Fundamentos de Toxicologia Experimental

MONITORIZAO DE CIDO HIPRICO EM URINA

1. Finalidade Determinar a quantidade de cido hiprico (AH) na urina para monitorizao de indivduos que possivelmente est exposto ocupacionalmente ao tolueno. Monitorizao onde a coleta da amostra por meio no invasivo, utiliza-se a urina, e para quantificao usa-se a tcnica de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE ou, mais comumente, HPLC) que se trata de uma tcnica muito sensvel e, portanto de alta preciso.

2. Fundamentos dos Mtodos O cido hiprico considerado um marcador de exposio ocupacional para o tolueno estando a sua concentrao relacionada exposio ocupacional, durante a jornada de trabalho do dia. O tolueno um composto aromtico tambm chamado de metilbenzeno por sua estrutura qumica. um lquido incolor, voltil quando em presso de vapor a 25C, com propriedade significativa de lipossolubilidade e que apresenta traos de benzeno de at 25%, quando utilizado para fins comerciais. A absoro ocorre principalmente pela via pulmonar, sendo que cerca de 40% do tolueno inalado absorvido pelos pulmes. A absoro ocorre principalmente pela via pulmonar, sendo que cerca de 40% do tolueno inalado absorvido pelos pulmes. A principal via de biotransformao a oxidao do grupamento metila. O primeiro passo corresponde formao do lcool benzlico, mediado pelo citocromo P450. Segue-se a oxidao a benzaldedo, pela ao de lcool desidrogenase e finalmente a formao do cido benzico, etapa catalisada pela enzima aldedo desidrogenase. Este cido se conjuga principalmente com a glicina, formando o cido hiprico e em menor proporo com o cido glicurnico, produzindo benzoilglicuronatos. A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao. Ela est fundamentada na migrao diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interaes, entre duas fases imiscveis, a fase mvel e a fase estacionria. A grande variedade de combinaes entre fases mveis e estacionrias a torna uma tcnica extremamente verstil e de grande

aplicao. A cromatografia pode ser utilizada para a identificao de compostos, por comparao com padres previamente existentes, para a purificao de compostos, separando-se as substncias indesejveis e para a separao dos componentes de uma mistura. O grande avano na cromatografia em coluna foi o desenvolvimento e a utilizao de suportes com partculas diminutas responsveis pela alta eficincia, as quais tornam necessrio o uso de bombas de alta presso para a eluio da fase mvel, devido a sua baixa permeabilidade. A Figura 1 mostra um equipamento tpico de CLAE. As fases mveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxignio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso.

Figura 1 - Esquema do equipamento de CLAE (HPLC)

A bomba deve proporcionar ao sistema vazo contnua sem pulsos com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluio da fase mvel a um fluxo adequado. As vlvulas de injeo usadas possuem uma ala de amostragem para a introduo da amostra com uma seringa e duas posies, uma para o preenchimento da ala e outra para sua liberao para a coluna. Existem alas

de diversos volumes, sendo utilizadas geralmente alas na faixa de 5-50 L para injees analticas e 0,5-2 mL para preparativas. As colunas utilizadas em CLAE so geralmente de ao inoxidvel, com dimetro interno de cerca de 0,45 cm para separaes analticas e na faixa de 2,2 cm para preparativas. O comprimento varivel, sendo comuns colunas analticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas colunas so reaproveitveis, sendo empacotadas com suportes de alta resoluo, no sendo necessria sua regenerao aps cada separao. O detector mais utilizado para separaes por CLAE o detector de ultravioleta, sendo tambm empregados detectores de fluorescncia, de ndice de refrao, e eletroqumicos, entre outros. Detectores de polarimetria para CLAE, recentemente desenvolvidos,

diferenciam compostos quirais, atravs da rotao de seus estereoismeros frente luz plano-polarizada.

3. Fluxograma dos Mtodos

Adicionado em um tubo de ensaio 1 mL de etanol + 1mL de urina (misturado com Mixer) (

Centrifugar a 200 RPM por 15min.

Injetado 20 l do sobrenadante no HPLC, (fase mvel = gua/Metanol/c. Actico 792/200/8), vazo de 1,3 mL/min. e = 257 nm.

4. Resultados e Discusso Temos os valores para a construo da curva padro mostrados na tabela abaixo: Padres de AH Branco 0,1 mg/mL 0,5 mg/mL 1,0 mg/mL rea do pico 2482613 2822305 4241657 5833585

A partir dos dados acima, obtemos a curva padro:

Para as amostras feitas em aula, temos: Amostras rea do pico A 1988659 B 820777; 886850 1 2609152, 2492562 2 4310224 Amostras 1 e 2 correspondem homens com mais de 30 anos; a amostra A, corresponde a uma mulher com menos 30 anos; e a amostra B, corresponde a um homem com menos de 30 anos. Calculando a media dos valores de pico para as amostras que foram feitas em replicatas e utilizando a equao da curva padro podemos encontrar a concentrao de AH atravs da diferena entre rea do pico da amostra e o valor do branco, isso para todas as amostras. A tabela abaixo mostra os valores calculados para as amostras: Amostras A B 1 2 AH (mg/mL) -0,15861 -0,49849 0,00976 0,53668

Levando-se em considerao a produo diria de urina contm em mdia 1,5 g de creatina, podemos fazer a correo dos valores de AH em g/ g de creatinina.

Amostras A B 1 2

AH (g/g de creatinina) -0,10574 -0,33233 0,0065 0,35778

5. Laudo frente ao resultado Utilizando os valores referncias para indivduos no expostos

ocupacionalmente a tolueno ou xileno descritos por Siqueira e Paiva, Podemos concluir que para as amostras A e B o valores (-0,1057 g AH/g creatinina e -0,3323 g AH/g creatinina, respectivamente) foram negativos devido o nvel de cido Hiprico dos indivduos estarem abaixo do valor utilizado como branco, logo podemos concluir que para a amostra A e para a amostra B, que pertencem a indivduos com mais de 30 anos, esto abaixo do valor de referncia mdio de 0,210,10 g AH/g creatinina para a faixa etria de 36-60 anos . Sabendo que as amostras 1 e 2 (0,0065 g AH/g creatinina e 0,3577g AH/g creatinina,respectivamente) que so de indivduos com menos de 30 anos de idade, esto abaixo do valor de referncia mdio de 0,160,09 g AH/g creatinina para a faixa etria de 18-35 anos.

6. Referncias Bibliogrficas LORENZETTI, G. G.; LETTIERI, M. T. Avaliao de cido hiprico como biomarcador de exposio ocupacional em trabalhadores de postos de combustveis. Revista Sade e Pesquisa, v. 2, n.3, p. 319-324, 2009.

SILVA, Z. L.; NICCIO, J. S.; JACINTO, M.; AMORIN, L. C. A.; ALVAREZLEITE, E. M. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. Vol. 38, n. 2, 2002.

SIQUEIRA, M. E. P. B.; PAIVA, M. J. N. Hippuric acid in urine: reference values. Revista Sade Pblica, 36 (6), p. 723-727, 2002.