Ortega Hernando Manuel Virologa Mdica

Grupo: 1902

Reporte Lavado de Material

Para el lavado del material de vidrio se utilizan detergentes no txicos, despus de un aclarado con agua destilada, el material despus se esteriliza en autoclave 121C/15lb/30. Si es posible el rea de lavado y esterilizacin debe ser situado fuera del laboratorio de cultivos celulares, pero en la proximidad, ya que la humedad y el calor que se produce puede ser difcil de disipar y producir problemas con el flujo de aire. Si no es posible, puede ser localizada en la entrada del laboratorio donde el trfico es mayor. Si adems se ponen las autoclaves y los refrigeradores en esta zona, el movimiento de personal y material dentro del laboratorio ser mucho menor. El rea de lavado debe contar con espacio para remojo de material, lavado y preparacin de cristalera. Adems un sitio para recibir material sucio o contaminado. El lavado de la cristalera para los cultivos celulares es muy delicado. Las botellas con medios o reactivos que se descarten, deben ser enjuagadas inmediatamente y dejarlas en agua para evitar que protenas u otros qumicos se peguen al vidrio. Deben ser sumergidas en cloro al 4% durante 18 horas, enjuagadas en agua cinco veces y luego sumergir en cido clorhdrico al 2% durante el mismo tiempo, se enjuagadas se pasan cinco veces ms por agua destilada desionizada. Para lavar el material se sigui el procedimiento descrito en el manual y posteriormente se esteriliz en autoclave.

Cultivo celular
El cultivo celular es el proceso mediante el que clulas, ya sean clulas procariotas, eucariotas o vegetales, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la prctica el trmino "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de clulas aisladas de eucariotas pluricelulares, especialmente clulas animales. El desarrollo histrico y metodolgico del cultivo celular est ntimamente ligado a los pptidos cultivares del cultivo de tejidos y el cultivo de rganos. Aislamiento de clulas Las clulas pueden ser aisladas de los tejidos para cultivos in vitro de muchas maneras. Las clulas pueden ser purificadas con facilidad de la sangre, sin embargo slo los leucocitos son capaces de crecer en cultivo. Las clulas mononucleares se pueden liberar de los tejidos blandos mediante hidrlisis enzimtica con enzimas como la colagenasa, tripsina o pronasa, que degradan la matriz extracelular. Como alternativa se pueden colocar trozos de tejido en medio de crecimiento, y las clulas que crecen son aptas para el cultivo. Este mtodo es el conocido como cultivo de explantes. Las clulas que se cultivan directamente desde un sujeto se conocen como clulas primarias. A excepcin de algunos derivados de tumores, la mayora de los cultivos celulares primarios tienen

Ortega Hernando Manuel Virologa Mdica

Grupo: 1902

un periodo de vida limitado. Despus de un cierto nmero de divisiones las clulas entran en el proceso de senescencia y dejan de dividirse, generalmente manteniendo la viabilidad Mantenimiento de clulas en cultivo Las clulas se cultivan y mantienen a una apropiada temperatura y mezcla de gases (habitualmente, 37C, 5% CO2 y 95% O2) en un incubador celular. Las condiciones de cultivo varan ampliamente para cada tipo celular, y la variacin de las condiciones para un tipo celular concreto, puede dar lugar a la expresin de diferentes fenotipos. Adems de la temperatura y la mezcla de gases, el factor ms comnmente variado en los sistemas de cultivo es el medio de crecimiento. Las recetas para los medios de crecimiento pueden variar en pH, concentracin de glucosa, factores de crecimiento y la presencia de otros componentes nutritivos. Los factores de crecimiento usados para suplementar a los medios derivan a menudo de sangre animal, como el suero bovino. Estos ingredientes derivados de la sangre plantean una potencial contaminacin con virus o priones de los productos farmacuticos derivados. En la actualidad se tiende a minimizar o eliminar el uso de estos ingredientes cuando sea posible. Estrategias alternativas de abastecimiento involucran la sangre de los animales procedentes de pases con un riesgo mnimo de encefalopata espongiforme bovina, como Australia y Nueva Zelanda, y el uso de nutrientes purificada concentrados derivados de suero en lugar de suero animal entero para el cultivo de clulas. Las clulas pueden crecer en suspensin o de manera adherente. Algunas clulas viven de forma natural sin adherirse a una superficie, como las que existen en el torrente sanguneo. Otras necesitan una superficie, como la mayora de clulas derivadas de tejidos slidos. A las clulas que crecen sin unirse a una superficie se las llama cultivos en suspensin. Algunos cultivos celulares adherentes pueden crecer en plstico para el cultivo de tejidos, que puede estar recubierto con componentes de la matriz extracelular para aumentar sus propiedades de adhesin y proporcionar otras seales necesarias para el crecimiento y diferenciacin. Otro tipo de cultivo adherente es el cultivo organotpico que consiste en cultivar las clulas en un ambiente tridimensional a diferencia de las placas de cultivo bidimensionales. Este tipo de cultivo 3D es bioqumica y fisiolgicamente similar al tejido vivo. Sin embargo presenta dificultades tcnicas debido a varios factores (por ejemplo: difusin). Manipulacin de las clulas en cultivo Al estar generalmente las clulas en continua divisin durante el cultivo, es normal que crezcan hasta ocupar toda el rea o volumen disponible. Esto puede generar varios problemas:

Agotamiento de los nutrientes del medio Acumulacin de clulas apoptticas o necrticas Inhibicin de la divisin celular por contacto: los contactos entre clulas pueden desencadenar un arresto del ciclo celular Diferenciacin celular promiscua provocada por los contactos intercelulares

Estos problemas pueden afrontarse mediante mtodos de cultivo celular en esterilidad. El objetivo de estos mtodos es evitar la contaminacin con bacterias o levaduras que competiran por los nutrientes y/o podran infectar y as eliminar las clulas. Toda manipulacin se lleva a cabo,

Ortega Hernando Manuel Virologa Mdica

Grupo: 1902

tpicamente, en una campana de flujo laminar para evitar la entrada de microorganismos contaminantes. Tambin pueden aadirse antibiticos al medio de cultivo. Entre las manipulaciones ms comunes llevadas a cabo en cultivos celulares, se encuentran los cambios de medio, el pase de las clulas y la transfeccin. Aplicaciones del cultivo celular El cultivo masivo de lneas celulares animales es fundamental para la manufactura de vacunas virales y diversos productos biotecnolgicos. Los productos biolgicos producidos mediante la tecnologa del ADN recombinante en cultivo celular incluyen enzimas, hormonas sintticas, inmunobiolgicos (anticuerpos monoclonales, interleucinas, linfoquinas y agentes anticancergenos). A pesar de que muchas protenas pueden producirse mediante ADN recombinante en cultivos bacterianos, las protenas ms complejas que son glicosiladas (modificadas mediante el agregado de carbohidratos) deben producirse en clulas animales. Un ejemplo relevante de tales protenas complejas es la hormona eritropoyetina. Actualmente, se estn realizando investigaciones para producir tales protenas complejas en clulas de insectos o de plantas superiores, debido al alto costo que implica producir tales protenas complejas en clulas de mamferos. Ventajas y desventajas de los cultivos celulares Los cultivos celulares tienen una serie de ventajas innegables, pero al mismo tiempo tienen desventajas que hay que tener en consideracin. Como ventajas podemos citar: Permiten un control preciso y fino del medio ambiente. En un cultivo se pueden controlar todos los factores del medio: Fsico-qumicos (pH, temperatura, presin osmtica, niveles de O2, CO2, tensin superficial...), y fisiolgicos (hormonas, factores de crecimiento, densidad celular,...) Caracterizacin y homogeneidad de la muestra. Las clulas en cultivo de una lnea celular, o de una lnea continua son homogneas, con morfologa y composicin uniformes. Se pueden obtener con facilidad un nmero elevado de rplicas idnticas, con lo que se supera el grave problema de heterogeneidad de las muestras inherente asociado al uso de animales de experimentacin. Economa. Suponen una economa en el uso de reactivos o drogas a estudiar pues al realizarse en volmenes reducidos, y con un acceso directo de las clulas a la droga las concentraciones requeridas son mucho ms bajas que en el animal completo. En cuanto a las desventajas del cultivo celular: Tcnica sensible. El crecimiento de las clulas animales es mucho ms lento que el de los contaminantes ms habituales (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas...) y adems dado que proceden de organismos pluricelulares son incapaces de crecer en ausencia de una compleja mezcla de nutrientes que simula el plasma o el fluido intersticial. Esto supone la necesidad de mantener las condiciones de asepsia en todo momento, lo cual es limitante a nivel tanto del instrumental requerido como del personal calificado para su manipulacin. Cantidad y costo. El costo de produccin de 1 g de tejido en cultivo es ms de 10 veces superior al obtenido en el animal. Asimismo existe una limitacin de produccin, que es

Ortega Hernando Manuel Virologa Mdica

Grupo: 1902

del orden de 10 g de clulas en un laboratorio normal, y que para ser superior a 100 g requiere instalaciones de tipo industrial. Inestabilidad. Muchas de las lneas celulares continuas son inestables, como consecuencia de la dotacin cromosmica aneuploide. La poblacin celular puede variar su composicin si alguna de las subpoblaciones celulares es capaz de crecer con una tasa ligeramente superior, es decir podemos encontrar diferencias significativas en la lnea celular de una generacin a la siguiente. La nica manera de evitarlo es emplear lneas estables que se resiembran a partir de un stock congelado cada determinado tiempo, o despus de un determinado nmero de generaciones. La investigacin biomdica supone el sacrificio cada ao de muchos miles de animales de experimentacin. El cultivo celular no puede reemplazar siempre el ensayo "in vivo" pero es una alternativa vlida en muchas situaciones. Extrajimos clulas de embrin de pollo para realizar cultivo celular, al parecer las clulas estaban creciendo en nuestro caso ya que cada da que se cambiaba el medio est estaba de color amarillo, lo que indica utilizacin de nutrientes, esto hasta el fin de semana que no se cambio el medio y se murieron las clulas.

Bacterifagos
Los bacterifagos (fagos) son parsitos intracelulares obligados que se multiplican al interior de las bacterias, haciendo uso de algunas o todas sus maquinarias biosintticas (p. ej., los virus que infectan bacterias). Existen muchas similaridades entre los bacterifagos y los virus de clulas animales. As, los bacterifagos pueden ser visualizados como sistemas modelo de los virus de clulas animales. Adems es necesario el conocimiento previo del ciclo de vida del bacterifago para entender uno de los mecanismos por los cuales los genes bacterianos pueden transferirse de una bacteria a otra. Aunque diferentes bacterifagos pueden contener diferentes materiales todos ellos contienen cido nucleico y protena. Dependiendo del fago, el cido nuclico puede ser ya DNA o ya RNA pero no ambos y puede existir en varias formas. Los cidos nuclicos de los fagos a menudo contienen bases raras o modificadas. Estas bases modificadas protegen a los cidos nucleicos del fago de las endonucleasas que cortan los cidos nuclicos del husped durante la infeccin. El tamao de los cidos nucleicos vara dependiendo del fago. Los fagos ms simples solo tienen suficiente cido nucleico para codificar un promedio de 3-5 productos gnicos, mientras que los fagos ms complejos, pueden codificar para ms de 100 productos gnicos. El nmero de protenas de diferentes clases y la cantidad de cada una de ellas en la partcula del fago variar dependiendo de la clase de fago que se trate. El fago mas simple posee varias copias de solo una o dos diferentes protenas, mientras que los ms complejos podran poseer muchos tipos de protenas diferentes. La funcin de las protenas durante la infeccin es proteger al cido nucleico de las nucleasas de su medio ambiente. Fagos Lticos o Virulentos

Ortega Hernando Manuel Virologa Mdica

Grupo: 1902

Los fagos lticos o virulentos son fagos que solo pueden multiplicarse en bacterias y matan a la clula por lisis al trmino del ciclo de vida. Fago lisognico o Temperado Los fagos lisognicos o temperados son aquellos que bien pueden multiplicarse via el ciclo ltico o entran en un estado quiescente en la clula. En este estado quiescente la mayora de los genes del fago no se transcriben; el genoma del fago existe en un estado reprimido. Al DNA del fago en este estado reprimido se le conoce como profago porque no es un fago pero posee el potencial para producir fagos. En la mayora de los casos el DNA de fago realmente se integra en el cromosoma del husped y se replica junto con el cromosoma del husped y se transmite a las clulas hijas. La clula que alberga un profago no se ve negativamente afectada por la presencia del profago y el estado lisognico puede persistir indefinidamente. A la clula que alberga un profago se le conoce como lisgena. Ensayo en placa Los fagos lticos se cuentan mediante ensayos de formacin de placas. Una placa se define como el rea clara que resulta de la lisis de bacterias. A la partcula infecciosa que da origen a la placa se le llama una unidad formadora de placa (ufp). No se observo crecimiento bacteriano por lo tanto tampoco las placas lticas

Congelacin
La criopreservacin es el proceso en el cual clulas o tejidos son congelados a muy bajas temperaturas, generalmente entre -80 C y -196 C (el punto de ebullicin del nitrgeno lquido) para disminuir las funciones vitales de una clula o un organismo y poderlo mantener en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. A esas temperaturas, cualquier actividad biolgica, incluidas las reacciones bioqumicas que produciran la muerte de una clula, quedan efectivamente detenidas. Normalmente para preservar una muestra biolgica durante el mayor tiempo posible sin que pierda su calidad se utiliza nitrgeno lquido. De esta manera sumergiendo la muestra en nitrgeno lquido se alcanzan temperaturas de hasta -195,79 C, la temperatura de ebullicin del nitrgeno lquido. La utilizacin de helio lquido permite alcanzar temperaturas incluso menores de hasta -268,93 C (temperatura de ebullicin del helio). Las muestras criopreservadas en nitrgeno lquido slo estarn afectadas por las radiaciones que puedan incidir sobre ellas puesto que la congelacin impide todo movimiento molecular en la muestra.El problema lo constituyen el proceso de congelacin previo y la descongelacin posterior que es lo que afecta gravemente a las muestras por los siguientes motivos:

Formacin de cristales de hielo durante la congelacin del agua

Ortega Hernando Manuel Virologa Mdica

Grupo: 1902

Estos cristales se forman tanto fuera como dentro de la clula y son los cristales intracelulares los que comportndose como cuchillas cortan las estructuras internas de la clula, especialmente las membranas.

El hielo es dinmico

Entre los 0 y los -30 el hielo cambia continuamente de conformacin lo que provoca que se acente el efecto "cuchilla" del mismo. Debido a estos efectos durante la congelacin se debe evitar la formacin de hielo intracelular siguiendo una serie de reglas:

Deshidratar la clula. Hay que extraer el agua de la clula y sustituirla por crioprotectores o criopreservantes que mantengan el equilibrio osmtico. Controlar la velocidad de congelacin. Hay que controlar la velocidad de congelacin para que la formacin de los cristales intracelulares sea lo menos daina posible. Si la congelacin se produce demasiado rpido se forma el hielo intracelular y si se da demasiado lento se produce el colapso celular. Ralentizar el metabolismo celular. Para ellos se trabaja a temperatura ambiente o a 4C.

Como regla general podemos afirmar que aprximadamente el 50% de las clulas que congelamos no sobrevivirn a la descongelacin. Actualmente se ha logrado superar esta etapa y de la congelacin se ha pasado a la vitrificacin, de tal forma que con este nuevo mtodo se consigue que no se creen cristales de hielo y sobrevivan la prctica totalidad de todas las clulas inmersas en el proceso. Criopreservantes Un criopreservante es un compuesto qumico que permite el mantenimiento de un tejido o de clulas por mucho tiempo cuando se las mantiene a baja temperatura. Los criopreservantes se catalogan de acuerdo a la velocidad para penetrar los tejidos, el grado de proteccin al cristal de agua que confieren y por la toxicidad qumica que pueden tener sobre las clulas. El grado de proteccin a las clulas est directamente vinculado al grado de asociacin que tengan con el agua molecular. A mayor afinidad, menor el agua disponible para la cristalizacin daina. Adems, estos productos se utilizan en conjunto con los medios nutritivos lquidos que conforman las mezclas congelantes. Aplicacin Las concentraciones criopreservantes son lamentablemente txicas para el tejido a temperatura ambiente, por lo cual, en el procedimiento de congelado, se deben respetar ciertos tiempos de exposicin del material a 4 C, para que el producto protector penetre el tejido sin alcanzar los niveles txicos referidos, antes del inicio del proceso de congelamiento propiamente tal. En el mismo sentido, cuando se procede a la tcnica de descongelado, previo al uso del material, se lo

Ortega Hernando Manuel Virologa Mdica

Grupo: 1902

debe someter a un lavado minucioso con medios nutritivos a concentraciones decrecientes del criopreservante, para su total eliminacin evitando de esa forma los efectos txicos. Criopreservantes Podemos distinguir dos tipos: agentes penetrantes y agentes no penetrantes. Agentes penetrantes Son compuestos de bajo peso molecular y permeables a travs de la membrana. Actuan desplazando el agua del interior de la clula evitando as la formacin de cristales de hielo intercelulares los cuales actan como cuchillos. Estos criopreservantes se utilizan en congelaciones a velocidad muy lenta y los ms comunes son:

Dimetil sulfxido (DMSO): Es muy txico a temperatura ambiente, pero si se aplica a baja temperatura es el que posee mejor resultado. Glicerol: Muy utilizado para mantener enzimas entre los -5 a 4 C sin congelar. Etilenglicol 1,2 propanodiol (PROH)

Agentes no penetrantes Son compuestos de elevado peso molecular que no son permeables a travs de la membrana sino que actan fuera de la clula promoviendo una rpida deshidratacin de la misma. Se utilizan en congelaciones a velocidades muy altas y los ms conocidos son:

Polivinil pirrolidona (PVP): La PVP no tiene un movimiento rpido tisular (a travs de los tejidos), por lo que se utiliza mucho en embriones. Lipoprotenas de la yema de huevo Protenas de elevado peso molecular Polietilenglicol (PEG)

Adems se ha observado que la glucosa, la trealosa y otros glcidos pueden actuar como criopreservantes naturales Descongelacin Durante la descongelacin se debe eliminar rpidamente la presencia intra y extracelular de los crioprotectores que suelen ser txicos a las elevadas concentraciones utilizadas. Adicionalmente se ha de tener en cuenta que la muestra debe ser atemperada de manera correcta hasta su temperatura de cultivo. Practica demostrativa, se observo el procedimiento para la congelacin de clulas y se comprob su viabilidad al observarlas al microscopio sin coloracin con azul de tripan.

Ortega Hernando Manuel Virologa Mdica

Grupo: 1902