BOLETN ESCUELA DE MEDICINA U.C.

, PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE CHILE

VOL. 33 N1 2008

LOS ASPECTOS FISIOPATOLGICOS Y MOLECULARES INVOLUCRADOS EN EL TRASPASO DE LISTERIA MONOCYTOGENES A TRAVS DE LA BARRERA PLACENTARIA. (UNA REVISIN BIBLIOGRFICA)
Demetrio Larran de la C.(1) Jorge Carvajal C. Ph.D (2)

RESUMEN La Listeria monocytogenes, agente infeccioso causal de la listeriosis, es un bacilo gram positivo intracelular facultativo, cuya principal va de contagio es la ingestin de alimentos contaminados. Este enteropatgeno ha desarrollado diferentes mecanismos que le permiten la invasin, sobrevida y multiplicacin en las clulas del hospedero. La infeccin por Listeria monocytogenes es usualmente asintomtica, sin embargo en pacientes embarazadas la infeccin intrauterina puede producir complicaciones perinatales graves. No se conocen con exactitud los mecanismos exactos mediante los cuales Listeria monocytogenes se localiza y logra traspasar la barrera placentaria. En este artculo se revisan los factores de virulencia de Listeria monocytogenes y su rol en la listeriosis perinatal.

INTRODUCCIN La Listeria monocytogenes, agente causal de la listeriosis, es un bacilo gram-positivo que infecta humanos y animales. Este microorganismo se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza y su principal va de contagio es a travs de la ingestin de agua y alimentos contaminados (1,2). Las infeccin por Listeria monocytogenes es usualmente asintomtica, sin embargo las manifestaciones clnicas de la listeriosis pueden ser variables segn el estado inmune del paciente. Puede presentarse como un cuadro gastrointestinal leve y autolimitado en el paciente inmunocompetente, o bien como un cuadro severo y de alta mortalidad, como meningitis, abscesos cerebrales y sepsis, en el paciente inmunocomprometido (3). Actualmente existe evidencia de que la inmunidad contra Listeria monocytogenes es casi completamente dependiente de la actividad de los linfocitos T (4,5). El embarazo es un

estado de tolerancia inmunolgica que determina una supresin de la inmunidad celular evitando as una reaccin cruzada contra el feto (6,7). Sin embargo esta menor actividad inmunolgica puede predisponer a la madre y al feto a infecciones por grmenes intracelulares, como Listeria monocytogenes; el riesgo de infeccin es 12 veces mayor en las embarazadas que en la poblacin general (8,9). La infeccin intrauterina puede producir importantes complicaciones como aborto espontneo, parto prematuro, corioamnionitis clnica, bito fetal y sepsis neonatal, determinando una alta mortalidad perinatal (8,10). La mayora de los grmenes capaces de infectar al feto alcanzan la cavidad amnitica por la va canalicular ascendente e infrecuentemente logran vulnerar la barrera placentaria. Sin embargo, a diferencia de otros microorganismos, Listeria monocytogenes tiene la capacidad de traspasar la placenta e infectar al feto por va hematgena.

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(1) Departamento de Obstetricia y Ginecologa, Unidad de Medicina Materno Fetal, Ponticia Universidad Catlica de Chile. (2) Departamento de Obstetricia y Ginecologa, Unidad de Medicina Materno Fetal, Ponticia Universidad Catlica de Chile. Correspondencia: jcarva@med.puc.cl Fax: 632 1924

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Recientemente, los avances en el campo de la bioqumica y biologa molecular han permitido entender mejor los mecanismos involucrados en este proceso. El objetivo de este artculo es revisar los mecanismos celulares y moleculares mediante los cuales Listeria monocytogenes logra alcanzar el torrente sanguneo e infectar la unidad fetoplacentaria.

referencias primarias. El resto de los artculos seleccionados corresponden a referencias secundarias debido a citacin frecuente en los artculos de referencia primaria. Los artculos de revisin y de opinin de expertos fueron excluidos de las publicaciones seleccionadas para esta revisin.

MATERIAL Y MTODOS Realizamos una bsqueda bibliogrfica en la base de datos MEDLINE utilizando los trminos Mesh Listeria infections, placenta, pathophysiology, Ecadherine, ActA, internalins y listeriolisin O. Se seleccionaron aquellos artculos enfocados en la fisiopatologa y en los mecanismos moleculares implicados en la infeccin por Listeria monocytogenes durante el embarazo y aquellas publicaciones dedicadas al traspaso de Listeria monocytogenes a travs de las barreras del hospedero. Se obtuvo un total de 70 artculos como

MICROBIOLOGA DE LISTERIA MONOCYTOGENES La Listeria monocytogenes es un bacilo grampositivo, -hemoltico, catalasa (+), no esporulado y mvil. Es un microorganismo aerobio, anaerobio facultativo y es capaz de sobrevivir en el interior de las clulas, incluso en clulas fagocticas del sistema monocitomacrfago. La Listeria monocytogenes es un enteropatgeno que mide 0.5 x 1.5 m y ha desarrollado diferentes mecanismos para sobrevivir bajo condiciones extremas de pH, salinidad y temperatura (11) (Tabla N1). Listeria monocytogenes tiene la capacidad de desarrollarse sin problemas a temperaturas desde -18o a 10oC, rango que incluye las

Tabla 1. Mecanismos adaptativos utilizados por Listeria monocytogenes para sobrevivir y desarrollarse bajo condiciones ambientales adversas.

Caracterstica bacteriana Termorresistencia

Mecanismo adaptativo Induccin de protenas de stress trmico Cambios en la composicin lipdica de membrana Acumulacin de solutos crioprotectores Cambios transcripcionales (factor sigma B asociado a RNA polimerasa bacteriana) Induccin de protenas de stress cido Sistema glutamato decarboxilasa Cambios transcripcionales (Factor sigma B) Sistema de transduccin histidina kinasa Transporte activo de protones a travs de la membrana (tipo H+-ATPasa) Induccin de protenas de stress salino Acumulacin de solutos osmoprotectores Cambios transcripcionales (Factor sigma B) Sistema de transduccin de seales Kdp Formacin de biofilms

Tolerancia a pH cido

Osmotolerancia

Resistencia a antibiticos y desinfectantes

temperaturas usuales de refrigeracin, por lo que la infeccin puede ser transmitida incluso a travs de alimentos refrigerados o congelados (11). Sin embargo, Listeria monocytogenes es destruida a travs de la pasteurizacin y por la mayora de los agentes desinfectantes (11). Se han descrito 17 serotipos de Listeria monocytogenes en base a sus antgenos somticos y flagelares. Corresponden a 15 antgenos somticos (I-XV) y 4 flagelares (A-D). Las diferentes combinaciones dan origen a un serotipo, que tiene una combinacin antignica nica. Slo 3 serotipos (1/2a, 1/2b y 4b) son responsables de ms del 95% de las infecciones en humanos. Sin embargo, se sabe que dentro de un mismo serotipo existen diferentes cepas, genticamente dismiles (12). Estudios recientes han demostrado que los primeros brotes de listeriosis fueron causados por un grupo de cepas relacionadas del serotipo 4b, llamadas Epidemic Clone I (ECI); el anlisis de brotes posteriores ha identificado un clon diferente, el ECII, que es fenotpica y genotpicamente distinto a otras cepas del serotipo 4b descritas previamente (13). La Listeria monocytogenes se comporta como un parsito intracelular facultativo, capaz de sobrevivir en los macrfagos e invadir numerosos tipos de clulas no fagocticas, como clulas epiteliales, hepatocitos y clulas endoteliales (14). En todos estos tipo celulares desarrolla una fase intracelular en la cual 1) se internaliza a la clula del hospedero; 2) sobrevive en fagolisosoma; 3) escapa del fagolisosoma; 4) se libera y replica en el citosol de la clula blanco; 5) se mueve en base reorganizacin del citoesqueleto de la clula hospedera; 6) extiende un filopodio y se disemina a la clula vecina (Figura 1). De esta forma logra traspasarse directamente a las clulas vecinas, donde reinicia el ciclo (14), diseminndose a travs de los tejidos del hospedero sin exponerse al ambiente extracelular, protegida de la inmunidad humoral. Esta propiedad ha sido extensamente estudiada en cultivos 21

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Figura 1. Proceso infeccioso y fase intracelular de la infeccin por Listeria monocytogenes. 1) Internalizacin a la clula del hospedero; 2) Sobrevivencia en fagolisosoma; 3) Escape del fagolisosoma; 4) Liberacin y replicacin bacteriana en el citosol de la clula blanco; 5) Movilidad bacteriana en base reorganizacin del citoesqueleto de la clula hospedera; 6) Extensin del filopodio y diseminacin directa a la clula vecina; 7) Formacin del fagolisosoma; 8) Escape del fagolisosoma; 9) Liberacin de Listeria monocytogenes al citosol y reinicio del ciclo.

celulares y se considera hoy en da como un fenmeno clave en la fisiopatologa de la listeriosis en humanos. I. FACTORES DE VIRULENCIA Los avances en las tcnicas de biologa molecular han permitido identificar diversos factores de virulencia implicados en procesos clave del ciclo intracelular de esta bacteria. Estos factores de virulencia, involucrados en: la invasin de la clula blanco, el escape del fagolisosoma y el traspaso de clula a clula, se describen en detalle a continuacin. a) Invasin de la clula: Internalinas y sus receptores La adhesin y entrada de Listeria monocytogenes a la clula est comandada por la accin de protenas expresadas en la superficie de la bacteria, las internalinas. Las internalinas pertenecen a un gran familia de protenas bacterianas 22

caracterizadas por poseer un dominio amino-terminal rico en leucina (15,16). Existen muchos tipos de internalinas, sin embargo slo las internalinas A (InlA) y B (InlB) estn involucradas en la invasin celular a clulas no fagocticas. Estudios recientes han evaluado los niveles de expresin gnica y la capacidad de invasin in vitro de distintas cepas de Listeria monocytogenes en diferentes tipos de clulas humanas, demostrndose que la capacidad invasiva y la produccin de citoquinas proinflamatorias (IL-8) es variable segn el tipo de clula y la cepa de Listeria monocytogenes analizada (17). Estas observaciones llevaron a estudiar los niveles de expresin de los genes de las internalinas (inlA, inlB), a travs del anlisis de los ARN mensajeros (mRNA), por tcnica de RTPCR en 27 cepas de Listeria monocytogenes obtenidas de muestras clnicas y 37 cepas obtenidas de cultivos de laboratorio (18). En general, aquellas cepas obtenidas de

muestras clnicas mostraron una menor capacidad invasiva, una menor produccin de IL-8 y niveles de expresin gnica ms bajas que sus controles de laboratorio. Esta expresin diferente de los factores de virulencia entre cepas obtenidas de pacientes enfermos y cepas aisladas desde alimentos ha sido confirmada por otros estudios (19,20) y permite concluir que la virulencia de Listeria monocytogenes es variable. Esta virulencia variable pudiese explicar adems el diferente comportamiento clnico que muestran las distintas cepas de Listeria monocytogenes. En un estudio epidemiolgico reciente se analiz la expresin de las internalinas en 300 cepas de Listeria monocytogenes obtenidas de pacientes enfermos, de las cuales 61 (20%) correspondan a pacientes embarazadas y las compararon con 150 cepas aisladas desde diferentes alimentos (21). El 96% de las cepas obtenidas a partir de pacientes enfermos expresaban internalina en su forma completa y funcional, mientras que esto slo ocurra en el 65% de las cepas obtenidas de alimentos. Las cepas obtenidas de alimentos se asociaron significativamente ms a la expresin de una forma truncada y no funcional de internalina, en comparacin con las cepas obtenidas de muestras clnicas (OR 12.73 95% Intervalo de Confianza (IC) [6.2726.34]). Estos resultados concuerdan con los de otros estudios, poniendo en evidencia que el rol de la internalinas en la patognesis de la listeriosis humana es crtico (21,22). Los receptores naturales de las InlA e InlB son E-caderina y Met, respectivamente (23,24). E-caderina es una glicoprotena transmembrana, dependiente de Ca+2 e involucrada en la adhesin celular. Met es un receptor tirosina kinasa cuyo ligando natural es el factor de crecimiento derivado de los hepatocitos (HGF). Se ha demostrado que, an por separado, cualquiera de estas protenas es suficiente para permitir la invasin celular (25,26). En condiciones fisiolgicas la E-caderina y Met se localizan

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en la matriz extracelular en estrecha relacin con las uniones intercelulares, manteniendo las clulas pegadas entre s. Se ha descubierto que la interaccin InlAE-caderina es especie-especfica, InlA tiene alta afinidad por la E-caderina humana y no es capaz de interactuar con la Ecaderina de ratones, aunque slo difieran en un aminocido (27). Recientemente, esta interaccin especie-especfica tambin ha sido descrita para InlB (28). Una vez que Listeria monocytogenes se ha unido a sus receptores (va E-caderina o va Met), se produce la fosforilacin y activacin de una serie de protenas intermedias en la clula del hospedero ( y cateninas, Gab1, Cb1, PI3-Kinasa) capaces de interactuar y reorganizar los filamentos de actina del citoesqueleto de la clula blanco (29-31). Existe evidencia molecular de que otras protenas como la miosina VIIA y su ligando, la vezatina son necesarias para la internalizacin (32,33). Mediante la reorganizacin del citoesqueleto y la interaccin miosina VIIA-vezatina se facilita la captacin de la bacteria por la clula del hospedero (endocitosis) y disgregacin del epitelio. Se postula adems que la reorganizacin del citoesqueleto y la formacin del complejo miosina VIIA-vezatina pudiesen tener una accin sinrgica en la invasin celular (34,35). b) Escape del fagolisosoma: Listeriolisina O y Fosfolipasas C Al traspasar la membrana plasmtica Listeria monocytogenes queda incluida en vesculas fagocticas (vacuola primaria). Esta vacuola se fusiona con los lisosomas, que contienen enzimas proteolticas y un pH cido, para formar los fagolisosomas (vacuola secundaria). En condiciones normales las bacterias y sus productos son degradados en los fagolisosomas. Las condiciones adversas en el interior del fagolisosoma no permiten la multiplicacin de Listeria monocytogenes, pero inducen la secrecin de listeriolisina O.

Listeriolisina O es una toxina dependiente de colesterol, codificada por el gen hly, perteneciente a una gran familia de toxinas formadoras de poros, las citolisinas, propias de las bacterias gram-positivas (36). Al ser secretada por la bacteria, listeriolisina O permite el escape del fagolisosoma (y en menor proporcin de la vacuola primaria) a travs de la formacin de poros, evitando la destruccin bacteriana y permitiendo el crecimiento y desarrollo microbiano en el citosol de la clula infectada. Listeriolisina O es uno de los factores de virulencia de Listeria monocytogenes mejor estudiados. Se sabe que esta toxina se encuentra en forma monomrica y que para formar poros y favorecer la lisis de la membrana lisosomal requiere que estos monmeros se fijen al colesterol de la membrana y se polimerizen (37). A diferencia otras citolisinas, listeriolisina O tiene mayor actividad a pH cido, denaturndose a pH neutro (38-40). Una vez que listeriolisina O perfora la membrana del lisosoma es rpidamente ubiquitinizada y degradada por los proteasomas (lisosomas proteolticos), antes de que pueda daar la membrana plasmtica (41,42). Existe evidencia de que en ausencia de actividad de listeriolisina O, la bacteria disminuye notablemente su capacidad invasiva y es no es capaz de reproducirse, al no poder escapar del fagosoma (43). Adems de listeriolisina O, Listeria monocytogenes secreta 2 fosfolipasas C (PLC), que contribuyen al escape de los lisosomas: La fosfolipasa C fosfatidilinositolespecfica (PI-PLC) y la fosfolipasa C fosfatidilcolina-especfica (PC-PLC). Estas protenas son codificadas por los genes plcA y plcB, respectivamente. Las cepas bacterianas con mutacin de plcA son menos eficientes en escapar de la vacuola primaria en comparacin con cepas nativas, demostrando la participacin de PI-PLC en esta funcin (44). En cambio, la mutacin de plcB se traduce en una acumulacin de bacterias en las vacuolas secundarias, sin alterar el escape de las

vacuolas primarias (fagocticas), sugiriendo que PC-PLC tiene mayor rol en el escape de la vacuola secundaria y diseminacin a clulas vecinas. Existe un aumento de 250-500 veces en la cantidad de bacterias necesarias para destruir el 50% de las clulas del cultivo (dosis letal50), cuando ambos genes son inactivados, aportando evidencia experimental de que ambas fosfolipasas C tienen funciones importantes en la virulencia de este germen (45). El mecanismo exacto mediante el cual listeriolisina O y el sistema de las fosfolipasas C comandan el escape del fagosoma es actualmente motivo de extensa investigacin. Se sabe que depende de vas metablicas complejas que incluyen la traslocacin de las PLC e hidrlisis de fosfolpidos, generacin de diacilglicerol (DAG), activacin de la protena kinasa C (PKC) y flujo de Ca+2 intracelular como segundo mensajero (46,47). c) Traspaso de clula a clula en base a actina: Rol de ActA ActA es una protena localizada en la superficie de la bacteria, que permite a la Listeria monocytogenes desplazarse eficientemente a travs del citosol de la clula del hospedero para invadir clulas vecinas que an no han sido infectadas. ActA es codificada por el gen actA. Se ha observado que las cepas bacterianas deficientes en ActA presentan una menor capacidad de invadir clulas vecinas (traspaso de clula a clula). Estudios utilizando fragmentos de clulas cubiertos con ActA han demostrando que la sola presencia de ActA es factor suficiente para que estos fragmentos sean capaces de desplazarse sobre extractos celulares (48). El mecanismo exacto mediante el cual ActA comanda el movimiento celular es objeto de investigacin; se sabe que depende de la interaccin de ActA con otras protenas como VASP y WASP, y que involucra la polimerizacin de los filamentos de actina del citosol de la clula blanco (29). Listeria monocytogenes es capaz de 23

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moverse rpidamente sobre la plataforma de actina y presionar contra la membrana plasmtica, creando una prolongacin citoplasmtica llamada filopodio que incluye al microorganismo. Este filopodio, al tomar contacto con la clula vecina es fagocitado, quedando la bacteria incluida en los fagosomas de la clula vecina y lista para reiniciar un nuevo ciclo infeccioso (49) (Figura 1). Adems, la expresin de ActA es suficiente para promover la entrada de Listeria innocua (una especie no virulenta) en clulas epiteliales, por lo que se piensa que ActA tendra adems un rol en la invasin celular (50). II. CRECIMIENTO Y DESARROLLO EN EL CITOSOL DE LA CLULA DEL HOSPEDERO Los patgenos intracelulares pueden dividirse en aquellos que son capaces de vivir en el interior de los lisosomas de la clula blanco y aquellos que deben escapar del fagolisosoma y desarrollarse en el citosol, como Listeria monocytogenes (51). La estrategia bsica de los patgenos intracelulares para poder sobrevivir el mayor tiempo posible en la clula infectada se basa en no extraer de la clula hospedera una cantidad excesiva de nutrientes esenciales para su metabolismo, de lo contrario, la clula hospedera se quedara sin nutrientes y morira, haciendo que las bacterias perdieran su nicho de crecimiento. Ms an, las bacterias intracelulares han desarrollado mecanismos para utilizar productos de desecho o no indispensables en el metabolismo de la clula hospedera para su desarrollo. Aunque muchos de los pasos intracelulares claves de Listeria monocytogenes han sido bien caracterizados, el conocimiento sobre los factores necesarios para la proliferacin citoslica es an limitado. Con el uso de DNA- microarrays y PCR se ha estudiado el perfil transcripcional de la fase intracelular de Listeria monocytogenes. Se demostr una mayor expresin de genes que 24

codificaban para protenas transportadoras esenciales en la captacin de carbono y nitrgeno, protenas de stress, reguladores de transcripcin y otras protenas con funcin hasta ahora desconocida (52). Posteriormente se demostr, mediante el desarrollo de cepas mutantes, que Listeria monocytogenes es capaz de utilizar fuentes de carbono alternativas (ej: glucosa fosforilada), como tambin fuentes alternativas de nitrgeno (ej: etanolamina), durante su replicacin en clulas epiteliales y que la va de las pentosas y no la glicolisis es la va predominante para metabolizar los azcares en los tejidos del hospedero (52). III. TRASPASO DE LISTERIA MONOCYTOGENES A TRAVS DE LAS BARRERAS DEL HOSPEDERO Nuestro entorno contiene una enorme variedad de agentes infecciosos, por lo que los seres humanos estamos en contacto permanente con una gran cantidad de grmenes. La mayora de los agentes infecciosos a los que se ve expuesto un individuo no consiguen penetrar en su organismo, sino que son detenidos por una serie de barreras fsicas como la barrera intestinal, la barrera placentaria y la barrera hematoenceflica. Sin embargo algunos microorganismos como Listeria monocytogenes han desarrollado diferentes mecanismos que les permiten vulnerar estas barreras. a) Traspaso de la barrera intestinal: el rol de E-caderina En 1981, la investigacin de un brote de listeriosis en Nova Scotia, Canad, puso en evidencia por primera vez la transmisin de Listeria monocytogenes a travs de los alimentos (53). Actualmente se sabe que la puerta de entrada es el tracto digestivo, de modo que la capacidad de Listeria monocytogenes de producir una infeccin sistmica depende directamente de su capacidad de atravesar el epitelio intestinal. En un elegante modelo murino de listeriosis Lecuit y cols utilizando ratones transgnicos, que expresaban E-

caderina humana, demostraron que Listeria monocytogenes lograba traspasar la barrera epitelial del intestino gracias a su interaccin con la E-caderina de los enterocitos. Esta interaccin llevaba a internalizacin y multiplicacin de la bacteria en la lamina propria del intestino delgado y diseminacin hacia los linfonodos mesentricos, hgado y bazo (54). Estudios recientes, utilizando sondas marcadas fluorescentes, han demostrado varias interacciones entre las clulas intestinales y Listeria monocytogenes. Los investigadores han demostrado que la bacteria es capaz de invadir las clulas slo en aquellos lugares en los cuales el epitelio est eliminando clulas muertas, un fenmeno constante en la mucosa intestinal. En este proceso, las clulas remanentes pierden transitoriamente las uniones intercelulares con sus vecinas. Esta brecha transitoria en la barrera epitelial expone la E-caderina permitiendo la fijacin de la bacteria y el traspaso del epitelio intestinal (17,55). Una vez en el torrente sanguneo el hgado es el primer rgano blanco. En el hgado, despus de atravesar el epitelio intestinal, Listeria monocytogenes invade los hepatocitos a travs de la interaccin de InlB y Met (49,56,57). En los hepatocitos Listeria monocytogenes se replica activamente hasta que la infeccin es controlada por la respuesta inmune celular (17,49). Esta etapa es subclnica y se cree que es un fenmeno frecuente dada la amplia distribucin de Listeria monocytogenes en la naturaleza. En individuos normales, la exposicin continua a antgenos listeriales, probablemente, determina el mantenimiento de linfocitos T de memoria anti-listeria; sin embargo, en pacientes en los que la inmunidad celular est deteriorada o es ms permisiva, como en las embarazadas, la proliferacin bacteriana descontrolada determina bacteremias prolongadas, permitiendo la invasin de los rganos blancos como cerebro o unidad fetoplacentaria (6,49,58).

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b) Traspaso de la barrera placentaria, transmisin vertical e infeccin intrauterina La barrera placentaria se encuentra anatmicamente a nivel de las vellosidades placentarias, especficamente en el sincitiotrofoblasto. El sincitiotrofoblasto es un tipo de epitelio especializado, compuesto por clulas multinucleadas, que se encuentra en contacto directo con la sangre materna que circula por el espacio intervelloso. En una capa celular subyacente, las clulas del citotrofoblasto (mononucleadas) se dividen y fusionan renovando la poblacin celular del sincitiotrofoblasto. Una delgada membrana basal separa las clulas trofoblsticas del tejido conectivo que contiene los vasos fetales por lo que se cree que la invasin del trofoblasto es un paso crtico para el desarrollo de infeccin fetal (59). La similitud existente entre la placenta de los roedores y los seres humanos (tipo hemocorial) ha contribuido a que gran parte de nuestro conocimiento sobre la fisiopatologa de la infeccin intrauterina por Listeria monocytogenes provenga de modelos murinos. Recientemente se evalu los mecanismos implicados en la transmisin vertical de Listeria monocytogenes utilizando hembras de cobayos embarazadas (60). Los autores demostraron que la invasin de las clulas del sincitiotrofoblasto por Listeria monocytogenes era dependiente de InlA y que la capacidad de invadir las clulas trofoblsticas in vitro era 100 veces menor en cepas mutantes de Listeria monocytogenes con delecin de InlA (60). Curiosamente, los autores no encontraron diferencias significativas en el crecimiento y desarrollo bacteriano en las placentas, fetos y rganos maternos, al comparar las cepas de Listeria monocytogenes nativas y las con delecin del InlA (60), por lo que postulan que probablemente exista otro mecanismo, independiente de InlA, involucrado en la transmisin vertical de Listeria monocytogenes in vivo (60).

Actualmente se ha demostrado la expresin de E-caderina en la superficie apical de las clulas del trofoblasto del espacio intervelloso, en estrecha relacin con la sangre materna, por lo que es altamente probable que la interaccin entre E-caderina y InlA sea el mecanismo involucrado en el traspaso de Listeria monocytogenes a travs de la barrera placentaria (61,62). En un interesante estudio, se estudi el rol del complejo InlA- E-caderina en este proceso. Utilizando tejidos placentarios frescos obtenidos de embarazos fisiolgicos, los investigadores observaron que las cepas de Listeria monocytogenes que expresaban InlA (cepa nativa) invadan sin problema el interior de las clulas trofoblsticas, sobre todo en los espacios intervellosos, donde las circulaciones materna y fetal estn en estrecha cercana. La evaluacin cuantitativa de la invasin bacteriana demostr que la capacidad de las cepas mutantes de Listeria monocytogenes (con inactivacin de InlA) para invadir los tejidos placentarios era 10 veces menor que la cepa nativa. Ms an, la invasin bacteriana de los tejidos placentarios reprodujo exactamente las lesiones histolgicas que se observan en las vellosidades coriales de las pacientes con listeriosis en las que ha ocurrido infeccin fetal (62). Adems se demostr que el 100% de las cepas de Listeria monocytogenes extradas de pacientes embarazadas con listeriosis expresan InlA en su forma completa y funcional (21). Tomados en conjunto, estos estudios ex vivo demuestran que la afinidad de Listeria monocytogenes por la placenta y la capacidad de infectar al feto se debe a la interaccin ligando-receptor de InlA con E-caderina de las clulas trofoblsticas. No se sabe cual es la funcin que desempea E-caderina en la superficie del sincitiotrofoblasto. Se ha postulado que su presencia se deba slo a remanentes de membrana que han quedado despus de la fusin de las clulas del citotrofoblasto durante la diferenciacin de las vellosidades coriales (63,64). El sincitiotrofoblasto es

el nico epitelio sincitial en humanos y posee caractersticas nicas, como la ausencia de membranas laterales entre sus clulas y su contacto directo con la sangre materna en el espacio intervelloso. Estas propiedades otorgan al sincitiotrofoblasto las caractersticas de un endotelio especializado. Actualmente existe evidencia de que adems de formar una barrera fsica entre la circulacin materna y fetal, el trofoblasto tiene actividad fagoctica y un rol inmunomodulador a travs de la secrecin de citoquinas (65-68), permitiendo an el desarrollo de Listeria innocua y cepas de Listeria monocytogenes mutantes, menos virulentas (58,69). La InlB no parece tener rol en el traspaso de la barrera placentaria. Se sabe que la invasin por Listeria monocytogenes es mediada por InlB en varios tipos celulares y que los receptores de InlB se hallan ampliamente distribuidos en casi todos los tejidos (70). Sin embargo, la infeccin transplacentaria no ocurre en especies animales en las que la invasin celular por Listeria monocytogenes es mediada nicamente por la va de la InlB, como tampoco en aquellas en las que la interaccin InlA- E-caderina no es posible, como ocurre en ratones (70). Sin embargo, la interaccin InlA- Ecaderina parece no ser el nico factor determinante en la infeccin trofoblstica y transmisin vertical de Listeria monocytogenes (60). En placentas hemocoriales, la barrera placentaria consiste tan slo en 2 capas celulares de trofoblasto y las clulas endoteliales de los vasos fetales (71), por lo que diferentes estudios han propuesto que la diseminacin clula a clula tiene tambin un rol en el traspaso de Listeria monocytogenes a travs de la barrera placentaria (58,71). Se demostr que si bien la diseminacin clula a clula no es indispensable en la infeccin placentaria, al menos facilitara este proceso al evidenciar una menor concentracin bacteriana en fetos de cobayos si se comparan cepas mutantes de Listeria monocytogenes incapaces de expresar ActA, con aquellas que expresan la protena (58). 25

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En un estudio reciente utilizando hembras de cobayo embarazadas se report que la expresin de internalinas A y B no era necesaria para el desarrollo de infeccin placentaria concluyendo que la transmisin vertical de Listeria monocytogenes era completamente dependiente de la expresin y funcionalidad de ActA, permitiendo a la bacteria pasar fcilmente a travs del trofoblasto y endotelio para alcanzar la circulacin fetal (69). En suma, el mecanismo mediante el cual Listeria monocytogenes cruza la barrera placentaria e infecta al feto no ha sido aclarado en su totalidad, siendo probable que exista ms de un mecanismo involucrado. Los modelos murinos actualmente disponibles slo han permitido establecer que la presencia de factores de virulencia es necesaria en este proceso, sin embargo, la importancia relativa de cada uno de estos factores en la fisiopatologa del paso placentario es an desconocida. c) Traspaso de la barrera hematoenceflica La barrera hematoenceflica es la separacin anatmica y funcional entre el sistema nervioso central y el compartimiento vascular. El endotelio microvascular es la estructura ms extensa de la barrera hematoenceflica y se caracteriza por poseer uniones estrechas entre sus clulas (72,73). Datos experimentales sugieren que Listeria monocytogenes utiliza diferentes mecanismos en el traspaso de la barrera hematoenceflica e infeccin del sistema nervioso central. Algunos estudios en animales han sugerido que desde el torrente sanguneo Listeria monocytogenes puede alcanzar el parnquima cerebral a partir de invasin directa del endotelio microvascular o invadiendo las clulas epiteliales de los plexos corodeos a travs de un proceso mediado por la interaccin de InlB y Met (24,74-77). Recientemente se demostr que la capacidad del complejo InlB-Met de invadir las clulas endoteliales de la microvasculatura cerebral era inhibida 26

en la presencia de inmunoglobulinas del suero de pacientes adultos (sobre todo Inmunoglobulina G), y que esta inhibicin exista, pero era 50 veces menor si se usaba suero de recin nacidos (78). Se ha demostrado la presencia de anticuerpos contra protenas de superficie de Listeria monocytogenes en el suero de pacientes sanos (79). Estas observaciones son interesantes pues in vivo, las clulas endoteliales y las bacterias libres en la sangre se encuentran en constante contacto con las protenas del suero, por lo que puede dudarse del real rol de InlB en la patogenia de la infeccin del sistema nervioso central en adultos. Estos hallazgos pudiesen sin embargo explicar el mecanismo implicado en la infeccin del sistema nervioso central por Listeria monocytogenes en recin nacidos pues, como comentbamos previamente, el rol inhibidor de las protenas sricas es 50 veces menor en el suero de recin nacidos en comparacin con el de los adultos sanos (78). La causa de esta diferencia en la capacidad de inhibir la invasin de Listeria monocytogenes entre el suero de recin nacidos y adultos no ha sido aclarada, pues la IgG traspasa libremente la barrera placentaria y alcanza sin problemas la circulacin fetal. Se ha postulado que otras clases de inmunoglobulinas, como la inmunoglobulina A, pudiesen estar involucradas en determinar esta inhibicin de la invasin bacteriana. Otro mecanismo que pudiese explicar esta diferencia entre el suero de adultos y recin nacidos es la selectividad que existe en el transporte placentario de las diferentes clases de inmunoglobulina G (80). Es posible que los anticuerpos anti-InlB pertenezcan a un subtipo de anticuerpos que no alcance niveles adecuados en la circulacin neonatal como para inhibir la invasin de Listeria monocytogenes al endotelio de la barrera hematoenceflica. Esta observacin es de la mayor relevancia pues otorga un probable rol a la inmunidad humoral en la infeccin del sistema nervioso central. Por el contrario, el rol del complejo InlA-

E-caderina en el traspaso de la barrera hematoenceflica no ha sido demostrado, pese a haberse demostrado la expresin de E-caderina en el endotelio microvascular y el epitelio de los plexos corodeos (81). El anlisis de un caso fatal de meningoencefalitis por Listeria monocytogenes demostr la presencia de Listeria monocytogenes en el interior de las clulas endoteliales y en la superficie luminal de los vasos sanguneos (82), otorgando un rol a la invasin de las clulas endoteliales en el traspaso de la barrera hematoenceflica. Adems, en un estudio de la dcada del 60 se evidenciaron signos de infeccin endotelial en la vena umbilical de en un feto de 28 semanas con corioamnionitis por Listeria monocytogenes (83). Estos hallazgos son interesantes, pues no slo demuestran que la invasin de las clulas endoteliales humanas es posible in vivo, sino que adems otorgan un probable rol a la invasin de las clulas endoteliales en la fisiopatologa del traspaso de Listeria monocytogenes a travs de a barrera placentaria. Estudios ms recientes sugieren que Listeria monocytogenes logra alcanzar el sistema nervioso central a travs de un mecanismo llamado caballo de Troya. Este mecanismo involucra el transporte de la bacteria desde el torrente sanguneo hacia el tejido neural, en el interior de los macrfagos (84). Una vez que Listeria monocytogenes ha activado la respuesta inmune celular se produce un reclutamiento masivo de clulas del sistema monocito-macrfago desde el torrente sanguneo hacia el foco infeccioso. Los macrfagos fagocitan y eliminan las bacterias extracelulares, sin embargo se infectan con Listeria monocytogenes a travs del traspaso clula a clula desde las mismas clulas del tejido blanco. Estos fagocitos infectados reingresan al torrente sanguneo y transportan a Listeria monocytogenes a travs de la barrera hematoenceflica. La infeccin puede entonces propagarse a travs del sistema nervioso central, por diseminacin clula a clula hacia el endotelio microvascular o por la propia

LOS ASPECTOS FISIOPATOLGICOS Y MOLECULARES INVOLUCRADOS EN EL TRASPASO DE LISTERIA MONOCYTOGENES A TRAVS DE LA BARRERA PLACENTARIA.

migracin de los fagocitos infectados hacia las neuronas y microgla (76,84,85). Una tercera ruta por la cual Listeria monocytogenes puede alcanzar el parnquima cerebral es a travs del transporte neural. Segn este modelo, Listeria monocytogenes llega al sistema nervioso central por va axonal ascendente desde terminaciones nerviosas perifricas (86,87). Existen estudios que apoyan que el mecanismo por el cual Listeria monocytogenes llega a estas terminaciones nerviosas sera la diseminacin clula a clula a partir de macrfagos infectados en un proceso dependiente de ActA (87,88). Actualmente se ha documentado el papel de la va neural ascendente en modelos animales de listeriosis, sin embargo el rol de la va transneural en la fisiopatologa de la listeriosis humana no ha sido demostrado (86). En suma, los resultados de los diferentes estudios en animales y observaciones en humanos, entregan una visin parcial de elementos involucrados en la llegada de Listeria monocytogenes al sistema nervioso central. Es probable que en la neuroinvasin se conjuguen diversos mecanismos y que una vez que Listeria monocytogenes traspasa la barrera hematoenceflica, la diseminacin a travs del tejido neural y glial sea a travs de la diseminacin clula a clula (88). En nuestra perspectiva es interesante notar como la barrera hematoenceflica es ms permeable en el recin nacido, explicando el rol perinatal adverso en la infeccin por Listeria monocytogenes. CONCLUSIONES La infeccin es un proceso complejo en el que interactuan diversos factores de la bacteria y del hospedero. La Listeria monocytogenes es un bacilo gram positivo ampliamente distribuido en la naturaleza cuyo mecanismo de contagio ms frecuente es la ingestin de agua o alimentos contaminados. Este enteropatgeno afecta principalmente a pacientes inmunosuprimidos y embarazadas; en estas ltimas tiene especial

capacidad para producir infeccin fetal determinando cuadros severos y de alta mortalidad perinatal. Durante los ltima dcada se ha logrado conocer con bastante detalle los mecanismos celulares y moleculares que permiten a Listeria monocytogenes alcanzar el torrente sanguneo e infectar al feto por va hematgena. Esto pues a diferencia de otros microorganismos Listeria monocytogenes ha desarrollado la increble capacidad de traspasar 3 importantes barreras: intestinal, hematoenceflica y fetoplacentaria. Listeria monocytogenes puede infectar las clulas del hospedero mediante invasin directa o por diseminacin directa de clula a clula. Este proceso de invasin y diseminacin requiere de la presencia de diversos factores de virulencia que le permiten a la bacteria: invadir la clula blanco (internalinas), escapar del fagolisosoma (listeriolisina O) y traspasarse directamente de clula a clula (ActA). La revisin de la literatura sugiere que Listeria monocytogenes utiliza una estrategia comn en el traspaso de las barreras intestinal y placentaria, por lo que es planteable que el tropismo placentario de esta bacteria sea slo consecuencia del mismo mecanismo utilizado por Listeria monocytogenes en el traspaso de la barrera intestinal. Sin embargo en la fisiopatologa de la infeccin fetal parecen haber otros mecanismos involucrados, como la diseminacin clula a clula mediada por ActA. El traspaso de Listeria monocytogenes a travs de la barrera hematoenceflica y la infeccin del sistema nervioso central parece ser un fenmeno ms complejo que involucra la diseminacin clula a clula, la presencia de Listeria monocytogenes en el interior de los fagocitos y la diseminacin bacteriana transneural, aunque este ltimo mecanismo parece menos probable en humanos. El conocimiento actual de los mecanismos moleculares involucrados en la fisiopatologa de la listeriosis es parcial. En

los prximos aos con los nuevos avances y tecnologas disponibles en el campo de la gentica, biologa molecular e inmunologa se lograrn descifrar las complejas interacciones entre Listeria monocytogenes y su entorno permitiendo crear nuevas estrategias de diagnstico, prevencin y tratamiento de las infecciones por Listeria monocytogenes.

AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen al Sr. Hernn Ahumada Poblete y a la Sra. Carmen Gloria Sandoval Tillera, asistentes de biblioteca de la Pontificia Universidad Catlica de Chile, por su buena disposicin y asistencia en la recoleccin del material utilizado en la elaboracin de este manuscrito.

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