques

A) Détermination de la potentiel de succion tissulaire

Les tubercules de pommes de terre sont constitués essentiellement de parenchyme de réserve. En mettant à profit la grande homogénéité de ce tissu, il est possible de réaliser un certain nombre d'expériences, telles que la mesure du poids frais ou d'une longueur, sur des fragments de tubercule.

1. Préparation du matériel

- Prendre trois pommes de terre, les éplucher et les placer dans un récipient plein d'eau. Découper les tubercules en parallélépipèdes de section carrée (env. 0,5 cm de côté).

- Après les avoir lavés, conserver les segments de tissus dans un papier sopalin humide.

- Ajuster alors les fragments de tissus à une longueur déterminée de 4cm, en supprimant les bords inférieurs et supérieurs.

- Essuyer légèrement les segments de tissus ainsi obtenus sur un papier sopalin et les

répartir en lots de 4.

- Déterminer rapidement, sur les balances, le poids frais (PF 0 ) de chaque lot (auquel

on attribuera un numéro).

2. Mode opératoire

- Préparer dans 6 tubes falcons de 50 mL des solutions de saccharose aux concentrations indiquées (ci-dessous), à partir d'une solution stock (2M).

bécher

Ψ s (bars) expérimentale

Concentration

Calcul Ψ s (bars) Solution idéale

finale (M)

1

0

0,00

 

2

-1,3

0,05

 

3

-2,6

0,10

 

4

-5,2

0,20

 

5

-11

0,40

 

6

 

0,60

 

7

-25,2

0,80

 

8

 

1,00

 

- Incuber vos lots de fragments de pomme de terre dans chacun des tubes.

- Après 1 heure d’incubation, mesurer pour chacun des lots, le poids frais PF f ainsi que

la longueur moyenne L f de chaque lot (légèrement essuyer les segments sur un papier

sopalin).

On calculera alors :

les segments sur un papier sopalin). On calculera alors : Pression osmotique d’une solution idéale (formule

Pression osmotique d’une solution idéale (formule de Van t’Hoff) :

Π =RT/V.log a w i x C B x R x T x 1000 en Pa (1 bar = 101325 Pa)

3. Résultats

Reporter sur un graphique, les courbes correspondant au L et au PF, en fonction de la concentration molaire (M) du saccharose.

Pour chacune des courbes, déterminer la valeur de la concentration de saccharose correspondant à l'intersection avec l'abscisse.

Calculer les valeurs théoriques idéale de Π pour les différentes solutions suivant la formulation de Van t’Hoff.

Calculer à partir de cette valeur, le potentiel hydrique des tissus (Ψ W = Ψ S = -Π car

Ψ P = 0 au point d’intersection sur l’axe des abscisses).

Exprimer alors Ψ W en MPa et en Bar.

Rappels :

0 °C = 273,15 K ; R = 8,31 J/mol.K ; i = 1 pour le saccharose, 2 pour le NaCl ; C B = Concentration Molaire de la solution.

B) Quelques propriétés des protoplastes foliaires

Le protoplaste est une cellule dont on a fait disparaître (mécaniquement ou enzymatiquement) la paroi. En l'absence des potentiels hydrostatiques (pressions) normalement exercées par la paroi sur le contenu cellulaire, il n'est stable que dans des conditions isotoniques (ou légèrement hypertoniques) et prend alors une forme sphérique. Les protoplastes permettent

d'étudier un certain nombre de caractéristiques du plasmalemme (perméabilité, charges, Nous nous bornerons ici à observer la pénétration de deux types de colorants, pour lesquels le plasmalemme présente une perméabilité sélective.

).

1. Isolement des protoplastes

perméabilité sélective. ). 1. Isolement des protoplastes 1.1. Incubation enzymatique - Peler délicatement, à

1.1. Incubation enzymatique

- Peler délicatement, à l'aide d'une brucelle à pointes fines, l'épiderme inférieur de 3-5 feuilles de mâche (Valerianella olitoria), et découper le mésophylle en carrés de 1mm² environ. Travailler sur un papier filtre humide, pour éviter le dessèchement.

- Pipeter dans une boîte de Pétri 2 ml d'une solution enzymatique déjà prête, contenant

des cellulases, des pectinases et du sorbitol. Expliquer le rôle de ces divers composés.

- Déposer les fragments de feuilles (face pelée vers le bas) à la surface de la solution d'incubation.

- Envelopper la boîte de Pétri d'une feuille d'aluminium et incuber à 20-30°C durant 30

minutes sur un agitateur orbital (50-100 tpm) - (Attention à ne pas renverser la boîte).

1.2.

Purification

- Filtrer la suspension de protoplastes à travers un filtre nylon (100 µm), pour éliminer les restes de feuilles non digérées. Rincer le matériel après usage.

- Centrifuger 1,5 mL de la suspension de protoplastes (tubes eppendorf de 1.5 mL, 500 tpm, 5 min).

- Eliminer le surnageant et laisser 100-150 µL de solution. Le culot de protoplastes sera suspendu en tapotant sur le tube. Ne surtout pas vortexer.

- Conserver cette suspension de protoplastes dans son tube eppendorf et agiter doucement avant usage.

2. Observation et comptage des protoplastes

Une cellule de numération est une lame porte objet dans laquelle est creusée une chambre de comptage de volume connu. C’est une lame épaisse en verre, comportant des rigoles et un quadrillage :

Plate-forme centrale

Profondeur de la chambredes rigoles et un quadrillage : Plate-forme centrale Lamelle planée Rigoles Lame porte - objet surélevés

Lamelle planée Rigoles Lame porte - objet surélevés
Lamelle planée
Rigoles
Lame porte - objet
surélevés

Quadrillage

Le volume de comptage est déterminé par :

-la surface du quadrillage gravé sur la lame. -la profondeur de la chambre.

Parmi les 100 rectangles totaux, on trouve 25 rectangles qui sont divisés en 20 petits carrés afin de faciliter le comptage.

Le volume correspondant au quadrillage total est égal à 1 mm 3 = 1 µL

Chaque rectangle correspond à un volume 100 fois plus faible, soit 0,01 mm 3 = 10 nL

Pour la Numération

Observer à l’objectif x10 pour repérer la position du quadrillage, et vérifier l’homogénéité de la répartition des cellules à compter (si la répartition est mauvaise, recommencer). Régler le contraste et la lumière pour observer la grille et les protoplastes.

Observer ensuite à l’objectif x40 ou à x60 pour réaliser le comptage (Voir instructions).

Compter les cellules contenues dans 4, 10, 20 ou dans la totalité des 100 rectangles du quadrillage.

Remarque : pour les cellules chevauchant les lignes de quadrillage, compter seulement celles qui chevauchent 2 arêtes du rectangle sur 4 (en pratique, on choisit de prendre en compte les cellules chevauchant la ligne horizontale supérieure, et la ligne verticale droite).

horizontale supérieure, et la ligne verticale droite). Numération sur le rectangle = 7 protoplastes - Prélever

Numération sur le rectangle = 7 protoplastes

- Prélever une goutte de suspension de protoplastes (env. 20µL) et la déposer sur la

gouttière centrale de la cellule de comptage (Malassez, voir explication). Estimer le

nombre de protoplastes isolés et leur concentration (protoplastes/mL).

- Observer alors, à un grossissement final de 400x-600x, les détails morphologiques

des protoplastes. Dessiner une cellule de protoplaste et déterminez la position des

chloroplastes, des vacuoles etc

3. Perméabilité sélective

- Pipeter délicatement 20 µL de la suspension de protoplastes.

- Ajouter sur les lames 1 et 2, respectivement, 20µL, des colorants suivants :

I : Rouge neutre 0.1 % v/v en solution TL.

II : Phénosafranine 0.1 % v/v en solution TL.

- Recouvrir d’une lamelle et après 2 min, observez au microscope. NE PAS LAISSER

SECHER !

Pour les deux essais, déterminer, le nombre de protoplasmes colorés (A compter sur 20 protoplastes sans a priori).

Commenter les résultats.

- Ajouter alors sur les bords d’une lamelle, 20µL d'eau ou de sorbitol à 15% (Réalisez deux expériences).

Observer en temps réel les phénomènes physiques sur les protoplastes.

C) Observations microscopiques

Les lambeaux épidermiques, constitués d'une assise cellulaire unique, permettent une observation microscopique aisée des cellules qui les composent. Les vacuoles de ces tissus occupent la presque totalité de l'espace cellulaire. Il est ainsi possible, en plongeant ces lambeaux dans des solutions de potentiel osmotique variable, d'étudier les échanges d'eau entre les cellules et le milieu extérieur, et, d'obtenir, sur la base d'observations microscopiques, des informations sur le potentiel hydrique cellulaire.

1. Mode opératoire - Inciser délicatement, à l'aide d'un scalpel, un carré de 3 mm

1. Mode opératoire

- Inciser délicatement, à l'aide d'un

scalpel, un carré de 3 mm de côté environ, dans

l'épiderme intérieur d'une écaille d'un bulbe d'oignon.

- Détacher avec une paire de brucelles à pointes fines, le fragment épidermique ainsi délimité en le saisissant par un des coins.

- Placer le lambeau (face déchirée vers le bas) entre lame et lamelle dans 1 mL d’une solution de sorbitol (6 tubes). Ajouter 20µL de Vert de Méthyle et 20µL de Rouge Neutre dans chaque tube eppendorf.

- Après 5 min., observez entre lame et lamelle au microscope.

- Dessinez les points extrêmes de turgescence et de plasmolyse, puis cherchez les points encadrant l’isotonie.

Choisir au microscope une zone facilement observable.

Observez

la

cellule

et

ses

hydrique cellulaire.

différents

2. Evaluation du potentiel hydrique cellulaire

compartiments

puis

évaluez

le

potentiel

A l'isotonie, le potentiel hydrique de la cellule est égal au potentiel osmotique du milieu extérieur.

On utilisera des solutions de sorbitol (substance qui ne pénètre pas ou peu dans les cellules) à différentes concentrations (0 ; 2; 6; 8 ; 10 et 15 %).

En travaillant chaque fois avec un lambeau frais, noter la concentration C, pour laquelle il y a une légère plasmolyse.

Déterminer la concentration molaire de sorbitol qui se rapproche le plus de l'isotonie et déduire le potentiel hydrique cellulaire.

Annexes :

Annexes : 8

Etude de la structure racinaire, caulinaire et du processus d’ouverture stomatique (TP2)

Exécution et montage des coupes anatomiques

1. Exécution

Les échantillons de plante sont au préalable coupé et inclus dans de l’agar à 4 %. L'agar sert pour les coupes au vibratome (Labonord 100 plus), mais pas vraiment pour protéger un tissu pendant l'inclusion.

Gardez une dizaine de coupe de chaque échantillon de tige ou de racine, puis procédez aux colorations de ces coupes.

2. Coloration

Respecter les indications de temps de traitement et de rinçage suivants :

Prendre une plaque multi-puits et ajoutez un volume de 5mL de chaque solution de coloration ou d’eau distillée. Procédez aux colorations des coupes des échantillons végétaux. Les transferts d’un milieu vers un autre se font à l’aide d’un tamis après chaque temps de traitement.

1) eau de javel: 15 min 2) rinçage abondant à l’eau 3) lavage rapide à l’acide acétique :

1-2 min 4) rinçage sommaire à l’eau

5) Coloration au rouge Congo: 10 min 6) Rinçage sommaire

7) Coloration au Vert d'iode: 5 min 8) Rinçage soigneux et montage sur lame.

Résultat

Les tissus cellulosiques apparaissent en rouge; les tissus lignifiés et subérifiés apparaissent en vert – ( Attention les colorations présentées en cours peuvent être différentes).

3. Montage

Il est indispensable que lames et lamelles soient propres et sèches et que, par ailleurs, les surfaces optiques du microscope, en particulier l'oculaire, soient essuyées avec un papier Kim Wipes (risque de rayures).

Ne monter que 2 à 3 coupes sur une lame en choisissant de préférence les fragments de coupes les moins colorés ; ce sont en principe les plus minces.

Placer suffisamment de liquide de montage sur la lame pour que toute la coupe soit immergée. Placer doucement la lamelle sur la préparation en vous aidant d'une aiguille montée. Ne pas appuyer sur la lamelle pour chasser d'éventuelles bulles d'air : la préparation serait irrémédiablement inutilisable.

Si besoin, ajouter de l'eau en présentant à l’aide des comptes gouttes au bord de la lamelle, sans la soulever (l'eau pénètre par capillarité), ou au contraire, éliminer les excès d'eau avec un mouchoir de papier.

II. CONSEILS POUR LE DESSIN

1. Généralités

Dessiner grand (2/3 d’une page), l'échelle du dessin étant choisie en fonction des plus petits détails à reproduire (Endoderme ou pôles vasculaires, par exemple).

Respecter les proportions relatives des différentes parties.

Faire des traits fins, nets, réguliers, continus (crayon HB).

Légendes: placées assez loin, brèves mais précises et complètes, écrites lisiblement et horizontalement; traits de rappel à la règle, se terminant dans le dessin par un point ou une flèche et ne se croisant pas.

Le titre comprend le nom complet de la plante (genre, espèce et autres indications taxonomiques en Latin), de l'organe ou du détail représenté, le sens de la coupe, le grossissement, etc

2. Dessin général

Représenter le contour exact d'un quart de coupe (pas de compas: une coupe n’est jamais parfaitement ronde) et les limites exactes des différents tissus en veillant particulièrement aux proportions relatives. Utiliser un tiré pour montrer l'arrêt "arbitraire" de la coupe.

Les particularités de votre échantillon doivent être représentées : nombre exact de faisceaux conducteurs, contours irréguliers d'une lacune, d'un cambium, position précise d'un canal ou d'une fibre isolée, etc. Ne pas représenter de cellules, sauf les très gros vaisseaux de métaxylème, caractéristiques des Monocotylées (voir planche I).

Utiliser les représentations conventionnelles des différents tissus (voir page suivante).

des différents tissus (voir page suivante ). A RENDRE pour le TP2, partie n°1 : 1-

A RENDRE pour le TP2, partie n°1 :

1- Pour le compte rendu, rendre une feuille A4 présentant les deux dessins schématiques d’une structure racinaire et d’une structure caulinaire.

2- Présenter le principe expérimental et rendre un tableau synthétique présentant les analogies et les différences entre ces deux tissus pour enfin conclure sur la relation entre la structure et la fonction d’un organe végétal.

entre ces deux tissus pour enfin conclure sur la relation entre la structure et la fonction
entre ces deux tissus pour enfin conclure sur la relation entre la structure et la fonction
entre ces deux tissus pour enfin conclure sur la relation entre la structure et la fonction

SSYYMMBBOOLLEESS UUTTIILLIISSEESS PPOOUURR UUNN SSCCHHEEMMAA AANNAATTOOMMIIQQUUEE

((TTPP 22))

Épiderme cutinisé

Suber (quadrillage à 90° - ici 3 couches)

Exoderme, péricycle, hypoderme, périderme, phelloderme (ici une assise)

Rhizoderme (Représentation non schématique des poils absorbants)

Endoderme en 'U' (Dessin non schématique) (Monocotylées)

Endoderme à cadre de Caspary (Dessin non schématique) (Eudicotylédones)

Cambium et phellogène (assise génératrice)

Collenchyme

Cambium et phellogène (assise génératrice) Collenchyme Phloème ( points non alignés ) Liber ( points alignés

Phloème (points non alignés)

Liber (points alignés en lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons)

Xylème primaire ou protoxylème (A noircir)

Métaxylème avec gros vaisseaux des Monocotylées (dessiner la forme exacte des vaisseaux)

Bois homoxylé (Gymnospermes - lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons)

Bois hétéroxylé (Eudicotylédones - lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons)

Parenchymes (préciser le type)

Sclérenchyme (quadrillage fin à 45°)

Parenchymes sclérifiés (quadrillage lâche à 45°)

EETTUUDDEE DDEESS PPRROOCCEESSSSUUSS RREEGGUULLAANNTT LLOOUUVVEERRTTUURREE SSTTOOMMAATTIIQQUUEE ((TTPP22 SSUUIITTEE))

Epidermes isolés

Les études sur épidermes isolés sont réalisées sur des feuilles de plants âgés de trois à quatre semaines (Arabidopsis thaliana, Commelina communis, Valerianella olitoria, Vicia faba). Les jeunes feuilles sont prélevées avant l’éclairement du phytotron (les stomates sont fermés).

A l’aide d’une pince, on pelle la face inférieure de la feuille de façon à détacher la couche épidermique. Chaque couche épidermique est collée, face inférieure sur une lamelle de verre avec de l’adhésif silicone de type Hollister N°7730 (Medical adhesive) connu pour ne pas

type Hollister N°7730 (Medical adhesive) connu pour ne pas endommager les cellules. Danger très important de

endommager les cellules. Danger très important de fixation tissulaire (peau-organe).

Les lamelles sont ensuite déposées dans des petites boîtes de Pétri contenant 3 ml de milieu tampon : KCl 10 mM, KOH 30 mM, MES 10 mM, pH ajusté à 6,5 avec de l’acide iminodiacétique. Puis les boîtes sont placées à l’obscurité (sous papier aluminium) à température ambiante pendant quinze minutes, avant l’ajout de molécules pharmacologiques à tester, afin de normaliser les valeurs d’ouverture stomatique entre les différentes expériences.

Ouverture stomatique

Les lamelles portant les épidermes végétaux seront soumises à quatre types de traitement :

Traitement lumineux d’une heure sous lampe à lumière froide. Traitement obscurité d’une heure supplémentaire (Absence de lumière). Traitement lumineux en présence d’acide abscissique à 1µM de concentration finale. Traitement obscurité en présence de fusiccocine à 5 µM de concentration finale. Après 1h de traitement, les épidermes montés sur une lame et sont observés au microscope.

concentration finale. Après 1h de traitement, les épidermes montés sur une lame et sont observés au

Observation

Observer d'abord au faible grossissement du microscope pour centrer la coupe, puis utiliser le grossissement moyen pour reconnaître les différents tissus et les zones où la coupe est la meilleure.

Passer au fort grossissement (10x 60) puis régler l'intensité lumineuse en agissant sur le rhéostat de l'éclairage, le condenseur de lumière et le diaphragme. Excès ou défaut de lumière sont également nuisibles à une bonne observation.

Utiliser l’oculaire équipé d’une graduation et comparer vos observations avec la lame de calibration gravée au centième de mm. Mettre le microscope en position de calibration de facon à faire correspondre vos occulaires avec la

lame de calibration.

correspondre vos occulaires avec la lame de calibration. Compter le nombre de lignes (X pour l’occulaire
correspondre vos occulaires avec la lame de calibration. Compter le nombre de lignes (X pour l’occulaire
correspondre vos occulaires avec la lame de calibration. Compter le nombre de lignes (X pour l’occulaire

Compter le nombre de lignes (X pour l’occulaire et Y pour la lame de calibration). Calculer la distance entre chaques lignes au niveau de l’occulaire avec l’équation suivante :

Mesure entre 2 lignes = Y/X x 10 µm

Maintenant, vous êtes capables de mesurer la taille des cellules végétales en µm grâce à votre calibration. Vous pouvez effectuer un comptage exhaustif des stomates ouvert ou fermés suivant les conditions expérimentales.

La largeur de l’ostiole, représentative de l’ouverture stomatique, exprimée en micromètre sera mesurée sous microscope photonique (grossissement 10x60).

Pour chaque traitement, l’ouverture moyenne de 20 stomates sera calculée ainsi que l’écart à la moyenne ( = Ecart type/racine (n-1)) – Fournir le tableau de valeur avec le compte rendu.

 
A RENDRE pour le TP2 partie n°2 :  

A RENDRE pour le TP2 partie n°2 :

A RENDRE pour le TP2 partie n°2 :  
 

3- Pour le compte rendu, présenter après une courte introduction, les objectifs du TP, l’Interprétation des observations chez Vicia faba et Commelina communis, puis finir par une conclusion.

4-

Rendre un tableau synthétique présentant les valeurs d’ouvertures des ostioles pour chaque condition expérimentale et donner les évaluations statistiques.

13
13
13
   

------------------------------------------------------------------------

Exemple de calcul de l'écart-type :

Voici quatre séries de 5 valeurs:

Condition A : 10 ; 12 ; 14 ; 16 ;

Condition B : 12 ; 12 ; 12 ; 12 ; 12

Condition C : 12 ; 13 ; 12 ; 11; 12

Condition D :

7 ; 17 ; 10 ; 13 ; 13

8

Calculer la moyenne de ces quatre conditions. Que constatez-vous ?

Quel est la variabilité des valeurs dans chacune de ces conditions ? Pour les distinguer, on calcule un paramètre appelé écart type ( )

Exemple de calcul :

A =

appelé écart type ( ) Exemple de calcul : A = TP3 : ETUDE DE LA

TP3 : ETUDE DE LA GLUTAMINE SYNTHETASE ET DE

LA GLUTAMATE SYNTHASE DES RACINES DE MAIS

I - Principe

L’ammoniac (NH 3 ) qui résulte de la réduction des nitrates ou de celle de l’azote atmosphérique est

immédiatement incorporé sous forme d’aminoacides ou d’amides. L’une de ces dernières, la glutamine, amide de

l’acide glutamique, est le précurseur ou le donneur du groupe aminé de nombreux produits du métabolisme

La glutamine est formé à partir de l’acide glutamique par action de la

(tryptophane, histidine, CTP, AMP,

glutamine synthétase:

).

NH 4 + acide glutamique + ATP

Mg 2+

synthétase: ). NH 4 + acide glutamique + ATP Mg 2 + glutamine + ADP +

glutamine + ADP + Pi

La glutamine synthétase est une enzyme de structure complexe, isolée chez les procaryotes et les

eucaryotes, dont le poids moléculaire varie selon les espèces de 500 à 600 KkDa. Elle peut également

catalyser la formation de - glutamyl hydroxamate:

Ac. glutamique + ATP + NH 2 OH

Mg 2+

formation de - glutamyl hydroxamate: Ac. glutamique + ATP + NH 2 OH Mg 2 +

- glutamyl hydroxamate + ADP + Pi

C’est la présence de ce composé qui sera recherchée dans des mélanges réactionnels comprenant la glutamine synthétase extraite de racines de maïs.

La glutamate synthase (glutamine : 2-oxoglutarate aminotransférase = GOGAT) catalyse la seconde étape de l’assimilation de l’azote ammoniacal ; elle permet le transfert d’un groupement NH 2 de la fonction amide de la glutamine vers l’acide 2-oxoglutarique pour former deux molécules de glutamate.

Glutamine + 2-oxoglutarate + NADH + H +

de glutamate. Glutamine + 2-oxoglutarate + NADH + H + 2 glutamate + NAD + Nous

2 glutamate + NAD +

Nous nous intéresserons donc au cours de ce TP à la glutamate synthase NADH-dépendante.

II - Préparation de l’extrait enzymatique

Les grains de maïs sont mis à germer pendant 72 h à 26°C en présence de (NH 4 ) 2 SO 4 10 mM) et de KNO 3 (10 mM). Les racines (10 g) sont broyées dans un mortier en présence de 15 mL de tampon Tris-HC1 (50 mM) pH 7,4 contenant de 1’EDTA (10 mM), du MgC1 2 (10 mM) et du DTT (10 mM). Après filtration sur étamine, la suspension obtenue est centrifugée à 14000 rpm pendant 30 minutes. Après élimination du culot, le surnageant obtenu servira à déterminer l’activité enzymatique étudiée.

III - Activité de la glutamine synthétase

1 / Réalisation de la courbe étalon La courbe étalon sera effectuée à l’aide de différentes concentrations de -glutamyl hydroxamate, les hydroxamates forment en effet des complexes fortement colorés avec les ions ferriques.

- Introduire dans 7 tubes à essais:

0 - 0,1 - 0,15 - 0,2 - 0,25 - 0,3 et 0,4 mL d’une solution de -glutamyl hydroxamate 5 mM.

- Compléter à 1,6 ml avec du tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7,4. Rajouter dans chaque tube 0,4 mL du réactif composé de :

- FeC1 6H à 10% dans HC1 0,2 N (1 vol.)

- Acide trichloracétique à 25% (1 vol.)

-HCl 6N (l vol.)

- Acide trichloracétique à 25% (1 vol.) -HCl 6N (l vol.) (en préparer 12 ml) Lire

(en préparer 12 ml)

Lire les densités optiques à 540 nm après 10 minutes.

2 / Détermination de l’activité enzymatique

Dans un tube à hémolyse, mélanger:

- 0,5 ml de tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7,4

- 0,2 ml de Na-glutamate (0,3 M)

- 0,2 ml d’ATP (30 mM)

-0,1 ml de MgSO 4 (0,5 M)

- 0,5 ml d’extrait enzymatique

- Incuber 5 minutes à 25°C. Ajouter alors 0,1 ml de NH 2 OH (1 vol. de NH 2 OH-HCl N + 1 vol. de NaOH N).

- Incuber 15 minutes à 25°C puis arrêter la réaction avec 0,4 ml du réactif décrit au III-A.

- Réaliser un essai témoin en remplaçant l’extrait enzymatique par du tampon.

- Centrifuger les essais à 5000 rpm pendant 10 minutes et lire les D.O. à 540 nm.

- Exprimer les résultats en nmoles de γ-glutamyl hydroxamate formées par minute et par mg de protéine.

IV - Etude de la glutamate synthase

La détermination de l’activité enzymatique sera effectuée en suivant au spectrophotomètre la diminution de D.O. à 340 nm correspondant à l’oxydation du NADH.

1 / Réalisation de la courbe étalon

A partir de la solution de NADH 1 mM, préparer les solutions : 25, 50, 100, 150 et 200 tM (Vf= 2,4 mL).

Lire directement les D.O. à 340 nm.

2 / Détermination de l’activité enzymatique

La préparation des mélanges réactionnels 1, 2 et 3 s’effectuera directement dans une cuve de spectrophotomètre de la manière suivante :

 

1

2

3

Tampon HEPES-KOH 200mM, pH8,6 renfermant 10

1,7 mL

1,3 mL

1,6 mL

mM

de DTT

2-oxoglutarate 10 mM

0,2 mL

0,2 mL

0 mL

NADH 1 mM

0 mL

0,4 mL

0,4 mL

Glutamine 100 mM

0,1 mL

0,1 mL

0 mL

Extrait enzymatique

0,4 mL

0,4 mL

0,4 mL

La réaction démarre par l’addition du NADH. Suivre la variation de D.O. à 340 nm toutes les 30 secondes pendant 5 minutes, du mélange 2 par rapport au mélange 1.

Effectuer la même opération en remplaçant 2 par 3.

Exprimer les résultats en nmoles de NADH oxydé par min et par mg de protéine.

Conclusions.

V - Dosage des protéines par la méthode de Bradford

Cette méthode repose sur la propriété du bleu de Coomassie à se lier, en milieu acide, aux protéines et de former ainsi un complexe qui absorbe à 595 nm.

1 / Préparation de la gamme étalon

Préparation des solutions de BSA

A partir d’une solution de protéine d’albumine sérique bovine (BSA) concentrée à 20 mg.mL -1 , préparer une solution fille à 2 mg/ mL -1 (V= 1 mL).

Préparer ensuite à l’aide de cette solution fille 6 tubes contenant 200 µL de solution de BSA à 0 - 0,25 - 0,5 – 1 - 1,5 et 2 mg. mL -1 .

Dosage au réactif de Bradford

Mélanger 10 µL de chacune de vos solutions de BSA dans le réactif de Bradford dilué 5X dans H 2 O (Vf= 1 mL).

Incuber 5 minutes à température ambiante et mesurer les D.O. à 595 nm en utilisant le tube 0 de la gamme comme 0 d’absorbance.

Tracer le graphe des D.O. obtenues à 595 nm en fonction de la concentration en BSA (µg.mL -1 ).

2 / Dosage de l’extrait enzymatique

Réaliser un dosage au réactif de Bradford des protéines contenues dans votre extrait après l’avoir dilué 10, 20 et 50 fois. Le mode opératoire sera le même que celui utilisé pour la réalisation de la gamme étalon.

Chaque dilution fera l’objet de 2 mesures.

Déterminer graphiquement la concentration en protéine de votre extrait enzymatique.

Préparation des Solutions et matériels, cultures et installation des Salles : (Version 2011)

TP 1 - préparation des solutions :

Achat à Carrefour de Pomme de Terre (20kg), Mâche (2 paquets) et 2 sacs d’oignons blancs.

14-18/Mars/2011 -

Solution de Sorbitol : MW 182.2 anhydre Faire 250 mL d’une solution à 15% w/v de Sorbitol (15g/L) puis, diluer.

Faire des solutions de sorbitol à 1, 5, 10 et 15 % w/v - 50mL de chaque Faire des fractions aliquotes pour 7x4 eppendorf de 1,5 mL.

Solution de Sucrose :

Solution stock de sucrose à 2M

Faire 2L : Pour 500 mL à 2M 342,30g de sucre

- MW 342.30

Sera dilué. en TP de 0.1 à 0.8 M

Tampon MES pH6.15 100mM (100mL) Peser 1.952 g de MES dans 90mL d’eau Ajouter qqs gouttes de NaOH 10N Ajuster à 100 mL

Solution TL : (Préparation en TP)

10% Sorbitol Tampon MES pH 6.15 0.05 M Ajouter extemporanément (en cours de TP):

50 % de sorbitol 20% 50 % de MES 100 mM

0.1 g de Cellulase Sigma (C-8546)

0.2 g de Pectinase Fluka (17389)

Rouge Neutre et Safranin O :

Diluer à 0.1 % w/v en solution TL sans enzymes (10mg pour 10mL) Aliquoter en 7x4 eppendorf de 1,5 mL.

Préparation d’une solution de Vert de méthyle (100mL)

en solution aqueuse, acidifiée à l'acide acétique :

Eau bidistillée :

100 ml

Vert de méthyle :

5 g

acide acétique glacial

1 cc

Laisser durant 1 heure sur l'agitateur magnétique, et ensuite filtrer !

TP 2 - Préparation des solutions :

7-11/Mars/2011 - Attention, lancer les cultures pour le matériel biologique en avance (4semaines) :

Vicia faba - 7 pots x12 binômes = 84 pots. Medicago sativa – 2 pots vermiculite x 12 binômes

Solutions à 5 µM fusicoccine et 1 µM ABA. (Risque toxicité).

La préparation des solutions se fait dans EtOH 100% et le stockage à -20°C.

Préparation bouteille Agar à 4% dans de l’eau (4x 100mL).

Préparation des Solutions tampons : (2000 mL)

KCl 10 mM, KOH 30 mM, MES 10 mM, pH ajusté à 6,5 avec de l’acide iminodiacétique.

Préparation des solutions de coloration :

Dilution dans 1000 mL d’eau distillée des solutions de coloration.

1-

Vert d'iode à 2/1000

2-

Rouge Congo à 2/1000 (Risque toxicité) A changer pour Carmin ou Phloroglucinol.

3-

Acide Acétique à 1% à partir d'acide acétique Glacial

4-

Solution d'eau de javel à 12°

Remplir les comptes gouttes avec les diverses solutions et de l'eau distillée (Faire les

étiquettes si nécessaire).

Installation de la salle pour le TP1:

14 postes avec :

1 vortex pour 2 binômes

1 microscope pour chaque binôme

1 cellule de Malassez pour chaque binôme +

lamelle

4

Lames de microscope +lamelles

1

portoir orange pour tube falcon de 50mL

6

tubes falcon vide + 1 tube de saccharose 2M

1

portoir eppendorf avec :

4 solutions de sorbitol en eppendorf :

1%, 5%, 10% et 15 % 2 tubes eppendorf de 1.5 mL vide + 1 tube de 2 mL

1

portoir de pipette avec :

1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL

1 propipette

1

éprouvette graduée de 50 mL - 100 mL

1

couteau court

1

pince

1

scalpel

1

pissette d’eau 500 mL

1

compte goutte d’eau distillée

1

pipetteman de 200µL

1

pipetteman de 1000 µL

d’eau 500 mL 1 compte goutte d’eau distillée 1 pipetteman de 200µL 1 pipetteman de 1000
d’eau 500 mL 1 compte goutte d’eau distillée 1 pipetteman de 200µL 1 pipetteman de 1000

1

lot de cône bleu

1 lot de cône jaune

1 sopalin

1 Poubelle de Table

Installation de la salle pour le TP2:

Installer la table orbitale et le Vibratome Installer les lampes LED/Fluocompacte pour l’éclairage

7 postes avec :

1 lame de calibration 100µm 1 microscope pour chaque binôme 1 vortex par binômes 4
1
lame de calibration 100µm
1
microscope pour chaque binôme
1
vortex par binômes
4
Lames de microscope +lamelles
1
portoir orange pour tube falcon de 50mL (Solution pour Stomate)
1
portoir eppendorf avec :
4 solutions de sorbitol en eppendorf : 1%, 5%, 10% et 15 %
2 tubes eppendorfs de 1.5 mL vide + 1 tube de 2 mL
1
portoir de pipette avec :
1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL
1 propipette
1
pince
1
scalpel
1
pissette d’eau 500 mL
compte goutte de Javel, Acide acétique, Vert
d’iode et Rouge congo
1
1 pipetteman de 10-20µL
1 pipetteman de 200µL
1 pipetteman de 1000 µL
1 lot de cône bleu
1 lot de cône jaune
1 sopalin
1Poubelle de Table
2
Supports nylon pour les coupes
2
Plaques 8 puits
1
marqueur
1 lot de cône jaune 1 sopalin 1Poubelle de Table 2 Supports nylon pour les coupes
1 lot de cône jaune 1 sopalin 1Poubelle de Table 2 Supports nylon pour les coupes

Les microscopes LEICA doivent être équipés d’objectif gradué. Réticule Leica gradué :

équipés d’objectif gradué. Réticule Leica gradué : Inventaire des solutions 01/2010 : Quantité Produit

Inventaire des solutions 01/2010 :

Quantité

Produit

Référence

Marque

1kg

D-Sorbitol

S1876-1kg

Sigma

500g

Iminodiacetic acid

220000

Aldrich

25g

Carmine

C1022-25g

Sigma

5g

MES

M3671-50g

Sigma

10g

Pectinase

17389

Fluka

50g

Pectinase

17389

Fluka

5kU

Pectinase solution

P4716-5kU

Sigma

2.5kU

Cellulase

2* C8546-2.5kU

Sigma

25g

Phloroglucinol

P3502-25g

Sigma

Solutions et matériels à préparer pour le TP3 "Etude de la glutamine synthétase (GS) et de la glutamate synthase (GOGAT) des racines de maïs" version

2010-2011

● Matériel végétal commun pour tous les étudiants

- 2 L Milieu de germination des grains de maïs

(NH 4 ) 2 SO 4 (10 mM)

1.32 g/l

KNO 3 (10 mM)

1.01 g/l

A conserver à RT (à préparer et à conserver au laboratoire INRA)

- 5 jours avant le TP Des grains de maïs sont mis à germer dans des containers en plastique (à l’INRA) sur 2 épaisseurs de sopalin imbibé de milieu de germination. La germination a lieu pendant 4 à 5 jours à l’étuve à 22°C.

• Solutions communes pour tous les étudiants

- Réactif de Bradford

A conserver à 4°C

Solution mère commune à tous les binômes

- HCl 0.2N

A conserver à RT

- NaOH 1N

A conserver à RT

- EDTA 10 mM

A conserver à RT

Peser 1.86 g pour 500 ml

- DTT 10 mM

Préparer 500 ml - à conserver à RT Peser 770 mg pour 500 ml

- Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT 10 mM

A conserver à 4°C – ajuster le pH avec KOH

• Solutions à préparer et à aliquoter pour chaque binôme

- Nbr binôme * Bouteille 100 ml H 2 O milliQ ou aliquoter tubes 50ml

A conserver à RT

- Tampon de broyage

Préparer 500 ml - à conserver à 4°C - aliquoter en tubes 50 ml

Produit

PM

C finale

pH

C finale

A peser (g) pour 500mL

(mM)

(g/L)

Tris –HCl

121.1

50

pH=7.4

6.06

3.025

EDTA

372.2

10

 

3.72

1.862

MgCl 2

6H 2 O

203.3

10

 

2.03

1.015

DTT

154.3

10

 

1.54

0.771

- Tampon Tris-HCl 25mM (3.03 g/L) pH=7.4

Préparer 1 l - à conserver à RT - ajuster le pH avec HCl - aliquoter en tubes 50 ml

- FeCl 3 6H 10% dans HCl 0.2N

Préparer 50 ml - A conserver à RT - Aliquoter en tubes 15 ml Peser 5 g pour 50 ml de HCl 0.2N

- Acide trichloroacétique 25 %

Préparer 50 ml - A conserver à RT - Aliquoter en tubes de 15 ml Peser 12.5 g pour 50 ml

- HCl 6N

Préparer 50 ml - A conserver à RT- Aliquoter en tubes de 15 ml Diluer 2 fois la solution commerciale 12 N : 25 ml solution HCl commerciale 12 N + 25 ml

H 2 O

- Na-glutamate (0.3 M)

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml Peser 1.12 g pour 20 ml

- ATP (30 mM) Préparer 10 ml - A conserver à -20°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml Peser 180 mg pour 10 ml

- MgSO 4 (0.5 M) Préparer 20 ml - A conserver à -20°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml Peser 2.46 g pour 20 ml

- NH 2 OH (hydroxylamine) Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml Peser 695 mg pour 10 ml H 2 O + 10 ml NaOH 1N (à prendre au labo symbiose)

- 2-oxoglutarate (10 mM) = -cétoglutarate

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml Peser 33.6 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT

- Glutamine (100mM)

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml Peser 293 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT (à prendre au labo symbiose)

- BSA (20 mg/ml)

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 2 ml Peser 200 mg pour 20 ml

• Solutions à préparer extemporanément = au début de la séance

-

NADH (1 mM)

Préparer 10 ml - A préparer extemporanément - A conserver à -20°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml Peser 7.5 mg pour 10 ml

- -glutamyl hydroxamate (5mM)

Préparer 10 ml - A préparer extemporanément - A conserver dans la glace pendant la manip - Aliquoter en tubes de 2 ml Peser 8.1 mg pour 10 ml de Tris HCl 25 mM pH= 7.4

Installation Salle TP 3 :

• Matériels commun

- 1 centrifugeuse sigma 2K15 + rotor 12139 (salle SN II-4)

- 1 (ou 2, si possible) balance + papier alu

- 1 bain marie à 25°C + portoir pour tubes corning (13*100mm)

- 1 centrifugeuse de paillasse pou eppendorf 2ml

- pour 2 binômes : 1 spectrophotomètre multipasseur blanc

- parafilm

- des gants S/M/L

• Matériels à installer sur la paillasse pour chaque binôme Quantité*Nbre binômes

- 1 mortier et 1 pilon (placard à côté sorbonne SN 0-4) à conserver au froid avant le début de la manip

- 1 entonnoir (SN 0-4)

- 1 étamine=gaze pour filtrer l’extrait enzymatique (entrée placard SN 0-4)

- 1 couteau ou scalpel

- 1 tube spécial centri (environ 30 ml avec bouchon vissé) pour la centri sigma et pour le rotor 12139 (Tiroir salle de prep 524)

- portoir tubes corning

- 14 tubes corning (13*100mm) en verre

- 1 spatule

- 1 vortex (tiroir SN II-4)

- 1 chronomètre (tiroir SN II-4)

- Des cônes jaunes 200µl + 1 pipetman P200

- Des cônes bleus 1000µl + 1 pipetman P1000

- 1 portoir eppendorf 1.5ml

- 8 tubes eppendorf 2ml

- 1 portoir à falcon 50 ml + 1 portoir à falcon 15 ml

- 1 tube falcon 15ml

- 1 bac à glace

- 1 poubelle de paillasse

- 1 pipette en verre de 2ml + 1 pipette en verre de 5ml + 1 pipette en verre de 10 ml+ 1 poire + portoir (salle SN 0-4)

- 1 pissette H 2 O

- 7 cuves spectro 3ml + 4 cuves spectro 1.5ml

TTTRRRAAAVVVAAAUUUXXX PPPRRRAAATTTIIIQQQUUUEEESSS dddeee PPPNNNVVV LLLSSSVVV222 2013 1
TTTRRRAAAVVVAAAUUUXXX
PPPRRRAAATTTIIIQQQUUUEEESSS
dddeee PPPNNNVVV
LLLSSSVVV222
2013
1

RREELLAATTIIOONNSS SSTTRRUUCCTTUURREESS -- FFOONNCCTTIIOONNSS CCHHEEZZ LLEESS VVEEGGEETTAAUUXX

OSMOSE ET PERMEATION (TP1)

A. INTRODUCTION

A première vue, les expériences groupées dans cette manipulation et le matériel biologique employé peuvent paraître disparates. En fait, il ne sera question ici que de certains types d'échanges cellulaires (osmose : eau ; perméation : ions) établis entre le vivant et son milieu.

ils ont été choisis parce qu'ils

Quant aux sujets d'analyse (tubercules, épidermes, protoplastes permettaient des expériences simples et de courte durée.

),

Le potentiel osmotique

Le potentiel osmotique, désignée par le symbole Ψs, est fonction de la température, de la concentration de la substance dissoute, et de ses caractéristiques de dissociation.

Le potentiel hydrique

La notion de potentiel hydrique a été largement discutée au cours.

Pour éclaircir des problèmes de terminologie, nous donnerons le tableau suivant :

Milieu intérieur

Milieu extérieur

 

=

int -

ext

Iso-osmotique

Isotonique

équilibre

 

= 0

Hypo-osmotique

Hypertonique

plasmolyse

   

> 0

Hyper-osmotique

Hypotonique

turgescence

   

< 0

B. Evaluation des paramètres osmotiques

A) Détermination de la potentiel de succion tissulaire

Les tubercules de pommes de terre sont constitués essentiellement de parenchyme de réserve. En mettant à profit la grande homogénéité de ce tissu, il est possible de réaliser un certain nombre d'expériences, telles que la mesure du poids frais ou d'une longueur, sur des fragments de tubercule.

1. Préparation du matériel

- Prendre trois pommes de terre, les éplucher et les placer dans un récipient plein d'eau. Découper les tubercules en parallélépipèdes de section carrée (env. 0,5 cm de côté).

- Après les avoir lavés, conserver les segments de tissus dans un papier sopalin humide.

- Ajuster alors les fragments de tissus à une longueur déterminée de 4cm, en supprimant les bords inférieurs et supérieurs.

- Essuyer légèrement les segments de tissus ainsi obtenus sur un papier sopalin et les

répartir en lots de 4.

- Déterminer rapidement, sur les balances, le poids frais (PF 0 ) de chaque lot (auquel

on attribuera un numéro).

2. Mode opératoire

- Préparer dans 6 tubes falcons de 50 mL des solutions de saccharose aux concentrations indiquées (ci-dessous), à partir d'une solution stock (2M).

bécher

Ψ s (bars) expérimentale

Concentration

Calcul Ψ s (bars) Solution idéale

finale (M)

1

0

0,00

 

2

-1,3

0,05

 

3

-2,6

0,10

 

4

-5,2

0,20

 

5

-11

0,40

 

6

 

0,60

 

7

-25,2

0,80

 

8

 

1,00

 

- Incuber vos lots de fragments de pomme de terre dans chacun des tubes.

- Après 1 heure d’incubation, mesurer pour chacun des lots, le poids frais PF f ainsi que

la longueur moyenne L f de chaque lot (légèrement essuyer les segments sur un papier

sopalin).

On calculera alors :

les segments sur un papier sopalin). On calculera alors : Pression osmotique d’une solution idéale (formule

Pression osmotique d’une solution idéale (formule de Van t’Hoff) :

Π =RT/V.log a w i x C B x R x T x 1000 en Pa (1 bar = 101325 Pa)

3. Résultats

Reporter sur un graphique, les courbes correspondant au L et au PF, en fonction de la concentration molaire (M) du saccharose.

Pour chacune des courbes, déterminer la valeur de la concentration de saccharose correspondant à l'intersection avec l'abscisse.

Calculer les valeurs théoriques idéale de Π pour les différentes solutions suivant la formulation de Van t’Hoff.

Calculer à partir de cette valeur, le potentiel hydrique des tissus (Ψ W = Ψ S = -Π car

Ψ P = 0 au point d’intersection sur l’axe des abscisses).

Exprimer alors Ψ W en MPa et en Bar.

Rappels :

0 °C = 273,15 K ; R = 8,31 J/mol.K ; i = 1 pour le saccharose, 2 pour le NaCl ; C B = Concentration Molaire de la solution.

B) Quelques propriétés des protoplastes foliaires

Le protoplaste est une cellule dont on a fait disparaître (mécaniquement ou enzymatiquement) la paroi. En l'absence des potentiels hydrostatiques (pressions) normalement exercées par la paroi sur le contenu cellulaire, il n'est stable que dans des conditions isotoniques (ou légèrement hypertoniques) et prend alors une forme sphérique. Les protoplastes permettent

d'étudier un certain nombre de caractéristiques du plasmalemme (perméabilité, charges, Nous nous bornerons ici à observer la pénétration de deux types de colorants, pour lesquels le plasmalemme présente une perméabilité sélective.

).

1. Isolement des protoplastes

perméabilité sélective. ). 1. Isolement des protoplastes 1.1. Incubation enzymatique - Peler délicatement, à

1.1. Incubation enzymatique

- Peler délicatement, à l'aide d'une brucelle à pointes fines, l'épiderme inférieur de 3-5 feuilles de mâche (Valerianella olitoria), et découper le mésophylle en carrés de 1mm² environ. Travailler sur un papier filtre humide, pour éviter le dessèchement.

- Pipeter dans une boîte de Pétri 2 ml d'une solution enzymatique déjà prête, contenant

des cellulases, des pectinases et du sorbitol. Expliquer le rôle de ces divers composés.

- Déposer les fragments de feuilles (face pelée vers le bas) à la surface de la solution d'incubation.

- Envelopper la boîte de Pétri d'une feuille d'aluminium et incuber à 20-30°C durant 30

minutes sur un agitateur orbital (50-100 tpm) - (Attention à ne pas renverser la boîte).

1.2.

Purification

- Filtrer la suspension de protoplastes à travers un filtre nylon (100 µm), pour éliminer les restes de feuilles non digérées. Rincer le matériel après usage.

- Centrifuger 1,5 mL de la suspension de protoplastes (tubes eppendorf de 1.5 mL, 500 tpm, 5 min).

- Eliminer le surnageant et laisser 100-150 µL de solution. Le culot de protoplastes sera suspendu en tapotant sur le tube. Ne surtout pas vortexer.

- Conserver cette suspension de protoplastes dans son tube eppendorf et agiter doucement avant usage.

2. Observation et comptage des protoplastes

Une cellule de numération est une lame porte objet dans laquelle est creusée une chambre de comptage de volume connu. C’est une lame épaisse en verre, comportant des rigoles et un quadrillage :

Plate-forme centrale

Profondeur de la chambredes rigoles et un quadrillage : Plate-forme centrale Lamelle planée Rigoles Lame porte - objet surélevés

Lamelle planée Rigoles Lame porte - objet surélevés
Lamelle planée
Rigoles
Lame porte - objet
surélevés

Quadrillage

Le volume de comptage est déterminé par :

-la surface du quadrillage gravé sur la lame. -la profondeur de la chambre.

Parmi les 100 rectangles totaux, on trouve 25 rectangles qui sont divisés en 20 petits carrés afin de faciliter le comptage.

Le volume correspondant au quadrillage total est égal à 1 mm 3 = 1 µL

Chaque rectangle correspond à un volume 100 fois plus faible, soit 0,01 mm 3 = 10 nL

Pour la Numération

Observer à l’objectif x10 pour repérer la position du quadrillage, et vérifier l’homogénéité de la répartition des cellules à compter (si la répartition est mauvaise, recommencer). Régler le contraste et la lumière pour observer la grille et les protoplastes.

Observer ensuite à l’objectif x40 ou à x60 pour réaliser le comptage (Voir instructions).

Compter les cellules contenues dans 4, 10, 20 ou dans la totalité des 100 rectangles du quadrillage.

Remarque : pour les cellules chevauchant les lignes de quadrillage, compter seulement celles qui chevauchent 2 arêtes du rectangle sur 4 (en pratique, on choisit de prendre en compte les cellules chevauchant la ligne horizontale supérieure, et la ligne verticale droite).

horizontale supérieure, et la ligne verticale droite). Numération sur le rectangle = 7 protoplastes - Prélever

Numération sur le rectangle = 7 protoplastes

- Prélever une goutte de suspension de protoplastes (env. 20µL) et la déposer sur la

gouttière centrale de la cellule de comptage (Malassez, voir explication). Estimer le

nombre de protoplastes isolés et leur concentration (protoplastes/mL).

- Observer alors, à un grossissement final de 400x-600x, les détails morphologiques

des protoplastes. Dessiner une cellule de protoplaste et déterminez la position des

chloroplastes, des vacuoles etc

3. Perméabilité sélective

- Pipeter délicatement 20 µL de la suspension de protoplastes.

- Ajouter sur les lames 1 et 2, respectivement, 20µL, des colorants suivants :

I : Rouge neutre 0.1 % v/v en solution TL.

II : Phénosafranine 0.1 % v/v en solution TL.

- Recouvrir d’une lamelle et après 2 min, observez au microscope. NE PAS LAISSER

SECHER !

Pour les deux essais, déterminer, le nombre de protoplasmes colorés (A compter sur 20 protoplastes sans a priori).

Commenter les résultats.

- Ajouter alors sur les bords d’une lamelle, 20µL d'eau ou de sorbitol à 15% (Réalisez deux expériences).

Observer en temps réel les phénomènes physiques sur les protoplastes.

C) Observations microscopiques

Les lambeaux épidermiques, constitués d'une assise cellulaire unique, permettent une observation microscopique aisée des cellules qui les composent. Les vacuoles de ces tissus occupent la presque totalité de l'espace cellulaire. Il est ainsi possible, en plongeant ces lambeaux dans des solutions de potentiel osmotique variable, d'étudier les échanges d'eau entre les cellules et le milieu extérieur, et, d'obtenir, sur la base d'observations microscopiques, des informations sur le potentiel hydrique cellulaire.

1. Mode opératoire - Inciser délicatement, à l'aide d'un scalpel, un carré de 3 mm

1. Mode opératoire

- Inciser délicatement, à l'aide d'un

scalpel, un carré de 3 mm de côté environ, dans

l'épiderme intérieur d'une écaille d'un bulbe d'oignon.

- Détacher avec une paire de brucelles à pointes fines, le fragment épidermique ainsi délimité en le saisissant par un des coins.

- Placer le lambeau (face déchirée vers le bas) entre lame et lamelle dans 1 mL d’une solution de sorbitol (6 tubes). Ajouter 20µL de Vert de Méthyle et 20µL de Rouge Neutre dans chaque tube eppendorf.

- Après 5 min., observez entre lame et lamelle au microscope.

- Dessinez les points extrêmes de turgescence et de plasmolyse, puis cherchez les points encadrant l’isotonie.

Choisir au microscope une zone facilement observable.

Observez

la

cellule

et

ses

hydrique cellulaire.

différents

2. Evaluation du potentiel hydrique cellulaire

compartiments

puis

évaluez

le

potentiel

A l'isotonie, le potentiel hydrique de la cellule est égal au potentiel osmotique du milieu extérieur.

On utilisera des solutions de sorbitol (substance qui ne pénètre pas ou peu dans les cellules) à différentes concentrations (0 ; 2; 6; 8 ; 10 et 15 %).

En travaillant chaque fois avec un lambeau frais, noter la concentration C, pour laquelle il y a une légère plasmolyse.

Déterminer la concentration molaire de sorbitol qui se rapproche le plus de l'isotonie et déduire le potentiel hydrique cellulaire.

Annexes :

Annexes : 8

Etude de la structure racinaire, caulinaire et du processus d’ouverture stomatique (TP2)

Exécution et montage des coupes anatomiques

1. Exécution

Les échantillons de plante sont au préalable coupé et inclus dans de l’agar à 4 %. L'agar sert pour les coupes au vibratome (Labonord 100 plus), mais pas vraiment pour protéger un tissu pendant l'inclusion.

Gardez une dizaine de coupe de chaque échantillon de tige ou de racine, puis procédez aux colorations de ces coupes.

2. Coloration

Respecter les indications de temps de traitement et de rinçage suivants :

Prendre une plaque multi-puits et ajoutez un volume de 5mL de chaque solution de coloration ou d’eau distillée. Procédez aux colorations des coupes des échantillons végétaux. Les transferts d’un milieu vers un autre se font à l’aide d’un tamis après chaque temps de traitement.

1) eau de javel: 15 min 2) rinçage abondant à l’eau 3) lavage rapide à l’acide acétique :

1-2 min 4) rinçage sommaire à l’eau

5) Coloration au rouge Congo: 10 min 6) Rinçage sommaire

7) Coloration au Vert d'iode: 5 min 8) Rinçage soigneux et montage sur lame.

Résultat

Les tissus cellulosiques apparaissent en rouge; les tissus lignifiés et subérifiés apparaissent en vert – ( Attention les colorations présentées en cours peuvent être différentes).

3. Montage

Il est indispensable que lames et lamelles soient propres et sèches et que, par ailleurs, les surfaces optiques du microscope, en particulier l'oculaire, soient essuyées avec un papier Kim Wipes (risque de rayures).

Ne monter que 2 à 3 coupes sur une lame en choisissant de préférence les fragments de coupes les moins colorés ; ce sont en principe les plus minces.

Placer suffisamment de liquide de montage sur la lame pour que toute la coupe soit immergée. Placer doucement la lamelle sur la préparation en vous aidant d'une aiguille montée. Ne pas appuyer sur la lamelle pour chasser d'éventuelles bulles d'air : la préparation serait irrémédiablement inutilisable.

Si besoin, ajouter de l'eau en présentant à l’aide des comptes gouttes au bord de la lamelle, sans la soulever (l'eau pénètre par capillarité), ou au contraire, éliminer les excès d'eau avec un mouchoir de papier.

II. CONSEILS POUR LE DESSIN

1. Généralités

Dessiner grand (2/3 d’une page), l'échelle du dessin étant choisie en fonction des plus petits détails à reproduire (Endoderme ou pôles vasculaires, par exemple).

Respecter les proportions relatives des différentes parties.

Faire des traits fins, nets, réguliers, continus (crayon HB).

Légendes: placées assez loin, brèves mais précises et complètes, écrites lisiblement et horizontalement; traits de rappel à la règle, se terminant dans le dessin par un point ou une flèche et ne se croisant pas.

Le titre comprend le nom complet de la plante (genre, espèce et autres indications taxonomiques en Latin), de l'organe ou du détail représenté, le sens de la coupe, le grossissement, etc

2. Dessin général

Représenter le contour exact d'un quart de coupe (pas de compas: une coupe n’est jamais parfaitement ronde) et les limites exactes des différents tissus en veillant particulièrement aux proportions relatives. Utiliser un tiré pour montrer l'arrêt "arbitraire" de la coupe.

Les particularités de votre échantillon doivent être représentées : nombre exact de faisceaux conducteurs, contours irréguliers d'une lacune, d'un cambium, position précise d'un canal ou d'une fibre isolée, etc. Ne pas représenter de cellules, sauf les très gros vaisseaux de métaxylème, caractéristiques des Monocotylées (voir planche I).

Utiliser les représentations conventionnelles des différents tissus (voir page suivante).

des différents tissus (voir page suivante ). A RENDRE pour le TP2, partie n°1 : 1-

A RENDRE pour le TP2, partie n°1 :

1- Pour le compte rendu, rendre une feuille A4 présentant les deux dessins schématiques d’une structure racinaire et d’une structure caulinaire.

2- Présenter le principe expérimental et rendre un tableau synthétique présentant les analogies et les différences entre ces deux tissus pour enfin conclure sur la relation entre la structure et la fonction d’un organe végétal.

entre ces deux tissus pour enfin conclure sur la relation entre la structure et la fonction
entre ces deux tissus pour enfin conclure sur la relation entre la structure et la fonction
entre ces deux tissus pour enfin conclure sur la relation entre la structure et la fonction

SSYYMMBBOOLLEESS UUTTIILLIISSEESS PPOOUURR UUNN SSCCHHEEMMAA AANNAATTOOMMIIQQUUEE

((TTPP 22))

Épiderme cutinisé

Suber (quadrillage à 90° - ici 3 couches)

Exoderme, péricycle, hypoderme, périderme, phelloderme (ici une assise)

Rhizoderme (Représentation non schématique des poils absorbants)

Endoderme en 'U' (Dessin non schématique) (Monocotylées)

Endoderme à cadre de Caspary (Dessin non schématique) (Eudicotylédones)

Cambium et phellogène (assise génératrice)

Collenchyme

Cambium et phellogène (assise génératrice) Collenchyme Phloème ( points non alignés ) Liber ( points alignés

Phloème (points non alignés)

Liber (points alignés en lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons)

Xylème primaire ou protoxylème (A noircir)

Métaxylème avec gros vaisseaux des Monocotylées (dessiner la forme exacte des vaisseaux)

Bois homoxylé (Gymnospermes - lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons)

Bois hétéroxylé (Eudicotylédones - lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons)

Parenchymes (préciser le type)

Sclérenchyme (quadrillage fin à 45°)

Parenchymes sclérifiés (quadrillage lâche à 45°)

EETTUUDDEE DDEESS PPRROOCCEESSSSUUSS RREEGGUULLAANNTT LLOOUUVVEERRTTUURREE SSTTOOMMAATTIIQQUUEE ((TTPP22 SSUUIITTEE))

Epidermes isolés

Les études sur épidermes isolés sont réalisées sur des feuilles de plants âgés de trois à quatre semaines (Arabidopsis thaliana, Commelina communis, Valerianella olitoria, Vicia faba). Les jeunes feuilles sont prélevées avant l’éclairement du phytotron (les stomates sont fermés).

A l’aide d’une pince, on pelle la face inférieure de la feuille de façon à détacher la couche épidermique. Chaque couche épidermique est collée, face inférieure sur une lamelle de verre avec de l’adhésif silicone de type Hollister N°7730 (Medical adhesive) connu pour ne pas

type Hollister N°7730 (Medical adhesive) connu pour ne pas endommager les cellules. Danger très important de

endommager les cellules. Danger très important de fixation tissulaire (peau-organe).

Les lamelles sont ensuite déposées dans des petites boîtes de Pétri contenant 3 ml de milieu tampon : KCl 10 mM, KOH 30 mM, MES 10 mM, pH ajusté à 6,5 avec de l’acide iminodiacétique. Puis les boîtes sont placées à l’obscurité (sous papier aluminium) à température ambiante pendant quinze minutes, avant l’ajout de molécules pharmacologiques à tester, afin de normaliser les valeurs d’ouverture stomatique entre les différentes expériences.

Ouverture stomatique

Les lamelles portant les épidermes végétaux seront soumises à quatre types de traitement :

Traitement lumineux d’une heure sous lampe à lumière froide. Traitement obscurité d’une heure supplémentaire (Absence de lumière). Traitement lumineux en présence d’acide abscissique à 1µM de concentration finale. Traitement obscurité en présence de fusiccocine à 5 µM de concentration finale. Après 1h de traitement, les épidermes montés sur une lame et sont observés au microscope.

concentration finale. Après 1h de traitement, les épidermes montés sur une lame et sont observés au

Observation

Observer d'abord au faible grossissement du microscope pour centrer la coupe, puis utiliser le grossissement moyen pour reconnaître les différents tissus et les zones où la coupe est la meilleure.

Passer au fort grossissement (10x 60) puis régler l'intensité lumineuse en agissant sur le rhéostat de l'éclairage, le condenseur de lumière et le diaphragme. Excès ou défaut de lumière sont également nuisibles à une bonne observation.

Utiliser l’oculaire équipé d’une graduation et comparer vos observations avec la lame de calibration gravée au centième de mm. Mettre le microscope en position de calibration de facon à faire correspondre vos occulaires avec la

lame de calibration.

correspondre vos occulaires avec la lame de calibration. Compter le nombre de lignes (X pour l’occulaire
correspondre vos occulaires avec la lame de calibration. Compter le nombre de lignes (X pour l’occulaire
correspondre vos occulaires avec la lame de calibration. Compter le nombre de lignes (X pour l’occulaire

Compter le nombre de lignes (X pour l’occulaire et Y pour la lame de calibration). Calculer la distance entre chaques lignes au niveau de l’occulaire avec l’équation suivante :

Mesure entre 2 lignes = Y/X x 10 µm

Maintenant, vous êtes capables de mesurer la taille des cellules végétales en µm grâce à votre calibration. Vous pouvez effectuer un comptage exhaustif des stomates ouvert ou fermés suivant les conditions expérimentales.

La largeur de l’ostiole, représentative de l’ouverture stomatique, exprimée en micromètre sera mesurée sous microscope photonique (grossissement 10x60).

Pour chaque traitement, l’ouverture moyenne de 20 stomates sera calculée ainsi que l’écart à la moyenne ( = Ecart type/racine (n-1)) – Fournir le tableau de valeur avec le compte rendu.

 
A RENDRE pour le TP2 partie n°2 :  

A RENDRE pour le TP2 partie n°2 :

A RENDRE pour le TP2 partie n°2 :  
 

3- Pour le compte rendu, présenter après une courte introduction, les objectifs du TP, l’Interprétation des observations chez Vicia faba et Commelina communis, puis finir par une conclusion.

4-

Rendre un tableau synthétique présentant les valeurs d’ouvertures des ostioles pour chaque condition expérimentale et donner les évaluations statistiques.

13
13
13
   

------------------------------------------------------------------------

Exemple de calcul de l'écart-type :

Voici quatre séries de 5 valeurs:

Condition A : 10 ; 12 ; 14 ; 16 ;

Condition B : 12 ; 12 ; 12 ; 12 ; 12

Condition C : 12 ; 13 ; 12 ; 11; 12

Condition D :

7 ; 17 ; 10 ; 13 ; 13

8

Calculer la moyenne de ces quatre conditions. Que constatez-vous ?

Quel est la variabilité des valeurs dans chacune de ces conditions ? Pour les distinguer, on calcule un paramètre appelé écart type ( )

Exemple de calcul :

A =

appelé écart type ( ) Exemple de calcul : A = TP3 : ETUDE DE LA

TP3 : ETUDE DE LA GLUTAMINE SYNTHETASE ET DE

LA GLUTAMATE SYNTHASE DES RACINES DE MAIS

I - Principe

L’ammoniac (NH 3 ) qui résulte de la réduction des nitrates ou de celle de l’azote atmosphérique est

immédiatement incorporé sous forme d’aminoacides ou d’amides. L’une de ces dernières, la glutamine, amide de

l’acide glutamique, est le précurseur ou le donneur du groupe aminé de nombreux produits du métabolisme

La glutamine est formé à partir de l’acide glutamique par action de la

(tryptophane, histidine, CTP, AMP,

glutamine synthétase:

).

NH 4 + acide glutamique + ATP

Mg 2+

synthétase: ). NH 4 + acide glutamique + ATP Mg 2 + glutamine + ADP +

glutamine + ADP + Pi

La glutamine synthétase est une enzyme de structure complexe, isolée chez les procaryotes et les

eucaryotes, dont le poids moléculaire varie selon les espèces de 500 à 600 KkDa. Elle peut également

catalyser la formation de - glutamyl hydroxamate:

Ac. glutamique + ATP + NH 2 OH

Mg 2+

formation de - glutamyl hydroxamate: Ac. glutamique + ATP + NH 2 OH Mg 2 +

- glutamyl hydroxamate + ADP + Pi

C’est la présence de ce composé qui sera recherchée dans des mélanges réactionnels comprenant la glutamine synthétase extraite de racines de maïs.

La glutamate synthase (glutamine : 2-oxoglutarate aminotransférase = GOGAT) catalyse la seconde étape de l’assimilation de l’azote ammoniacal ; elle permet le transfert d’un groupement NH 2 de la fonction amide de la glutamine vers l’acide 2-oxoglutarique pour former deux molécules de glutamate.

Glutamine + 2-oxoglutarate + NADH + H +

de glutamate. Glutamine + 2-oxoglutarate + NADH + H + 2 glutamate + NAD + Nous

2 glutamate + NAD +

Nous nous intéresserons donc au cours de ce TP à la glutamate synthase NADH-dépendante.

II - Préparation de l’extrait enzymatique

Les grains de maïs sont mis à germer pendant 72 h à 26°C en présence de (NH 4 ) 2 SO 4 10 mM) et de KNO 3 (10 mM). Les racines (10 g) sont broyées dans un mortier en présence de 15 mL de tampon Tris-HC1 (50 mM) pH 7,4 contenant de 1’EDTA (10 mM), du MgC1 2 (10 mM) et du DTT (10 mM). Après filtration sur étamine, la suspension obtenue est centrifugée à 14000 rpm pendant 30 minutes. Après élimination du culot, le surnageant obtenu servira à déterminer l’activité enzymatique étudiée.

III - Activité de la glutamine synthétase

1 / Réalisation de la courbe étalon La courbe étalon sera effectuée à l’aide de différentes concentrations de -glutamyl hydroxamate, les hydroxamates forment en effet des complexes fortement colorés avec les ions ferriques.

- Introduire dans 7 tubes à essais:

0 - 0,1 - 0,15 - 0,2 - 0,25 - 0,3 et 0,4 mL d’une solution de -glutamyl hydroxamate 5 mM.

- Compléter à 1,6 ml avec du tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7,4. Rajouter dans chaque tube 0,4 mL du réactif composé de :

- FeC1 6H à 10% dans HC1 0,2 N (1 vol.)

- Acide trichloracétique à 25% (1 vol.)

-HCl 6N (l vol.)

- Acide trichloracétique à 25% (1 vol.) -HCl 6N (l vol.) (en préparer 12 ml) Lire

(en préparer 12 ml)

Lire les densités optiques à 540 nm après 10 minutes.

2 / Détermination de l’activité enzymatique

Dans un tube à hémolyse, mélanger:

- 0,5 ml de tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7,4

- 0,2 ml de Na-glutamate (0,3 M)

- 0,2 ml d’ATP (30 mM)

-0,1 ml de MgSO 4 (0,5 M)

- 0,5 ml d’extrait enzymatique

- Incuber 5 minutes à 25°C. Ajouter alors 0,1 ml de NH 2 OH (1 vol. de NH 2 OH-HCl N + 1 vol. de NaOH N).

- Incuber 15 minutes à 25°C puis arrêter la réaction avec 0,4 ml du réactif décrit au III-A.

- Réaliser un essai témoin en remplaçant l’extrait enzymatique par du tampon.

- Centrifuger les essais à 5000 rpm pendant 10 minutes et lire les D.O. à 540 nm.

- Exprimer les résultats en nmoles de γ-glutamyl hydroxamate formées par minute et par mg de protéine.

IV - Etude de la glutamate synthase

La détermination de l’activité enzymatique sera effectuée en suivant au spectrophotomètre la diminution de D.O. à 340 nm correspondant à l’oxydation du NADH.

1 / Réalisation de la courbe étalon

A partir de la solution de NADH 1 mM, préparer les solutions : 25, 50, 100, 150 et 200 tM (Vf= 2,4 mL).

Lire directement les D.O. à 340 nm.

2 / Détermination de l’activité enzymatique

La préparation des mélanges réactionnels 1, 2 et 3 s’effectuera directement dans une cuve de spectrophotomètre de la manière suivante :

 

1

2

3

Tampon HEPES-KOH 200mM, pH8,6 renfermant 10

1,7 mL

1,3 mL

1,6 mL

mM

de DTT

2-oxoglutarate 10 mM

0,2 mL

0,2 mL

0 mL

NADH 1 mM

0 mL

0,4 mL

0,4 mL

Glutamine 100 mM

0,1 mL

0,1 mL

0 mL

Extrait enzymatique

0,4 mL

0,4 mL

0,4 mL

La réaction démarre par l’addition du NADH. Suivre la variation de D.O. à 340 nm toutes les 30 secondes pendant 5 minutes, du mélange 2 par rapport au mélange 1.

Effectuer la même opération en remplaçant 2 par 3.

Exprimer les résultats en nmoles de NADH oxydé par min et par mg de protéine.

Conclusions.

V - Dosage des protéines par la méthode de Bradford

Cette méthode repose sur la propriété du bleu de Coomassie à se lier, en milieu acide, aux protéines et de former ainsi un complexe qui absorbe à 595 nm.

1 / Préparation de la gamme étalon

Préparation des solutions de BSA

A partir d’une solution de protéine d’albumine sérique bovine (BSA) concentrée à 20 mg.mL -1 , préparer une solution fille à 2 mg/ mL -1 (V= 1 mL).

Préparer ensuite à l’aide de cette solution fille 6 tubes contenant 200 µL de solution de BSA à 0 - 0,25 - 0,5 – 1 - 1,5 et 2 mg. mL -1 .

Dosage au réactif de Bradford

Mélanger 10 µL de chacune de vos solutions de BSA dans le réactif de Bradford dilué 5X dans H 2 O (Vf= 1 mL).

Incuber 5 minutes à température ambiante et mesurer les D.O. à 595 nm en utilisant le tube 0 de la gamme comme 0 d’absorbance.

Tracer le graphe des D.O. obtenues à 595 nm en fonction de la concentration en BSA (µg.mL -1 ).

2 / Dosage de l’extrait enzymatique

Réaliser un dosage au réactif de Bradford des protéines contenues dans votre extrait après l’avoir dilué 10, 20 et 50 fois. Le mode opératoire sera le même que celui utilisé pour la réalisation de la gamme étalon.

Chaque dilution fera l’objet de 2 mesures.

Déterminer graphiquement la concentration en protéine de votre extrait enzymatique.

Préparation des Solutions et matériels, cultures et installation des Salles : (Version 2011)

TP 1 - préparation des solutions :

Achat à Carrefour de Pomme de Terre (20kg), Mâche (2 paquets) et 2 sacs d’oignons blancs.

14-18/Mars/2011 -

Solution de Sorbitol : MW 182.2 anhydre Faire 250 mL d’une solution à 15% w/v de Sorbitol (15g/L) puis, diluer.

Faire des solutions de sorbitol à 1, 5, 10 et 15 % w/v - 50mL de chaque Faire des fractions aliquotes pour 7x4 eppendorf de 1,5 mL.

Solution de Sucrose :

Solution stock de sucrose à 2M

Faire 2L : Pour 500 mL à 2M 342,30g de sucre

- MW 342.30

Sera dilué. en TP de 0.1 à 0.8 M

Tampon MES pH6.15 100mM (100mL) Peser 1.952 g de MES dans 90mL d’eau Ajouter qqs gouttes de NaOH 10N Ajuster à 100 mL

Solution TL : (Préparation en TP)

10% Sorbitol Tampon MES pH 6.15 0.05 M Ajouter extemporanément (en cours de TP):

50 % de sorbitol 20% 50 % de MES 100 mM

0.1 g de Cellulase Sigma (C-8546)

0.2 g de Pectinase Fluka (17389)

Rouge Neutre et Safranin O :

Diluer à 0.1 % w/v en solution TL sans enzymes (10mg pour 10mL) Aliquoter en 7x4 eppendorf de 1,5 mL.

Préparation d’une solution de Vert de méthyle (100mL)

en solution aqueuse, acidifiée à l'acide acétique :

Eau bidistillée :

100 ml

Vert de méthyle :

5 g

acide acétique glacial

1 cc

Laisser durant 1 heure sur l'agitateur magnétique, et ensuite filtrer !

TP 2 - Préparation des solutions :

7-11/Mars/2011 - Attention, lancer les cultures pour le matériel biologique en avance (4semaines) :

Vicia faba - 7 pots x12 binômes = 84 pots. Medicago sativa – 2 pots vermiculite x 12 binômes

Solutions à 5 µM fusicoccine et 1 µM ABA. (Risque toxicité).

La préparation des solutions se fait dans EtOH 100% et le stockage à -20°C.

Préparation bouteille Agar à 4% dans de l’eau (4x 100mL).

Préparation des Solutions tampons : (2000 mL)

KCl 10 mM, KOH 30 mM, MES 10 mM, pH ajusté à 6,5 avec de l’acide iminodiacétique.

Préparation des solutions de coloration :

Dilution dans 1000 mL d’eau distillée des solutions de coloration.

1-

Vert d'iode à 2/1000

2-

Rouge Congo à 2/1000 (Risque toxicité) A changer pour Carmin ou Phloroglucinol.

3-

Acide Acétique à 1% à partir d'acide acétique Glacial

4-

Solution d'eau de javel à 12°

Remplir les comptes gouttes avec les diverses solutions et de l'eau distillée (Faire les

étiquettes si nécessaire).

Installation de la salle pour le TP1:

14 postes avec :

1 vortex pour 2 binômes

1 microscope pour chaque binôme

1 cellule de Malassez pour chaque binôme +

lamelle

4

Lames de microscope +lamelles

1

portoir orange pour tube falcon de 50mL

6

tubes falcon vide + 1 tube de saccharose 2M

1

portoir eppendorf avec :

4 solutions de sorbitol en eppendorf :

1%, 5%, 10% et 15 % 2 tubes eppendorf de 1.5 mL vide + 1 tube de 2 mL

1

portoir de pipette avec :

1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL

1 propipette

1

éprouvette graduée de 50 mL - 100 mL

1

couteau court

1

pince

1

scalpel

1

pissette d’eau 500 mL

1

compte goutte d’eau distillée

1

pipetteman de 200µL

1

pipetteman de 1000 µL

d’eau 500 mL 1 compte goutte d’eau distillée 1 pipetteman de 200µL 1 pipetteman de 1000
d’eau 500 mL 1 compte goutte d’eau distillée 1 pipetteman de 200µL 1 pipetteman de 1000

1

lot de cône bleu

1 lot de cône jaune

1 sopalin

1 Poubelle de Table

Installation de la salle pour le TP2:

Installer la table orbitale et le Vibratome Installer les lampes LED/Fluocompacte pour l’éclairage

7 postes avec :

1 lame de calibration 100µm 1 microscope pour chaque binôme 1 vortex par binômes 4
1
lame de calibration 100µm
1
microscope pour chaque binôme
1
vortex par binômes
4
Lames de microscope +lamelles
1
portoir orange pour tube falcon de 50mL (Solution pour Stomate)
1
portoir eppendorf avec :
4 solutions de sorbitol en eppendorf : 1%, 5%, 10% et 15 %
2 tubes eppendorfs de 1.5 mL vide + 1 tube de 2 mL
1
portoir de pipette avec :
1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL
1 propipette
1
pince
1
scalpel
1
pissette d’eau 500 mL
compte goutte de Javel, Acide acétique, Vert
d’iode et Rouge congo
1
1 pipetteman de 10-20µL
1 pipetteman de 200µL
1 pipetteman de 1000 µL
1 lot de cône bleu
1 lot de cône jaune
1 sopalin
1Poubelle de Table
2
Supports nylon pour les coupes
2
Plaques 8 puits
1
marqueur
1 lot de cône jaune 1 sopalin 1Poubelle de Table 2 Supports nylon pour les coupes
1 lot de cône jaune 1 sopalin 1Poubelle de Table 2 Supports nylon pour les coupes

Les microscopes LEICA doivent être équipés d’objectif gradué. Réticule Leica gradué :

équipés d’objectif gradué. Réticule Leica gradué : Inventaire des solutions 01/2010 : Quantité Produit

Inventaire des solutions 01/2010 :

Quantité

Produit

Référence

Marque

1kg

D-Sorbitol

S1876-1kg

Sigma

500g

Iminodiacetic acid

220000

Aldrich

25g

Carmine

C1022-25g

Sigma

5g

MES

M3671-50g

Sigma

10g

Pectinase

17389

Fluka

50g

Pectinase

17389

Fluka

5kU

Pectinase solution

P4716-5kU

Sigma

2.5kU

Cellulase

2* C8546-2.5kU

Sigma

25g

Phloroglucinol

P3502-25g

Sigma

Solutions et matériels à préparer pour le TP3 "Etude de la glutamine synthétase (GS) et de la glutamate synthase (GOGAT) des racines de maïs" version

2010-2011

● Matériel végétal commun pour tous les étudiants

- 2 L Milieu de germination des grains de maïs

(NH 4 ) 2 SO 4 (10 mM)

1.32 g/l

KNO 3 (10 mM)

1.01 g/l

A conserver à RT (à préparer et à conserver au laboratoire INRA)

- 5 jours avant le TP Des grains de maïs sont mis à germer dans des containers en plastique (à l’INRA) sur 2 épaisseurs de sopalin imbibé de milieu de germination. La germination a lieu pendant 4 à 5 jours à l’étuve à 22°C.

• Solutions communes pour tous les étudiants

- Réactif de Bradford

A conserver à 4°C

Solution mère commune à tous les binômes

- HCl 0.2N

A conserver à RT

- NaOH 1N

A conserver à RT

- EDTA 10 mM

A conserver à RT

Peser 1.86 g pour 500 ml

- DTT 10 mM

Préparer 500 ml - à conserver à RT Peser 770 mg pour 500 ml

- Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT 10 mM

A conserver à 4°C – ajuster le pH avec KOH

• Solutions à préparer et à aliquoter pour chaque binôme

- Nbr binôme * Bouteille 100 ml H 2 O milliQ ou aliquoter tubes 50ml

A conserver à RT

- Tampon de broyage

Préparer 500 ml - à conserver à 4°C - aliquoter en tubes 50 ml

Produit

PM

C finale

pH

C finale

A peser (g) pour 500mL

(mM)

(g/L)

Tris –HCl

121.1

50

pH=7.4

6.06

3.025

EDTA

372.2

10

 

3.72

1.862

MgCl 2

6H 2 O

203.3

10

 

2.03

1.015

DTT

154.3

10

 

1.54

0.771

- Tampon Tris-HCl 25mM (3.03 g/L) pH=7.4

Préparer 1 l - à conserver à RT - ajuster le pH avec HCl - aliquoter en tubes 50 ml

- FeCl 3 6H 10% dans HCl 0.2N

Préparer 50 ml - A conserver à RT - Aliquoter en tubes 15 ml Peser 5 g pour 50 ml de HCl 0.2N

- Acide trichloroacétique 25 %

Préparer 50 ml - A conserver à RT - Aliquoter en tubes de 15 ml Peser 12.5 g pour 50 ml

- HCl 6N

Préparer 50 ml - A conserver à RT- Aliquoter en tubes de 15 ml Diluer 2 fois la solution commerciale 12 N : 25 ml solution HCl commerciale 12 N + 25 ml

H 2 O

- Na-glutamate (0.3 M)

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml Peser 1.12 g pour 20 ml

- ATP (30 mM) Préparer 10 ml - A conserver à -20°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml Peser 180 mg pour 10 ml

- MgSO 4 (0.5 M) Préparer 20 ml - A conserver à -20°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml Peser 2.46 g pour 20 ml

- NH 2 OH (hydroxylamine) Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml Peser 695 mg pour 10 ml H 2 O + 10 ml NaOH 1N (à prendre au labo symbiose)

- 2-oxoglutarate (10 mM) = -cétoglutarate

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml Peser 33.6 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT

- Glutamine (100mM)

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml Peser 293 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT (à prendre au labo symbiose)

- BSA (20 mg/ml)

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 2 ml Peser 200 mg pour 20 ml

• Solutions à préparer extemporanément = au début de la séance

-

NADH (1 mM)

Préparer 10 ml - A préparer extemporanément - A conserver à -20°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml Peser 7.5 mg pour 10 ml

- -glutamyl hydroxamate (5mM)

Préparer 10 ml - A préparer extemporanément - A conserver dans la glace pendant la manip - Aliquoter en tubes de 2 ml Peser 8.1 mg pour 10 ml de Tris HCl 25 mM pH= 7.4

Installation Salle TP 3 :

• Matériels commun

- 1 centrifugeuse sigma 2K15 + rotor 12139 (salle SN II-4)

- 1 (ou 2, si possible) balance + papier alu

- 1 bain marie à 25°C + portoir pour tubes corning (13*100mm)

- 1 centrifugeuse de paillasse pou eppendorf 2ml

- pour 2 binômes : 1 spectrophotomètre multipasseur blanc

- parafilm

- des gants S/M/L

• Matériels à installer sur la paillasse pour chaque binôme Quantité*Nbre binômes

- 1 mortier et 1 pilon (placard à côté sorbonne SN 0-4) à conserver au froid avant le début de la manip

- 1 entonnoir (SN 0-4)

- 1 étamine=gaze pour filtrer l’extrait enzymatique (entrée placard SN 0-4)

- 1 couteau ou scalpel

- 1 tube spécial centri (environ 30 ml avec bouchon vissé) pour la centri sigma et pour le rotor 12139 (Tiroir salle de prep 524)

- portoir tubes corning

- 14 tubes corning (13*100mm) en verre

- 1 spatule

- 1 vortex (tiroir SN II-4)

- 1 chronomètre (tiroir SN II-4)

- Des cônes jaunes 200µl + 1 pipetman P200

- Des cônes bleus 1000µl + 1 pipetman P1000

- 1 portoir eppendorf 1.5ml

- 8 tubes eppendorf 2ml

- 1 portoir à falcon 50 ml + 1 portoir à falcon 15 ml

- 1 tube falcon 15ml

- 1 bac à glace

- 1 poubelle de paillasse

- 1 pipette en verre de 2ml + 1 pipette en verre de 5ml + 1 pipette en verre de 10 ml+ 1 poire + portoir (salle SN 0-4)

- 1 pissette H 2 O

- 7 cuves spectro 3ml + 4 cuves spectro 1.5ml

TTTRRRAAAVVVAAAUUUXXX PPPRRRAAATTTIIIQQQUUUEEESSS dddeee PPPNNNVVV LLLSSSVVV222 2013 1
TTTRRRAAAVVVAAAUUUXXX
PPPRRRAAATTTIIIQQQUUUEEESSS
dddeee PPPNNNVVV
LLLSSSVVV222
2013
1

RREELLAATTIIOONNSS SSTTRRUUCCTTUURREESS -- FFOONNCCTTIIOONNSS CCHHEEZZ LLEESS VVEEGGEETTAAUUXX

OSMOSE ET PERMEATION (TP1)

A. INTRODUCTION

A première vue, les expériences groupées dans cette manipulation et le matériel biologique employé peuvent paraître disparates. En fait, il ne sera question ici que de certains types d'échanges cellulaires (osmose : eau ; perméation : ions) établis entre le vivant et son milieu.

ils ont été choisis parce qu'ils

Quant aux sujets d'analyse (tubercules, épidermes, protoplastes permettaient des expériences simples et de courte durée.

),

Le potentiel osmotique

Le potentiel osmotique, désignée par le symbole Ψs, est fonction de la température, de la concentration de la substance dissoute, et de ses caractéristiques de dissociation.

Le potentiel hydrique

La notion de potentiel hydrique a été largement discutée au cours.

Pour éclaircir des problèmes de terminologie, nous donnerons le tableau suivant :

Milieu intérieur

Milieu extérieur

 

=

int -

ext

Iso-osmotique

Isotonique

équilibre

 

= 0

Hypo-osmotique

Hypertonique

plasmolyse

   

> 0

Hyper-osmotique

Hypotonique

turgescence

   

< 0

B. Evaluation des paramètres osmotiques

A) Détermination de la potentiel de succion tissulaire

Les tubercules de pommes de terre sont constitués essentiellement de parenchyme de réserve. En mettant à profit la grande homogénéité de ce tissu, il est possible de réaliser un certain nombre d'expériences, telles que la mesure du poids frais ou d'une longueur, sur des fragments de tubercule.

1. Préparation du matériel

- Prendre trois pommes de terre, les éplucher et les placer dans un récipient plein d'eau. Découper les tubercules en parallélépipèdes de section carrée (env. 0,5 cm de côté).

- Après les avoir lavés, conserver les segments de tissus dans un papier sopalin humide.

- Ajuster alors les fragments de tissus à une longueur déterminée de 4cm, en supprimant les bords inférieurs et supérieurs.

- Essuyer légèrement les segments de tissus ainsi obtenus sur un papier sopalin et les

répartir en lots de 4.

- Déterminer rapidement, sur les balances, le poids frais (PF 0 ) de chaque lot (auquel

on attribuera un numéro).

2. Mode opératoire

- Préparer dans 6 tubes falcons de 50 mL des solutions de saccharose aux concentrations indiquées (ci-dessous), à partir d'une solution stock (2M).

bécher

Ψ s (bars) expérimentale

Concentration

Calcul Ψ s (bars) Solution idéale

finale (M)

1

0

0,00

 

2

-1,3

0,05

 

3

-2,6

0,10

 

4

-5,2

0,20

 

5

-11

0,40

 

6

 

0,60

 

7

-25,2

0,80

 

8

 

1,00