Caracterizacin de los buffer fosfatos utilizados en la preparacin de solucin de hemoglobina (Hb) a pH controlado

A. A. Fernndez G., J. E. Falcn D., G. del Toro G., A. R. Pozo D. Centro de Biofsica Mdica, Universidad de Oriente

Resumen
En el estudio in vitro de determinadas enfermedades hematolgicas, en especial la Anemia Drepanoctica (AD), se necesita obtener soluciones de hemoglobina (Hb) en condiciones semejantes a las fisiolgicas. Una metodologa muy utilizada es el lavado de los glbulos rojos con solucin buffer con el objetivo de aislarlos del resto de los constituyentes de la sangre, proporcionarle un pH constante dentro del rango fisiolgico y, una vez provocada la hemlisis, obtener la solucin de Hb en las condiciones deseadas. En este trabajo se compara tres de los buffer biolgicos ms utilizados reportados en la literatura (PBS, PBP y BSKG), obtenindose caractersticas qumicas tales como el pK, el intervalo de efecto buffer, la influencia de la temperatura sobre el pH, su estabilidad en el tiempo, as como el efecto de los mismos sobre el sistema biolgico, dado por el grado de hemlisis que provocan y el nmero de lavados necesarios para imprimir a la solucin de hemoglobina el pH deseado. Los resultados del estudio mostraron que los tres buffer pueden ser utilizados en el lavado de los glbulos rojos, reportndose al buffer fosfato salino (PBS) como el de mejores condiciones, ya que provoca el menor grado de hemlisis y la menor variacin del pH con la temperatura, que permite que en el rango de 5 a 40 C su pH se mantenga dentro del rango de variaciones permitidas por el organismo, que cambia de 7,35 a 7,45.

Abstract
In the in vitro study of determined hematological illnesses, especially the Sickle Cell Disease (SCD), itis needed to get (Hb) hemoglobin solutions in similar conditions to the physiologicones. A very used methodology is the washing of the red cells with buffer solution to isolate them of the remainder of the blood constituents, to proportion a constant pH within the physiologic range and once that the hemolysis is provoked, to get the (Hb) hemoglobin solution in the desired conditions. In this work three of the most used biological buffers are compared (PBS, PBP and BSKG), showing chemistry properties like the pK, the buffer effect interval, the influence of the temperature on pH, their stability in the time, as well as the effect on the biological system, considering the grade of hemolysis that they provoke and the number of washings necessary in order to obtain the hemoglobin solution with the desired pH. The results of the study showed that the three buffers can be used in the red cells washing, reporting the phosphate buffer saline (PBS) as the one of the best conditions, since it provokes the least grade of hemolysis and the least variation of the pH with the temperature, that permits that in the range from 5 to 40 C its pH stays within the range of variations permitted by the organism that varies from 7,35 to 7,45.

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Introduccin
La Anemia Drepanoctica (AD), se considera un problema de salud pblica y social en Cuba, donde el 3,1 % de la poblacin general porta el gen de la HbS. Se distribuye principalmente en Ciudad de la Habana, Santiago de Cuba y Guantnamo /1, 2/. Se trata de una anemia hemoltica congnita de causa intracorpuscular, caracterizada por la presencia en la sangre de numerosos hemates en forma de hoz o semiluna (drepanocitos), ms rgidos y menos flexibles que los de un individuo normal, la cual se transmite con carcter autosmico recesivo y evoluciona con dolores reumatoides, osteoarticulares, lceras en las piernas y crisis hemolticas con perodos de bienestar intercalados /3/. Su causa es la presencia de la Hemoglobina S (HbS), una Hb mutante que presenta un intercambio de aminocidos en su estructura proteica, y en su estado desoxigenado polimeriza en el interior de la clula para formar un gel extremadamente viscoso causante de la falciformacin de la misma /4-6/. La polimerizacin de la HbS que constituye el evento fisiopatolgico primario de la AD puede ser estudiada por diversos mtodos fsico-qumicos /6, 7/ siendo necesaria la obtencin de solucin de HbS a partir de los glbulos rojos. En el Centro de Biofsica Mdica (CBM) se ha desarrollado una metodologa para el estudio del proceso de polimerizacin por Resonancia Magntica Nuclear (RMN) /8/, y un factor importante es la preparacin de la muestra biolgica (solucin de HbS). En el procedimiento de obtencin de la muestra para su estudio por RMN, es til el uso de soluciones buffer en el lavado del paquete de glbulos rojos, con el objetivo de garantizar un pH constante, semejante al fisiolgico. Prcticamente en todos los procesos biolgicos, al igual que en muchos procesos qumicos, es indispensable un rango de pH determinado. Ejemplo de ello es el flujo sanguneo durante el transporte de oxgeno de los pulmones a los tejidos, donde se conserva un pH muy prximo a 7,4 (pH fisiolgico), permitindose variaciones entre 7,35 y 7,45 /9/. La Hb es un sistema amortiguador importante; transporta oxgeno y dixido de carbono (CO2). Durante la oxigenacin se produce un cambio en la

molcula de Hb de cido dbil a un cido ms fuerte, con lo cual se aade iones hidrgeno al medio, mientras que en la reduccin toma iones hidrgeno (Efecto Bohr)/10/ . En el caso de pacientes con AD, se acenta su importancia, ya que se reporta (Hahn y Gillespie,1927) /5/ que uno de los factores que influyen en el proceso de polimerizacin de la HbS es el pH, de forma tal que a pH alcalinos, la gelificacin es inhibida e incrementada a pH cidos, reportndose en la literatura una dependencia lineal del log del inverso del tiempo de demora (td) contra el pH /11/. En la conservacin del pH de las muestras de sangre total o soluciones de Hb desempea un papel fundamental la solucin buffer, la cual hace resistencia a la variacin de la concentracin de iones hidrgeno cuando se aade lcali o cido, estando constituida casi invariablemente por una mezcla de un cido dbil, o una base, y su sal conjugada. Estas soluciones pueden clasificarse en buffer generales, todos los buffer comnmente utilizados durante los ltimos 75 aos; buffer universales, que presentan una baja capacidad buffer, pero un amplio rango de pH, y buffer biolgicos que presentan un moderado rango de pH, pero que contienen sustancias estables que no provocan reacciones secundarias con el medio /12/. A esta ltima pertenecen los buffer estudiados. Las propiedades de una disolucin buffer pueden representarse cuantitativamente mediante la ecuacin de Henderson-Hasselbach /9, 13, 14/.
pH = pKa + log A HA

(1)

El pH de la disolucin buffer depende del valor de la constante de disociacin del cido dbil y de la relacin entre las concentraciones molares del cido y la base conjugada, la cual casi no cambia al aadir pequeas cantidades de cido o base fuerte. Las soluciones buffer no solamente deben presentar resistencia al variar el pH por la adicin de cido o lcali, sino tambin al efecto de la dilucin, la temperatura o la adicin de sales neutras. Debemos destacar, que el pKa de los buffer depende de la temperatura, de modo que un cambio de esta ltima provoca una variacin de pH en la solucin buffer. El coeficiente variacin del pH con la temperatura puede ser apreciable, por ejemplo, cambiando la temperatura

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de un buffer Tris-HCl de 25 a 37 C, cambia el pH de 8,0 a 7,71. Por esa razn, es importante medir el pH a la temperatura de uso, para corregir la diferencia de temperatura, o usar un buffer de pequeo coeficiente de temperatura /15/. Entre los parmetros que describen las propiedades de una disolucin buffer son de importancia el intervalo de efecto buffer y la capacidad de la disolucin buffer. Para obtener muestras de Hb en condiciones in vitro lo ms semejantes a las in vivo, se requiere un buffer con una composicin fisiolgica que no dae el sistema biolgico, una capacidad buffer adecuada y en el rango de pH en que se trabaja, as como, un moderado efecto de la temperatura sobre el pH, teniendo vital importancia en nuestro caso el proporcionar un pH estable a la solucin de HbS, ya que ste es uno de los factores que influyen en la polimerizacin /5/.

operacin se realiz de manera similar, pero en este caso con NaOH (1 mol/L), obtenindose de la lectura de pH en cada adicin la curva de valoracin de los buffer.

Estabilidad de las soluciones buffer en el tiempo

A las tres soluciones buffer se realiz un minucioso control de pH durante 15 das utilizando el electrodo combinado. Se calibr el pH-metro con tabletas buffer (BDH chemical Ltd Poole England) para el pH indicado (pH 4, 7 y 9,2).

Seguimiento del pH en los lavados

A partir de la sangre venosa heparinizada se prepar un pool o mezcla de sangre de diferentes individuos para lograr un sistema homogneo. Se centrifug a 2 000 r.p.m. durante 10 min; se separ el plasma y se le midi el pH. El paquete de glbulos fue dividido en 6 porciones de 1,5 mL en tubos de centrfuga; se lavaron con solucin buffer (el nmero de veces planteado en cada experimento). Se estudi los valores de pH: 7,0, 7,2 y 7,4. Luego de cada lavado, se midi el pH del sobrenadante extrado; el paquete de clulas se hemoliz utilizando dos muestras para cada pH, una se hemoliz por congelacin y la otra con saponina blanca, y se midi el pH de la solucin de Hb de cada una.

Mtodo experimental
Composicin de los buffer
Buffer Fosfato Salino (PBS): NaCl 124 mmol/L, Na2HPO4 10 mmol/L, y KH2PO4 3 mmol/L. Buffer fosfato de Potasio (PBP): K2HPO43H2O 232 mmol/L, y KH2PO4 67 mmol/L /11/. Buffer Fosfato Salino con potasio y glucosa (BSKG): NaCl 135 mmol/L, KCl 5 mmol/L, NaH2PO4 2 mmol/L, Na2HPO4 8 mmol/L, y glucosa 11 mmol/L /16/.

Estudio de la actividad hemoltica de los buffer /17/

Se calcul el por ciento de hemlisis (2) a partir de la medicin de la absorbancia a = 545 nm (mxima absorbancia de la oxiHb) usando la tcnica espectrofotomtrica. Se prepar un control positivo (CP, Na2CO3 al 0,1 %); un control negativo (CN, PBS pH 7,4), y las correspondientes soluciones de los buffer en estudio [PBS (pH 7,0 y 7,2); BSKG (pH 7,0; 7,2 y 7.4) y PBP (pH 7,0; 7,2 y 7,4)]. Se aadi 0,2 mL de sangre total (ST) a 9,8 mL de cada uno de los controles (CP y CN) y de cada uno de los buffer en estudio. Se agitaron las muestras, se centrifugaron a 2 500 r.p.m. y se midi la absorbancia del sobrenadante. Al CP se le midi la absorbancia directamente, producto de la hemlisis instantnea.
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Estudio de la influencia de la temperatura en pH del buffer

Se utiliz un termostato (precisin de 0,1 C) y un pH-metro (precisin de 0,01) "Pharmacia LKB", adems de un agitador elctrico para homogeneizar la solucin. Se estudi un rango de temperatura de 5 a 40 C en intervalos de 5 C, proporcionando idnticas condiciones experimentales en cada buffer.

Valoracin de las soluciones buffer

Teniendo en cuenta que el pH de los buffer es 7,4, se tom 200 mL de buffer y se valor con HCl (1mol/ L) aadiendo volmenes fijos (100 L en el caso del PBS y el BSKG, y 1000 L en el del PBP). Esta

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Se calcul el % de hemlisis utilizando la ecuacin (2) /17/:

Resultados y discusin
Influencia de la temperatura en el pH del buffer
La dependencia del pH del buffer con la temperatura se muestra en la grfica 1, donde se compara con la reportada en literatura para un buffer fosfato /12/.
PBS PBP BSKG

A( M ) A(CN ) % (Hemlisis) = 100 % A(CP) A(CN )

A(M) - Absorbancia de la muestra. A(CN) - Absorbancia del control negativo. A(CP) - Absorbancia de control positivo
Lite ratura 7.5 5 7 .5 7.4 5 pH 7 .4 7.3 5 7 .3

(2)

278 2 83 2 88 293 298 30 3 30 8 313 3 18 32 3 T em p e ratu ra (K )

Grfico 1: Dependencia del pH con la temperatura para los buffer PBS, PBP, BSKG. Comparacin con el rango de pH fisiolgico.

En los estudios de la polimerizacin de la HbS reportados en la literatura, el rango de temperatura utilizado va desde 4 a 37 C, teniendo en cuenta que el pH fisiolgico oscila entre 7,35 y 7,45. Observamos que el pH del PBP y el BSKG a valores de temperatura menores de 12 C y mayores de 40 C; en el caso del BSKG se alejan del lmite de pH fisiolgico, a diferencia del PBS que presenta una variacin menor que permite que en el rango de temperatura analizado su pH se mantenga dentro de las variaciones permitidas por el organismo. Este resultado es muy importante, ya que se ha reportado que a valores menores de 10 C, la polimerizacin de la HbS se detiene y retarda, por lo que muchos autores realizan la preparacin inicial de las muestras a 4 C. Profundizando en la dependencia de la temperatura, se realiz un ajuste a un polinomio de orden 4, lo que permiti evaluar la variacin del pH de los buffer a

25 C, temperatura en la que, generalmente se trabaja en nuestro laboratorio en la preparacin de los mismos y para las muestras de Hb a 36 C, temperatura de incubacin en el estudio por RMN /18, 19/. Los resultados mostraron que para el PBS el pH vari en 0,02 u, para el PBP 0,03 u, y para el BSKG 0,05 u, lo que equivale a un por ciento de cambio relativo de 0,3; 0,4 y 0,7 respectivamente, demostrndose que el coeficiente de variacin de pH de los buffer con respecto a la temperatura es pequeo, y reafirmndose el PBS como el de menor coeficiente de variacin. A partir de este resultado, se puede conocer la posible influencia de un factor que afecta el pH, parmetro que es necesario mantener constante, ya que como se conoce es uno de los factores fisiolgicos que afectan la polimerizacin de la HbS, por lo que su variacin por factores externos acarreara errores sistemticos evitables y falseara los resultados.

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Valoracin del buffer

En el grfico 2 se reporta las curvas de valoracin de los tres buffer, a partir de las cuales se determina el pK y el intervalo de efecto buffer. El punto de inflexin de la curva sigmoidal obtenida representa el

pK del buffer, reportndose en el experimento para el caso del PBS un pK de 6,90; en el del PBP de 6,84 y en el del BSKG de 6,83, los cuales se diferencian en un 1,5 % , 0,6 % y 0,4 % respectivamente, del valor del pK (6,8) de los buffer fosfatos reportados en la literatura /9/.

R eferencia pK = 6,8
40

PBP pK = 6,84 0,01

35

Volumen aadido

30

PBS pK = 6,90 0,01 BSKG pK = 6,83 0,02

25

20

15

10

pH

10

11

Grfico 2: Curvas de valoracin de los buffer PBP, PBS y BSKG.

El intervalo de efecto buffer depende de la relacin [HA]/[A-], que en la prctica se hace variar desde un 10 % de cido y un 90 % de su base conjugada hasta un 90 % del cido y un 10 % de la base, lo que implica que el intervalo de cada sistema buffer es aproximadamente de pK1. Este intervalo puede ser obtenido experimentalmente de la curva de valoracin, ya que el mismo queda representado por la meseta que se extiende a ambos lados del valor del pK, regin del sistema en que vara muy poco el pH a pesar de que se est aadiendo cido o base, adems de que se puede obtener por el ajuste sigmoidal que permite realizar el programa computacional ORIGIN, el cual reporta el valor del 10 % y el 90 % de la valoracin, encontrndose los siguientes intervalos: para el PBS (5,74 - 8,08); para el PBP (5,42 - 8,26) y para el BSKG (5,63 - 8,03), todos similares al reporte terico (grficos 5, 6, y 7).

De los grficos se puede entender porqu la relacin [HA]/[A-] se puede variar hasta el orden planteado, ya que por encima del mismo, la capacidad reguladora del buffer disminuye hasta perderse. Si la capacidad reguladora de estas soluciones viene definida por db/dpH, donde dpH es el aumento de pH resultante de la adicin de una cantidad db de cido o de base; entonces cuanto mayor sea la cantidad de cido o de base que haya que adicionar para provocar una variacin definida de pH, mayor ser la capacidad reguladora del buffer, lo que se relaciona con la pendiente del intervalo de efecto buffer. A mayor pendiente de ste, se puede plantear que la capacidad reguladora del buffer es mayor, ya que implicara una mayor adicin de cido o de base para provocar una variacin definida en el pH. A partir del ajuste de regresin lineal al intervalo de efecto buffer de las curvas de valoracin, se obtuvo
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que el PBP tiene mayor pendiente que el PBS, y ste mayor que el BSKG. Por lo que, del estudio experimental se puede inferir que el buffer que presenta mayor capacidad reguladora es el PBP (que adems de poseer la mayor pendiente, en su valoracin los volmenes aadidos fueron de 1 000 L, a diferencia de los otros buffer, donde se emple 100 L, mostrando una amplia capacidad buffer), seguido despus del PBS y por ltimo el BSKG.

Estabilidad del pH del buffer en el tiempo

A cada solucin buffer se reliz un minucioso control de pH durante 15 das (tabla 1), obtenindose que la desviacin estndar de la variacin del pH calculada para los tres buffer en ese perodo de tiempo cae dentro del rango de error del equipo de medicin, lo que nos demostr la buena estabilidad de los buffer en su pH.
TABLA 1: ESTABILIDAD DEL pH DE LOS BUFFER PBS, PBP Y BSKG EN EL TIEMPO

PBS Da pH -7,4 2 7,39 6 7,36 7 7,39 10 7,37 14 7,39 15 7,39 XSd 7,380,014

PBP Da -2 4 6 10 13 15 XSd

BSKG pH Da 7,21 -7,22 2 7,21 3 7,24 6 7,23 9 7,25 10 7,24 15 7,230,016 XSd

PH 7,54 7,52 7,53 7,51 7,55 7,53 7,51 7,520,015

A partir del trabajo experimental realizado, aun teniendo en consideracin que los resultados obtenidos en el estudio de estabilidad son buenos, se recomienda que los buffer deben ser preparados y almacenados en fro, y siempre que se vayan a utilizar se ajuste el pH previamente, ya que sobre el mismo influyen muchas variables ya descritas que provocan su variacin, las cuales fueron ajustadas en el estudio, pero que en la prctica diaria realizarlas sera muy engorroso.

reporta no provoca hemlisis) el PBS a pH 7,4. El por ciento de hemlisis se calcul para los tres buffer a tres pH diferentes (7,0; 7,2 y 7,4) y se obtuvo para los tres casos por cientos muy pequeos (tabla 2). El mayor efecto hemoltico lo mostr el PBP con un valor mximo de 0,502 % a un pH de 7,2; mucho menor que el valor mximo permisible del 2 %. Adems, se reafirm el PBS a pH 7,4 como el de menor efecto hemoltico con el valor mnimo de absorbancia, justificando su empleo como control negativo. Este estudio es muy importante cuando se quiere obtener clulas rojas intactas en condiciones in vitro semejantes a las fisiolgicas, ya que para mantener la forma de la clula, sta debe de estar rodeada de una solucin isotnica, lo que quiere decir que la concentracin de agua de esta solucin es la misma que la del interior de la clula. De los resultados obtenidos se infiere que los buffer estudiados presentan una composicin isotnica.

Empleo del buffer en el sistema biolgico

Despus de la caracterizacin qumica de los buffer, se comprob su efecto en el sistema biolgico estudio, determinando experimentalmente su actividad hemoltica, ya que uno de los requisitos imprescindibles para los buffer utilizados en este tipo de muestra es su isotonicidad con el medio. Para determinar el por ciento de hemlisis, se aplic la tcnica experimental descrita previamente, utilizando como control negativo (solucin que se

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TABLA 2: VALORES DEL POR CIENTO DE HEMLISIS CALCULADOS PARA LOS BUFFER PBS, BSKG Y PBP
Solucin CP (Na2CO3) CN (PBS 7.4) PBS 7 7,2 BSKG 0,0103 0,011 0,115 0,163 Absorvancia 1,483 0,0086 % Hemlisis

7 7,2 7,4 PBP 7 7,2 7,4

0,0106 0,01 0,0093 0,0136 0,016 0,0106

0,135 0,009 0,005 0,339 0,502 0,1 35

Uno de los factores fundamentales en los experimentos por RMN u otra tcnica es lograr que la solucin final de Hb posea un pH adecuado y constante, por lo que es importante evaluar el valor final de pH que obtendr la solucin de Hb, para lo cual se monitore el pH despus de cada lavado. Los resultados obtenidos se reportan en las tablas 3, 4 y 5, en las cuales se observa que para el caso del PBP con el segundo lavado se alcanz el valor de pH del buffer, mientras que en el del PBS y el del BSKG en el tercer lavado es que se alcanz un valor de pH bastante cercano al del buffer, siempre dentro del rango de variacin fisiolgico, siendo mejor en el caso del PBS que en el del BSKG. Esto concuerda con lo obtenido en el anlisis qumico de los buffer, donde el orden de capacidad buffer fue PBP>PBS>BSKG.
TABLA 3: SEGUIMIENTO DEL pH DE LOS LAVADOS DE LAS CLULAS ROJAS CON EL BUFFER PBS

PBS 1L 2L 3L 7 7,400,02 7,220,02 7,050,02 7,2 7,590,04 7,380,01 7,230,02 7,4 7,660,02 7,480,04 7,410,01

Hc 7,06 7,22 7,4

Hs 7,05 7,24 7,39

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Hc: hemlisis por congelacin; Hs: hemlisis con saponina blanca; 1L, 2L, 3L: 1ro, 2do y 3er lavados. Vol. XIII, N 3, 2001

TABLA 4: SEGUIMIENTO DEL pH DE LOS LAVADOS DE LAS CLULAS ROJAS CON EL BUFFER PBP

PBP 7 7,2 7,4

1L 7,040.01 7,220.02 7,410.02

2L 7,000,01 7,200,01 7,400,02

3L 7,000,01 7,200,02 7,400,01

Hc 7,03 7,23 7,41

Hs 7,05 7,21 7,4

TABLA 5: SEGUIMIENTO DEL pH DE LOS LAVADOS DE LAS CLULAS ROJAS CON EL BUFFER BSKG

BSKG 7 7,2 7,4

1L 7,510,07 7,570,02 7,620,01

2L 7,230,02 7,320,01 7,630,01

3L 7,060,02 7,230,02 7,450,01

Hc 7,09 7,21 7,37

Hs 7,1 7,24 7,38

Hc: hemlisis por congelacin; Hs: hemlisis con saponina blanca; 1L, 2L, 3L: 1er, 2do, y 3er lavados.

A partir de aqu se comprob con qu nmero de lavados se logra el pH original del buffer, usando el

pH 7,4 (pH que se emplea experimentalmente en el laboratorio) para los buffer estudiados.

TABLA 6: SEGUIMIENTO DEL pH DE LOS LAVADOS EN CLULAS ROJAS CON LOS BUFFER PBS, PBP Y BSKG A pH 7,4

Buffer 1L PBS 7,580,05 PBP 7,460,02 BSKG 7,690,01

2L 7,480,01 7,400,01 7,530,01

3L 7,420,02 -7,470,02

4L 7,400,01 -7,400,01

1L, 2L, 3L: 1er, 2do y 3er lavados.

Se encontr que para el PBS y el BSKG se necesit 4 lavados y en el del PBP solamente 2. Los resultados se muestra en la tabla 6. Esto debe tenerse en cuenta si se pretende, como finalidad, imponer el valor del pH final igual al del buffer utilizado. Al mismo tiempo se debe tener presente que existe un compromiso entre el buffer final y el tiempo de preparacin y accin sobre la muestra. Para los tres buffer se observ que la solucin de Hb final presenta un pH muy cercano al pH del ltimo lavado de los glbulos, as como no se obtuvo diferencias significativas en dependencia del tipo de hemlisis utilizada (tablas 3, 4 y 5), cumplindose los objetivos de la metodologa de proporcionar a la solucin de Hb un pH igual al buffer utilizado. El seguimiento del pH se realiz en muestras de clulas con HbS utilizando el PBS, encontrndose similitud a lo obtenido en clulas rojas normales. En la tabla 7 se observa que utilizando dos lavados no se alcanza el valor de pH que presenta el buffer.

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TABLA 7: SEGUIMIENTO DEL pH DEL BUFFER PBS EN CLULAS ROJAS CON HbS UTILIZANDO DOS LAVADOS

pH 7 7,1 7,2 7,3 7,4

1L 7,320,02 7,420,01 7,560,02 7,590,01 7,690,03

2L 7,090,01 7,200,02 7,270,02 7,390,01 7,470,02

TABLA 8: SEGUIMIENTO DEL pH DEL BUFFER PBS EN CLULAS ROJAS CON HbS UTILIZANDO TRES LAVADOS

Paciente 1 2 3 4 5 mediasd %

pH (P) 7,82 8 7,97 8,03 8,08 7,940,13 1,7

pH (1L) 7,75 7,8 7,78 7,81 7,86 7,800,04 0,5

pH (2L) 7,47 7,42 7,52 7,52 7,52 7,490,04 0,5

pH (3L) 7,42 7,39 7,36 7,42 7,39 7,390,025 0,3

(P) Plasma: 1L, 2L, 3L: 1er, 2do y 3er lavados.

En la tabla 8 se reporta el comportamiento del pH del sobrenadante para diferentes lavados, observndose que, a medida que aumenta el nmero de lavados, el valor medio tiende al valor de pH del buffer. El valor medio del pH en el tercer lavado para las cinco muestras analizadas fue de 7,39, con una dispersin de 0,03, acercndose al valor inicial del buffer utilizado, por lo cual fue necesario realizar un cuarto lavado para garantizar un pH 7,4 en las muestras. Como se aprecia en las tablas que corresponden al seguimiento del pH, el valor del mismo reportado para el plasma, ya sea de un pool o de una muestra, se encontr generalmente por encima del rango de pH fisiolgico, lo que, teniendo en cuenta la bibliografa, puede deberse, a que la medicin del pH en sangre debe realizarse en el transcurso de los cincos minutos despus de la extraccin, debido a que las reacciones

metablicas del sistema continan, y stas pueden influir en el pH. Tambin debe tenerse en cuenta las condiciones de preparacin de las muestras de Hb en el laboratorio, al aire atmosfrico, lo cual provoca que parte del dixido de carbono presente en las mismas se elimine, y este es un componente cido que puede influir en el aumento del pH, ya que se afecta su equilibrio con el par conjugado, la base dbil HCO3 . Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se puede plantear que el PBS mostr mejores caractersticas que el PBP y el BSKG, atendiendo al objetivo propuesto, lo cual se puede apreciar en el menor coeficiente de variacin del pH con la temperatura, y en el menor efecto hemoltico; dos de las propiedades ms importantes a la hora de seleccionar un buffer adecuado para su empleo en los estudios con clulas rojas y soluciones de Hb.
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Bibliografa
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Vol. XIII, N 3, 2001