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Olga Redondo Gonzlez MIR 3 Anlisis Clnicos Hospital Universitario de Guadalajara, 25 abril 2007
Conceptos bsicos: estructura del DNA Tipo de muestra Obtencin de la muestra Caractersticas de la muestra: Pureza/ Concentracin Amplificacin de fragmentos de DNA mediante Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) Anlisis e identificacin de fragmentos:
Electroforesis Enzimas de Restriccin Hibridacin Secuenciacin
Objetivos
1975-77 Sanger y Barrell y Maxam y Gilbert. Mtodos rpidos de secuenciacin del DNA 1985 Mullis y cols. PCR Mullis y cols. PCR
En 1953, James Watson y Francis Crick propusieron el modelo de la doble hlice para la estructura del DNA, basados en los resultados de los rayos X de Franklin y Wilkins.
La Real Academia de las Ciencias de Suecia concede el Premio Nobel en Qumica 1993, a Kary B. Mullis, USA, por su invento del mtodo de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR).
0.34 nm (2-desoxiD-rribosa)
3.4 nm
Tipo de muestra
Caractersticas de la muestra: DNA = huella gentica
1 mg de DNA = 150.000 clulas 6.6 pg de DNA/clula
ESTABILIDAD MUTABILIDAD
Evolucin especies Patologas
De dnde se obtiene la muestra? De cualquier tipo de clula nucleada: Sangre Tejidos Clulas bucales Races de pelo Semen Vellosidades coriales Lquidos biolgicos
Obtencin de la muestra
Sangre + Solucin hipotnica Tejido + Homogeneizador + 300 l Buffer de Extraccin (SDS al PELLET 10% P/V) + 15 l Proteinasa K
Incubar 1 hora a 55C Inactivar 10a 98C
Fase Acuosa
Fase Orgnica
Caractersticas de la muestra
Concentracin:
Espectrofotometra
1 Unidad de Absorbancia a 260 nm = 50 g/ml de doble hebra de DNA 40 g/ml de hebra sencilla de DNA o RNA.
[ DNA ] = A 260 * 50g * dilucin
Fluorometra
Pureza:
2.2 A260/ A280 1.8
T (C) 100
Ciclo 1
Desnaturalizacin 95C
Ciclo 2
Ciclo 3
Programa de PCR
Sntesis 70C
80
Segundo ciclo
Tercer ciclo
Termociclador
n=20-50 ciclos
Electroforesis Electroforesis
Enzimas de restriccin
Hibridacin
Secuenciacin
Electroforesis (EF)
cidos nucleicos: molculas polianinicas uniformemente cargadas que pueden migrar en un campo elctrico. Geles:
poliacrilamida fragmentos < 500 pb; agarosa (fragmentos 200 pb-50Kb). EF en gel de campo pulsante (agarosa al 1%).
Visualizacin: colorante bromuro de etidio, marcaje radiactivo (32P). Identificacin fragmentos de DNA por tamao:
Virus/ bacterias Deleciones
700-800 pb 400-500 pb
Transiluminador
Electroforesis
Hibridacin
Secuenciacin
Enzimas de restriccin
In vivo
Reconocen y cortan el DNA de doble hlice en sitios especficos (secuencias de reconocimiento) endonucleasas. Origen bacteriano: supervivencia a lisis por fagos (no existente en eucariotas).
In vitro
Extremos cohesivos 5
Extremos cohesivos 3
Extremos romos
M1 DNA normal
400 pb
-ACCATG-TGGTAC-
100 pb
300 pb
400 pb
400 pb 300 pb
WM
M1
M2
100 pb
Electroforesis
Enzimas de restriccin
Hibridacin Hibridacin
Secuenciacin
Hibridacin molecular
Fundamento: Apareamiento de dos secuencias
nucleotdicas por complementariedad de bases C-G y A-T
Utilidad:
Deteccin:
Radioactiva (32P) Fluorescente (fluorocromo) Quimioluminiscente (luminol)
Electroforesis
Enzimas de restriccin
Hibridacin
Secuenciacin Secuenciacin
Electroforesis
Enzimas de restriccin
Hibridacin
Secuenciacin
Lo logramos Crick!!! Cmo te parece que nos qued el modelo del ADN? En 1962, Watson, Crick y Wilkins, recibieron el Premio Nobel por su descubrimiento
Elemental mi querido Watson, elemental!! Nos qued como una doble hlice!!!