UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA FACULTAD DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIASDepartamento Acadmico de Ciencia, Tecnologa e Ingeniera deAlimentosEVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

EN PULPACONCENTRADA DE CAMU CAMU ( Myrciaria dubia (H.B.K.) Mc Vaugh) ENDOS ESTADO DE MADUREZ EN TINGO MARIA Tesis Para optar el ttulo de: INGENIERO EN INDUSTRIAS ALIMENTARIASHELMUT LEONID CALVAY VERASTEGUIPROMOCION 2007 ITINGO MARIA PERU2009

La Amazona peruana posee una gran diversidad biolgica, cuyariqueza florstica es abundante. Esta abundancia incluye de manera importantea los frutales nativos, pues constituye una fuente importante en la dieta de la p o b l a c i n y tambin como materia prima para la agroindustria r e g i o n a l (Gonzles, 2007). El camu camu ( Myrciaria dubia (H.B.K.) Mc Vaugh), tienecomo habitad natural al bosque aluvial inundable, puede quedar totalmentesumergido en el agua cuatro a cinco meses, sin

embargo se adapta bien asuelos con buen drenaje y regmenes hdricos con sequas hasta dos meses( V i l l a c h i c a , 1 9 9 6 ; Salvador, 1997). Se caracteriza por su alto contenido decido ascrbico presentando 2780 mgAA/100g de pulpa (Gonzles, 2007;V i l l a c h i c a , 1 9 9 6 ) , c o n v i r t i n d o s e a s e n u n p o d e r o s o a n t i o x i d a n t e q u e a despertado el inters del mercado exterior para ser utilizado en la agroindustria la farmacia, en el diseo de alimentos benficos para la salud como alimentosfuncionales y nutracuticos.Para satisfacer el mercado exterior y la agroindustria, adems delcamu camu que se produce en selva baja, es necesario incentivar en cultivo deesta fruta en una zona donde haya mayor acceso, fcil transporte y recolecciny donde las inundaciones no sean muy frecuentes, en tal sentido, se vio por c o n v e n i e n t e realizar un estudio de la capacidad antioxidante de la p u l p a concentrada de camu camu proveniente de selva alta (zona del alto Huallaga).El producto final a evaluado, es una pulpa concentrada hasta un 60 % de supeso inicial y envasado al vaco en bolsas de polietileno. Los objetivos del presente trabajo de investigacin fueron: Cuantificar el contenido de cido ascrbico de l a p u l p a concentrada de camu camu en dos estados de madurez, durante un periodo dealmacenamiento de 60 das.- Cuantificar el contenido de polifenoles totales y catequina en la p u l p a concentrada de camu camu en dos estados de madurez,

d u r a n t e u n periodo de almacenamiento de 60 das.- Evaluar la actividad antioxidante de la pulpa concentrada de camucamu en dos estados de madurez, empleando dos modelos in vitro: DPPH y Peroxilo, durante un periodo de almacenamiento de 60 das.

Caracterizar el producto concentrado al trmino del periodo dealmacenamiento.

2.2. Concentrado de alimentos En todo el mundo se observa un aumento destacado en e l consumo de frutas tropicales (Kuskoski et al , 2005). El proceso de concentrado ayuda a preservar mejor el potencial nutricional de este tipo de productos.20 Este proceso est basado en la reduccin de la actividad de agua, a s d e e s t e m o d o p r o l o n g a r l a v i d a t i l d e l o s j u g o s d e f r u t a ( G o m e s e t a l ,2005). El proceso de concentracin tiene un papel fundamental en la calidad de l o s a l i m e n t o s . L o s j u g o s d e f r u t a c o n t i e n e n m s d e l 7 5 a 9 5 % d e a g u a , s u retiro reduce los costos de empaque, almacenamiento y trasporte, prolongandola vida til del jugo de fruta (Brasil et al., 2008; Gomes et al , 2005). Durante el procesamiento clsico de jugos, tal como pasteurizacin t r m i c a y concentracin por evaporacin, pueden ocurrir prdidas d e compuestos nutricionales termosensibles tales como la vitamina C. Nuevosprocesos tienen que ser investigados como alternativas al tratamiento trmicoconvencional (Rodrigues et al., 2004). Para ello el proceso concentracin por evaporacin al vaco es una tcnica que permite concentrar jugos o pulpascomo las del camu camu con menores prdidas de sus nutrientes. Existe otrosp r o c e s o s p a r a c o n c e n t r a c i n d e a l i m e n t o s l q u i d o s , c o m o e l proceso de membrana que es ventajoso en comparacin con la evaporacin clsica,debido a la posibilidad de operar bajo c o n d i c i o n e s s u a v e s , s i n a f e c t a r l a termosensibilidad de algunas sustancias como las vitaminas (Rodrigues et al., 2004).Segn el CODEX Alimentario 2005, se entiende por zumo o jugo concentrado de fruta el producto al que se ha eliminado fsicamente el agua enuna cantidad suficiente para elevar el nivel de grados Brix al menos en un 50%ms que el valor Brix establecido para el zumo o jugo reconstituido de la mismaf r u t a . E n l a p r o d u c c i n d e z u m o o j u g o d e s t i n a d o a l a e l a b o r a c i n d e concentrados se utilizarn procedimientos adecuados, que podrn combinarsecon la difusin simultnea con agua de pulpa y clulas y/o el orujo de fruta,siempre que los slidos solubles de fruta extrados con agua se aadan al jugoprimario en la lnea de produccin antes de proceder a la concentracin. Losc o n c e n t r a d o s d e z u m o s o j u g o s d e f r u t a p o d r n c o n t e n e r c o m p o n e n t e s restablecidos de sustancias aromticas y aromatizantes voltiles, elementostodos ellos que debern obtenerse por procedimientos fsicos adecuados y quedebern proceder del mismo tipo de fruta.

presentes en ambas frutas, ya que en el proceso de c o n c e n t r a d o p a r t e d e estos cidos se transforman en sales de cidos al asociarse con los mineralesde la pulpa, generndose una capacidad amortiguadora del conjunto de cidosorgnicos predominantes en el sistema biolgico. Medina y Pagano (2003),i n d i c a n q u e l a r e l e v a n c i a d e l p H adems est asociada, a la presencia des a l e s , p r o t e n a s y otros compuestos coloidales que permiten al s i s t e m a biolgico conservar el pH.Otro factor que influye en estos resultados podra ser el mtodo dec o n c e n t r a c i n u t i l i z a d o . R o d r g u e z , e t a l . ( 2 0 0 4 ) r e p o r t a n u n a l i g e r a disminucin del pH (de 2,7 a 2,6) al concentrar jugo de camu camu empleandoosmosis inversa a 20 bar y al aumentar la presin a 40 y 60 bar obtuvieronmayor disminucin del pH, de 2,7 a 2,5. Estos autores tambin reportan unadisminucin significativa del pH al concentrar pulpa de camu camu empleandoevaporacin osmtica, de 2,6 a 2,2 por lo que se puede afirmar que el mtodode concentracin influye en el pH del producto concentrado. 5.2.2. Determinacin de micronutrientes

Con los datos del cuadro 10 se obtuvo la figura 9, observndose q u e e l Z i n c (Zn) est presente en mayor cantidad en ambos estados d e madurez. Tambin se observa que hay disminucin significativa (p<0,05) con lamaduracin para todos los minerales analizados, con excepcin de manganeso(Mn) que se encuentra en igual cantidad (p< 0,05). Se sabe que los minerales son cofactores de muchas enzimas,esta es la razn principal porqu los minerales se consideran micronutrientes esenciales (Bohinski, 1991).Las sales minerales ejercen mltiples funciones en el organismohumano como electrolitos, como componentes de enzimas y como elementosconstitutivos de determinadas sustancias corporales, pero como componentesde los alimentos no solo resultan importantes por razones de fisiologa de lanutricin, sino porque tambin participan frecuentemente en el sabor, activan ei n a c t i v a n r e a c c i o n e s c a t a l t i c a s y d e o t r a n a t u r a l e z a , e i n f l u y e n s o b r e l a consistencia. (Senser y Scherz, 1999).Zapata y Dufour (1993), reportan en pulpa de camu camu para losestados de madurez pintn y maduro respectivamente, un contenido en Zn, de1,2 y 1,3 mg/kg; un contenido en Cu, de 0,7 y 0,8 mg/kg; un contenido en Mn,de 1,4 y 2,1 mg/kg y; un contenido en Fe, de 1,8 para ambos. Estos valoresreportados no concuerdan con lo obtenido en los anlisis. Medina y Pagano(2003), mencionan que en las frutas, el contenido de minerales depende delmanejo agronmico de las tierras. 5.3. Cuantificacin de cido ascrbico en la pulpa concentrada de camucamu, almacenado a 15 a 10C El cido ascrbico es nutrimento esencial para el ser humano. Unabaja ingesta causa una enfermedad, por deficiencia, conocida como escorbuto(Gutirrez et al ., 2007). La vitamina C (L-cido ascrbico) es un importante a n t i o x i d a n t e y t i e n e f u n c i o n e s m e t a b l i c a s e n p l a n t a s y a n i m a l e s , p e r o e n humanos, y en algunas otras especies de animales, han perdido la capacidadde sintetizarlo (Wheeler et al ., 1998).Los resultados fueron analizados estadsticamente mediante el diseo completo al azar (DCA) con un arreglo factorial de 2x3 (ANEXO A I). 5.3.1. Determinacin de la curva patrn de cido ascrbico La determinacin de cido ascrbico (AA) se realiz b a j o condiciones de aire acondicionado a 20 5C y se prepar los estndares enel mismo momento de la evaluacin, para garantizar un anlisis con mnimoerror proveniente de la degradacin del cido ascrbico. Segn Gutirrez et al .( 2 0 0 7 ) , e l e s t n d a r p u r o d e c i d o a s c r b i c o a u n a c o n c e n t r a c i n d e 2 , 0 8 mg/100ml, se preserva mejor a 4 y 10C por 9 horas, por el contrario, aceleras u degradacin a 20, 30 y 40C, degradndose t o t a l m e n t e a e s t a l t i m a temperatura con tan solo transcurrir 6 horas.E n l a figura 11, se muestra la curva estndar de AA obtenido alinyectar 20 l de 10, 20, 30, 40 y 50

g/ml de AA al sistema HPLC y en laf i g u r a 1 2 s e m u e s t r a e l c r o m a t o g r a m a d e l A A a 5 0 g / m l . S e o b t u v o u n coeficiente de correlacin (r 2 = 0,999), cuya ecuacin lineal permiti determinar el contenido de cido ascrbico presente en la pulpa de camu camu en dosestados de madurez. Gokmen et al . (2000), determin el contenido de cidoascrbico en frutas y vegetales de la misma forma, donde la concentracin decido ascrbico lo determin usando una curva de calibracin basado en lagrafica de concentracin ( g/ml) vs rea del pico (convertido a mili unidadesde absorbancia, mUA).

5.4.1. Determinacin de la curva patrn de catequina Se obtuvo un coeficiente de correlacin (r 2 = 0 , 9 9 8 ) , c o n u n a ecuacin lineal: Absorbancia = 0,00011(Concentracin de CAT, M) + 0,00379para determinar el contenido de polifenoles totales presente en la pulpa dec a m u c a m u e n d o s e s t a d o s d e m a d u r e z ( f i g u r a 1 7 ) . V a r g a s et al . ( 2 0 0 5 ) , determinaron el contenido de fenlicos libres enlazados y totales en pulpa dearaz usando el reactivo de Folin-Ciocalteu y lectura espetrofotmtrica a 765nm, para lo cual efectuaron una curva de calibracin con D(+)catequina. 5.4.2. C o n t e n i d o d e p o l i f e n o l e s t o t a l e s e n l a p u l p a concentrada por estado de madurez Segn el ANVA del ANEXO B II, muestra que existe diferenciasa l t a m e n t e significativas (p<0,05), en el contenido de polifenoles t o t a l e s presente en las pulpas concentradas de camu camu, encontrndose mayor

contenido en el estado maduro con un promedio de 47,81 2,36 mgCAT/g encomparacin con el estado pintn que posee 30,94 1,33 mgCAT/g.Al comparar el contenido de cido ascrbico en pulpa concentradapor estado de madurez en cada da de evaluacin segn los ANEXOS B IIa,IIb y IIc, cuadro 15 y figura 18, se observa que el estado maduro posee mayor c o n t e n i d o d e p o l i f e n o l e s t o t a l e s q u e e l e s t a d o p i n t n , e n t o d o s l o s d a s d e evaluacin existiendo diferencias altamente significativas (p<0,05).Arts-Hernndez

et al . , 2 0 0 7 , m e n c i o n a q u e e l c o n t e n i d o d e compuestos fenlicos decrece con la maduracin en frutas como el pltano,guaba y granada. En el presente estudio, ocurre lo contrario ya que se obtuvomayor contenido de polifenoles en el estado maduro. Esta diferencia podraatribuirse a la distinta composicin que poseen estas frutas en comparacincon el camu camu, tambin podra ser que parte de la cscara desmenuzadapresente en la pulpa tambin aporte compuestos fenlicos.En conclusin estos resultados indican que la pulpa concentradade camu camu maduro contiene mayor contenido de polifenoles totales que elestado pintn. 5.4.3. C o n t e n i d o d e p o l i f e n o l e s t o t a l e s e n l a p u l p a concentrada por tiempo de almacenamiento Segn el ANVA del ANEXO B III, muestra que no e x i s t e diferencias significativas (p<0,05) entre los das de almacenamiento en ambo ambose s t a d o s d e m a d u r e z , e s t o e s c u a n d o l o s p r o m e d i o s d e a m b o s e s t a d o s s e compara en el tiempo de almacenamiento, pero, al comparar por tiempo dealmacenamiento en cada estado de madurez, segn los ANEXOS B IIIa , IIIb,c u a d r o 1 6 y f i g u r a 1 9 , m u e s t r a n q u e , e n e l e s t a d o p i n t n h a y d i f e r e n c i a s significativas (p<0,05) entre los das de almacenamiento, y comparando lospromedios mediante la prueba de Tukey (p<0,05), se encontr mayor contenidoal inicio de la evaluacin con 35,63 0,47 mgCAT/g, adems se observa unaprdida de polifenoles totales significativa a los 30 das de almacenamiento,mantenindose constante entre los 30 y 60 das. En la pulpa concentrada decamu camu maduro, hay diferencias significativas (p<0,05) entre los das dealmacenamiento, y comparando los promedios mediante la prueba de Tukey(p<0,05), el mayor contenido de polifenoles totales se registr a los 0 y 60 dasd e a l m a c e n a m i e n t o c o n 5 0 , 2 3 1 , 0 9 y 4 7 , 5 7 1,21 m g C A T / g , respectivamente, no habiendo diferencias significativas entre ellos, y unap r d i d a d e p o l i f e n o l e s t o t a l e s s i g n i f i c a t i v a a l o s 3 0 d a s , p e r o n o s i e n d o significativa ante el da 60 de evaluacin.Artz-Hernndez et al . ( 2 0 0 7 ) , m e n c i o n a n q u e l o s c o m p u e s t o s fenlicos estn involucrados en muchas interacciones que responden al estrsbitico y abitico en las plantas. En efecto, los frutos de camu camu fueron p u l p e a d o s y c o n c e n t r a d o s p o r l o q u e p o d r a d e c i r s e q u e l o s f r u t o s s e sometieron a un stress abitico, repercutiendo este proceso en las variacionesdel contenido de polifenoles. Evaluaron tambin el contenido de polifenoles totales en limones, almacenados a 0, 2, 5 y 10C, encontrando prdida graduala los 10 das de almacenamiento en todas las temperaturas, excepto en loslimones almacenados a 0C, que mantuvo su contenido de polifenoles. El contenido de polifenoles totales est influenciado por e l contenido de compuestos fenlicos libres y enlazados. Los

c o m p u e s t o s enlazados por lo general se encuentran como glucsidos. Si existe actividadglucosdica, se generarn los carbohidratos y las respectivas agliconas, por loque, ocurrir un incremento de los compuestos fenlicos libres. Adems loscompuestos fenlicos libres pueden ser atacados a una mayor velocidad quelos enlazados por en enzimas tales como la polifenoloxidasa y la peroxidasa.Vargas et al . (2005). En el presente estudio las pulpas no fueron t r a t a d a s trmicamente (operacin de blanqueado) por lo que, estas enzimas, presentese n m u c h a s f r u t a s t a m b i n p o d r a n e s t a r p r e s e n t e s e n e l c a m u c a m u y n o fueron inactivadas con el objeto de preservar el contenido de cido ascrbicotal y como provienen de la cosecha para su evaluacin en almacenamientoentre 15 a 10C.En conclusin en el estado maduro, el contenido de polifenolest o t a l e s s e c o n s e r v e n a l m a c e n a m i e n t o , y e n e l e s t a d o p i n t n d i s m i n u y significativamente. 5.4.4. C o n t e n i d o d e p o l i f e n o l e s t o t a l e s e n l a p u l p a concentrada por tratamientos En el cuadro 17, en la figura 20 y el ANVA del ANEXO B IV, se o b s e r v a que los tratamientos T4, T5 y T6 son estadsticamente i g u a l e s (p<0,05) y son superiores a T1, T2 y T3. Adems, T1 es superior a T2 y T3(p<0,05), no existiendo diferencia significativa entre T2 y T3 (p<0,05). Estosdatos nos indican que los tratamientos T4, T5 y T6 correspondiente al estado maduro evaluados a los 0, 30 y 60 das de almacenamiento, son los q u e siempre poseen mayor contenido de polifenoles totales. 5.5. Cuantificacin de catequina en la pulpa concentrada de camu camu,almacenado a 15 a 10C Las polifenoles (catequinas) de origen vegetal como la catequina, epicatequina, galocatequina, epigalocatequina, galato de catequina, galato degalocatequina, galato de epicatequina y galato de epigalocatequina tienen unaactividad antioxidante poderosa y tienen numerosas propiedades medicinalespotencialmente benficos, incluyendo la inhibicin de carcinognesis (Dalluge,J y Nelson, B. 2000).Los resultados se analizaron mediante el diseo completo al azar (DCA) con un arreglo factorial de 2x3 (ANEXO C I). 5.5.1. Determinacin de la curva patrn de catequina Se obtuvo un coeficiente de correlacin (r 2 = 0 , 9 9 8 9 ) , c o n u n a ecuacin lineal: Absorbancia (mUA) = 0,0652 (Concentracin de CAT, M) +0 , 1 8 5 6 p a r a d e t e r m i n a r e l c o n t e n i d o d e catequina presente en la pulpa dec a m u c a m u e n d o s e s t a d o s d e m a d u r e z ( f i g u r a 2 1 ) , y e n l a f i g u r a 2 2 , s e muestra el cromatograma HPLC, obtenido al inyectar estndar de CAT a 500 M. Ding et al . (1999), mencionan que hay muchos mtodos para determinar polifenoles en t, siendo la cromatografa lquida en columna, el mtodo masconveniente.

Desarrollaron un mtodo rpido por cromatografa lquida en fasereversa para determinar los principales polifenoles y cafena en t: catequina,g a l a t o d e e p i c a t e q u i n a , galato de epigalocatequina, epigalocatequina, epicatequina y cafena, los cuales fueron separados satisfactoriamente en 15min. Sandoval et al . (2002-a), determinaron catequinas en extractos acuososd e M a c a y t verde, por HPLC en fase reversa, usando estndares dec a t e q u i n a , g a l a t o d e e p i g a l o c a t e q u i n a y p o l i f e n n 6 0 ( m e z c l a d e epigalocatequina, epicatequina y galato de epicatequina). Sandoval et al. (2002b), determinaron catequinas en muestras liofilizadas de ua de g a t o empleando HPLC en fase reversa, detectando catequina, epigalocatequina,epicatequina y galato de epigalocatequina. 5.5.2. Contenido de catequina en la pulpa concentrada por estado de madurez Segn el ANVA del ANEXO C II, muestra que existe diferenciasaltamente significativas (p<0,05), en el contenido de catequina presente en laspulpas concentradas de camu camu, encontrndose mayor contenido el estadom a d u r o c o n u n p r o m e d i o de 0,44 0 , 0 1 5 m g C A T / g e n c o m p a r a c i n c o n e l estado pintn que posee 0,31 0,019 mgCAT/g, esta diferencia se aprecia enl a s f i g u r a s 2 4 y 2 5 , d o n d e s e m u e s t r a n l o s c r o m a t o g r a m a s H P L C d e C A T presente en la pulpa concentrada de camu camu pintn y maduro.Al comparar el contenido de catequina en pulpa concentrada por estado de madurez en cada da de evaluacin segn los ANEXOS C IIa, IIb yI I c , c u a d r o 1 8 y f i g u r a 2 3 , s e o b s e r v a q u e e l e s t a d o m a d u r o p o s e e m a y o r contenido de catequina que el estado pintn, en todos los das de evaluacinexistiendo diferencias altamente significativas (p<0,05). Comparando el contenido de catequina en pulpa madura de camucamu concentrado (0,45 0,015 mg/g) obtenido al inicio del almacenamiento(da 0), se observa que es superior a la maca ( Lepidium meyenii ) (0,32 0,001mg/g extracto acuoso de [] =50 mg/ml) (Sandoval et al ., 2002a); pero es inferior a l t v e r d e ( Camellia sinensis ) (30,39 1,9 mg/g extracto acuoso de [] =50mg/ml), (Sandoval et al., 2002a); asimismo es inferior a la ua de gato (

Uncariatomentosa ) (8,47 0,1 mg/g de producto liofilizado), (Sandoval et al ., 2002b).En conclusin estos resultados indican que la pulpa concentradade camu camu maduro contiene mayor contenido de catequina que el estadopintn. 5.5.3. Contenido de catequina en la pulpa concentrada por tiempo de almacenamiento Segn el ANVA del ANEXO C III, muestra que no e x i s t e diferencias significativas (p<0,05) entre los das de almacenamiento en ambose s t a d o s d e m a d u r e z , e s t o e s c u a n d o l o s p r o m e d i o s d e a m b o s e s t a d o s s e compara en el tiempo de almacenamiento, pero, al comparar por tiempo dealmacenamiento en cada estado de madurez, segn los ANEXOS C IIIa , IIIb,c u a d r o 1 9 y f i g u r a 2 6 , m u e s t r a n q u e , e n e l e s t a d o p i n t n h a y d i f e r e n c i a s significativas (p<0,05) entre los das de almacenamiento, y comparando lospromedios mediante la prueba de Tukey (p<0,05), se encontr mayor contenidoa los 30 das de la evaluacin con 0,34 0,008 mgCAT/g, ya que en este daaument su contenido de catequina, asimismo se observa que hay una prdidas i g n i f i c a t i v a d e c a t e q u i n a e n e l d a 6 0 ,

p e r o q u e n o e s s i g n i f i c a t i v o e n comparacin con el da 0 de la evaluacin. En la pulpa concentrada de camuc a m u m a d u r o , h a y diferencias significativas (p<0,05) entre los das d e almacenamiento, y comparando los promedios mediante la prueba de Tukey( p < 0 , 0 5 ) , e l m a y o r c o n t e n i d o d e c a t e q u i n a s e r e g i s t r a l o s 0 y 3 0 d a s d e almacenamiento con 0,45 0,015 y 0,46 0,008 mgCAT/g, respectivamente,no habiendo diferencias significativas entre ellos, adems se observa que nohay diferencias significativas entre los das 0 y 60, pero si entre los das 30 y 60de la evaluacin.E n c o n c l u s i n e n e l e s t a d o p i n t n e l c o n t e n i d o d e c a t e q u i n a s e conserv en el almacenamiento al igual que en el estado maduro. 5.5.4. Contenido de catequina en la pulpa concentrada por tratamientos En el cuadro 20, en la figura 27 y segn el ANVA del ANEXO C I V , s e observa que los tratamientos T4, T5 son estadsticamente iguales( p < 0 , 0 5 ) ; T 5 e s s u p e r i o r a T 1 , T 2 , T 3 y T 6 ( p < 0 , 0 5 ) . A d e m s n o h a y significancia entre T4 y T6 (p<0,05), pero T6 es estadsticamente superior a T1,T2 y T3 (p<0,05); T2 y T3 son estadsticamente iguales (p<0,05) y tambin sonsuperiores a T1 (p<0,05). Estos resultados nos indican que los tratamientos T4,T5 y T6 correspondiente al estado maduro

evaluados a los 0, 30 y 60 das dealmacenamiento, son los que siempre poseen mayor contenido de catequinas. 5.6. Evaluacin de la actividad antioxidante en la pulpa concentrada decamu camu, almacenado a 15 a 10C