MICROBIOLOGIA APLICADA Manual de Laboratorio

PRACTICA Nm. 4 TINCION DIFERENCIAL DE GRAM

I. OBJETIVO Distinguir las bacterias Gram positivas de las Gram negativas.

II. INTRODUCCION La tcnica de coloracin de Gram es de gran utilidad en Bacteriologa, ya que permite diferenciar las bacterias en Gram Positivas y Gram Negativas. Casi la mitad de las bacterias, son Gram positivas y el resto Gram negativas. El mtodo fue descubierto por Christian Gram (Dans), en 1884, quien observ que en cortes histolgicos que contenan bacterias coloreadas con violeta de genciana y tratadas con solucin acuosa de yodo, este colorante podra ser removido del corte histolgico con el empleo de alcohol, pero no de las bacterias. Posteriormente descubri que no todas las bacterias retenan al violeta de genciana sino que algunas eran decoloradas por accin del alcohol. A las primeras las llam Gram positivas y a las segundas Gram negativas. Estas que quedan incoloras son teidas luego mediante el empleo de un colorante de contraste como la safranina, para hacer posible su observacin. Existen muchas modificaciones de esta coloracin, pero fundamentalmente es lo mismo.

III. MATERIAL Y SUBSTANCIAS Gradilla. Portaobjetos. Asa bacteriolgica. Mechero Bunsen. Cerillos encendedor. Lpiz graso. Papel absorbente. Hisopos. Microscopio.

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Aceite de inmersin. Cristal violeta. Lugol. Alcohol al 95%. Safranina. Cultivos bacterianos: A, B y C.

IV. TECNICA 1. Preparar 3 extensiones (frotis) en la forma ya indicada. 2. Cubrir la extensin con cristal violeta y dejar actuar durante un minuto. 3. Lavar con agua corriente, cuidando que no se arrastre la preparacin y sacudir para eliminar el exceso de agua. 4. Cubrir la extensin con solucin de lugol y dejar actuar por un minuto. 5. Lavar con agua corriente. 6. Decolorar con alcohol al 95 96%, aproximadamente 10 segundos hasta observar el alcohol transparente. 7. Lavar con agua corriente. 8. Cubrir la extensin con Safranina y dejar actuar por 1 minuto. 9. Lavar con agua corriente. 10. Secar la preparacin al aire o colocndola entre papel absorbente. 11. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin y observar al microscopio con objetivo de inmersin.

INTERPRETACION: Las bacterias Gram positivas retienen el cristal violeta y se teirn en azul morado. Las Gram negativas se tien en rojo rosa.

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12. Dibujar lo observado:

Cultivo A.

Cultivo B.

Cultivo C.

V. CUESTIONARIO 1. Cul es el fundamento de la Tincin Diferencial de Gram? 2. Cul es la funcin que desempea el Lugol en esta coloracin? 3. Escribir el nombre cientfico (Gnero y especie), de 5 bacterias Gram positivas y 5 Gram negativas. 4. Consultar la tcnica de otra tincin diferencial. 5. Explicar: Por qu algunos microorganismos Gram positivos en un cultivo joven pueden volverse Gram negativos cuando ste envejece?

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