MICROSCPIO PTICO DE CAMPO CLARO

O microscpio um instrumento utilizado para observar pormenores de objectos ou objectos muito pequenos, colocados a uma distncia inferior distncia mnima de viso distinta, permitindo a observao de estruturas com dimenses inferiores s do limite de resoluo do olho humano. O microscpio ptico um microscpio composto, por ser constitudo por dois sistemas de lentes, objectivas e oculares, que, em conjunto, permitem obter uma imagem ampliada do objecto. Para a observao microscpica ser possvel, um feixe de luz emitido por uma lmpada situada na base do microscpio tem de atravessar o objecto (iluminao transmitida) e chegar aos nossos olhos, depois de passar pelas lentes do microscpio. Os objectos destinados observao microscpica so preparados a fim de se tornarem transparentes, se no o forem naturalmente. A luz que atravessa o objecto chamada luz transmitida. A capacidade para ver o objecto designa-se por visibilidade e depende do contraste que o objecto apresenta. Entende-se por contraste a diferena relativa de intensidade luminosa ou de cor entre o objecto e o meio que o rodeia. Por outro lado, os objectos so visveis quando: - So naturalmente corados (cloroplastos, por ex.) - So corados artificialmente - So incolores, mas tm ndices de refraco significativamente diferentes dos do meio no qual esto montados. Para poderem ser observados, os objectos tm de ser montados entre uma lmina e uma lamela, existindo entre estas um meio de montagem (gua ou outro) que elimina diferenas de ndice de refraco entre o objecto e os vidros da lmina e da lamela. O conjunto formado pela lmina, objecto e lamela constitui a preparao microscpica. Para manusear a preparao microscpica pega-se pelas arestas, entre os dedos polegar e indicador, evitando colocar os dedos sobre as superfcies da lmina. Componentes do microscpio ptico (Fig. 1): Sistema mecnico (suporte ou estativo) a) P ou base - Placa rectangular e pesada que assenta sobre a mesa de trabalho, dando estabilidade ao conjunto. Inclui tambm um encaixe para o suporte da lmpada.

b) Brao - Haste em parte vertical e em parte oblqua fixada base, que suporta as restantes partes do microscpio atravs de dois sistemas cremalheira-parafuso, os quais permitem o movimento vertical da platina.

Fig. 1 - Constituio do microscpio ptico de fundo claro. c) Tubo ou canho - Serve de suporte ao sistema de amplificao. Compreende duas partes: uma vertical e outra inclinada. A parte superior, inclinada, um tubo binocular, tendo dois tubos portaoculares regulveis lateralmente, dos quais o da esquerda regulvel tambm em altura. Este ltimo

dispositivo de correco permite compensar as desigualdades do poder visual dos dois olhos (anisometropia). A regulao lateral permite ajustar a distncia entre as oculares distncia interpupilar do observador, que pode variar entre 55 e 75 mm. O tubo binocular pode ainda ser rodado e fixado na posio desejada por meio de um parafuso. d) Suporte do condensador, do diafragma e do porta-filtros - Est fixo base inferior do suporte da platina. e) Botes de comando dos movimentos: parafusos macromtrico e micromtrico e parafuso de deslocao vertical do condensador. So botes bilaterais que controlam as deslocaes verticais da platina e do condensador. Os que comandam os movimentos da platina so de dois tipos: - Botes de comando do parafuso de focagem rpida (parafuso macromtrico ou de grandes deslocaes) - permitem movimentos verticais de grande amplitude. - Botes de comando do parafuso de focagem lenta (parafuso micromtrico) - permitem movimentos verticais de pequena amplitude, apenas para correco da focagem. f) Botes de controlo da sobreplatina- Servem para deslocar a preparao sobre a platina e colocar o objecto no centro do campo visual. g) Revlver - Pea que suporta as objectivas e que roda de modo a colocar a objectiva desejada no prolongamento do tubo do microscpio. h) Platina - Placa onde se coloca a preparao, com a lamela voltada para cima, tendo no centro uma abertura para deixar passar a luz. i) Pina da sobreplatina - Serve para imobilizar a preparao. j) Interruptor - Boto onde se liga e desliga o microscpio. Sistema ptico A - Sistema de iluminao Fornece, orienta e regula a quantidade de luz que atravessa o objecto (luz transmitida) e que, atravs do sistema de ampliao, chega ao observador.

k) Fonte luminosa - Lmpada de incandescncia de baixa voltagem situada na base do microscpio, que fornece o feixe de raios luminosos. Em alguns modelos de microscpios, a abertura deste feixe pode ser regulada por um diafragma de campo, colocado sobre a fonte luminosa. m) Filtro de luz - A qualidade da imagem pode ser melhorada com o uso de filtros corados, que determinam a composio espectral da luz usada. Os filtros absorvem certas radiaes, conforme a sua cor e espessura. Nos microscpios de luz artificial usado um filtro azul que absorve o excesso de radiao amarela emitida pela lmpada, o que nos permite obter luz branca. Alm disso, o filtro absorve o excesso de calor e de brilho e, por absorver as radiaes visveis de maior comprimento de onda (vermelho e amarelo), contribui para aumentar o poder de resoluo do microscpio. n) Diafragma do condensador (diafragma-ris) - Regula a abertura do feixe luminoso que, vindo do condensador, atinge a objectiva. o) Condensador - Sistema constitudo por duas lentes, que fornece objectiva um cone de luz uniforme, cuja abertura regulada pelo diafragma de abertura. O condensador diz-se aplantico por estar corrigido em relao aberrao esfrica (ver adiante). Esta correco importante para que o condensador possa fornecer objectiva um cone de luz uniforme. Concentra os raios luminosos na preparao, fornecendo raios oblquos e raios directos, aumentando, assim, o poder de resoluo da objectiva. B - Sistema de ampliao constitudo por lentes objectivas e oculares, integradas num sistema ptico centrado, isto , com um eixo ptico comum a todas as lentes (e comum tambm ao eixo ptico do condensador). p) Objectivas (lente frontal + lentes correctoras) q) Oculares (lente ocular + lente de campo)

OBJECTIVAS

Uma objectiva (Fig. 2) uma associao de lentes, situada na extremidade do tubo mais prxima do objecto. Recebe a luz vinda do objecto e fornece uma imagem (imagem intermediria) ampliada, invertida e real desse objecto. Esta imagem ser ainda ampliada pelas oculares.

Nas objectivas existem diferentes tipos de lentes. A que se encontra mais prxima do objecto chamada lente frontal. Desta depende a ampliao dada pela objectiva. As restantes lentes so chamadas lentes correctoras, destinadas a melhorar a qualidade da imagem. Em geral, o dimetro da lente frontal das objectivas varia na razo inversa do respectivo poder de ampliao.

Fig. 2 - Objectivas. Poder de ampliao

a capacidade de fornecer uma imagem ampliada do objecto. Geralmente, toma-se esta faculdade na acepo da sua expresso numrica, a ampliao.

Ampliao

Corresponde ao nmero de vezes que a imagem aparece maior do que o objecto. Varia na razo directa do comprimento da objectiva e na razo inversa do dimetro da lente frontal. Normalmente, as objectivas tm ampliaes de 4x, 10x, 40x e 100x, podendo tambm ter uma ampliao de 25x.

Focar

Operao de regulao da distncia entre o objecto e a objectiva, de modo a ser obtida uma imagem ntida. Para focar so utilizados os parafusos macromtrico e micromtrico.

ngulo de abertura

ngulo formado pelos raios luminosos marginais que delimitam o cone de luz que atinge a lente frontal da objectiva (Fig. 3). O ngulo de abertura no uma constante da objectiva, pois varia com

o ndice de refraco do meio existente entre o objecto e a lente da objectiva. Este ngulo aumenta com o grau de ampliao da objectiva porque, quanto maior a ampliao, mais largo tem de ser o cone de luz que penetra na lente frontal, uma vez que a luminosidade das objectivas varia inversamente sua ampliao. Este cone de luz regulado pela abertura do diafragma do condensador. Por outro lado, quanto mais pequena for a abertura do condensador, maior ser o contraste entre os elementos que compem a imagem, pelo que ser necessrio chegar a um compromisso de equilbrio entre a luminosidade e o contraste.

Fig. 3 - ngulo de abertura.

Abertura numrica

Notao caracterstica da objectiva, que relaciona o ngulo de abertura com o ndice de refraco do meio situado entre o objecto e a lente frontal da objectiva. igual ao produto do ndice de refraco (n) do meio entre o objecto e a lente frontal da objectiva pelo seno do semi-ngulo de abertura (sen):

AN = n . sen

Atribui-se, por conveno, o valor 1 para o ndice de refraco do ar. Os outros meios so opticamente mais densos, apresentando maior resistncia transmisso da luz.

ndices de refraco Ar ..................... 1.00 gua ................. 1.33 leo de cedro .... 1.51 Vidro ................ 1.51

Como o valor de sempre inferior a 90, o valor do seno de sempre inferior a 1. Assim, quando o meio entre o objecto e a lente frontal da objectiva o ar (n = 1), o que acontece nas objectivas a seco (4x, 10x e 40x), a abertura numrica sempre inferior a 1, sendo igual a sen. Quando se utiliza leo de cedro (n = 1.51) entre a preparao e a objectiva, o que necessrio para a observao com a objectiva de imerso (100x), a abertura numrica superior a 1.

Abertura numrica das objectivas Objectiva de 4x .............. 0.10 Objectiva de 10x ............ 0.25 Objectiva de 40x ............ 0.65 Objectiva de 100x .......... 1.25

Da abertura numrica de uma objectiva dependem a sua luminosidade e a sua resoluo e, deste modo, a qualidade da imagem.

Luminosidade

Faculdade de deixar passar mais ou menos luz. A luminosidade de uma objectiva varia na razo inversa da sua ampliao. Por este motivo, necessrio fornecer maior quantidade de luz quando se utilizam objectivas de maior ampliao.

Poder de resoluo

Faculdade de formar imagens distintas de dois pontos adjacentes. Geralmente, esta faculdade expressa pelo seu valor numrico, o limite de resoluo.

Limite de resoluo

Distncia linear mnima entre dois pontos adjacentes, dos quais o microscpio d imagens distintas. o dimetro aparente da mais pequena partcula visvel. O microscpio ptico permite distinguir dois pontos que estejam afastados um do outro por uma distncia igual a 0.2 - 0.3 m. Para distncias inferiores, no possvel definir esses dois pontos, sendo, ento, observados como um ponto nico. Assim, o limite de resoluo do microscpio ptico est entre 0.2 e 0.3 m. O limite de resoluo do olho humano, distncia de 25 cm, de 100 a 300 m (0.1 a 0.3 mm). podemos, por isso, dizer que o microscpio ptico tem um poder de resoluo 500 vezes superior ao da viso humana. O limite de resoluo (LR), depende do comprimento de onda da luz () e da abertura numrica (AN) da lente objectiva utilizada, de acordo com a seguinte expresso:

LR = 0.61 / AN

Se o valor deste quociente for muito baixo, podemos distinguir dois pontos que estejam muito prximos um do outro. Assim, quanto menor for o limite de resoluo, maior o poder de resoluo. O limite de resoluo de uma objectiva varia na razo inversa da sua abertura numrica. Para que o condensador tenha uma abertura numrica superior a 1, necessrio colocar uma gota de leo de cedro (leo de imerso) entre a sua lente frontal e a preparao. Para se obter um valor mnimo da expresso anterior, utiliza-se luz de baixo comprimento de onda (luz azul) e uma abertura numrica elevada (com a objectiva de imerso). Deste modo, obtm-se o mximo poder de resoluo. Para o clculo genrico deste valor, considera-se o comprimento de onda da luz verde (0.55 m) e a abertura numrica do condensador igual da objectiva utilizada.

Limite de resoluo das objectivas Objectiva de 4x .............. 3.36 Objectiva de 10x ............ 1.34 Objectiva de 40x ............ 0.52 Objectiva de 100x .......... 0.27

Poder penetrador

Permite obter imagens bem focadas de pontos situados em diferentes planos da preparao. Esta capacidade diminui com o aumento da ampliao.

Objectivas a seco

So as que utilizam ar como meio ptico entre a lente frontal e a preparao (objectivas de 4x, 10x e 40x). A objectiva de 40x possui um dispositivo com uma mola (montagem telescpica), que protege a lente contra possveis choques. Esta objectiva est calibrada para a observao de preparaes com lamela de espessura de 0.17 mm. As restantes objectivas no so sensveis presena de lamela.

Objectiva de imerso (objectiva de 100x)

Necessita de leo de cedro entre a lente e a preparao. A imerso diz-se homognea se for utilizado leo de cedro, por esta substncia ter um ndice de refraco igual ao do vidro. Da a notao HI (imerso homognea) presente na objectiva. A imerso aumenta a abertura numrica e o poder de resoluo. Com a imerso homognea so eliminadas as perdas de luz que ocorrem quando os raios luminosos passam de um meio opticamente mais denso (nvidro = 1.51) para um meio opticamente menos denso (nar = 1). Deste modo, a objectiva recebe mais raios de luz do que receberia sem imerso. Esta objectiva tem um dispositivo de proteco igual ao da objectiva de 40x. Por necessitar de uma imerso homognea, a lente de 100x no sensvel presena de lamela.

Objectivas para-focais

Aquelas em que, estando a imagem visvel para uma certa objectiva, permanece visvel para a seguinte, bastando um pequeno movimento do parafuso micromtrico para que esta fique correctamente focada.

Notaes das objectivas

Ampliao ..................................................... 4x

10x

40x 0.65 0.17

100x 1.25

Abertura numrica ......................................... 0.10 0.25 Correco para lamela ................................... Imerso homognea .......................................

HI

Aberraes

A nitidez da imagem produzida por meios pticos prejudicada pelos defeitos inerentes s lentes, as aberraes. As objectivas tm dois tipos de aberraes:

Aberrao esfrica - A esfericidade da lente determina a existncia de vrios focos para os raios luminosos que nela incidem. Os que incidem na margem da lente so mais fortemente desviados do que os centrais, o que resulta numa distoro da imagem.

Aberrao cromtica - Resulta da decomposio da luz em virtude da desigual refraco sofrida pelas radiaes de diferentes cores. Havendo um foco para cada cor, a imagem fica irisada.

Objectivas acromticas e aplanticas

As aberraes cromtica e esfrica podem ser corrigidas atravs da associao de lentes correctoras, dizendo-se, neste caso, que as objectivas so acromticas e aplanticas.

Curvatura de campo

Traduz-se pela falta de nitidez da parte marginal do objecto quando o centro est focado e vice versa. A curvatura de campo provoca um defeito de focagem em relao a todas as partes do objecto fora do eixo ptico.

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OCULARES

Uma ocular (Fig. 4) uma associao de lentes, colocada na extremidade do tubo mais prxima do observador. Tem a funo de ampliar a imagem intermediria dada pela objectiva e desta fornecer uma imagem virtual, ampliada e direita. A ampliao final dada pelo microscpio o produto das ampliaes parciais da objectiva e da ocular utilizada.

Fig. 4 - Ocular.

Oculares de Huyghens

So constitudas por duas lentes plano-convexas, ambas com a face plana voltada para o observador. A lente ocular a que se encontra mais prxima do observador e a responsvel pela ampliao dada pela ocular. A outra designada por lente colectora ou lente de campo e tem como funo conduzir a imagem formada pela objectiva ao plano focal da lente ocular. Entre as duas lentes existe um diafragma que limita o dimetro do campo ptico. O comprimento das oculares varia na razo inversa da sua ampliao. O facto de se substituir uma ocular por outra de maior ampliao no aumenta o poder de resoluo do microscpio, apenas fornece uma maior ampliao da imagem j resolvida pela objectiva. A utilizao de oculares de grande ampliao tem como consequncia uma diminuio da nitidez. Por outro lado, uma ocular com uma ampliao demasiado baixa no permite distinguir pormenores da imagem dada pela objectiva.

Campo ptico ou campo visual

Superfcie iluminada, na qual est a imagem do objecto. O seu dimetro pode ser calculado com a ajuda de uma escala graduada. A partir do dimetro possvel calcular a rea do campo ptico.

Construo da imagem e suas qualidades As lentes utilizadas no microscpio so convergentes. Quando um feixe de raios luminosos paralelos incide perpendicularmente numa lente convergente, esses raios vo convergir para um ponto chamado foco (F) (Fig. 5).

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Nas lentes existe um ponto chamado centro ptico (CO) (Fig. 5). Qualquer raio luminoso que passe por este ponto no sofre desvio de trajectria. A recta que passa pelos focos e pelo centro ptico o eixo ptico (EO) (Fig. 5). Todos os pontos situados no eixo ptico tm a sua imagem sobre o prprio eixo. Fig. 5 - Lente convergente.

Para determinarmos a imagem de um ponto, basta traar dois raios luminosos: um, que passa pelo centro ptico e que, por isso, no sofre desvio; outro, paralelo ao eixo ptico, que se refracta, passando pelo foco. No ponto onde os dois raios se cruzam temos a imagem do ponto que utilizmos como objecto. Aplicando estes princpios ao microscpio, obtemos o esquema da Fig. 6.

Fig. 6 - Construo da imagem.

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A imagem dada pela objectiva (imagem intermediria) uma imagem real (pode ser projectada num alvo), ampliada e invertida em relao ao objecto. Como esta imagem se projecta entre o foco e o centro ptico da lente ocular, ao traarmos a imagem dada pela lente ocular, verificamos que os raios luminosos no se cruzam. Neste caso, para encontrarmos a imagem dada pela ocular traamos o prolongamento dos raios no sentido contrrio (a tracejado na Fig. 6). A imagem final assim obtida virtual, isto , no pode ser projectada num alvo, formando-se apenas na retina, quando os olhos se aproximam das oculares. tambm uma imagem ampliada e invertida em relao ao objecto. A imagem final dada pelo microscpio virtual, ampliada e direita em relao imagem intermediria (Fig. 6).

Regras para a observao microscpica

Posio do microscpio - Em frente do observador.

Posio do observador - Sentado de forma a manter uma posio confortvel para a observao ao microscpio. Os olhos devem estar colocados prximos das oculares. Uma mo comanda os parafusos macromtrico e micromtrico e a outra comanda os parafusos de deslocao da sobreplatina. Quando se atinge a posio desejada, uma das mos pode ficar livre para desenhar ou escrever, com o caderno encostado base do microscpio.

Posio da preparao microscpica - Apoiada sobre a platina e imobilizada pela pina da sobreplatina, sempre com a lamela voltada para cima. O objecto dever estar no centro da abertura da platina, posio que se obtm movendo os parafusos de deslocao da sobreplatina.

Modo de focar o microscpio - Respeitando as regras anteriores, o observador deve executar os seguintes passos: - Ajustar o condensador para a posio mais elevada. - Abrir o diafragma. - Colocar inicialmente sempre a objectiva de menor ampliao, certificando-se de que est correctamente alinhada no prolongamento do tubo (ouve-se um estalido). - Regular a distncia interpupilar. - Fazer subir a platina com a ajuda do parafuso macromtrico, observando pelas oculares at que surja uma imagem visvel.

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- Focar com o parafuso micromtrico, observando pela ocular direita um pormenor da preparao, mantendo o olho esquerdo fechado. - Fechar agora o olho direito e observar pela ocular esquerda. - Sem mexer na platina, rodar o anel de regulao do tubo porta-ocular esquerdo at obter uma imagem focada, to ntida como a observada pela ocular direita. Ao abrir os dois olhos simultaneamente, a imagem estar focada.

Modo de explorar uma preparao - A explorao poder ser feita de um modo ordenado, tal como exemplificado na Fig. 7.

Fig. 7 - Modo de explorar uma preparao.

Modo de registar a localizao de um objecto na preparao - A sobreplatina constituda por duas escalas perpendiculares e respectivos nnios, que permitem indicar a posio do objecto colocado no centro do campo ptico, atravs do registo do ponto de encontro das leituras das duas escalas.

Mudana de objectiva - Rodar o revlver at colocar a objectiva seguinte em posio de observao, exactamente no prolongamento do tubo. Note-se que as objectivas so para-focais: pode-se mudar de uma objectiva para a seguinte sem necessidade de mover o parafuso macromtrico, bastando ajustar a focagem com o parafuso micromtrico. necessrio ainda ajustar a posio do diafragma objectiva utilizada: uma objectiva de maior ampliao obriga a maior abertura do diafragma.

Utilizao da objectiva de imerso - Depois de utilizar a objectiva a seco de maior ampliao, executar os seguintes passos: - Rodar o revlver, deixando-o numa posio intermdia entre a objectiva de imerso e a anterior.

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- Colocar uma gota de leo de cedro sobre a lamela, sem retirar a preparao da platina. - Rodar o revlver de modo a colocar a objectiva de imerso no prolongamento do tubo. - Observar pelas oculares e ajustar a focagem. - Terminada a observao, colocar a objectiva de menor ampliao. - Descer a platina, se for necessrio. - Limpar a objectiva de imerso e a preparao com um pano macio e humedecido numa mistura de ter e lcool.

Cuidados a ter com o microscpio

- No tocar com os dedos nas lentes frontais nem oculares. - Evitar que as objectivas toquem nas preparaes. - No utilizar a objectiva de imerso sem adicionar leo de cedro. - Limpar as lentes com um pano ou um papel macio, em delicados movimentos circulares. - No desmontar as objectivas nem as oculares. - No retirar as objectivas dos seus encaixes no revlver. - No forar os parafusos de deslocamento.

Recomendaes a seguir depois da sua utilizao

- Colocar a objectiva de menor ampliao. - Descer a platina, se for necessrio. - Limpar a objectiva de imerso e a preparao, retirando o leo de cedro com um pano macio e um pouco de ter e lcool, tendo o cuidado de no deixar vestgios deste, uma vez que pode descolar as lentes.

Fotomicrografia

possvel captar a imagem intermediria do microscpio (imagem real), introduzindo no seu eixo ptico uma cmara fotogrfica ou de vdeo. As fotografias tiradas tm uma ampliao igual ampliao da objectiva utilizada, uma vez que a ocular no interfere.

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