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UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS BERASTEGUI 2008
INTRODUCION
El crecimiento microbiano se define como el aumento del numero de individuos (microorganismos) y constituye una variable de gran importancia en el desarrollo biotecnolgico; su medicin permite en muchas ocasiones evaluar la eficiencia de los bioprocesos. Existen diversas tcnicas para medir la cantidad de clulas de un cultivo, cada una de las cuales presenta una serie de ventajas y desventajas con respecto a los dems, pero por lo general todas reportan datos que se aproximan a la realidad (con mayor o menor exactitud). En el presente informe se estudiaran 3 tcnicas para la medicin de biomasa: peso seco, densidad ptica y recuento total directo (cama de Neubauer). Se analizaran los resultados obtenidos mediante dichas tcnicas, as como tambin las ventajas y desventajas que ofrece cada una de ellas. De igual manera se reportaran otras tcnicas para la medicin de biomasa. Para tales objetivos se realizaron consultas en textos afines e Internet. Todo lo anterior permitir ampliar los conocimientos sobre el tema, lo cual es de suma importancia para el desempeo del ingeniero de alimentos en el rea de la Biotecnologa.
OBJETIVOS
OBJETIVOS ESPECFICOS Analizar los resultados obtenidos mediante las tcnicas de medicin de biomasa: peso seco, densidad ptica, y recuento total directo. Comparar los resultados obtenidos por cada tcnica para la medicin de biomasa. identificar las ventajas y desventajas de las tcnicas de medicin de biomasa. Describir otros mtodos para la medicin de biomasa celular
MEDICIN DE BIOMASA CELULAR El clculo del nmero de clulas que existen en una suspensin se puede llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopa, nmero de colonias), masa celular (peso seco, medida del nitrgeno celular, turbidimetra) o actividad celular (grado de actividad bioqumica con relacin al tamao de la poblacin). Todos estos mtodos se clasifican en dos apartados: mtodos directos y mtodos indirectos. Mtodos directos:
Recuento del nmero de clulas en una cmara Thoma Peso seco celular Determinacin de nitrgeno o de protenas totales Determinacin de DNA
Mtodos indirectos:
Recuento de colonias en placa Recuento sobre filtro de membrana Consumo de oxgeno Liberacin de dixido de carbono Concentracin de un enzima constitutivo Decoloracin de un colorante Incorporacin de precursores radiactivos Medida de la turbidez
PESO SECO CELULAR El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se encuentran en una suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105C hasta peso constante. Esta tcnica es til para grandes volmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran nmero de bacterias. La desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la clula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradacin. Tambin la muestra seca puede
recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta. "El aumento de volumen con la humedad tiene un lmite. Este va creciendo hasta que la clula alcanza un porcentaje de humedad que corresponde al punto de saturacin de la pared celular, aproximadamente del 30 % para todas las especies en clculos tcnicos. A partir de ste valor el volumen permanece constante, ya que el agua que penetra en el volumen de las clulas no produce hinchamiento de la pared celular. Por lo tanto, el valor del 30 % es un valor para utilizarlo prcticamente, si bien cada especie tiene su punto de saturacin de la pared celular" (2). No sucede as con el peso, cuyo valor sigue aumentando hasta alcanzar el contenido mximo de agua para la especie correspondiente. Como consecuencia de lo anteriormente expuesto, se definen, para una clula los siguientes pesos especficos: Peso especfico anhidro Peso especfico a H % de humedad Peso seco volumtrico saturado Peso seco volumtrico hmedo.
DENSIDAD PTICA Esta tcnica se basa en el principio de que la cantidad de luz dispersada es proporcional a la masa de clulas presentes en la trayectoria de la luz. Se refiere a la medida de cantidades relativas de luz absorbida por una muestra, en funcin de la longitud de onda. Cada componente de la solucin tiene su patrn de absorcin de luz caracterstico. Comparando la longitud de onda y la intensidad del mximo de absorcin de luz de una muestra versus soluciones standard, es posible determinar la identidad y la concentracin de componentes disueltos en la muestra (solucin incgnita).
Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentracin de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partcula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaos de las clulas bacterianas son diferentes. Por esta razn, para estimar el nmero de microorganismos totales o el nmero de microorganismos viables de una suspensin bacteriana debe realizarse una "curva de calibracin" con cada tipo de microorganismo, slo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad ptica) con el nmero de microorganismos totales o con UFC.
Fig. Absorbancia en funcin de la concentracin de clulas CONTEO DIRECTO (CAMARA DE NEUBAUER) Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio. La cmara de Neubauer. Tiene dos cmaras de conteo.
La mayor dificultad del recuento en cmara es obtener reproductibilidad en el llenado de la cmara con lquido. Otra dificultad es la adsorcin de las clulas en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorcin es crtica en el proceso de dilucin de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza inica (solucin fisiolgica o medios mnimos sin fuente de carbono). Una de las mayores ventajas del recuento microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos contados.
Para determinar la concentracin final se aplic la ecuacin C1V1 = C2V2 Tubo N 1 C1 = 1000ppm*0 ml / 10 ml = 0 ppm Tubo N 2 C2 = 1000ppm x 2 ml / 10 ml = 200 ppm Tubo N 3 C3 = 1000ppm x 4 ml / 10 ml = 400 ppm Tubo N 4 C4 = 1000ppm x 6 ml / 10 ml = 600 ppm Tubo N 5 C5 = 1000ppm x 8ml / 10 ml = 800 ppm Tubo N 6 C6 = 1000ppm x 10 ml / 10 ml = 1000 ppm Tabla N 1 1 2 3 4 10 8 6 4 0 2 4 6 0 200 400 600
5 2 8 800
6 0 10 1000
Tabla N 2 Tubo Peso Tubos(g) 1 18.9066 2 18.3760 3 18.4472 4 15.4872 5 18.5931 6 18.3880
DENSIDAD PTICA
Para calcular las nuevas concentraciones, se parti de las diluciones realizadas en la tcnica de peso seco (0, 200, 400, 600, 800, 1000 respectivamente).
C1V1 = C2V2
C2 (tubo1) = 0 ppm x 1 ml / 9 ml = 0 ppm C2 (tubo2) = 200 ppm x 1 ml / 9 ml = 22.2ppm C2 (tubo3) = 400 ppm x 1 ml / 9 ml = 44.4 ppm C2 (tubo4) = 600 ppm x 1 ml / 9 ml = 66.67 ppm C2 (tubo5) = 800 ppm x 1 ml / 9 ml = 88.89 ppm C2 (tubo6) = 1000 ppm x 1 ml / 9 ml = 111.1 ppm
Tabla 3 V1(ml) C1(ppm) V2(ml) C2(ppm) Tubo1 1 0 9 0 Tubo2 1 200 9 22.2 Tubo3 1 400 9 44.4 Tubo4 1 600 9 66.67 Tubo5 1 800 9 88.89 Tubo6 1 1000 9 111.1
Para este ensayo, se tomaron 0.5ml de cada tubo empleado en el ensayo de densidad ptica.
Tabla N 4 Tubo 1 2 3 4 5 6 Peso (tubo+muestra seca)g 18.9066 18.3885 18.5165 16.6774 18.6612 18.4163
Peso Seco (Ps) = peso (muestra seca + tubo) peso del tubo Se debe multiplicar por el factor de dilucin Fd = 1/9 para que el resultado de en g de clulas / ml. El peso de los tubos se observan en la tabla 2. Tubo N 1 Ps = 18.9066 g 18.9066g = 0 Tubo N 2 Ps = 18.3777g 18.3760g = 0.0017 g/ml x Fd = 1.88 x 10-4 g de clula/ml Tubo N 3 Ps = 18.4507g 18.4472g = 0.0035 g/ml x Fd = 3.88x10-4 g de clula/ml Tubo N 4 Ps = 15.4929g 15.4872g = 0.0057 g /ml x Fd = 6.33x10-4g de clula/ml Tubo N 5 Ps = 18.6002g 18.5931g = 0.0071 g/ml x Fd = 7.88x10-4g de clula/ml Tubo N 6 Ps = 18.3980g 18.3880g = 0.01 g/ml x Fd = 1.11x10-3g de clula/ml
1 g de cel/ml g de cel/L 0 0
5 7.88x10-4 0.788
6 1.11x10-3 1.11
2. DENSIDAD OPTICA Los resultados de la absorbancia para las concentraciones de 0, 22.2, 44.4, 66.67, 88.89 y 111.1 ppm medidas a una longitud de onda de 540nm fueron los siguientes: Tabla N 6 Tubo 1 2 3 4 5 6 3. CONTEO DIRECTO El conteo de clulas en los cuadros sombreados fue el siguiente para cada tubo 1 4 [ppm] 0 22.2 44.4 66.67 88.89 111.1 Absorbancia 540 nm 0 0.014 0.028 0.053 0.086 0.1220
El factor de conversin a utilizar ser: Clulas/L= (total clulas/5)x25= (cel./0.1mm3)x1000mm3/1cm3= cel./ml x 1000ml/1L= Cel/L*Fd
Tubo N 2 (11 cel/5) x 25 = 55 cel/0.1mm3 (10) = 550cel/mm3 x (1000mm3/1ml) x (1000ml/1L) = 55X107 Cel/L x Fd Tubo N 3 (15cel/5) x 25 = 75 cel/0.1mm3 (10) = 750cel/mm3 x (1000mm3/1ml) x (1000ml/L) = 75x107cel/L x Fd Tubo N 4 (36 cel/5) x 25 = 180 cel/0.1mm3 (10) =1800cel/ml x (1000mm3/1ml) x (1000ml/L) = 1.8x109cel/L x Fd Tubo N 5 (31 cel/5) x 25 = 175 cel/0.1mm3 (10) = 1750 cel/mm3 x (1000mm3/1ml) x (1000ml/L) = 1.75x109 cel/L x Fd Tubo N 6 (58cel/5) x 25 = 290 cel/0.1mm3 (10) = 2900 cel/mm3 x (1000mm3/1ml) x (1000ml/L) = 2.9x109 cel/L x Fd GRAFICAS
Absorvacia
N cel/mil
G celulas/L vs A r bsorvancia
0 4 ,1 0 2 ,1
Absorvancia
G cel/L r
ANLISIS DE RESULTADOS Las tcnicas mencionadas anteriormente y que estudiamos en el transcurso del laboratorio son tcnicas sencillas de fcil aplicacin, que ofrecen ventajas pero que tambin tienen sus limitaciones pero que una adecuada aplicacin de estas conducen a resultados confiables. De acuerdo con los resultados se puede concluir que la tcnica de peso seco fue el mtodo mas exacto, pues se acerco mas a los datos reales, sin embargo, se observa que en el tubo # 4 y el tubo #6 los g de clula/L fueron mucho mayor a las concentraciones de las diluciones madres (600 y 1000ppm) lo que indica que hubo errores en la aplicacin de la tcnica en cuanto que se sobre manipularon los tubos de ensayos, permitiendo que estos ganaran humedad; tambin se atribuye un margen de error a las mediciones realizadas en la balanza analtica la cual no se pudo calibrar adecuadamente e igual con las mediciones volumtricas realizadas aumentaron el margen de error. Existe sin
embargo la posibilidad de que no se evaporara el agua de la biomasa por completo permitiendo de esta forma que se aumentara el peso. Para el resto de tubos existe la posibilidad de que se volatilizaran componentes de la clula o que igualmente repercutieran los errores de medicin. Los resultados obtenidos a travs de el mtodo de densidad ptica permiten establecerlo como uno de los mas confiables, rpidos y sencillos, sin embargo, las desviaciones que se observan al momento de graficar concentracin de clulas/L Vs absorbancia nos permite inferir que hubo errores leves en la aplicacin de la tcnica en lo que corresponde a mediciones al momento de realizar las diluciones lo que pudo haber limitado el mtodo sin embargo la correlacin de 0.98 es aceptable, e indica que con un mejor manejo de las condiciones optimas de aplicacin la exactitud de los datos puede ser mayor. Con el mtodo de conteo directo se logr hacer una aproximacin del nmero de clulas/L que haba en la muestra en estudio, no obstante se debe mencionar que las principales fuentes de error en la aplicacin de la tcnica obedecen a factores como la falta de habilidad y dominio de la tcnica para realizar el conteo requerido. De igual manera los procedimientos de limpieza u enjuague de la cmara permitieron que los resultados se alteraran en cierto margen. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES A partir del estudio de las tcnicas para medicin de biomasa y los resultados obtenidos a travs de su aplicacin, se puede concluir que: La medicin de biomasa celular es un indicativo del crecimiento celular por lo que es de gran importancia conocer y aplicar correctamente las tcnicas que permiten su realizacin; tcnicas como el peso seco, densidad ptica y conteo directo permiten una aproximacin a la medida real de biomasa, sin embargo son mtodos que requieren del control de ciertos parmetros para su aplicacin y adems del manejo adecuado de la tcnica. Los resultados obtenidos por medio de este laboratorio permite resaltar la exactitud de los resultados obtenidos a travs de la tcnica de peso seco, motivo por el que se ratifica su utilizacin a nivel de laboratorio de igual manera
la rapidez y confiabilidad de la tcnica de densidad ptica respalda su uso para la determinacin de biomasa celular en el rea de biotecnologa; no obstante los principales inconvenientes se presentaron en la aplicacin de conteo directo en cmara de Neubauer debido principalmente a la falta de habilidad en el manejo de la tcnica. Una recomendacin para mejorar la exactitud de las tcnicas es el manejo de las condiciones ptimas bajo las cuales se deben aplicar stas, adems de realizarse un reconocimiento y calibracin previa de los equipos y confiables. e instrumentos a utilizar todo con la finalidad de obtener resultados reproducibles
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1. Consulte y explique otros mtodos utilizados para la medicin de la biomasa microbiana. Absorcin: Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en suspensin, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometra mide la luz dispersada por una solucin de partculas. La turbidimetra mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a travs de la solucin. Con relacin a la longitud de onda y al tamao de la partcula pueden existir tres tipos de dispersin. Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero pueden llevar a resultados errneos. Principalmente, dan informacin sobre el peso seco (contenido macromolecular). Turbidimetra: La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentracin de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao celular del microorganismo. Peso hmedo: Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin. Es una tcnica til para grandes volmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de lquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de clulas bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformacin celular. Para corregir el peso hmedo se determina la
cantidad de lquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugacin, para ello se utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas. Volumen de clulas empacadas y nmero de clulas: El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde diferentes perspectivas y de acuerdo a stas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologas. Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las clulas individuales, esto es iniciar y completar una divisin celular. De esta forma, se considera a los microorganismos como partculas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en el nmero total de partculas bacterianas. Existen dos formas para determinar el nmero total de microorganismos en una muestra:
a) b)
Recuento microscpico de partculas Recuento electrnico de partculas utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa. Para estos recuentos se utilizan generalmente cmaras de recuentos, aunque tambin pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y transparentizadas o teidas con colorantes fluorescentes (Naranja de acridina).
La mayor dificultad del recuento en cmara es obtener reproductibilidad en el llenado de la cmara con lquido. Otra dificultad es la adsorcin de las clulas en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorcin es crtica en el proceso de dilucin de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza inica. Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersin, aunque la mayora de los recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del recuento microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos contados.
Recuento electrnico: Los contadores electrnicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o micelares. Estos instrumentos comunicados constan a travs bsicamente de un de dos compartimientos En ambos pequeo conducto.
compartimientos hay electrodos que miden la resistencia elctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeo y su resistencia es muy alta, la resistencia elctrica de cada compartimiento es independiente. Determinacin de cidos nucleicos: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. Se determina la cantidad existente de un determinado cido nucleico (generalmente DNA) y a partir de este dato se estima la masa de la poblacin. Determinacin de nitrgeno: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. Existen distintas tcnicas para determinar la cantidad de nitrgeno que contiene una muestra con relacin al compuesto que se quiera determinar. Puede analizarse el nitrgeno no proteico mediante el NO2-, NO3-, NH4+, el nitrgeno proteico mediante absorcin en UV, Reaccin de Biuret, Reaccin de Lowry, o el nitrgeno total mediante la Digestin de Kjeldahl. Incorporacin de precursores radiactivos: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. En esta tcnica se adiciona al medio un compuesto marcado radiactivamente que puede ser incorporado a la clula, y luego se determina la cantidad de marca incorporada por toda la poblacin.
2. Qu son los colorantes supravitales? Los colorantes supravitales son sustancias que colorean las partes internas de las clulas sin necesidad de ser destruida, por lo general estos son compuestos de color intenso que permite un resalte envidiable facilitando el conteo. Son varios, como el azul de cresilo, violeta cristal, azul de Prusia, verde Jano entre otros 3. Establecer un comparativo entre las tres tcnicas estudiadas Tcnica Densidad ptica Ventajas Es rpida, precisa y verstil fcil de usar y eficiente en costo. Exacto en condiciones optimas de aplicacin de esta tcnica. Desventajas Se limita cuando se tienen en el medio de fermentacin otros slidos en suspensin. No diferencia clulas viables de clulas muertas.
Peso seco
Esta tcnica es til para grandes volmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos. Representan el peso de un gran nmero de bacterias Es econmico y fcil de aplicar
Es limitado para concentraciones muy elevadas de clulas en el medio de fermentacin Componentes voltiles de la clula pueden perderse por el secado puede existir alguna degradacin de la estructura celular y/o componentes celulares. la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta. Se limita para clulas difciles de centrifugar Requiere de mucho tiempo en comparacin con los otros mtodos
permite observar directamente la morfologa y tamao de las clulas estudiadas. Indica condiciones subptimas de crecimiento o presencia de un genotipo o fenotipo alterados utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de biotecnologa
Algunas clulas por su tamao no se pueden contar Se requiere tiempo y habilidad No es eficiente en suspensiones poco densas. Una dificultad es obtener reproductibilidad en el llenado de la cmara con lquido. Se presenta la adsorcin de las clulas en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas.
BIBLIOGRAFIA www.monografias.com AURELIO HERNNDEZ MUOZ, "MICROBIOLOGA", EDITORIAL PARANINFO, MADRID, 1997. http://www.microbiologa.com http://www.geocities.com STAINER, R. MICROBIOLOGA. BARCELONA: ED REVERT S.A. http://www.monografias.com/trabajos10/10cincrec/10cincrec.shtml? relacionados http://www.uamenlinea.uam.mx/materiales/licenciatura/diversos/AQUIAH UATL_RAMOS_MARIA_DE_LOS_ANGELES_Manual_de_practicas_de. pdf