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THESE DE DOCTORAT DE LUNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE Spcialit Chimie Physique et Chimie Analytique

Prsente par Mathieu Goutayer

Pour obtenir le grade de DOCTEUR de lUNIVERSIT PIERRE ET MARIE CURIE

Sujet de la thse : Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo Soutenue le 11 dcembre 2008 devant le jury compos de :

M Jrme Bibette M Jean-Pierre Benot M Bertrand Tavitian Mme Valrie Cabuil M Rmi Meyrueix Mme Isabelle Texier

Directeur de thse Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Examinateur

Universit Pierre & Marie Curie - Paris 6 Bureau daccueil, inscription des doctorants et base de donnes Esc G, 2me tage 15 rue de lcole de mdecine 75270-PARIS CEDEX 06

Tl. Secrtariat : 01 42 34 68 35 Fax : 01 42 34 68 40 Tl. pour les tudiants de A EM : 01 42 34 69 54 Tl. pour les tudiants de EN ME : 01 42 34 68 41 Tl. pour les tudiants de MF Z : 01 42 34 68 51 E-mail : scolarite.doctorat@upmc.fr

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Rsum :
La nanomdecine reprsente le champ dapplication des nanotechnologies, et plus particulirement des nanoparticules, la mdecine. Ce nouveau domaine est trs prometteur notamment en ce qui concerne la dtection et le traitement de pathologies dorigine infectieuse, gntique ou cancreuse. Nous avons dvelopp de nouvelles nanoparticules biocompatibles et valu leur potentiel en tant que nanocargos dagents thrapeutiques ou diagnostiques grce limagerie de fluorescence in vivo. Ces particules sont des nanomulsions de type huile dans eau, de quelques dizaines de nanomtres de diamtre, stabilises par une couche de surfactants compose de phospholipides et dagents de furtivit. Lencapsulation dans le cur des nanoparticules de fluorophores organiques absorbant et mettant dans les longueurs donde compatibles avec les dispositifs dimagerie de fluorescence permet de suivre leur biodistribution aprs injection dans des souris Nude. Ces nano-mulsions furtives et fluorescentes peuvent galement tre fonctionnalises sur leur surface par des ligands de ciblage actifs tels que le peptide cRGD. De telles nano-mulsions fonctionnalises montrent in vitro une adhsion spcifique avec les cellules exprimant lintgrine v3, un biomarqueur de langiognse. Laccumulation, passive et/ou active mdie par les cRGD, des particules au sein de diffrents modles de tumeurs sous-cutanes implants chez la souris Nude, est observe par imagerie de fluorescence non invasive.

Mots cls :
Nanoparticules ; Nano-mulsion ; Fluorescence ; Biodistribution ; Ciblage actif

Cette thse a t prpare au sein des laboratoires suivant :


Laboratoire des collodes et des matriaux diviss LCMD-ESPCI 10 rue Vauquelin 75005 Paris Laboratoire de Fonctionnalisation et Chimie des Microsystmes DTBS-LFCM 17, rue des Martyrs 38054 Grenoble cedex

Nanoemulsions for therapeutic or diagnostic agents vectorisation; biodistribution study by in vivo fluorescence imaging.

Abstract:
Nanomedecine represents the application field of nanotechnology, and more especially nanoparticles, to medicine. This new domain is promising in particular for the detection and treatment of infectious, genetic and cancer pathologies. We have developed new biocompatible nanoparticles, and evaluated their potential as nanocarriers for therapeutic or diagnostic agents thanks to in vivo fluorescence imaging. These particles are oil in water nanoemulsions, which diameter is less than an hundred nanometers, stabilized by a mixture of phospholipids and stealth agents. The encapsulation of organic dyes with absorbing and emitting wavelengths suitable for in vivo fluorescence imaging, allows the follow up of the nanoemulsions after their injection in mice models. Fluorescent stealth nanoemulsions can also be functionalized in order to covalently link onto their surface targeting ligands, such as the cRGD peptide. Indeed, cRGD functionalized nanoemulsions exhibit in vitro specific adhesion with cells expressing v3 integrine, an angiogenic biomarker. The particle uptake, either passive and/or cRGD-mediated, in different tumor models bear by Nude mice, is observed using non invasive fluorescence imaging.

Key Words:
Nanoparticles; Nanoemulsion; Fluorescence; Biodistribution; Active targeting

Table des matires :

INTRODUCTION GENERALE ............................................................... 9 CHAPITRE I : NANOPARTICULES POUR LE IN VIVO ................ 13


I.1. INTERET DES NANOPARTICULES POUR LA MEDECINE ........................................ 14
I.1.1. Dfinition des nanoparticules..................................................................................... 14 I.1.2. Avantages des nanoparticules .................................................................................... 15 I.1.3. Applications des nanoparticules................................................................................. 16

I.2. LES DIFFERENTES NANOPARTICULES ................................................................ 18


I.2.1. Diffrents types de nanoparticules ............................................................................. 18 I.2.2. Les trois gnrations de nanoparticules ..................................................................... 22 I.2.3. Nanoparticules, principe gnral................................................................................ 26

I.3. EXEMPLES DE NANOPARTICULES POUR LE VIVANT UTILISEES EN CLINIQUE ...... 27


I.3.1. Nanoparticules vocation thrapeutique ................................................................... 27 I.3.2. Nanoparticules vocation diagnostique..................................................................... 28

I.4. CONCLUSION .................................................................................................... 29

CHAPITRE II : IMAGERIE MEDICALE............................................ 31


II.1. LES DIFFERENTES TECHNIQUES DIMAGERIE ................................................... 33
II.1.1. Imagerie molculaire ................................................................................................ 34 II.1.2. Rayons X .................................................................................................................. 35 II.1.3. Ultrasons................................................................................................................... 36 II.1.4. Imagerie par Rsonance Magntique........................................................................ 37 II.1.5. Imagerie nuclaire .................................................................................................... 38 II.1.6. Fluorescence ............................................................................................................. 39

II.2. IMAGERIE DE FLUORESCENCE.......................................................................... 39


II.2.1. Principe et grandeurs physiques ............................................................................... 39 II.2.2. Application de la fluorescence pour limagerie in vivo ............................................ 42 II.2.3. Dispositifs exprimentaux ........................................................................................ 45 II.2.4. Traceurs .................................................................................................................... 47

II.3. CONCLUSIONS ................................................................................................. 50

CHAPITRE III : NOUVELLES FORMULATIONS DE NANOEMULSIONS............................................................................................. 53


III.1. DEFINITION ET PROPRIETES DES NANO-EMULSIONS ....................................... 55
III.1.1. Les mulsions .......................................................................................................... 55

III.1.2. Les nano-mulsions ................................................................................................. 57

III.2. CHOIX DE LA FORMULATION .......................................................................... 61


III.2.1. Dtails des constituants ........................................................................................... 62 III.2.2. Choix de la technique dmulsification ................................................................... 66 III.2.3. Protocole gnral de fabrication .............................................................................. 69

III.3. CARACTERISTIQUES DE LA FORMULATION DE REFERENCE ............................. 70


III.3.1. Composition ............................................................................................................ 70 III.3.2. Proprits physiques................................................................................................ 71 III.3.3. Stabilit et volution dans le temps ......................................................................... 79

III.4. VARIATIONS AUTOUR DE LA FORMULATION DITE DE REFERENCE................... 82


III.4.1. Nature du cur lipophile ......................................................................................... 82 III.4.2. Quantit totale de surfactants .................................................................................. 85 III.4.3. Ratio phospholipides / surfactants pegyls.............................................................. 87 III.4.4. Longueur et structure des chanes pegyles............................................................. 90

III.5. CONCLUSIONS................................................................................................ 93

CHAPITRE IV : NANO EMULSIONS FLUORESCENTES.............. 97


IV.1. LOCALISATION DU FLUOROPHORE AU SEIN DES NANOPARTICULES ................ 99 IV.2. CHOIX DES FLUOROPHORES ......................................................................... 101
IV.2.1. Structure gnrale de fluorophores compatibles avec limagerie de fluorescence in vivo.................................................................................................................................... 101 IV.2.2. Cyanines................................................................................................................ 103

IV.3. INCORPORATION DES FLUOROPHORES DANS LES NANO-EMULSIONS ............ 106


IV.3.1. Production de nano-mulsions fluorescentes ........................................................ 106 IV.3.2. Calcul du nombre de fluorophores par globule ..................................................... 107 IV.3.3. Impact de lencapsulation sur les proprits des nano-mulsions ......................... 109

IV.4. PROPRIETES OPTIQUES DES NANO-EMULSIONS FLUORESCENTES .................. 111


IV.4.1. Spectres dabsorption et dmission...................................................................... 111 IV.4.2. Rendement quantique de fluorescence .................................................................. 117 IV.4.3. Dure de vie de fluorescence ................................................................................ 121 IV.4.4. Vitesse de photoblanchiment ................................................................................ 123

IV.5. ENCAPSULATION ET STABILITE .................................................................... 125


IV.5.1. Stabilit de lencapsulation ................................................................................... 125 IV.5.2. Stabilit chimique du fluorophore......................................................................... 127

IV.6. DISCUSSION ET CONCLUSIONS ..................................................................... 131


IV.6.1. Discussion ............................................................................................................. 131 IV.6.2. Conclusion ............................................................................................................ 136

CHAPITRE V : COMPORTEMENT DES NANO-EMULSIONS EN MILIEU BIOLOGIQUE ........................................................................ 139


V.1. LE
SANG, UN VEHICULE DE DISTRIBUTION ET DELIMINATION DES

NANOPARTICULES ................................................................................................. 140

V.1.1. Composition du sang .............................................................................................. 141 V.1.2. La circulation sanguine des nanoparticules ............................................................ 142 V.1.3. Llimination des nanoparticules du sang .............................................................. 143

V.2. COMPATIBILITE EX VIVO ENTRE LE SANG ET LES NANO-EMULSIONS ............. 148


V.2.1. Stabilit de la fluorescence des nano-mulsions en milieu sanguin ....................... 148 V.2.2. Stabilit des globules rouges en prsence de nano-mulsions ................................ 151 V.2.3. Conclusions ............................................................................................................ 153

V.3. ETUDE DE LA BIODISTRIBUTION DES NANOPARTICULES SUR SOURIS SAINE ... 153
V.3.1. Evolution de la biodistribution des nanoparticules en fonction du temps .............. 154 V.3.2. Evolution de la biodistribution en fonction de la formulation ................................ 164

V.4. CONCLUSION ................................................................................................ 170

CHAPITRE

VI

NANO-EMULSIONS

FONCTIONNALISEES

POUR LA DETECTION DES TUMEURS .......................................... 173


VI.1. LES TUMEURS, CONSIDERATIONS GENERALES ............................................. 174
VI.1.1. Description ............................................................................................................ 174 VI.1.2. Langiognse, un phnomne cl dans le dveloppement et la dtection des tumeurs .............................................................................................................................. 175

VI.2. LE CIBLAGE DES TUMEURS .......................................................................... 178


VI.2.1. Le couple ligand / rcepteur .................................................................................. 178 VI.2.2. Le couplage chimique des ligands sur les nanoparticules ..................................... 181 VI.2.3. Prparation de nano-mulsions fonctionnalises................................................... 183

VI.3. LES MODELES TUMORAUX ET VALIDATION IN VITRO ................................... 189


VI.3.1. Modles de cellules tumorales .............................................................................. 189 VI.3.2. Test in vitro de reconnaissance cellulaire des nanoparticules - cRGD.................. 190

VI.4. CIBLAGE ACTIF DES TUMEURS IN VIVO ........................................................ 193


VI.4.1. Mise en vidence de leffet EPR ( Enhanced Permeation and Retention )........ 193 VI.4.2. Exprimentation in vivo : premire srie............................................................... 195 VI.4.3. Exprimentation in vivo : deuxime srie ............................................................. 198 VI.4.4. Conclusions ........................................................................................................... 203

VI.5. MODELE DE CELLULES TUMORALES HEK 3 .............................................. 203


VI.5.1. Protocole exprimental.......................................................................................... 204 VI.5.2. Rsultats ................................................................................................................ 204

VI.5.3. Discussion ............................................................................................................. 207

VI.6. CONCLUSIONS ............................................................................................. 208

CONCLUSION GENERALE ................................................................ 211 BIBLIOGRAPHIE.................................................................................. 219 ANNEXES................................................................................................ 229


ANNEXE I : MATERIELS ........................................................................................ 230 ANNEXE II : DISPOSITIFS DE MESURE.................................................................... 231
Spectres dabsorption ........................................................................................................ 231 Spectres dmission........................................................................................................... 231 Diffusion quasi-lastique de la lumire ............................................................................. 231 Potentiel zta ..................................................................................................................... 231 Dure de vie de fluorescence (Fluorophore : DiD) ........................................................... 232 Dure de vie de fluorescence (Fluorophore : DiR)............................................................ 232

ANNEXE III : PARAMETRES DE SONICATION ......................................................... 233 ANNEXE IV : PREPARATION


DUNE NANO-EMULSION NON DOPEE ISSUE DE LA

FORMULATION DE REFERENCE .............................................................................. 234

ANNEXE V : PREPARATION DUNE

NANO-EMULSION FLUORESCENTE ISSUE DE LA

FORMULATION DE REFERENCE .............................................................................. 235

ANNEXE VI : SYNTHESE DU SURFACTANT REACTIF : PE-PEG-MAL ................... 236 ANNEXE VII : PREPARATION DUNE
NANO-EMULSION FLUORESCENTE ISSUE DE LA

FORMULATION A 2,5 % M/M DE SURFACTANT FONCTIONNALISABLE

.................... 237

ANNEXE VIII : PROTOCOLES CELLULAIRES .......................................................... 239


Cultures cellulaires ............................................................................................................ 239 Analyse par cytomtrie en flux.......................................................................................... 239 Analyse par microscopie de fluorescence ......................................................................... 240

Introduction gnrale

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Les nanotechnologies reprsentent aujourdhui un domaine scientifique et technique en plein essor. A lchelle mondiale, les nanotechnologies suscitent de plus en plus dintrt et sont en voie de constituer le cur de la prochaine rvolution industrielle. Ainsi, lutilisation des nanotechnologies, et notamment de nanoparticules, dans le cadre plus spcifique de la mdecine (ce que lon appelle dsormais nanomdecine) connat actuellement de grands progrs et devrait permettre damliorer la dtection prcoce et le traitement de nombreuses pathologies (cancers, maladies auto-immunes ou infectieuses par exemple). Le dveloppement de ce type de technologie constitue donc un enjeu majeur de sant publique.

Les objectifs de ces travaux de thse ont consist dvelopper et tudier de nouvelles nanoparticules biocompatibles de taille nanomtrique destines tre administres par injection intraveineuse, et ayant pour vocation de vhiculer des agents thrapeutiques et/ou diagnostiques. Pour cela, les nanoparticules dveloppes doivent tre biocompatibles, biodgradables et autant que possible bioassimilables. Elles doivent galement avoir la proprit dtre stables temprature ambiante, et avoir un comportement in vivo leur permettant dchapper aux dfenses immunitaires de lorganisme et rendant possible le ciblage dune population cellulaire donne. En vue de son application lchelle industrielle, le procd de fabrication de ces nanoparticules doit en outre tre simple et avoir un faible cot de revient. Ltude du comportement biologique des nanoparticules constitue donc un point cl de leur dveloppement. Afin dvaluer rapidement et moindre cot leur potentiel biologique en tant que nanotransporteurs, nous avons eu recours limagerie de fluorescence in vivo.

Dans une premire partie, nous prsenterons brivement les diffrentes nanoparticules existantes ainsi que leur intrt pour la nanomdecine (Chapitre I). Nous nous intresserons ensuite aux diffrentes modalits dimagerie biomdicale, et plus particulirement limagerie de fluorescence in vivo qui sera utilise par la suite pour suivre la biodistribution aprs injection des nanoparticules dveloppes (Chapitre II).

La seconde partie sera ensuite consacre la description, la prparation et ltude des nouvelles nanoparticules biocompatibles dveloppes. Ces particules sont des globules de nano-mulsions de type huile dans eau, de quelques dizaines de nanomtres de diamtre, stabiliss par une couche de surfactants compose de phospholipides et dagents de furtivit - 10 -

Introduction gnrale

(Chapitre III). De plus, lincorporation dun fluorophore organique au sein de ces particules permet de leur confrer les proprits indispensables leur dtection et leur suivi par imagerie de fluorescence in vivo. Ces nanoparticules fluorescentes, dont les proprits optiques seront tudies, constituent ainsi une nouvelle catgorie de traceurs nanoparticulaires biocompatibles pour limagerie de fluorescence, en particulier pour les tudes prcliniques (Chapitre IV).

La troisime et dernire partie prsentera les premiers rsultats biologiques obtenus. Dans un premier temps, le comportement des nanoparticules fluorescentes non fonctionnalises sera tudi, en se focalisant notamment sur leur compatibilit physique et biologique avec le sang. Une tude de leur biodistribution dans la souris saine aprs injection intraveineuse sera galement prsente (Chapitre V). Ensuite, la fonctionnalisation de ces nanoparticules par des ligands spcifiques de biomarqueurs tumoraux sera dtaille, puis une tude in vitro de reconnaissance spcifique de ces particules avec des cellules exprimant ces marqueurs sera expose. Enfin, la biodistribution et laccumulation tumorale des nanoparticules fonctionnalises aprs leur injection dans lorganisme de souris porteuses de tumeurs seront tudies par imagerie de fluorescence in vivo.

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Chapitre I : Nanoparticules pour le in vivo

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Les nanotechnologies pour le vivant et plus particulirement lutilisation de nanoparticules se situent linterface de trois grandes disciplines : la biologie, la physique, et la chimie. Ce nouveau domaine est en pleine effervescence. Les nanoparticules vhiculant un agent de contraste ou dlivrant slectivement un principe actif dans les cellules cibles incarnent la version moderne des magic bullets imagines au dbut du XXme sicle par le mdecin allemand Paul Ehrlich. Apres avoir donn une dfinition des nanoparticules, nous prsenterons leurs avantages ainsi que les applications envisages pour la mdecine. Ce chapitre sintressera ensuite aux principaux types et aux diffrentes gnrations de nanoparticules. Enfin, il prsentera des exemples de nanoparticules approuves pour un usage clinique thrapeutique ou diagnostique.

I.1. Intrt mdecine

des

nanoparticules

pour

la

I.1.1. Dfinition des nanoparticules


Une nanoparticule est un assemblage de quelques centaines quelques milliers datomes, formant un objet dont au moins une dimension est comprise entre 1 et 100 nm. Cette dfinition exclut donc les objets dont la plus petite dimension est comprise entre 100 et 1000 nm. Ces particules, bien que de taille nanomtrique, tant dsignes comme submicromtriques.

A titre de comparaison avec les structures organiques naturelles, les nanoparticules se situent principalement dans la gamme de taille correspondant aux protines (Figure I1).

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Chapitre I : Nanoparticules pour le in vivo

Figure I1: Gamme de tailles des nanoparticules compare celles des principales structures chimiques et biologiques.

I.1.2. Avantages des nanoparticules


La faible taille des nanoparticules leur confre des proprits intressantes : elle offre en effet une importante surface spcifique et une grande stabilit. Ces particules ont effectivement lavantage de former des solutions homognes qui ne sdimentent ou ne crment pas (voir Chapitre III). Mais ce sont surtout leurs capacits esquiver les dfenses immunitaires et leur capacit cibler une population de cellules particulires qui en font des vecteurs prometteurs (I.2.2).

Lutilisation des nanoparticules pour la dtection et le traitement de pathologies ouvre un nouveau domaine de recherche. Lun des terrains dapplication le plus prometteurs, et aussi le plus avanc actuellement, est la dlivrance de mdicaments ( drug delivery en anglais), et en particulier le dveloppement de thrapies cibles pour loncologie. En effet, vhiculer les molcules anticancreuses par des nanoparticules permet daugmenter leur slectivit pour les tumeurs, et ainsi de rduire les svres effets secondaires accompagnant les chimiothrapies. La dlivrance spcifique dagents dintrt vers un organe, un tissu ou une cellule constitue aujourdhui un dfi majeur pour la prvention, la localisation et le traitement des maladies humaines, notamment infectieuses, cancreuses ou dorigine gntique. Actuellement, lobtention de concentrations efficaces en principes actifs au niveau des zones cibles ne peut se faire quau dtriment de cellules saines, puisquune partie importante - 15 -

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des substances administres est capte par dautres tissus. Cette accumulation au sein de tissus non viss occasionne des effets toxiques consquents et parfois rdhibitoires qui peuvent entraner labandon du traitement en dpit de son efficacit. De nombreux principes actifs prsentent des caractristiques physico-chimiques (hydrophilie, poids molculaires, etc.) peu favorables au passage des nombreuses barrires cellulaires, physico-chimiques et biologiques qui sparent le site dadministration du mdicament de son site daction. Ces principes actifs sont donc toujours mal absorbs, souvent trs rapidement dgrads, mtaboliss, ou limins et donc incapables datteindre leur cible au niveau tissulaire ou cellulaire. Il faut savoir que 95 % des nouveaux principes actifs dvelopps ont des proprits pharmacocintiques mdiocres [1]. Pour toutes ces raisons, le dveloppement de vecteurs de mdicaments permettant la dlivrance spcifique de la molcule active au niveau du site daction a pris un essor considrable au cours des dernires annes.

I.1.3. Applications des nanoparticules


La dlivrance de mdicaments concerne principalement des molcules chimiques (principes actifs) mais elle englobe galement les agents thrapeutiques biologiques comme les protines, les peptides et galement lADN ou lARN pour les thrapies gniques. Outre la dlivrance de principes actifs chimiques ou biologiques au sein des tissus cibls, les nanoparticules peuvent galement tre utilises pour dautres types de thrapies, telles que la radiothrapie, la thermothrapie ou encore la thrapie photodynamique. La radiothrapie consiste dtruire des cellules places proximit dune source mettant des rayonnements radioactifs. Lintrt des nanoparticules est alors de vhiculer la source radioactive directement au niveau de la zone traiter [2]. La thermothrapie ou hyperthermie a la mme finalit, mais utilise une lvation de la temprature pour y parvenir. Il sagit alors de provoquer par un champ extrieur (magntique ou laser par exemple) un chauffement local grce des nanoparticules situes dans la zone traiter, de manire ce que lnergie dissipe soit suffisante pour lever la temprature de quelques degrs (autour de 45C) induisant la destruction des cellules [3, 4]. La thrapie photodynamique [5] se base sur des molcules

(photosensibilisateurs) qui, suite labsorption dun rayonnement lumineux, - 16 -

Chapitre I : Nanoparticules pour le in vivo

produisent de loxygne singulet ou des radicaux libres. Ces substances ont dimportantes proprits oxydantes qui conduisent la mort des cellules environnantes. Une fois de plus, les nanoparticules jouent le rle de transporteur permettant de vhiculer le photosensibilisateur dans la zone dintrt [6, 7].

Dans les trois cas, les nanoparticules sont utilises pour vhiculer les agents thrapeutiques (source radioactive, matriaux provoquant lhyperthermie,

photosensibilisateur) dans la zone cible. En effet, il est toujours prfrable que ces agents thrapeutiques saccumulent de faon prfrentielle au sein des tissus traiter afin de minimiser leur impact sur les cellules saines.

Le diagnostic, et plus particulirement limagerie mdicale, constitue galement un champ dapplication auquel la nanomdecine peut apporter de relles amliorations, les nanoparticules jouant le rle de traceurs ou dagents de contraste. Le chapitre suivant dcrira les diffrentes techniques dimagerie mdicale et, pour chacune dentre elles, les avantages que peut apporter lutilisation de nanoparticules.

Une grande partie des nanoparticules inorganiques possdent intrinsquement des proprits thrapeutiques ou diagnostiques (I.2.1.5). Cest notamment le cas des botes quantiques fluorescentes ( Quantum dots en anglais), des nanoparticules magntiques utilises comme agent de contraste en IRM (Imagerie de Rsonance Magntique), ou encore des particules pour la thermothrapie. En revanche, les particules organiques sont dpourvues de telles proprits. Leur rle consiste protger les agents thrapeutiques ou diagnostiques qui leur sont adjoints, les vhiculer vers une zone de lorganisme cible, et ventuellement les relarguer. Ainsi, outre la protection des agents dintrt (thrapeutiques ou diagnostiques) et leur libration ventuelle, la principale mission des nanoparticules est de vhiculer les agents dintrt vers une zone cible. Cela sous-entend donc quelles disposent de proprits de vectorisation particulire.

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I.2. Les diffrentes nanoparticules


Comme prsent au dbut de ce chapitre, la dfinition des nanoparticules est uniquement base sur la taille de ces objets : au moins une des dimensions de lobjet doit tre infrieure 100 nm. Cette dfinition nest donc pas limitative vis--vis de la composition de ces particules. Il existe ainsi une grande varit de nanoparticules allant des particules dor aux liposomes, en passant par les nanoparticules polymriques. Si le choix du cur des particules est primordial en ce qui concerne la protection et lventuel relargage des agents dintrt, le contrle de la surface lest tout autant. Ce sont en effet ses proprits de surface qui permettront la particule de vhiculer les agents thrapeutiques ou diagnostiques vers la zone cible.

I.2.1. Diffrents types de nanoparticules


La composition du cur des nanoparticules est trs varie : il peut sagir dassemblages organiques ou inorganiques [8]. Nous allons dcrire ici les nanoparticules les plus courantes.

I.2.1.1. Liposomes

Les liposomes [9] sont des vsicules constitues dune ou plusieurs doubles couches concentriques de phospholipides et de molcules de cholestrol encapsulant un rservoir aqueux. La taille des liposomes varie entre 30 nm et plusieurs micromtres. Ces particules sont depuis de nombreuses annes utilises comme outils pour la biologie, la biochimie et la mdecine en tant que transporteurs de principes actifs thrapeutiquesou dagents dimagerie [10]. Leur caractre non toxique et biocompatible font de ces collodes des systmes intressants pour les applications in vivo. Cependant, les liposomes prsentent galement quelques limitations : ils ont effectivement montr une faible capacit dencapsulation (notamment pour les molcules lipophiles piges dans la double couche de phospholipides), une stabilit modre, une production dlicate, et un relargage prcoce des principes actifs hydrophiles dans le sang [11].

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Chapitre I : Nanoparticules pour le in vivo

Les niosomes sont des ensembles supramolculaires similaires aux liposomes, la diffrence que les molcules constituant la double couche ne sont pas des phospholipides mais des surfactants de synthse (lipides non ioniques) [12]. Cest galement le cas des polymersomes, pour lesquels des copolymres bloc (comportant une partie hydrophile et une partie hydrophobe) forment la structure emprisonnant le rservoir aqueux [13-16].

I.2.1.2. Micelles

Les micelles sont des auto-assemblages de molcules amphiphiles qui forment des structures de type cur-coquille ( core-shell en anglais) en milieu aqueux. Les micelles se forment lorsque la concentration en surfactants dans le milieu dpasse une valeur seuil nomm concentration micellaire critique. Dans ce cas, les molcules amphiphiles sautoassemblent pour regrouper leurs parties hydrophobes et exposer en surface uniquement leurs domaines hydrophiles. Les micelles sont donc des systmes supramolculaires qui sont en quilibre avec les molcules amphiphiles en solution [1]. Diffrents types de micelles ont ainsi t obtenues en fonction des surfactants utiliss. On peut ainsi citer les micelles base de phospholipides ou de surfactants pegyls, mais ce sont celles utilisant des copolymres qui concentrent la plus grande partie de la recherche actuelle [17-20].

I.2.1.3. Nanoparticules polymriques

Les premires nanoparticules polymriques dveloppes par Couvreur et al. dans les annes 1980 sont base de polyalkylcyanoacrylates [21]. Diffrents polymres ont ensuite t utiliss avec succs pour former des nanoparticules, les plus couramment utiliss actuellement tant le poly(acide lactique), le poly(acide glycolique) et leur copolymre le poly(lactide-coglycolide), respectivement abrgs en anglais PLA, PGA et PLGA. Ces polymres ont lavantage davoir une grande biocompatibilit et dtre biodgradables par lorganisme. Ils sont ainsi utiliss depuis de nombreuses annes pour fabriquer des dispositifs mdicaux et des implants sous-cutans. Les nanoparticules polymriques offrent de plus une meilleure stabilit que les liposomes, que se soit in vivo ou durant le stockage. Cependant, mme si la biocompatibilit des polymres est bonne, ils ne sont pas dnus de toute cytotoxicit une fois structurs sous forme de nanoparticules. De plus, la - 19 -

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prsence de solvants organiques toxiques rsiduels au sein des nanoparticules est galement problmatique. Enfin, la production de telles nanoparticules est difficilement industrialisable et aboutit gnralement des milieux peu concentrs en particules (~2 %).

Des polymres base de polypeptides, polynuclotides, ou de polysaccharides sont galement employs pour lobtention de nanoparticules [8].

Parmi les nanoparticules polymriques, on peut galement citer lexistence des dendrimres et des nanogels. Les dendrimres sont des complexes polymriques de taille comprise entre 1 et 10 nm qui, partir dun monomre possdant au moins trois sites ractifs et formant le cur de la particule, se construisent par lajout contrl de couches successives de monomres [22]. Ces constructions polymriques fortement branches ont une structure bien contrle. Malheureusement la synthse des dendrimres est dlicate. Quant aux nanogels, ce sont des structures moins courantes constitues de polymres hydrophiles. Contrairement aux nanoparticules polymriques prcedemment dcrites, leurs chanes ne sont pas fortement imbriques les unes dans les autres, ce qui leur confre une flexibilit plus importante. La particule finale, gonfle deau, offre ainsi une grande surface spcifique et une importante capacit dencapsulation [23, 24].

I.2.1.4. Nanoparticules lipidiques

Pour pallier les inconvnients des nanoparticules de polymres (importants rsidus de solvants organiques restant aprs la synthse, possible cytotoxicit, production grande chelle de faon reproductible difficile, mauvaise conservation dans le temps) et des liposomes (faible stabilit, processus de fabrication complexe, faible taux dencapsulation de principes actifs lipophiles cristalliss), de nouvelles nanoparticules structures autour dun cur lipidique ont t dcrites. Ces nanoparticules sont constitues dun cur lipidique, gnralement base de triglycrides biodgradables, bioassimilables et non toxiques. Parmi les particules entrant dans cette catgorie, les nanoparticules lipidiques solides ou SLN (pour Solid Lipid Nanoparticles ) sont les plus tudies [25-28]. Le cur de ces particules dveloppes au cours des annes 1990 est constitu dune matrice de lipides qui est solide temprature

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Chapitre I : Nanoparticules pour le in vivo

ambiante mais galement la temprature du corps humain. Cette matrice plus ou moins cristallise est stabilise par une couche de surfactants. Les lipides utiliss sont soit des triglycrides hautement purifis, soit des mlanges de glycrides ou des cires. Ces particules ont une stabilit et une capacit encapsuler les molcules lipophiles suprieure celle des liposomes. Elles peuvent de plus tre synthtises en labsence de solvant organique. De telles structures prsentent cependant les inconvnients suivants : laugmentation de la taille des particules au cours du temps ; une tendance glifier de manire imprvisible ; des transitions polymorphiques inattendues ; et une faible capacit dencapsulation due la structure cristalline de la matrice lipidique.

Parmi les nanoparticules lipidiques on trouve galement les nanocapsules lipidiques ou LNC (pour Lipid NanoCapsules ), qui sont constitues dun cur lipidique liquide entour par une coque solide [29, 30]. Les lipoprotines dorigine naturelle [31] ou synthtique [32] font aussi partie des nanoparticules lipidiques. Enfin, lessemble des nanoparticules lipidiques est quelque fois regoup sous lapplation de nano-mulsions [33], bien que ce terme soit plus gnrallement utilis pour dcrire des dispersions dhuile dans leau, pour lesquelles les globules de phase disperse non cristallise sont stabiliss par une couche de surfactants [34] (voir Chapitre III). Ces systmes bass sur des curs lipidiques non cristalliss ne sont pas concerns par les problmes de polymorphisme.

I.2.1.5. Nanoparticules inorganiques

Outre les nanoparticules organiques, des nanoparticules inorganiques ont galement t dveloppes. Les plus courantes sont les nanoparticules mtalliques dor [35, 36] ou dargent, les nanoparticules magntiques [37], les nanoparticules en silice [38] et les nanocristaux semi-conducteurs [39-42]. La majorit des particules magntiques se base sur lutilisation doxydes de fer superparamagntiques. Ces particules sont constitues de petites particules de maghmite (Fe2O3) ou de magntite (Fe3O4), de quelques nanomtres de diamtre, qui peuvent tre encapsules dans une matrice de silice, de polymre ou de polysaccharide (dextran). Ces particules magntiques sont dsignes par le terme SPIO ( SuperParamagnetic Iron Oxide ) pour celles dont la taille est comprise entre 50 et 500 nm, et USPIO ( Ultra small SuperParamagnetic Iron Oxide ) si leur diamtre est infrieur 50 nm. Il existe galement

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

des nanoparticules doxydes de fer monocristallins de moins de 3 nm de diamtre (MION ou Monocristalline Iron Oxyde Nanoparticles ) encapsuls dans une coque de dextran pour aboutir une taille denviron 10 nm. Parmi les nanoparticules inorganiques largement tudies, on peut galement citer le cas des nanocristaux semi-conducteurs fluorescents, plus connus sous leur dnomination anglaise Quantum dots (botes quantiques en franais). Ces objets mesurant entre 2 et 10 nm de diamtre sont composs dun cur cristallin semi-conducteur. Les couples dlments les plus couramment utiliss sont les suivants : cadmium/slnium, cadmium/tellure, indium/arsenic ou indium/phosphore. Ce cur est gnralement recouvert dune coque de sulfure de zinc afin de passiver la surface tout en stabilisant les proprits optiques de ces nanoparticules.

I.2.2. Les trois gnrations de nanoparticules


En vue damliorer le comportement biologique des nanoparticules, des modifications de leurs proprits de surface ont t ralises, conduisant ainsi trois gnrations de nanoparticules.

I.2.2.1. Premire gnration

La premire gnration de nanoparticules tait constitue de collodes stables en milieu aqueux. Outre leurs proprits thrapeutiques ou diagnostiques intrinsques, leur intrt rsidait principalement dans leur capacit viter llimination et lexcrtion par le systme rnal. En effet, le principal organe dlimination de lorganisme est le rein, dont le fonctionnement repose sur un principe de filtration travers des pores de quelques nanomtres seulement. Ainsi, lencapsulation dagents dintrt de faible poids molculaire au sein de vecteurs collodaux dune dizaine de nanomtres permet dviter leur limination rnale et de prolonger leur effet. La taille des nanoparticules doit toutefois tre suffisamment petite pour quelles ne restent pas bloques dans les plus petits vaisseaux sanguins. Cependant, si la taille des nanoparticules leur permet dviter de nombreux piges gomtriques de lorganisme, ce seul paramtre ne permet pas une longue circulation dans

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Chapitre I : Nanoparticules pour le in vivo

le compartiment sanguin. Les nanoparticules sont en effet considres comme des corps trangers par les dfenses immunitaires de lorganisme, et plus prcisment par le systme rticuloendothlial. A ce titre, elles sont souvent rapidement prises en charge par les macrophages. Afin de pouvoir atteindre la zone dintrt, il convient donc dviter la phagocytose en leurrant les dfenses immunitaires ; on parle alors de furtivit.

I.2.2.2. Seconde gnration : les nanoparticules furtives

Comme le souligne Torchilin [9], lobjectif principal des nanoparticules ou nanotransporteurs une fois administrs dans le compartiment sanguin est daugmenter la dure de vie de lagent vhiculer dans la circulation sanguine. En effet, les mcanismes naturels de mtabolisation et dlimination limitent grandement lactivit thrapeutique ou diagnostique des mdicaments ou des agents de contraste injects tels quels (voir Chapitre V). Non seulement llimination de la substance dintrt de la circulation sanguine diminue la dose qui va finalement atteindre les tissus cibls, mais laccumulation de cette mme substance dans les organes dlimination ou de squestration (rein, foie, rate ) peut galement entraner des effets secondaires toxiques au niveau de ces tissus. Dans le cas de lutilisation dagent de contraste, ces accumulations peuvent de plus masquer la zone dintrt, et donc perturber et fausser la dtection. Cest pourquoi de nouvelles stratgies ont t dveloppes afin daugmenter la dure de vie des nanoparticules dans le compartiment sanguin. Ces techniques se basent sur la modification chimique de la surface des nano-transporteurs (liposomes, nanoparticules de polymre, mulsions ).

Le

principal

mcanisme

dlimination

de

lorganisme

est

le

systme

rticuloendothlial (voir Chapitre V). Les particules trangres sont rapidement marques au cours de leur circulation dans le sang par des protines dsignes par le terme dopsonines. Les objets opsoniss sont ensuite phagocyts par les cellules de Kupffer (macrophages du foie), les macrophages de la rate ou des poumons, ou encore par les macrophages circulants. Afin de limiter ce processus, les particules sont recouvertes dagent de furtivit, ce qui leur permet dchapper la capture par les cellules du systme immunitaire en esquivant la fixation des opsonines [43-45]. La grande majorit des agents de furtivit utiliss pour crer une couche protectrice autour des transporteurs, sont des polymres. Le PEG (polythylne

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

glycol), ou POE (polyoxythylne), est le plus couramment utilis car il a lavantage dtre biocompatible, soluble en milieu aqueux, non toxique, et a en outre une faible immunognicit et antignicit. Il est de plus autoris linjection chez lhomme par la FDA ( Food and Drug Administration : organisme autorisant la commercialisation des mdicaments sur le territoire des tats-Unis d'Amrique).

Figure I2 : Structure du polyoxythylne (POE ou PEG) utilis pour augmenter la furtivit des particules.

De nombreux travaux ont t mens pour optimiser le pourcentage de PEG la surface des particules, ainsi que la taille et la structure des chanes de polymre [43]. Il ressort globalement de ces tudes qu taille gale, une chane ramifie est plus efficace quune chane linaire, mais galement quen dessous dune masse molaire de 2000 g/mol, lamlioration de la dure de vie en circulation nest que peu marque. Ces tendances gnrales sont cependant nuancer car les rsultats obtenus dpendent fortement de la nanoparticule sur laquelle sont fixes les chanes polyoxythylne [43]. Lutilisation de polymres saccharidiques de type dextran pour augmenter la furtivit des particules est galement possible, notamment dans le cas des nanoparticules magntiques utilises comme agent de contraste pour lIRM.

Lutilisation dagents de furtivit a permis lapparition de ce que lon nomme la seconde gnration de nanoparticules. Ces objets peuvent avoir un temps de sjour dans la circulation sanguine suffisamment important pour relarguer lentement un agent thrapeutique dans le sang, ou pour quil se produise une accumulation passive au sein de tissus pour lesquels lendothlium vasculaire est discontinu (voir Chapitre VI).

I.2.2.3. Troisime gnration : les nanoparticules ciblantes

Les collodes furtifs restent dans la circulation sanguine plus longuement que les autres nanoparticules. Ils finissent cependant par tre extravass hors du compartiment sanguin, notamment dans les zones o la vascularisation prsente dimportantes fenestrations comme le foie ou les zones dangiognse (voir Chapitre VI). Ainsi, afin de favoriser - 24 -

Chapitre I : Nanoparticules pour le in vivo

laccumulation des nanoparticules dans un tissu donn, il est indispensable de fonctionnaliser leur surface avec des ligands biologiques qui seront reconnus par les cellules composant le tissu dintrt. Les ligands peuvent tre des anticorps [41, 46], des peptides [42], des saccharides, des oligonuclotides [47] ou dautres molcules comme le folate [31, 40, 48]. Lajout de ces ligands la surface des nanoparticules favorise gnralement leur capture par les macrophages [49]. Cest pourquoi il est important dassocier les agents de ciblage aux agents de furtivit afin de contrebalancer cet effet. La formation dune barrire strique risque toutefois de masquer les ligands et donc de rendre caduque le ciblage actif. Par consquent, les agents de ciblage sont loigns du cur de la nanoparticule par un bras espaceur (le plus souvent une chane polyoxythylne) de manire ce quils voluent la surface de la couche de furtivit. Lutilisation des bras espaceurs est galement avantageuse dans la mesure o elle offre lagent de ciblage une plus grande libert de mouvement favorisant ainsi sa complexation avec la cible. En effet, il a t montr que le greffage de ligands directement la surface dune particule entrane une diminution importante de la vitesse de complexation, la libert de mouvement du ligand tant fortement rduite par la particule. La flexibilit du bras espaceur permet alors de redonner suffisamment de libert de mouvement lagent de ciblage afin de maximiser les probabilits de rencontre entre le ligand et le rcepteur dans la bonne conformation. Ainsi, la troisime gnration de nanoparticules pour le vivant se caractrise par la prsence dune barrire strique associe lajout dagents de ciblage lis la surface par un bras espaceur (Figure I3) [50].

Figure I3 : Evolution des nanoparticules (ici des nano-mulsions). Premire gnration : nanoparticule nue ( gauche). Deuxime gnration : nanoparticules furtives (au centre). Troisime gnration : nanoparticules ciblantes ( droite).

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I.2.3. Nanoparticules, principe gnral


Le concept des nanoparticules multifonctionnelles dcrit par Mauro Ferrari [51] regroupe toutes les considrations voques prcdemment. Ce principe est illustr la Figure I4.

Figure I4 : Nanoparticule multifonctionnelle. Une telle nanoparticule a la capacit de transporter un ou plusieurs principes actifs, ainsi quun agent de contraste permettant son suivi dans lorganisme du patient. La prsence dagents de furtivit la surface des particules permet dviter leur capture par les macrophages et augmente leur temps de circulation dans lorganisme. Les agents de permation permettent de traverser les barrires biologiques (telles que la paroi des vaisseaux sanguins) qui se dressent entre les nanoparticules et la zone cible. Enfin, les agents de ciblage (anticorps par exemple) greffs sur la nanoparticule autorisent un ciblage actif et favorisent donc laccumulation dans le tissu cible et/ou linternalisation par les cellules vises (daprs [51]).

Comme nous venons de le voir, les nanoparticules constituent une sorte de plateforme ou de noyau dassemblage sur lequel diffrents agents viennent prendre place : Agent de furtivit Agent de ciblage Agent de permation Agent de contraste Agent thrapeutique

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Chapitre I : Nanoparticules pour le in vivo

On peut galement ajouter cette liste les agents dactivation. De tels agents permettent la libration de lagent thrapeutique la suite dun stimulus extrieur (pH ou ondes ultrasonores par exemple), autorisant ainsi la dlivrance de principes actifs de manire localise et contrle au sein de lespace extra ou intracellulaire de la zone cible.

Il est ainsi possible, partir dune mme plateforme de base, dobtenir un grand nombre de nanoparticules aux proprits diffrentes en fonction des agents choisis.

I.3. Exemples de nanoparticules pour le vivant utilises en clinique

I.3.1. Nanoparticules vocation thrapeutique


Les premiers transporteurs pharmacologiques nano-particulaires ont t

commercialiss dans la dernire dcennie du XXme sicle. Linjection lhomme de liposomes de quelques dizaines de nanomtres de diamtre encapsulant des molcules anticancreuses est approuve depuis plus de 10 ans pour le traitement de certains cancers du sein ou de lovaire. Ainsi en 1997, le DaunoXome (NeXstar Pharmaceuticals, Inc.) est arriv dans larsenal de chimiothrapie. Il sagit de liposomes encapsulant de la daunorubicine. Cette formulation a t suivie en 1999 par lAmBisome (Gilead Sciences / Fujisawa Healthcare) qui est galement base sur des liposomes dont la bicouche lipidique comporte des molcules dAmphotricine B, un antibiotique antifongique. La doxorubicine, une molcule anticancreuse, est galement commercialise sous forme liposomale sous les noms de Myocet (Elan Europe) et Doxil(USA) / Caelix(Europe) (Johnson & Johnson Alza). Dans ce dernier cas, la formulation du liposome comporte des agents de furtivit afin damliorer sa biodistribution ; de telles particules sont appeles liposomes furtifs. En 2005, la premire nanoparticule autre que les liposomes a t autorise par la FDA pour injection intraveineuse. Il sagit de lAbraxane (Baxter Healthcare) prconis pour le traitement du cancer du sein. Cette particule est base sur lencapsulation de paclitaxel, une molcule anticancreuse, au sein dune matrice protique (albumine) ayant une taille de 130 nm. - 27 -

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De nombreuses autres nanoparticules pour la dlivrance de mdicaments sont actuellement en cours dtudes prcliniques et cliniques. Ce sont principalement des liposomes incorporant des molcules hydrophiles, ou des nanoparticules solides base de lipides, de protines ou de polymres biodgradables encapsulant des molcules lipophiles.

I.3.2. Nanoparticules vocation diagnostique


En parallle des particules utilises pour la dlivrance de mdicaments, certaines nanoparticules inorganiques sont galement approuves par la FDA. Ces particules sont des SPIO et des USPIO utilises en temps quagents de contraste pour lIRM (voir Chapitre II). Ainsi lAMI-25, SPIO commercialis depuis 1995 sous le nom d'Endorem (Laboratoire Guerbet), est constitu de particules doxydes de fer de 5 6 nm de diamtre enrobes par une couche de dextran (polysaccharide augmentant la furtivit) pour aboutir des particules denviron 100 nm de diamtre. Cet agent de contraste, inject par voie intraveineuse, est utilis pour visualiser les lsions du foie associes une altration du systme rticuloendothlial (tumeurs et mtastases hpatiques notamment). Le Resovist commercialis par Schering fait galement partie des SPIO. Cet agent de contraste denviron 60 nm de diamtre est constitu de carbodextran encapsulant des particules doxydes de fer denviron 4 nm de diamtre. Ce produit est utilis pour les mmes indications que lEndorem. Parmi les USPIO, le produit le plus avanc est lAMI-227 (Sinerem, Laboratoire Guerbet). Il est galement constitu de particules doxydes de fer de 4 6 nm de diamtre enrobes par une couche de dextran. Cependant la taille finale de la nanoparticule est denviron 30 nm contre 100 nm pour lAMI-25 prcdemment cit. Il est indiqu pour la dtection et la caractrisation des ganglions mtastatiques chez les patients atteints dun cancer du pelvis. La demande dautorisation de mise sur le march est en cours aux EtatsUnis mais elle a t retire en Europe au cours de la phase III car lamlioration de contraste na pas t juge satisfaisante.

Ces particules tant inorganiques, leur mtabolisme et leur limination ont t tudis. Aprs injection intraveineuse, ces particules sont rapidement captes par les cellules du systme rticuloendothlial (principalement les cellules de Kupffer, mais galement les cellules de la rate, des ganglions lymphatiques, et de la moelle osseuse). Une fois - 28 -

Chapitre I : Nanoparticules pour le in vivo

phagocytes, les nanoparticules sont ensuite lentement dgrades dans les lysosomes des cellules du systme rticuloendothlial puis intgres dans le pool de fer de l'organisme. Elles ont donc la particularit de ne pas tre dtectables dans les voies excrtrices biliaires ou rnales.

I.4. Conclusion
Les nanoparticules reprsentent un rel espoir pour la mdecine. Elles peuvent en effet favoriser la dlivrance dagents thrapeutiques au sein mme de la zone traiter en limitant leur capture par dautres tissus. Cela permet ainsi de rduire les effets secondaires de ces traitements, et redonne de lintrt des principes actifs qui avaient des proprits physiques et une biodistribution insatisfaisantes. Dun point de vue diagnostique, elles permettent damliorer le contraste des modalits dimagerie actuelles et donc de faciliter la dtection prcoce de pathologies (voir Chapitre II). Ainsi depuis quelques annes, un grand nombre de nanoparticules vocation diagnostique ou thrapeutique ont t dveloppes et tudies. Cependant, bien quelles aient souvent des proprits intressantes, bien peu dentre elles sont parvenues une utilisation clinique. En effet, la production, la stabilit, la biodistribution, et lefficacit restent des conditions critiques runir pour lutilisation clinique de nouvelles nanoparticules. La toxicit des nanoparticules reste galement un point crucial quil convient de connatre afin dviter que le remde soit pire que le mal. Parmi les diffrents types de nanoparticules, les nano-mulsions nont t que peu utilises ce jour, essentiellement pour des questions de stabilit. Ces matriaux prsentent pourtant une grande biocompatibilit et une importante versatilit qui leur permettent dencapsuler de manire durable de nombreuses molcules ou particules aux fonctions diffrentes. Avant de sintresser au dveloppement de nouvelles nanoparticules biocompatibles de type nano-mulsions, le chapitre suivant sera consacr aux diffrentes modalits dimagerie clinique et prclinique. Limagerie de fluorescence sera plus particulirement aborde car elle constitue un outil trs efficace pour ltude de la biodistribution des nanoparticules.

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Chapitre II : Imagerie mdicale

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Nous venons de voir, dans le chapitre prcdent, que la nanomdecine nous permet desprer dimportantes avances dans la dtection et le traitement de certaines pathologies. Outre cette rvolution attendue, les progrs rcents de limagerie mdicale ont dj permis de grandes amliorations dans le domaine du diagnostique au cours des dernires dcennies. La mdecine moderne a en effet rgulirement recours des techniques dimagerie mdicale, que ce soit pour des raisons cliniques ou scientifiques. Limagerie mdicale dsigne un ensemble de techniques non invasives permettant dobtenir des informations sur des aspects internes de lorganisme. Ces diffrentes techniques dimagerie mdicale sont rgulirement utilises afin dtablir un diagnostic prcis, de prparer une opration chirurgicale ou de contrler les effets dun traitement ou dun acte chirurgical. Elles sont galement de plus en plus sollicites au niveau de la recherche mdicale dans le but dapprofondir nos connaissances de lanatomie et de la physiologie des organismes vivants, et plus particulirement de ltre humain. On peut, en fonction des informations recherches, classer les techniques dimagerie en deux catgories : Limagerie structurelle, qui renseigne sur lanatomie des organes (volume, position, prsence ventuelle de lsions) Limagerie fonctionnelle, qui permet dobtenir des indications sur le fonctionnement de lorganisme (physiologie, mtabolisme)

Ce chapitre prsentera le fonctionnement, les avantages et les inconvnients des diffrentes techniques dimagerie mdicale et biomdicale existantes. Il sintressera plus particulirement leur potentiel pour limagerie molculaire. Cette dernire est rattache limagerie fonctionnelle : elle permet la visualisation de processus biologiques dun point de vue spatial et temporel, lchelle molculaire ou gntique, de manire non invasive [52]. Limagerie molculaire ncessite cependant linjection de traceurs ou agents de contraste afin de mettre en vidence le processus tudi. Les agents de contraste couramment utiliss dans les diffrentes modalits dimagerie seront donc dtaills. Ce chapitre se focalisera enfin plus prcisment sur limagerie de fluorescence in vivo.

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Chapitre II : Imagerie mdicale

II.1. Les diffrentes techniques dimagerie


Les techniques dimagerie mdicale et biomdicale sont dites non invasives et non traumatisantes. En effet, en dehors de linjection de traceurs pour certaines modalits, aucun prlvement (biopsie) ni aucune atteinte des barrires de lorganisme nest ncessaire leur mise en oeuvre.

Les diffrentes modalits dimagerie biomdicale sont ainsi toutes bases sur lutilisation de rayons lectromagntiques pour obtenir les informations dsires, sans effectuer de prlvements sur lorganisme. Ces techniques utilisent des rayonnements rpartis sur lensemble du spectre lectromagntique : des rayons gamma dans le cas de limagerie nuclaire pour les rayonnements les plus nergtiques, aux ultrasons lors des chographies, en passant par les rayons X, les ondes radio dans le cas des IRM (en complment dun champ magntique constant), et enfin les rayonnements infrarouges dans le cas de limagerie de fluorescence in vivo (Figure II-1).

Figure II-1 : Reprsentation des diffrentes modalits dimagerie en fonction des ondes lectromagntiques quelles utilisent.

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Cependant, sil existe plusieurs techniques permettant dobtenir des images in vivo, elles sont souvent lourdes et onreuses, et ne sont pas toutes adquates pour effectuer de limagerie molculaire. Avant de prsenter chacune des mthodes dimagerie indiques ci-dessus, nous allons rappeler lintrt de limagerie molculaire.

II.1.1. Imagerie molculaire


Limagerie molculaire est un nouveau domaine de recherche biomdical qui peut tre dfini comme la reprsentation visuelle, la caractrisation et la quantification de processus biologiques lchelle cellulaire ou subcellulaire, et galement le suivi de processus molculaires au sein dorganismes vivants de manire non invasive [52, 53]. Les avantages lis limagerie molculaire sont dune part une meilleure comprhension des processus biologiques, mais galement le diagnostic prcoce de tumeurs ou de maladies neurologiques, cardiovasculaires ou auto-immunes. Elle permet en outre dacclrer le dveloppement de nouvelles thrapies pour ces pathologies grce des tests prcliniques et cliniques permettant loptimisation des traitements. Pour parvenir ces fins, limagerie molculaire se base sur lutilisation dagents de contraste ou traceurs. Chaque traceur est destin mettre en vidence un processus biologique donn. Ils peuvent tre classs en deux catgories : les traceurs ciblants et les traceurs activables. Les premiers vont se fixer prfrentiellement au niveau de cibles, alors que les seconds ne sont dtectables quaprs avoir ragi avec la cible, ce qui permet de rduire le bruit de fond et amliore le contraste final (Figure II-2).

Figure II-2 : Illustration des diffrents principes de traceurs. a) Traceur ciblant : lagent de contraste est li une molcule (biomarqueur) qui est reconnue ou qui reconnat spcifiquement une cible

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Chapitre II : Imagerie mdicale


biologique donne (par exemple un traceur li un anticorps qui reconnat une protine exprime en surface de certaines cellules). b) Traceur activable: lagent de contraste est inhib et cest laction dun processus biologique qui va restituer les proprits qui permettent de le dtecter (par exemple un traceur dont les proprits physiques vont tre modifies par laction dune enzyme).

Limagerie molculaire permet par exemple de dtecter de manire prcoce la prsence de certains marqueurs tumoraux dans un organisme vivant, alors que la tumeur est indtectable avec les modalits dimagerie structurelles classiques sans raliser de prlvement.

II.1.2. Rayons X
La radiographie par rayons X est la plus ancienne technique dimagerie mdicale. En effet, ds 1895 W.C. Rntgen, physicien allemand dcouvreur des rayons X, ralise la premire radiographie de la main de sa femme. Cette technique sest depuis largement dveloppe et est couramment utilise. En plus de la radiographie classique , le dveloppement de capteurs rayons X base de semi-conducteurs et lavnement de linformatique dans les annes 1970 ont permis lapparition de la tomodensimtrie, plus couramment appele scanner. Les scanners permettent, aprs reconstruction, de raliser des vues en coupe ou des vues en trois dimensions.

II.1.2.1. Agents de contraste

Liode, qui a la proprit de fortement absorber les rayons X, est couramment utilise en tant quagent de contraste dans le cas de langiographie (visualisation du systme sanguin). Son injection dans le systme sanguin permet aussi de mieux reprer les organes fortement vasculariss et en particulier certaines tumeurs. Les nanoparticules mtalliques (en or par exemple) ont galement t proposes recemment comme agents de contraste pour limagerie par rayons X du fait de la prsence datomes lourds. Cependant, le pouvoir contrastant de ces traceurs (iod ou nano-particulaire) est faible. Les quantits injectes sont par consquent importantes, ce qui limite le dveloppement de nouveaux agents de contraste ciblants permettant de raliser de limagerie molculaire.

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II.1.2.2. Avantages et inconvnients

Les rayons X sont une modalit dimagerie structurelle rapide et efficace offrant une rsolution de quelques dizaines de micromtres sans limite de profondeur. Cependant, si cette technique offre un excellent contraste entre les os et les tissus mous, le contraste entre les diffrents tissus mous est faible et rend par exemple difficile la localisation de tumeurs au sein de ces tissus. De plus, les rayons X sont des rayonnements ionisants et ce titre, leur utilisation doit seffectuer avec toutes les mesures de protection adquates.

II.1.3. Ultrasons
Depuis son utilisation en obsttrique dans les annes 1970, lchographie sest largement dveloppe et est devenue une technique dimagerie trs rpandue. Les ultrasons sont principalement utiliss pour raliser de limagerie structurelle ddie lanalyse des tissus mous , mais ils peuvent galement servir dans le cadre de limagerie fonctionnelle, notamment pour la mesure des flux sanguins grce lchographie Doppler.

II.1.3.1. Agents de contraste

Lutilisation de microbulles permet damliorer le contraste de limagerie ultrasonore. Ces agents de contraste sont notamment utiliss lors des chocardiographies. Ces particules sont gnralement des mulsions dhuiles perfluorocarbones stabilises par une couche de phospholipides [54, 55]. Ces huiles possdent la proprit de dissoudre dimportantes quantits de gaz (elles sont notamment utilises pour produire le sang artificiel). Ces microbulles sont fortement chognes en milieu aqueux puisque la diffrence de densit entre le gaz contenu dans les microbulles et les tissus environnants est grande. La nature de ces agents de contraste, leur efficacit et les possibilits de fonctionnalisation permettent denvisager lutilisation des microbulles pour la dlivrance de mdicaments ou pour limagerie molculaire.

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Chapitre II : Imagerie mdicale

II.1.3.2. Avantages et inconvnients

Lutilisation des ultrasons est sans danger, cest pourquoi cette modalit dimagerie est particulirement employe pour imager les ftus. Cette technique est de plus rapide, peu coteuse et peu encombrante. La rsolution peut tre trs prcise, mais elle diminue rapidement lors de lobservation de zones profondes, et les os ne laissent pas passer les ondes ultrasonores. Enfin, cette mthode est oprateur-dpendante et ncessite un contact entre le patient et le dispositif.

II.1.4. Imagerie par Rsonance Magntique


Limagerie par rsonance magntique (IRM) est une technologie rcente, particulirement adapte la visualisation des tissus mous. Son dveloppement a eu lieu dans le dbut des annes 1980. Lapparition de lIRM fonctionnelle dans les annes 1990 a entre autres permis dimportantes avances dans la comprhension du fonctionnement du cerveau.

II.1.4.1. Agents de contraste

Limagerie par rsonance magntique, bien que traditionnellement utilise pour visualiser les tissus (localisation et taille des tumeurs), permet de raliser de limagerie molculaire grce linjection dagents de contraste : nanoparticules superparamagntiques ou chlates de gadolinium [56].

II.1.4.2. Avantages et inconvnients

LIRM est une technique sans danger puisque, contrairement aux rayons X, elle ne se base pas sur lutilisation de rayonnements ionisants. Elle offre un excellent contraste au niveau des tissus mous, bien meilleur que celui obtenu par tomodensimtrie, mais ne permet pas de visualiser les tissus durs (os). Cette technique est sans doute la modalit dimagerie structurelle la plus puissante mais elle nest toutefois pas dnue de dfauts. En effet, la dure dacquisition est relativement longue mais cest surtout son cot trs important qui limite son utilisation. - 37 -

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II.1.5. Imagerie nuclaire


La mdecine nuclaire repose sur la dtection de la dsintgration datomes radioactifs entrant dans la structure de molcules dites radiopharmaceutiques pralablement injectes au patient. Cest une technique dimagerie fonctionnelle et mme molculaire car elle permet de visualiser et de localiser laccumulation des radiopharmaceutiques. Deux technologies bases sur des radiolments diffrents sont actuellement utilises : la tomographie mission de positrons (TEP, ou PET en anglais pour Positron Emission Tomography ) et la tomographie dmission monophotonique (TEMP, ou SPECT en anglais pour Single Photon Emission Tomography ).

II.1.5.1. Agents de contraste

Ces techniques sont bases sur la dsintgration de radiopharmaceutiques qui sont des agents de contraste. En TEMP, les radiolments couramment employs sont le techntium 99m (99mTc), lindium 111m (111In) et liodure 123 (123I). Pour la TEP, les lments utiliss ont une dure de demi-vie courte (infrieure 2 heures) : il sagit de loxygne 15 (15O), lazote 13 (13N), le carbone 11 (11C) et le fluor 18 (18F). Il est important de noter que la production de radiopharmaceutiques et leur conservation limitent le nombre de processus diffrents qui peuvent tre tudis, un traceur spcifique tant ncessaire pour chaque cible. Le principal traceur utilis en TEP est le 2-fluoro-2-deoxy-D-glucose, une molcule de glucose dans laquelle le groupement hydroxyle en position 2 est remplac par un atome de fluor radioactif (18F-FDG). Ladministration de ce radiopharmaceutique permet de suivre le mtabolisme du glucose, et ainsi de localiser les cellules fortement consommatrices de glucose telles que les cellules tumorales.

II.1.5.2. Avantages et inconvnients

La mdecine nuclaire, grce aux techniques TEMP et surtout TEP, est une mthode trs sensible [52, 53]. Elle ncessite cependant linjection de radiopharmaceutiques qui - 38 -

Chapitre II : Imagerie mdicale

doivent tre synthtiss juste avant lanalyse du fait de leur courte dure de vie. Cette dpendance en atomes radioactifs difficiles produire (production en cyclotron pour la TEP, ou en gnrateur pour la TEMP), rend malheureusement cette technique trs onreuse. De plus, lutilisation de sources radioactives en fait une technique lourde utiliser en termes de mesures de scurit.

II.1.6. Fluorescence
La dernire modalit prsente ici est limagerie de fluorescence. Si la fluorescence est une technique fortement rpandue dans le domaine biomdical, notamment lchelle molculaire (ADN ou protine) ou cellulaire (cytomtrie en flux ou coloration histologique), elle est, malgr ses atouts, encore peu employe pour raliser de limagerie in vivo. La section suivante rappellera le principe de la fluorescence, les avantages et les inconvnients lis son utilisation en imagerie in vivo, et prsentera galement les dispositifs dimagerie et les principaux traceurs existants.

II.2. Imagerie de fluorescence


Limagerie de fluorescence est une mthode trs sensible mais qui a linconvnient davoir une faible rsolution spatiale et une profondeur de dtection limite. Il sagit malgr tout de la mthode la plus rapide et la moins coteuse pour imager des molcules ou des cellules dans le petit animal. Elle constitue ainsi une mthode complmentaire de lIRM ou de la mdecine nuclaire [57]. De plus, son faible temps dacquisition en fait la technique dimagerie molculaire la mieux adapte aux mthodes de screening .

II.2.1. Principe et grandeurs physiques


La fluorescence correspond lmission de lumire par une substance (molcule ou matriau par exemple) depuis un tat lectronique excit.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

II.2.1.1. Diagramme de Jaboski

Les diffrents processus lectroniques engendrs par labsorption de lumire par une substance fluorescente (appele galement fluorophore ou fluorochrome) peuvent tre reprsents par le diagramme de Jaboski (Figure II-3).

Figure II-3 : Diagramme de Jaboski.

Ltat lectronique singulet fondamental ainsi que les deux premiers tats lectroniques singulets excits sont respectivement reprsents par S0, S1, S2. Chacun de ces niveaux dnergie lectronique, ainsi que ltat excit triplet (T1), comprend plusieurs niveaux dnergie vibrationnelle nots 0, 1, 2, etc. (les niveaux dnergie rotationnelle ne sont pas reprsents). A temprature ambiante, lnergie thermique nest pas suffisante pour peupler les tats nergtiques S1 et S2. Cest labsorption de lnergie lumineuse apporte par un photon qui permet de peupler ces tats excits. Labsorption a gnralement lieu depuis les niveaux vibrationnels les plus bas de ltat fondamental car ce sont les plus peupls. Un fluorophore est gnralement excit jusquaux niveaux vibrationnels levs, que ce soit ceux de S1 ou de

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Chapitre II : Imagerie mdicale

S2. Les molcules excites se relaxent ensuite rapidement par conversion interne jusquau niveau vibrationnel le plus faible (0) de ltat excit S1. Le retour ltat fondamental S0 depuis le niveau vibrationnel 0 de ltat S1 peut alors avoir lieu par mission dun photon, ce qui correspond la fluorescence, ou par dsexcitation non radiative (principalement par dgagement de chaleur lors des collisions avec les molcules environnantes). Dautre part, des phnomnes concurrents comme le transfert dnergie entre fluorophores ou vers un inhibiteur de fluorescence peuvent galement avoir lieu ltat excit. Ces processus concurrents de lmission de fluorescence font que le nombre de photons mis est infrieur aux nombre de photons absorbs. Lnergie libre lors de lmission de fluorescence est gnralement infrieure celle ayant permis lexcitation, de lnergie tant dissipe lors des phnomnes de conversion interne qui suivent labsorption. Les longueurs donde tant inversement proportionnelles lnergie du photon, la longueur donde dmission est donc dcale vers le rouge (vers les plus grandes longueurs dondes) par rapport la longueur donde dexcitation. La diffrence entre la longueur donde o labsorption est maximale et celle o lmission de fluorescence est la plus intense se nomme dplacement de Stokes. Pour certaines molcules, un processus de conversion intersytme autorise le peuplement de ltat excit triplet T1 depuis ltat excit singulet S1. Le retour ltat S0 peut dans ce cas seffectuer soit par mission de lumire, on parle alors de phosphorescence, soit par dsexcitation non radiative. Ltat excit triplet T1 tant moins nergtique que S1, lnergie libre par la phosphorescence est plus faible que celle lie au processus de fluorescence. Lmission de phosphorescence est ainsi dcale vers les plus grandes longueurs donde par rapport lmission de fluorescence.

II.2.1.2. Grandeurs fluorescence

physiques

caractristiques

de

la

Les principales caractristiques physiques des fluorophores sont dfinies ci-dessous : Longueurs d'onde dabsorption et dmission de fluorescence : elles

correspondent aux longueurs donde pour lesquelles labsorption et lmission de fluorescence sont maximales. Coefficient d'extinction (ou absorption molaire) : ce coefficient relie la quantit de lumire absorbe sur une longueur de cuve l (en cm), pour une longueur

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d'onde donne, la concentration C (en M) du fluorophore en solution, selon la loi de Beer-Lambert : Absorbance = l C ( sexprime donc en M-1.cm-1). Rendement quantique de fluorescence : il correspond au nombre de photons mis par rapport au nombre de photons absorbs et reprsente donc lefficacit relative de la fluorescence compare aux autres voies de dsexcitation. Dure de vie de fluorescence ou dure de vie de l'tat excit S1 : il sagit de la dure moyenne pendant laquelle la molcule reste l'tat excit avant de retourner son tat fondamental. A titre dexemple, cette dure est de lordre de la nanoseconde pour un fluorophore organique. Photoblanchiment : lorsque la molcule est l'tat excit, il existe une certaine probabilit pour qu'elle participe des ractions chimiques (on parle alors de ractions photochimiques), en particulier avec l'oxygne. Le fluorophore perd alors ses proprits de fluorescence. Autrement dit, quand une solution de molcules fluorescentes est excite, une certaine proportion d'entre elles peut tre dtruite chaque instant par photoblanchiment, ce qui engendre une diminution de l'intensit de fluorescence au cours du temps lors dune irradiation continue.

II.2.2. Application de la fluorescence pour limagerie in vivo


La fluorescence permet de faire de limagerie molculaire car il est possible de suivre des traceurs en observant leur mission de fluorescence aprs les avoir excits par une source lumineuse. Cependant, si limagerie de fluorescence in vivo est encore en dveloppement, cest quil a fallu dans un premier temps saffranchir des limitations optiques existant dans les tissus organiques.

II.2.2.1. Limitations optiques in vivo

Lutilisation de fluorophores pour des exprimentations in vivo engendre des contraintes supplmentaires par rapport une utilisation in vitro du fait de la prsence de tissus organiques sur le trajet des rayonnements lumineux dexcitation et de fluorescence.

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Chapitre II : Imagerie mdicale

Les principaux problmes rencontrs en imagerie de fluorescence in vivo sont les suivants : La diffusion du rayonnement lumineux (dexcitation et dmission) lors de la traverse des tissus entrane une importante perte dintensit ainsi quune perte dinformation, ce qui rend plus difficile la localisation exacte du fluorophore dans lorganisme. Labsorption par les tissus de la lumire dexcitation et de celle mise par le fluorophore conduit, comme le phnomne de diffusion, une perte dintensit du signal de fluorescence. Lauto-fluorescence des tissus, qui est lorigine dune diminution importante du contraste de limage, correspond la fluorescence naturelle mise par de nombreux constituants des tissus (hmoglobines, porphyrines ) ainsi que par la nourriture contenue dans le systme digestif.

Dun point de vue instrumental, il est ncessaire, pour limiter ces inconvnients, daugmenter la sensibilit de dtection et de filtrer le rayonnement dexcitation diffus. Quant au traceur utilis, il doit possder un rendement quantique de fluorescence et un dplacement de Stokes les plus levs possibles.

De plus, le choix de longueurs donde dabsorption et dmission adquates (dans le proche infrarouge) permet galement de rduire ces phnomnes gnants. En effet, la diffusion du rayonnement lumineux par les tissus organiques diminue quand les longueurs donde dexcitation et dmission augmentent. En outre, le phnomne dabsorption du rayonnement par les tissus peut tre fortement diminu si lon utilise des longueurs donde dexcitation et dmission comprises entre 650 et 900 nm. La Figure II-4 reprsente la variation des coefficients dabsorption de diffrents tissus organiques en fonction de la longueur donde. Il apparat nettement sur ce schma que la fentre optimale se situe dans le proche infrarouge, entre labsorption de lhmoglobine et celle de leau [58].

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Figure II-4 : Coefficients dabsorption de diffrents tissus organiques en fonction de la longueur donde (daprs Mobley, J. et T. Vo-Dinh [58]).

De plus, lobservation dans le proche infrarouge permet de rduire considrablement lauto-fluorescence des tissus. Comme on le voit sur la Figure II-5, de nombreux organes (peau, intestin, vessie) sont fluorescents dans les longueurs donde du visible. Cependant, si lon travaille dans le proche infrarouge, alors ces mmes organes nmettent que trs peu de fluorescence, ce qui permet de visualiser les fluorophores injects dans la souris avec un contraste bien plus important [57].

Figure II-5 : Auto-fluorescence des organes de la souris dans diffrentes conditions optiques [57].

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Chapitre II : Imagerie mdicale

II.2.2.2. Avantages de la fluorescence

En dpit des limitations lies aux proprits optiques des tissus il existe donc un domaine de longueurs donde (650 900 nm) pour lequel limagerie de fluorescence est avantageuse. Cette technique prsente en effet de nombreux intrts : elle allie une bonne sensibilit, un faible encombrement, des agents de contraste stables et elle ne se base pas sur lutilisation de radiations ionisantes. Cette technique est galement peu onreuse lachat et au fonctionnement, ce qui en fait une modalit dimagerie molculaire de choix pour le petit animal. Les applications envisages court terme pour le petit animal sont dune part l'aide la dcouverte de biomarqueurs permettant de cibler des tumeurs ou la plaque d'athrome, et dautre part la dcouverte et l'valuation de nouvelles thrapeutiques. A moyen terme, des applications de limagerie de fluorescence sont actuellement envisages pour l'homme, en dermatologie, comme outil de diagnostic du cancer du sein, de dtection de mtastases ou de ganglions sentinelles en intra-opratoire, ou de polypes prcancreux par endoscopie du colon.

II.2.3. Dispositifs exprimentaux


Cette section prsente diffrents dispositifs instrumentaux dvelopps par le CEALETI pour limagerie de fluorescence in vivo du petit animal.

II.2.3.1. Imagerie de fluorescence par rflectance

Limagerie de fluorescence par rflectance (FRI en anglais pour Fluorescence Reflectance Imaging ) permet dobtenir des clichs de fluorescence en deux dimensions. Ce dispositif est constitu dune couronne de diodes laser mettant 633 ou 660 nm place autour dune camra CCD refroidie. Cette camra est quipe de filtres capables de sparer le rayonnement dexcitation diffus des signaux de fluorescence mis par les traceurs pralablement injects ; en effet, ces filtres laissent uniquement passer les longueurs donde suprieures 665 ou 690 nm en fonction de la longueur donde dexcitation (633 ou 660 nm).

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Le temps dacquisition dune image varie entre dix et quelques centaines de millisecondes. Le systme de filtration permet galement de travailler en lumire inactinique. Cet quipement est dsormais couramment utilis au laboratoire pour imager des tumeurs laide de traceurs spcifiques marqus par des fluorophores mettant dans le proche infrarouge.

Figure II-6 : Imagerie de fluorescence par rflectance.

II.2.3.2. Tomographie de fluorescence

Contrairement au premier dispositif qui permet dobtenir uniquement des images en deux dimensions, la tomographie de fluorescence donne accs des reconstructions en trois dimensions. Avec ce dispositif, lacquisition se fait par transmission : la camra qui recueille la fluorescence se situe de lautre ct de lanimal par rapport au faisceau dexcitation laser. Ce faisceau laser balaie la zone tudier en se dplaant selon les axes du plan, de manire illuminer successivement une srie de points de lanimal. Pour chaque position du laser, un clich de fluorescence et de transmission des tissus sont enregistrs. Lanalyse de lensemble des clichs obtenus permet, aprs traitement par des algorithmes, dobtenir des reconstructions en trois dimensions incluant la localisation dans lespace des sources de fluorescence.

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Chapitre II : Imagerie mdicale

Figure II-7 : Tomographie de fluorescence.

Les deux dispositifs dcrits sont implants au sein de la plateforme imagerie de fluorescence in vivo pour le petit animal dirige par Jean-Luc Coll situe lInstitut Albert Bonniot (IAB) [http://www-iab.ujf-grenoble.fr]. Toutes les exprimentations ralises sur le petit animal dans le cadre de ce travail ont t ralises au sein de cette plateforme dimagerie.

II.2.4. Traceurs
Limagerie de fluorescence ncessite, comme toutes les techniques dimagerie molculaire, linjection dagents de contraste ou traceurs, qui sont dans ce cas des fluorophores.

Parmi les molcules et matriaux fluorescents utiliss couramment en imagerie de fluorescence, on distingue les fluorophores organiques, les protines fluorescentes et les nanocristaux semi-conducteurs (Figure II-8).

Figure II-8 : a) Fluorophore organique (vert dindocyanine) ; b) Protine fluorescente ( Green Fluorescent Protein ou GFP) ; c) Nanocristaux semi-conducteurs.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

II.2.4.1. Fluorophores organiques

Les fluorophores organiques sont des molcules qui possdent le plus souvent de nombreuses insaturations conjugues. Le Chapitre IV prsente quelques structures de fluorophores organiques compatibles avec limagerie de fluorescence in vivo. A titre dexemple, on peut citer le cas du vert dindocyanine (ou ICG en anglais pour IndoCyanine Green ). Ce fluorophore est largement utilis depuis de nombreuses annes pour des exprimentations sur la souris, mais aussi sur lhomme puisquil fait partie des rares molcules fluorescentes autorises par la FDA. LICG est utilis dans le cadre dtudes vasculaires, que ce soit dans lil, le cerveau, ou le cur [57]. Les marqueurs organiques fluorescents peuvent aussi tre employs pour visualiser et localiser des cellules cancreuses in vivo dans le petit animal. Pour cela, des drivs du glucose comme le Cypate-mono-2-deoxy-glucose peuvent tre utiliss, le cypate tant une molcule fluorescente drive de lICG. Ces traceurs sont en effet rapidement absorbs par les cellules cancreuses du fait de leur forte consommation en glucose. Enfin, la dtection de tumeurs peut galement tre ralise grce lutilisation de fluorophores organiques, gnralement issus de la famille des cyanines, coupls des peptides ou des anticorps permettant de cibler spcifiquement certaines tumeurs [59].

II.2.4.2. Protines fluorescentes

Les fluorophores synthtiques ne sont pas les seuls utiliss en imagerie de fluorescence. En effet, il existe certaines protines naturelles qui ont des proprits de fluorescence, comme la Green Fluorescent Protein (GFP) [60-62]. La GFP est une protine issue dune mduse (Aequorea victoria) qui a pour proprit dmettre dans le vert lorsquelle est excite par une lumire bleue. Le gne codant pour la GFP peut tre utilis comme gne rapporteur : la squence gntique codant pour la protine fluorescente est insre entre un gne dintrt et son promoteur afin que lexpression du gne en question entrane galement la production de la protine fluorescente. La GFP peut donc tre considre comme un traceur activable. Cette technique a permis dtudier le dveloppement de diverses tumeurs chez la souris, mais aussi son dveloppement embryonnaire [59]. La GFP a cependant linconvnient dabsorber dans le bleu et dmettre dans le vert, longueurs donde

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Chapitre II : Imagerie mdicale

pour lesquels les tissus biologiques absorbent et diffusent fortement, rendant ainsi difficile sa dtection au sein dun animal vivant. Dautres protines fluorescentes ont donc t dveloppes la fois pour tre compatibles avec limagerie de fluorescence in vivo et pour largir la palette de couleurs : la production de diffrentes protines de fluorescence par diffrents gnes dintrt permet de visualiser plusieurs processus biologiques simultanment (multiplexage). Cette technologie ncessite nanmoins lutilisation de cellules et danimaux transgniques et est donc difficilement envisageable pour lhomme.

II.2.4.3. Nanocristaux semi-conducteurs fluorescents

Les nanocristaux semi-conducteurs ou botes quantiques [39] ( Quantum Dots en anglais), voqus dans le Chapitre I sont des fluorophores trs performants. Leurs principaux avantages rsident dans le contrle de la longueur donde dmission, limportant dplacement de Stockes et leur faible photoblanchiment. Ces nanoparticules, comprises entre 2 et 10 nanomtres de diamtre, sont constitues de quelques milliers datomes de matriaux semi-conducteurs tels que les couples cadmium/slnium, cadmium/tellure, indium/arsenic ou indium/phosphore. Du fait du confinement du semi-conducteur dans les trois dimensions au sein de la nanoparticule, les lectrons des nanocristaux ont des niveaux d'nergie discrets et quantifis. Ces niveaux d'nergie peuvent tre contrls par le changement de la taille et par la nature des atomes qui composent le nanocristal. Les proprits de fluorescence dcoulant directement de ces niveaux dnergie, le maximum dmission de fluorescence peut ainsi tre contrl.

II.2.4.4. Vers biocompatibles

de

nouvelles

sondes

nano-particulaires

Les botes quantiques que nous venons de dcrire ont dexcellentes proprits optiques. Cependant, leur composition et leur mtabolisation une fois injectes dans un organisme vivant soulvent des interrogations quant leur biocompatibilit. Parmi les autres types de traceurs optiques nano-particulaires, on trouve galement des nanoparticules de silice [38] ou de polymres [63] encapsulant plusieurs molcules de fluorophores. Nanmoins, ces

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

particules soulvent les mmes questions que les botes quantiques en termes de biocompatibilit et dlimination. Les avantages dcoulant de lutilisation des nanoparticules, dtaills dans le chapitre I, incitent malgr tout au dveloppement de nouvelles nano-structures pour limagerie de fluorescence. En effet, lutilisation de telles sondes peut permettre daugmenter fortement la sensibilit de limagerie optique puisque chaque particule vhicule de nombreuses molcules fluorescentes : la reconnaissance dun rcepteur par un ligand prsent sur la nanoparticule est ainsi associe un nombre important de fluorophores, facilitant la dtection de cette reconnaissance. De plus, les fluorophores encapsuls au sein de ces particules prsentent gnralement une meilleure photostabilit. Enfin, leur structure nanoparticulaire leur permet une plus grande versatilit et une approche multifonctionnelle associant diverses modalits dimagerie et/ou dagents thrapeutiques. Nous avons donc cherch, au cours de ces travaux, dvelopper de nouvelles nanoparticules organiques fluorescentes biocompatibles et autant que possible bioassimilables par lorganisme.

II.3. Conclusions
Nous venons de voir lintrt de limagerie molculaire pour ltude et la comprhension de pathologies, mais galement pour leur dtection et leur traitement. Parmi lventail des diffrentes modalits dimagerie, la fluorescence prsente de nombreux avantages tels que la rapidit dacquisition, un faible cot, un encombrement rduit, et une grande sensibilit. Toutefois, limagerie molculaire est fortement lie aux traceurs. Il existe ainsi un rel besoin de traceurs facilement modifiables pour pouvoir imager diffrents processus biologiques. Un des objectifs de ce travail a donc t de dvelopper de nouvelles nanoparticules pouvant agir comme traceurs optiques. Dautre part, lutilisation de limagerie de fluorescence constitue galement un outil prcieux pour la comprhension de la biodistribution des nanoparticules et de leur comportement in vivo. En effet, mme si laccent sera par la suite mis sur les proprits de fluorescence des nouvelles nanoparticules synthtises, il ne faut pas oublier quun des objectifs est dobtenir terme un vecteur versatile capable de vhiculer un agent de contraste et/ou un agent thrapeutique.

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Chapitre II : Imagerie mdicale

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Les chapitres prcdents ont rappel lintrt des nanoparticules pour le vivant, que ce soit pour la dlivrance de mdicaments ou en tant quagents dimagerie, mais galement lattention particulire qui doit tre porte la biocompatibilit de ces collodes. Ce chapitre est quant lui consacr llaboration de nouvelles nanoparticules organiques biocompatibles bases sur des nano-mulsions de type huile dans eau. Les nano-mulsions sont dveloppes pour tre utilises en tant que transporteurs (ou cargo) de molcules dintrt ; dans le cas prsent il sagit dun marqueur fluorescent. De tels transporteurs ont comme fonction dassurer la protection de la molcule dintrt avant et aprs injection (ici nous nous focaliserons sur la voie veineuse), de favoriser son accumulation dans les tissus biologiques cibls, et le cas chant de contrler le relargage de la molcule dintrt (dans notre cas le fluorophore ne doit pas diffuser hors des globules pendant tout le temps ncessaire limagerie). Les nano-mulsions formules ici doivent donc tre : biocompatibles : les nano-mulsions tant destines circuler dans le systme sanguin, elles doivent tre composes dlments non toxiques tolrs par lorganisme. furtives : afin daugmenter la proportion de nano-mulsions atteignant le tissu biologique cibl, il est souvent ncessaire davoir des temps de circulation dans le sang importants (voir Chapitre 1). strilisables : toutes les solutions injectables dans le systme sanguin doivent tre striles afin dviter toute contamination par des microorganismes. Cest pourquoi le diamtre des nano-mulsions doit tre infrieur 100 nm afin de faciliter la strilisation par filtration. De plus, de telles petites tailles sont ncessaires lextravasion hors du systme sanguin et linternalisation cellulaire, ce qui constitue un avantage pour certaines applications biologiques. stables : les solutions de nano-mulsions doivent pouvoir tre stockes pendant plusieurs mois sans dstabilisation collodale significative.

Aprs avoir donn une description des nano-mulsions et dtaill les avantages attendus de leur utilisation, ce chapitre se focalisera sur le choix des constituants et de la technique dmulsification afin de rpondre aux critres prcdemment noncs. Ainsi une formulation dite de rfrence et ses proprits physiques seront prsentes. Enfin quelques

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions

formulations issues de variations autour de celle de rfrence seront dcrites, afin dillustrer limpact de certains facteurs sur la taille des nano-mulsions.

III.1. Dfinition mulsions

et

proprits

des

nano-

III.1.1. Les mulsions


Les mulsions sont des matriaux dont lusage est trs rpandu et les applications larges. En effet, elles sont fortement prsentes dans les domaines agroalimentaire et cosmtique mais elles sont galement la base de nombreuses peintures et servent mme dposer le bitume qui recouvre nos routes. Mais ici ce sont leurs utilisations pour la dlivrance de molcules actives in vivo qui nous intressent.

III.1.1.1. Dfinitions

Une mulsion est le mlange de deux liquides immiscibles ou faiblement miscibles. Un liquide (la phase disperse) est dispers sous forme de gouttelettes dans un autre (la phase continue). Les mulsions sont gnralement thermodynamiquement instables, mais lajout de surfactants permet de stabiliser linterface entre les deux liquides et confre ainsi aux mulsions une stabilit cintique plus ou moins grande. Il est noter quil existe des mulsions thermodynamiquement stables, celles-ci sont dsignes sous lappellation de micro-mulsions. La nature de la phase disperse (nomme galement discontinue ou interne) et celle de la phase continue (appele aussi externe ou dispersante) permettent de dfinir deux types dmulsion : les mulsions de type huile dans eau (H/E ou O/W pour oil in water en anglais) o la phase disperse est lipophile et la phase continue hydrophile ; et les mulsions de type eau dans huile (E/H ou W/O pour water in oil en anglais) o cette fois la phase disperse est hydrophile et la phase continue est lipophile.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

III.1.1.2. Emulsions naturellement prsentes dans lorganisme

Des mulsions de type huile dans eau base de triglycrides, de cholestrol, de phospholipides et de protines amphiphiles sont naturellement prsentes dans lorganisme et plus particulirement dans la lymphe et le sang. Les graisses ingres sont absorbes au cours de la digestion par des cellules de lintestin grle, puis transfres et transportes sous forme de chylomicrons dans le systme lymphatique. Les chylomicrons sont des lipoprotines, c'est--dire des mulsions stabilises la fois par des phospholipides et par des protines amphiphiles nommes apolipoprotines. Ils sont composs 98 % de lipides (88 % de triglycrides / 8 % de phospholipides / 1 % de cholestrol estrifi) et 2 % de protines ; leur diamtre est compris entre 20 et 1000 nm. Les chylomicrons rejoignent la circulation sanguine lorsque le rseau lymphatique se dverse dans le sang au niveau de la veine sous-clavire. Une partie des chylomicrons (ceux dont la taille est infrieure 200 nm) vont ensuite tre capts par le foie, et transforms en dautres lipoprotines telles que les HDL ( High Density Lipoprotein ) ou les LDL ( Low Density Lipoprotein ) dont la composition, la taille, et la nature des apolipoprotines sont diffrentes. Ce sont ces lipoprotines synthtises par le foie qui seront assimiles et utilises par les cellules de lorganisme. Les chylomicrons en circulation, notamment ceux dont le diamtre est suprieur 200 nm, vont eux voluer vers des tailles plus petites par changes de matire avec les autres chylomicrons et les lipoprotines au cours de leur sjour dans le compartiment sanguin, permettant ainsi leur capture et leur mtabolisation par les cellules du foie. Enfin une partie des chylomicrons en circulation dans le sang est galement assimile et stocke par les cellules adipeuses. Les chylomicrons et les diffrentes lipoprotines jouent galement un rle important dans le temps de circulation sanguine des nanoparticules injectes [43]. Les lipoprotines changent couramment entre elles des apolipoprotines et du cholestrol au cours de leur circulation dans le systme sanguin. Il semblerait que de la mme manire elles aient aussi la capacit de rduire la furtivit des collodes et particulirement celle des liposomes, en capturant les polymres de furtivit par change de surfactants. Laltration de la couche de rpulsion strique rend alors possible la fixation des opsonines la surface des nanoparticules, conduisant ainsi leur phagocytose par les macrophages du systme rticuloendothlial (voir Chapitre I et Chapitre V).

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions

III.1.1.3. Emulsions pour la dlivrance de mdicaments

De

nombreuses

formulations

dmulsions

ont

dveloppes,

et

mme

commercialises pour certaines, afin de transporter des molcules thrapeutiques aprs injection intraveineuse. Ces formulations sont pour la plupart composes dune phase disperse constitue de triglycrides. Les globules, stabiliss par une couche de phospholipides et de surfactants pegyls, ont gnralement un diamtre aux alentours de 250 nm [64]. La production des ces mulsions submicromtriques seffectue principalement par homognisation haute pression dune mulsion grossire prpare par agitation mcanique dune solution aqueuse contenant les surfactants, et de la phase huileuse contenant le principe actif [65] (voir III.2.2). Les SLN ( Solid Lipid Nanoparticles ) presents dans le chapitre I que lon pourait assimils des nano-mulsions pour lesquelles la phase disperse est cristalise sont galement utiliss pour encapsuler et vehiculer des agents thrapeutiques, et princapalement des anticancreux [28].

III.1.2. Les nano-mulsions

III.1.2.1. Dfinitions

Les nano-mulsions sont une sous-classe dmulsions dont le diamtre est compris dans une gamme nanomtrique . Cependant, il ny a pas encore de consensus dans la littrature pour dfinir prcisment cette gamme, qui peut varier fortement : 10 100 nm [6668], 20 200 nm [34, 68-70] ou encore 100 1000 nm [71]. Nous retiendrons ici la dfinition de Solans et al. [34], soit un diamtre compris entre 20 et 200 nm. Les nano-mulsions sont des systmes thermodynamiquement instables.

III.1.2.2. Proprits particulires

Si dun premier abord, seul le diamtre semble diffrencier les nano-mulsions des mulsions de taille micromtrique, de nombreuses proprits dcoulent de ce seul paramtre. - 57 -

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Parmi les proprits qui seront intressantes dans notre cas, on peut citer leur grande stabilit, leur relative transparence, et la possibilit de les striliser par filtration.

III.1.2.2.1. Stabilit

La dispersion dune phase dans une autre sous forme dmulsion nest pas thermodynamiquement stable. Il existe en effet plusieurs processus de dstabilisation (rversible ou irrversible) qui vont favoriser lvolution du systme dispers vers son tat final stable thermodynamiquement, c'est--dire une solution biphasique. Le crmage (migration de la phase disperse vers le haut de la solution) ou la sdimentation (migration vers le bas de la solution) sont des phnomnes rversibles de dstabilisation des mulsions, puisque lagitation de la solution permet de redisperser les gouttelettes. Ces phnomnes favorisent cependant la coalescence, un phnomne irrversible, en entranant une augmentation de la concentration locale en particules et donc des probabilits de contact entre les globules plus importantes. La vitesse de migration des gouttelettes (par crmage ou par sdimentation) est rgie par la loi de Stockes (quation III.1) : v= 2 gr 2 9 c (quation III.1) vitesse de migration de la goutte (m.s-1) acclration due la pesanteur (m.s-2) diffrence entre les masses volumiques des phases (kg.m-3) rayon de la goutte (m) viscosit dynamique de la phase continue (Pa.s)

Avec

v
g

La vitesse de crmage (ou de sdimentation) tant proportionnelle au carr du rayon des globules, la diminution du diamtre de ces gouttelettes permet de ralentir fortement la vitesse de migration verticale. En outre, pour des diamtres de lordre de quelques dizaines de nanomtres, le mouvement brownien (qui dcrit le mouvement alatoire dune particule dans un fluide) devient prdominant devant le mouvement li la pesanteur, permettant ainsi de maintenir indfiniment une homognit parfaite de la solution (il ny a plus de phnomne de crmage ou de sdimentation) [68].

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions

Cependant, si grce leur faible taille les nano-mulsions ne sont pas concernes par les phnomnes de dstabilisation rversibles que sont le crmage et la sdimentation, elles restent nanmoins soumises aux phnomnes de dstabilisation irrversibles que sont la coalescence et le mrissement dOstwald (Figure III1). La coalescence correspond la rupture du film de surfactants sparant deux globules en contact, entranant ainsi la fusion entre deux gouttelettes. Le mrissement dOstwald intervient quand la phase disperse est faiblement soluble dans la phase continue. Dans ce cas, la pression de Laplace plus importante dans les globules de faible diamtre va forcer la solubilisation de molcules de la phase disperse dans la phase continue, qui vont ensuite tre prfrentiellement assimiles par les plus grosses gouttelettes (car la pression de Laplace y est plus faible). Ce phnomne engendre donc un transfert de la phase disperse des petits globules vers les plus grands via la phase continue, entranant une augmentation de la taille globale des gouttelettes. Etant donns leurs faibles diamtres, les nano-mulsions sont trs sensibles au mrissement dOstwald, qui est de ce fait la cause majeure de vieillissement de ces systmes collodaux.

Figure III1 : Schma des phnomnes de dstabilisation irrversibles des mulsions. (1) Coalescence : la coalescence correspond la fusion de deux globules par rupture du film de surfactants les stabilisant. (2) Mrissement dOstwald : le mrissement dOstwald intervient quand la phase disperse est soluble (mme faiblement) dans la phase continue. La diffrence de pression de Laplace qui existe entre les globules de faible diamtre et ceux de taille plus importante va entraner une migration des molcules de la phase disperse des petits vers les gros globules.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

III.1.2.2.2. Transparence

Les mulsions de taille micromtrique diffusent fortement la lumire visible, et moins que les indices de rfraction de la phase disperse et de la phase continue ne soient ajusts, elles apparaissent blanches et opaques. En revanche, comme la taille des gouttelettes des nano-mulsions est largement infrieure aux longueurs donde du spectre visible (400-700 nm), la lumire nest pas ou peu diffuse et ainsi, mme avec une diffrence dindices de rfraction importante, les nano-mulsions sont quasiment transparentes [68]. Ainsi, les solutions de nano-mulsions dont le diamtre de gouttelettes est proche de 100 nm sont troubles, et plus le diamtre augmente plus les solutions deviennent opaques. Cette caractristique optique permet donc dvaluer la stabilit des nano-mulsions par un simple contrle visuel, puisque laugmentation de la taille dune faible minorit de globules suffit rendre la solution trouble.

III.1.2.2.3. Strilisation

Le faible diamtre des nano-mulsions rend possible une strilisation des solutions par filtration sur des membranes dont les pores font 0,22 m. Une telle taille de pores permet dliminer toute contamination de la solution par des microorganismes [72]. Cette technique est plus simple mettre en uvre que lirradiation et moins dstabilisante que la strilisation par la chaleur.

III.1.2.3. Applications particulires

Les nano-mulsions sont des collodes dont ltude et le dveloppement sont rcents. Nanmoins, ces nano-objets apparaissent dj trs prometteurs pour de nombreuses applications. Leur transparence par rapport aux mulsions de taille micromtrique est un atout indniable pour lindustrie cosmtique car elle est lie aux notions de puret, de simplicit et de fracheur. De plus, les nano-mulsions peuvent tre facilement absorbes par la peau et leur faible taille permet une strilisation par filtration [66, 73]. Les nano-mulsions sont galement des particules de choix pour la dlivrance de mdicaments. Cependant, si de nombreuses quipes de recherche travaillent sur lencapsulation de principes actifs dans des mulsions de taille submicromtrique - 60 -

Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions

(gnralement autour de 250 nm de diamtre [64]) peu dentre elles se focalisent sur lutilisation de nano-mulsions pour vectoriser des mdicaments [70, 74, 75]. Pourtant leur trs faible diamtre permet de favoriser leur circulation dans lorganisme en limitant leur limination, notamment par le foie et la rate [75]. On peut galement noter lexistence de travaux sur lencapsulation de pesticides [69] ou encore ltude des proprits antimicrobiennes propres certaines formulations de nanomulsions [76].

III.2. Choix de la formulation


Les nano-mulsions dcrites ici sont de type huile dans eau : la phase disperse est de lhuile et la phase continue est une solution aqueuse. Lmulsification consiste disperser finement la phase huileuse sous forme de gouttelettes de quelques dizaines de nanomtres de diamtre dans la phase aqueuse, les gouttelettes tant stabilises par la formation dune couche de surfactants entre la phase disperse et la phase continue.

Nous avons choisi, pour des raisons de biocompatibilit, des constituants reconnus comme inoffensifs (GRAS : Generally Recognized As Safe) par la FDA. Les nano-mulsions se composent ainsi dun mlange de phospholipides et de surfactants pegyls afin de stabiliser les gouttelettes de glycrides, tous ces constituants tant dores et dj utiliss dans des formulations dmulsions submicromtriques pour la dlivrance de mdicaments.

Pour obtenir des nano-mulsions stabilises au moins en partie par des phospholipides, il est ncessaire demployer des quantits beaucoup plus importantes de ces molcules que dans le cas des mulsions submicromtriques, pour lesquelles les surfactants sont gnralement apports par la phase continue (III.1.1.3). Or la dissolution dune quantit importante de phospholipides dans leau est un procd long et fastidieux. En effet, les phospholipides doivent dans un premier temps tre dissous dans un solvant organique ; puis ce solvant est vapor de manire former un film lipidique, qui est ensuite rhydrat par une solution aqueuse, et enfin soniqu afin de disperser la totalit des phospholipides sous forme de liposomes. Afin dviter ce long processus de dissolution, nous avons choisi de dissoudre les phospholipides dans la phase huileuse plutt que dans la phase continue. Bien que les

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phospholipides soient connus pour tre peu solubles dans les huiles organiques, lutilisation de certaines cires permet nanmoins de grandement amliorer cette solubilit. La phase disperse des nouvelles formulations dveloppes est donc compose dune huile vgtale et dune cire, afin de pouvoir solubiliser les phospholipides dans la phase huileuse.

III.2.1. Dtails des constituants

III.2.1.1. Surfactants

La couche de surfactants utilise pour stabiliser linterface entre la phase disperse et la phase continue est compose de lcithine associe des surfactants pegyls.

III.2.1.1.1. Lcithine

La lcithine est un mlange de molcules amphiphiles zwittrioniques dorigine naturelle, majoritairement composes de phospholipides. Les structures des principales molcules composant la lcithine sont illustres sur la Figure III2. Les phospholipides sont les principaux constituants des bicouches lipidiques formant les membranes des cellules ; cest pourquoi, outre leurs proprits mulsifiantes, ils sont aussi biocompatibles et bioassimilables. Ils confrent ainsi aux nano-mulsions un certain biomimtisme avec les lipoprotines et les cellules, permettant ainsi daugmenter la furtivit des particules une fois en suspension dans le systme sanguin. La lcithine utilise dans les formulations de nano-mulsions est issue de graines de soja ; la composition des acides gras quelle contient est donc similaire celle des triglycrides de lhuile de soja (principalement des acides gras insaturs comportant 18 atomes de carbone). La masse molaire de la lcithine a t arbitrairement fixe 750 g/mol, ce qui correspond la masse molaire moyenne des phospholipides la composant.

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions


O O P R1 O O O O O O O O N R1 O O O O O P O NH3

a)
R2

b)
R2

O P N O O OH R

OH

c)

d)

Figure III2 : Structure des principaux composants de la lcithine. a) Phosphatidylcholine ; b) Phosphatidylthanolamine ; c) Lysophosphatidylcholine ; d) Acide gras (R, R1, R2 : rsidus d'acides gras). Les acides gras naturels sont constitus dune chane carbone de 4 28 atomes de carbone sature ou non. Ceux entrant dans la composition de la lcithine de soja possdent plus particulirement 18 atomes de carbone et sont polyinsaturs.

III.2.1.1.2. Surfactants pegyls

Les surfactants pegyls sont des molcules amphiphiles non ioniques de synthse dont la partie hydrophile comporte des motifs polyoxythylne (POE ou par abus PEG). Ces chanes peuvent tre linaires comme dans le cas des starates de polyoxythylne (commercialiss sous la dnomination Myrj par la socit Croda) ou bien ramifies dans le cas des Tween (voir la Figure III3). Les surfactants pegyls sont biocompatibles et possdent de bonnes proprits mulsifiantes et stabilisantes grce la rpulsion strique engendre par leurs chanes polyoxythylne hydrophiles. Ces chanes permettent galement daugmenter la furtivit des nano-mulsions vis--vis des systmes de dfense biologique (voir Chapitre I). Le principal surfactant pegyl utilis est le starate de polyoxythylne 50 (Myrj 53) commercialis par Croda. Mais les starates de polyoxythylne 20 ou 100 (respectivement Myrj 49 et Myrj 59) et le Tween 80 vendu par Sigma-Aldrich entrent aussi dans la composition de certaines formulations. Le Tableau III1 indique les masses molculaires moyennes de ces surfactants, ainsi que le nombre de motifs polyoxythylne quils comportent.

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OH O
w

OH O
x

a)
C17H35

O O O
n-1

b)
OH C17H33

O O O
z

OH O
y

Figure III3 : Structures des surfactants pegyls. a) Starate de polyoxythylne ou Myrj (avec n = 20 ; 50 ; 100) ; b) Tween 80 ( avec w+x+y+z=20).

Surfactant TWEEN 80 Myrj 49 Myrj 53 Myrj 59

Nombre de motifs POE 20 20 50 100

Poids molculaire (g/mol) 1310 1164 2484 4684

Tableau III1 : Masses molaires et nombre de motifs des surfactants pegyls utiliss.

III.2.1.2. Phase disperse

Comme dcrit prcdemment, la phase disperse est un mlange de glycrides constitu dune huile et/ou dune cire permettant daugmenter la solubilit des phospholipides.

III.2.1.2.1. Huile de soja

Un des constituants de la phase disperse est une huile vgtale : lhuile de soja. Cette huile biocompatible et bioassimable est principalement compose de triglycrides chanes grasses longues et insatures. Elle est autorise linjection principalement dans le cas de la nutrition parentrale, du fait de sa richesse en acides gras essentiels (voir Tableau III2 et Chapitre I). Le Tableau III2 indique le pourcentage moyen des principaux acides gras qui composent lhuile de soja [77].

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions


Nature des acides gras C16 C16 :1 C18 C18 :1 C18 :2 C18 :3 Pourcentage 8,0 13,3 % < 0,2 % 2,4 5,4 % 17,7 26,1 % 49,8 57,1 % 5,5 9,5 %

Tableau III2 : Composition de l'huile de soja. La notation des acides gras seffectue selon la nomenclature de type C:, o correspond au nombre datomes de carbone et au nombre dinsaturations de la chane carbone.

Nous avons slectionn cette huile car les triglycrides qui la composent sont considrs comme insolubles dans leau, ce qui est une proprit indispensable pour minimiser le processus de mrissement dOstwald, responsable en grande partie de la destabilisation collodale des nano-mulsions.

III.2.1.2.2. Suppocire NC

La cire utilise pour la formulation des nano-mulsions est la Suppocire NC commercialise par Gattefoss. Cette cire est une huile de synthse compose de glycrides (mono-, di-, triglycrides) dacides gras saturs dorigine naturelle, comportant principalement entre 12 et 18 atomes de carbone (Tableau III3). La Suppocire NC est solide temprature ambiante et fond sur une plage de temprature relativement large centre autour de 38C. Compte tenu de la prsence dacides gras chane moyenne et de fonctions alcool libre sur les mono- et diglycrides, cette cire est trs faiblement soluble dans leau, mais elle possde en contrepartie un important pouvoir de solubilisation.

Longueur de la chane carbone des glycrides C8 C10 C12 C14 C16 C18 Tableau III3 : Composition de la Suppocire NC.

Pourcentage 0,1 0,9 % 0,1 0,9 % 25 50 % 10 24,9 % 10 24,9 % 10 24,9 %

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III.2.2. Choix de la technique dmulsification


Les techniques permettant dobtenir des nano-mulsions sont peu nombreuses. Elles peuvent tre classes en deux catgories : les techniques basse nergie et les techniques haute nergie.

Les techniques basse nergie utilisent certaines proprits physico-chimiques des constituants pour obtenir des nano-mulsions avec un apport nergtique relativement faible. Par exemple, les techniques dites de temprature dinversion de phase ou PIT (acronyme anglais pour Phase Inversion Temperature) se basent sur le changement de solubilit des chanes polyoxythylne en fonction de la temprature. Les surfactants contenant des motifs polyoxythylne sont en gnral solubles en milieu aqueux temprature ambiante, mais ils deviennent liposolubles quand la temprature augmente du fait de la dshydratation des chanes polyoxythylne. Cette inversion de solubilit est mise profit pour obtenir des nanomulsions. Une micro-mulsion est prpare une temprature suprieure celle de linversion de solubilit du surfactant : celui-ci se trouve alors encapsul dans la phase disperse. En refroidissant la solution, les chanes polyoxythylnes vont se rhydrater et les surfactants vont migrer vers linterface, dformer la membrane et provoquer la cration de globules de faible diamtre, aboutissant ainsi la formation dune nano-mulsion. Les caractristiques finales des globules dpendent fortement de la structure de la micro-mulsion initiale [34, 78, 79]. Dautres techniques dobtention de nano-mulsions se basant sur linversion de phase catastrophique ont galement t utilises [69, 79]. Linversion de phase catastrophique ou CPI (sigle anglais pour Catastrophic Phase Inversion) consiste dstabiliser une micro-mulsion en ajoutant la solution un volume important de phase disperse. Cela induit une forte augmentation du taux de coalescence et conduit au final linversion de lmulsion et la formation de gouttelettes de faible taille. Ces techniques basse nergie sont couramment employes pour obtenir des nanomulsions. Cependant, comme les proprits finales des collodes dpendent en grande partie de la nature des micro-mulsions de dpart, ces mthodes imposent une grande rigueur sur la formulation. Elles laissent peu de marge de manuvre pour optimiser la formulation des nano-mulsions, notamment en fonction de leur comportement en milieu biologique. De plus, lincorporation de surfactants fonctionnalisables risque de perturber fortement le processus dmulsification. Or de tels surfactants sont ncessaires pour le greffage de ligands

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions

biologiques permettant une vectorisation active des nano-mulsions dans la zone dintrt (voir Chapitre VI).

Les techniques haute nergie se basent quant elles sur lapplication dune force mcanique de cisaillement capable de fractionner les globules en particules de plus petite taille. Deux technologies diffrentes permettent de fournir un cisaillement suffisamment puissant pour former des nano-mulsions : les homogniseurs haute pression et les sondes ultrasons. Le principe de fonctionnement des homogniseurs haute pression est le suivant : la phase disperse et la phase continue sont prmlanges de manire former une mulsion grossire. Cette solution est ensuite projete haute pression (jusqu' 150 MPa) dans une chambre dinteraction, dont la gomtrie est tudie pour gnrer un intense cisaillement capable de rduire fortement la taille des globules [66, 73, 74, 80, 81]. Bien que lobtention dmulsions submicroniques par sonication soit connue [71, 82, 83], et que les ultrasons soient capables de fournir de trs importantes quantits dnergie, cette technique est relativement peu utilise pour la production de nano-mulsions [70, 75]. Lhomognisation haute pression ou les techniques basse nergie sont en effet plus couramment employes. La sonication possde pourtant des avantages non ngligeables : en tant que technique haute nergie, elle permet davoir une grande libert sur la formulation, et linverse de lhomognisation haute pression, elle permet de travailler sur des plus petits volumes et avec des viscosits plus importantes. La sonication est par consquent la technique qui a t utilise pour obtenir lensemble des nano-mulsions dcrites dans ce travail. Le processus dmulsification par sonication est rappel ci-aprs. Un gnrateur convertit le courant lectrique discontinu (50/60 Hz) en une nergie lectrique haute frquence (20kHz). Ce courant est transmis vers un transducteur o il est chang en vibrations mcaniques longitudinales grce un cristal pizo-lectrique. Ces vibrations sont ensuite amplifies par la sonde (sonotrode) et transmises au liquide sous la forme dondes ultrasoniques consistant en une succession de compressions et de dpressions. Ces variations de pression engendrent la formation de bulles microscopiques (dair ou de vapeur) appeles cavits. Ces cavits se dilatent durant les phases de dpression et implosent violemment durant les phases de compression. Leffondrement des bulles provoque alors localement un puissant cisaillement saccompagnant dune lvation de la temprature.

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Bien que ce phnomne, appel cavitation, dure seulement quelques millisecondes et que lnergie libre par chaque bulle soit faible, sa frquence fait que lnergie cumule gnre par toutes les bulles de cavitation est trs leve. Il en rsulte une intense agitation lchelle de lchantillon, et donc la dispersion de la phase huile dans la phase aqueuse sous forme de gouttelettes de faibles diamtres. Lintensit du phnomne de cavitation varie fortement avec les proprits du milieu, notamment la tension de vapeur, la viscosit, la densit, et toutes les proprits lies la quantit de molcules ou dions en solution. Lnergie requise pour former une bulle de cavitation est proportionnelle la tension de surface et la pression de vapeur. Ainsi, plus la tension de surface est importante, plus lnergie ncessaire pour produire les cavits est importante. Cependant lnergie de londe de choc libre est alors plus importante lorsque les bulles seffondrent. De la mme manire, plus la viscosit de la solution est importante, plus la puissance ncessaire pour former les bulles de cavitation est grande, mais en contrepartie lnergie libre par leffondrement de ces bulles est galement plus intense. Lappareil de sonication utilis pour obtenir les nano-mulsions est un sonificateur AV505 (Sonics, Newtown USA) qui peut tre quip de deux sondes diffrentes : une sonde de 13 mm de diamtre et une sonde conique de 3 mm de diamtre. Trois paramtres permettent de moduler la sonication : la puissance, les impulsions (pulses) et le temps de sonication. La puissance sexprime en pourcentage de la puissance totale de lappareil (500 W). Lutilisation de la sonde conique impose de ne pas dpasser 40 % de la puissance maximale. Nanmoins, comme la surface de la sonde conique est largement infrieure celle de la sonde classique, la puissance dlivre localement est plus grande in fine. Il est possible de soniquer la solution en continu ou par impulsions (pulses). Dans le cas de la sonication discontinue, la dure de chaque impulsion (pulse on) ainsi que le temps de repos (pulse off) entre deux impulsions dultrasons doivent tre dfinis (en secondes). Soniquer la solution par impulsions et non en continu permet dune part dquilibrer la solution grce aux temps de repos entre les impulsions, mais cela permet galement de limiter llvation de la temprature de la solution. Il est noter que le temps de sonication correspond la somme de toutes les impulsions de sonication (pulse on) et diffre donc du temps total de sonication qui comprend aussi les phases de repos (pulse off).

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions

III.2.3. Protocole gnral de fabrication


Les nano-mulsions, de type huile dans eau, sont obtenues par sonication de la phase huileuse dans la phase aqueuse. La phase disperse est compose dun mlange dhuile de soja et de Suppocire NC. Les globules sont stabiliss par lassociation de lcithine et de surfactant pegyl. Cependant, pour des raisons de solubilit, la lcithine est dissoute dans la phase disperse : lassociation de la lcithine et du mlange huile/cire est nomme phase huileuse. Un solvant organique (dichloromthane) est ajout pour faciliter la dissolution de la lcithine. Une fois tous les composs dissous, le solvant est vapor sous vide une temprature suprieure celle de fusion de la cire. Le surfactant pegyl est quant lui apport par la phase continue qui, en plus de la solution aqueuse, peut ventuellement comporter du glycrol afin daugmenter la viscosit. En effet, une phase continue visqueuse favorise le processus dmulsification et permet aussi dviter les projections lors de la sonication. La phase aqueuse est prpare par mlange chaud du glycrol, du surfactant pegyl et de la solution aqueuse. Les deux phases pralablement maintenues environ 50C sont mlanges et la solution diphasique est sonique directement jusqu' obtention dune solution transparente de nano-mulsions (Figure III4).

Figure III4 : Schma du protocole de prparation d'une solution de nano-mulsions.

Une reprsentation graphique des nano-mulsions est prsente ci-dessous (Figure III 5).

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Figure III5 : Schma de la structure des nano-mulsions.

Les nano-mulsions sont produites par lot ; les volumes de lot couramment utiliss sont de 2 mL ou 5 mL, mais des lots de 100 mL ont aussi t raliss. Lannexe III dcrit les paramtres de sonication utiliss en fonction du volume du lot.

III.3. Caractristiques de la formulation de rfrence


La formulation dcrite dans ce paragraphe est dite de rfrence, car cest partir delle que la grande majorit des tudes physiques, optiques et biologiques a t ralise. Cest pourquoi, dans la suite de ce travail les nano-mulsions dcrites ont t obtenues avec la formulation de rfrence, sauf mention contraire.

III.3.1. Composition
Le Tableau III4 indique la composition de la formulation de rfrence. La phase disperse reprsente 10 % de la masse totale et est compose 75 % de Suppocire NC et 25 % dhuile de soja. La formulation comprend deux types de surfactants : la lcithine et un surfactant pegyl, reprsentant respectivement 6,90 % et 11,40 % de la masse totale de la solution finale. Le surfactant pegyl est un starate de polyoxythylne dont la chane hydrophile se compose de 50 motifs polyoxythylne (Myrj 53). Son poids molculaire est denviron 2500 g/mol, la chane hydrophile ayant elle seule une masse molaire de 2250 - 70 -

Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions

g/mol. Le surfactant pegyl reprsente 33 % en moles de la quantit totale de surfactants, tandis que la lcithine en reprsente 67 %, sa masse molaire ayant t fixe 750 g/mol. La fraction globale de surfactants est ainsi de 18,3 % en masse, ce qui est nettement suprieur la quantit de phase disperse. La quantit de matire rellement disperse est donc largement suprieure aux 10 % mentionns plus haut, la solution saline ne reprsentant finalement que 69,20 % de la masse totale de lmulsion. Enfin, la formulation comprend galement 2,5 % de glycrol afin daugmenter la viscosit pour faciliter le processus dmulsification.

Masse (mg) Phase disperse Phase continue Surfactants Huile de soja Suppocire

% w/w 2,50 7,50 2,50 69,20 6,90 11,40

50 150 50 q.s.p 2000 138 228

NC

Glycrol Solution saline Lcithine Myrj 53

Tableau III4 : Composition de la formulation de rfrence pour un lot de 2 mL.

III.3.2. Proprits physiques


La formulation dcrite dans le paragraphe prcdent est mulsionne selon le protocole prsent dans la section III.2.3 (un protocole dtaill est disponible en annexe IV) et conduit une solution jaune translucide de nano-mulsions. Les paragraphes suivants sont ddis ltude des proprits physiques des nano-mulsions issues de la formulation de rfrence : taille des globules, potentiel zta, morphologie et tat du cur des globules.

III.3.2.1. Distribution en taille et taille moyenne

La diffusion quasi-lastique de la lumire, galement nomme spectroscopie par corrlation de photons ou DLS (sigle anglais pour Dynamic Light Scatering), permet daccder la distribution en taille de petites particules en solution. Lors de la mise en uvre de cette technique, une solution collodale est claire par un faisceau lumineux monochromatique. Une partie de la lumire diffuse par les particules est alors dtecte par un photomultiplicateur.

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Le mouvement brownien des particules modifie constamment les distances entre les particules diffusantes dans le temps. Le dplacement des particules engendre alors des fluctuations au niveau des interactions constructives et destructives de la lumire diffuse. Le traitement de ces fluctuations par un corrlateur numrique permet dobtenir une fonction dauto-corrlation du signal qui reprsente la probabilit pour une particule de se trouver un instant t+dt au mme point de lespace qu linstant t. Plus une particule est petite, plus cette probabilit est faible. Inversement, la probabilit augmente avec la taille des particules. Le traitement mathmatique de la fonction dauto-corrlation permet donc dobtenir la distribution en taille des particules. De plus, lutilisation de la thorie de Mie rend accessible la pondration de la distribution en volume et en nombre et permet ainsi de dfinir un diamtre moyen en volume ou en nombre. Le diamtre moyen des nano-mulsions est mesur par diffusion quasi-lastique de la lumire grce un Zeta-sizer Nano ZS (Malvern, Royaume-Uni). La Figure III6 reprsente la distribution en taille de nano-mulsions issues de la formulation de rfrence. Le diamtre moyen pondr en volume est de 35 2 nm, avec un indice de polydispersit (dfini comme le rapport de lcart type sur le diamtre moyen) proche de 0,170 ; la solution est donc lgrement polydisperse. Cependant, la mthode de production conduit une excellente reproductibilit de la distribution en taille des globules obtenus puisque le diamtre moyen ne varie que trs peu entre les diffrents lots de nano-mulsions raliss avec cette formulation.

30 25 20 % volume 15 10 5 0 1 10 d (nm)
Figure III6 : Distribution en taille (pondration en volume) d'une solution de nano-mulsions issues de la formulation dite de rfrence temprature ambiante aprs fabrication.

100

1000

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions

III.3.2.2. Potentiel Zta

Le potentiel zta caractrise la charge de surface des collodes en solution. Il ne correspond cependant pas la charge relle de la surface du collode, mais celle quil acquiert en solution. La solvatation dune particule charge entrane la formation dune double couche ionique. La couche la plus proche de la particule est compose dions de charge oppose celle de la surface de la particule. Ces ions sont solidement lis la particule, cest pourquoi cette couche dite de Stern est aussi nomme couche lie. La couche de Stern attire son tour des ions de charge oppose (donc de mme charge que la particule). Cette seconde couche appele couche diffuse ou couche de Gouy contient galement des ions de charge identique celle des ions de la couche lie (voir Figure III7), mais en concentration volumique moindre. Lorsque la particule est mise en mouvement, que ce soit par mouvement brownien ou induit (par un champ lectrique par exemple), il se forme un plan de glissement (ou plan glissant) au niveau de la double couche de solvatation : la couche de Stern et une partie de la couche de Gouy restent lies la particule et vont la suivre dans son mouvement, alors que le reste de la couche diffuse reste immobile ou bouge avec du retard par rapport la particule. Cest au niveau de ce plan de glissement que les particules interagissent entre elles et cest donc ce niveau que le potentiel zta est mesur.

Figure III7 : Schma de la double couche ionique de solvatation dune particule.

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Le potentiel zta est souvent mesur pour prdire la stabilit des particules en suspension. Lintensit de la force de rpulsion lectrostatique est en effet lie au potentiel zta : plus les particules ont un potentiel zta lev (en valeur absolue), plus elles vont se repousser et moins elles vont avoir tendance sagrger. Le potentiel zta des nano-mulsions a t mesur avec un Zeta-sizer Nano ZS (Malvern, Royaume-Uni). La solution de collodes est soumise un champ lectrique qui va dplacer les particules vers les lectrodes de charge oppose avec une vitesse proportionnelle lintensit du potentiel zta. Cette vitesse de dplacement est mesure par un anmomtre doppler laser. Le dcalage de frquence et de phase dun faisceau laser incident engendr par les particules en mouvement permet de dterminer la mobilit des particules. A partir de la viscosit de la phase continue, et grce lapplication de la thorie de Smoluchowski, la mobilit est convertie en potentiel zta.

Le potentiel zta des nano-mulsions de la formulation de rfrence est de -5 2 mV.

Le potentiel zta des nano-mulsions est trs proche de zro. Cette faible valeur peut sexpliquer par le fait que la lcithine est principalement compose de phospholipides zwittrioniques (donc globalement neutres), et que les surfactants pegyls sont quant eux non ioniques. Les charges ngatives observes sont sans doute lies aux acides gras libres apports par la phase disperse ou la lcithine. La prsence de la couche de surfactants pegyls contribue galement diminuer le potentiel zta puisque la barrire strique des chanes polyoxythylne entrane lloignement du plan de glissement par rapport la particule. Etant donn le faible potentiel zta des nano-mulsions, ce sont principalement les forces de rpulsion strique dues aux surfactants pegyls, et non les forces de rpulsion lectrostatique, qui permettent de contrebalancer les forces dattraction inter-particulaires de Van der Walls, vitant ainsi lagrgation des particules.

III.3.2.3. Morphologie

La morphologie des nano-mulsions peut tre observe grce la cryo-microscopie lectronique en transmission (CryoTEM : Cryo Transmission Electronique Microscopy).

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions

Cette technique permet dtudier des chantillons en solution dans leau et vite ainsi que les proprits morphologiques des particules tudies ne soient modifies par lvaporation du solvant qui est ncessaire pour lutilisation de la microscopie lectronique en transmission classique. La prparation des chantillons consiste dposer la solution sur une grille en carbone puis liminer la majorit de la solution de manire ne laisser quun film de quelques centaines de nanomtres dpaisseur dans les trous de la grille. La grille est ensuite rapidement plonge dans un bain dthane liquide (~ -180C) formant ainsi des films de glace amorphe. Lchantillon est ensuite plac dans une station de transfert maintenue -190C (azote liquide) qui est introduite dans la chambre du microscope lectronique en transmission (MET). Les grilles sont alors observes sur un MET (JEOL 2100HC) travaillant 200 kV quip dun filament LaB6. Les analyses ont t ralises par Audrey Royre en collaboration avec le service de microscopie lectronique de linstitut de biologie intgrative (IFR 83).

Les clichs reprsent Figure III8 montrent des particules de taille variable et aussi de formes diffrentes. En effet, si certaines particules semblent sphriques, on observe galement des formes plus allonges. Si on suppose que toutes les particules ont la mme forme mais quelles sont observes selon des orientations diffrentes alors deux formes distinctes sont envisageables : soit les particules sont des tubes, soit ce sont des disques pais.

Or on observe peu de formes sphriques ayant des diamtres compatibles avec la plus petite dimension des particules aux formes allonges. A linverse il y a plus de forme circulaire ayant une taille comparable avec la plus grande dimension des collodes oblongs. Ce constat signifie donc que lhypothse de particules sous forme de disques est privilgier. Le rapport mesur entre la hauteur des disques et leur diamtre est en moyenne de 0,5.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Figure III8 : Clichs de cryo-microscopie lectronique en transmission de nano-mulsions issus de la formulation de rfrence.

Ces structures rappellent celles de nanoparticules lipidiques solides (SLN) dj observes en CryoTEM nommes plaquettes mais en plus pais [84]. Cette technique permet galement de vrifier les informations obtenues par diffusion quasi-lastique de la lumire. La polydispersit des nano-mulsions mesur par DLS est galement observe sur les clichs de cryo-microscopie. Cependant les tailles des particules observes semblent lgrement infrieures celles obtenus par diffusion quasi-lastique de la lumire.

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions

III.3.2.4. Calorimtrie diffrentielle balayage

La calorimtrie diffrentielle balayage (Differential Scanning Calorimetry ou DSC en anglais) est une technique thermo-analytique permettant dobtenir les tempratures de transition de phase des matriaux, ainsi que les enthalpies qui y sont associes. Le principe de la mesure repose sur la diffrence de chaleur que lon doit fournir un chantillon donn par rapport une rfrence inerte pour les amener une mme temprature. La calorimtrie diffrentielle balayage permet donc de visualiser les transitions exothermiques telles que la cristallisation, et les transitions endothermiques comme la fusion. Le mlange huileux constitu dhuile de soja, de Suppocire NC et de lcithine est un solide temprature ambiante, et devient liquide autour de 37C. Cette proprit physique est due la Suppocire NC. Ainsi, lanalyse calorimtrique du mlange huileux montre bien la prsence dun phnomne endothermique stalant sur une large gamme de temprature centre autour de 37C qui correspond la fusion (Figure III9).

0 -0,5 -1 Flux de chaleur (mW) -1,5 -2 -2,5 -3 -3,5 -4 -4,5 -5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Temprature ( C) 37 fusion du C mlange huileux

Figure III9 : Thermogramme du mlange huileux entrant dans la composition des nanomulsions.

Il est intressant de savoir dans quel tat se trouve le cur lipophile des globules aprs mulsification. Lanalyse des solutions de nano-mulsions ncessite dutiliser des capsules - 77 -

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fermes afin dviter les perturbations engendres par lvaporation de la phase continue. Les donnes obtenues pour les nano-mulsions indiquent labsence de transition de phase entre 5 et 45C : la fusion de la cire nest plus observe (Figure III10). Lhypothse la plus probable est que la nano-structuration des globules empche la solidification de la cire lors de la diminution de la temprature aprs lmulsification. Il faut rappeler que lmulsification se droule une temprature suprieure la temprature de fusion de la Suppocire NC, environ 50C, afin de favoriser la fragmentation des globules.

-1 -1,2 -1,4 Flux de chaleur (mW) -1,6 -1,8 -2 -2,2 -2,4 -2,6 -2,8 -3 5

Nano-mulsion

Nano-mulsion 'congele'

35 fusion du C cur globules 15 25 35 Temprature ( C) 45 55

Figure III10 : Effet de la conglation sur les thermogrammes de nano-mulsions.

Le comportement dune solution de nano-mulsions a ensuite t tudi sur une plage de temprature plus large : entre -20C et 60C. Cette fois le phnomne endothermique associ la fusion de la cire est clairement visible autour de 35C (Figure III10). La conglation et la dconglation de lchantillon ont donc permis de retrouver la transition de phase de la Suppocire NC. La fusion stale nanmoins sur une gamme de temprature lgrement dcale (autour de 35C contre 37C pour le mlange huileux non mulsionn). Il est important de noter que la conglation et la dconglation des nano-mulsions engendrent une importante dstabilisation collodale entranant la coalescence des globules. En effet aprs conservation -20C les solutions deviennent opaques, indiquant ainsi

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions

laugmentation du diamtre moyen des globules. Les mesures par diffusion quasi-lastique de la lumire confirment lanalyse visuelle puisquelles indiquent lapparition dune population de globules submicroniques denviron 200 nm de diamtre (Figure III11).

18 16 14 12
% Volume

Avant conglation

Aprs conglation

10 8 6 4 2 0 1 10
d (nm )

100

1000

10000

Figure III11 : Effet de la conglation sur la distribution en taille de nano-mulsions issues de la formulation de rfrence. Lchantillon ayant subit la conglation a t maintenu -20C pendant 12 heures avant dtre lentement ramen temprature ambiante en vue de la mesure par diffusion quasilastique de la lumire.

En conclusion, il semble donc que ce soit le trs faible diamtre des nano-mulsions (35 nm) qui perturbe le changement dtat de la phase disperse. La nano-structuration entrane en effet un phnomne de surfusion au niveau des globules [85]. La conglation de ceux-ci engendre leur dstabilisation et une augmentation de la taille moyenne, ce qui explique que lon retrouve dans ce cas la transition de phase de la Suppocire NC.

III.3.3. Stabilit et volution dans le temps


Aucune opacification des solutions de nano-mulsions nest observe au cours de leur conservation temprature ambiante jusqu' au moins 18 mois. Cela indique labsence de vieillissement collodal, puisque la formation dune faible proportion de globules de tailles suprieures 100 nm suffirait troubler les solutions. Cette observation visuelle est - 79 -

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confirme lorsque lon compare les spectres de distribution en taille dune nano-mulsion raliss juste aprs lmulsification et aprs plus de 18 mois de stockage ( temprature ambiante, soit environ 20C, et labri de la lumire). Aucune diffrence significative nest observe (Figure III12).

30 25 20
% volume

t0

18 mois

15 10 5 0 1 10
d (nm)

100

1000

Figure III12 : Distribution en taille de nano-mulsions issues de la formulation de rfrence aprs fabrication et aprs 18 mois de conservation temprature ambiante et labri de la lumire.

La formulation de rfrence est ainsi trs stable dans le temps, tant au niveau de la taille des globules que du potentiel zta qui nvolue pas avec le temps. Cependant, mme si la grande majorit des chantillons ne semble pas voluer avec le temps, certains dentre eux ont t dstabiliss. La premire instabilit constate est de type physico-chimique : au bout dun temps relativement long, une anne environ, des grains blancs se forment dans certaines solutions. La prsence de ces particules est systmatiquement accompagne dun pH acide denviron 3. Les solutions ntant pas acides aprs mulsification, elles se sont donc acidifies au cours du temps. La diminution du pH peut tre au moins en partie relie au phnomne doxydation des acides gras et notamment des acides gras insaturs et polyinsaturs. En effet, lapparition de diverses molcules acides lors dtudes sur la stabilit dmulsions micromtriques est dcrite dans la littrature [86, 87]. De plus, lacidification des solutions a galement t observe dans le cadre dune tude sur la stabilit de la fluorescence (voir Chapitre IV). Cette

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions

exprience a permis de constater que lapparition des grains blancs est beaucoup plus rapide dans le cas des solutions dont le pH a t fortement abaiss par ajout dune solution dacide chlorhydrique. La formation des particules blanches est donc bien une consquence de la diminution du pH. La seconde instabilit constate est de type biologique. Certaines solutions sopacifient localement cause du dveloppement dun microorganisme qui apparat sous la forme de fibres enchevtres (Figure III13). Lobservation microscopique permet galement de visualiser quelques globules dont le diamtre est proche de 500 nm. Le dveloppement du microorganisme (probablement une moisissure) entrane donc une dstabilisation des globules. Il est probable que pour sassurer un apport en lipides, les microorganismes librent dans la solution des enzymes de type lipases qui vont dgrader les triglycrides constituant les nano-mulsions. Les produits issus de la raction enzymatique sont plus solubles dans leau ; ils favorisent donc le mrissement dOstwald, et par consquent lapparition de globules de tailles plus importantes.

Figure III13 : Observation microscopique du microorganisme se dveloppant dans les chantillons de nano-mulsions. A : grossissement 20 / B : grossissement 100.

En conclusion, afin daugmenter la stabilit des nano-mulsions, il peut tre utile dutiliser une solution tampon de manire limiter lacidification des solutions lors de loxydation des acides gras et/ou de conditionner les solutions sous atmosphre inerte. De

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plus, lutilisation de molcules antioxydantes liposolubles telles que la vitamine E (ou tocophrols) pourrait limiter la dgradation des lipides. Enfin, lajout dantimicrobien dans la phase continue permettrait dliminer la croissance de microorganismes responsables de la dstabilisation collodale des nano-mulsions, sachant que pour des applications en biologie, il est de toute faon ncessaire de striliser les solutions de nano-mulsions de manire adapte (par exemple par filtration). En tenant compte de ces remarques, la stabilit des nanomulsions pourrait tre amliore, mme si elle est dores et dj trs satisfaisante puisquelle excde une anne.

III.4. Variations autour de la formulation dite de rfrence


A partir de la formulation de rfrence de nombreuses autres compositions ont t labores. Les formulations prsentes dans cette partie ont t conues pour valuer limpact de certains paramtres sur la taille des nano-mulsions. Les paramtres tudis sont les suivants : la nature du cur lipophile, la quantit globale de surfactants par rapport la phase disperse, le ratio entre les surfactants pegyls et la lcithine, et enfin la nature du surfactant pegyl. Ces formulations ont galement t ralises afin dvaluer ultrieurement leffet des modifications apportes vis--vis de la biodistribution aprs injection intraveineuse dans le petit animal (voir Chapitre V).

III.4.1. Nature du cur lipophile


Afin de pouvoir tudier leffet de la modification de la composition du cur lipophile sur la taille des nano-mulsions, une nouvelle srie de formulations diffrentes a t ralise : toutes les formulations ont la mme quantit de phase disperse, qui reprsente 10 % de la masse totale de lmulsion, mais la nature et les proportions des constituants de cette phase varient (Tableau III5).

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions


Composition A B C D E F Huile de soja 0 25 50 75 0 0 Suppocire NC 100 75 50 25 75 50

Huile de lin 10 0 0 0 25 50

G 0 25 75 Tableau III5 : Composition des diffrentes phases disperses en pourcentage massique.

Les diffrentes phases disperses testes sont composes de Suppocire NC pure, de Suppocire NC et dhuile de soja, et de Suppocire NC et dhuile de lin (Tableau III5). Lhuile de lin est une huile dorigine vgtale compose de triglycrides dont les acides gras comportent majoritairement 18 atomes de carbone et sont insaturs (Tableau III6). Cette huile est nettement plus riche en C18 :3 ( 3) que lhuile de soja.

Nature des acides gras C16 C16 :1 C18 C18 :1 C18 :2 C18 :3 Tableau III6 : Composition de l'huile de lin.

Pourcentage 4,0 7,0 % 0,1 % 3,0 6,0 % 13,0 29,0 % 17,0 30,0 % 47,0 55,0 %

La quantit de surfactants est identique pour toutes les formulations (0,14 mmol/mL). Cependant, le ratio molaire diffre de celui de la formulation de rfrence puisque quil est de 50 % de lcithine / 50 % de Myrj 53 au lieu de 66,7 % / 33,3 %. Ainsi la lcithine reprsente 5% de la masse totale et le surfactant pegyl 16,55 %. Ce changement a t effectu afin de diminuer la quantit de lcithine par lot, permettant ainsi de rduire la proportion de Suppocire NC dans la phase disperse sans engendrer de problme de solubilit pour les formulations pauvres en cire. La formulation comprend galement 2,5 % de glycrol afin daugmenter la viscosit pour faciliter le processus dmulsification. Enfin, une solution saline (Hepes 0,05M ; EDTA 0,01 M ; pH 7,4) constitue les 65,95 % restants (Tableau III7).

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Masse (mg) Phase disperse Phase continue Surfactants Solution A-G Glycrol Solution saline Lcithine Myrj 53 200 50 q.s.p 2000 100 331 % w/w 10 2,50 65,9 5 16,6

Tableau III7 : Composition des formulations testes pour valuer limpact de la composition du cur lipophile sur les nano-mulsions (lot de 2 mL).

Lhistogramme suivant (Figure III14) reprsente le diamtre moyen des globules obtenus en utilisant le mme protocole dmulsification que pour la formulation de rfrence, en fonction de la composition de la phase disperse.

50
Diamtre moyen (nm) pondration volume

45 40 35 29 30 25 20 15 10 5 0 A B C D E F G 29 30 31 29 28 30

Figure III14 : Evolution du diamtre moyen en fonction de la composition de la phase disperse.

Les diffrences de composition de la phase disperse ninduisent pas de changement du diamtre moyen des nanoparticules. La taille moyenne des particules pour lensemble de ces formulations est de 29,5 2,0 nm. Le potentiel zta nvolue pas non plus avec les changements de nature du cur lipophile effectus, puisquil conserve sa valeur de - 5 2 mV pour toutes les formulations testes.

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions

Il est ainsi possible de faire varier la nature de la phase disperse, et donc ses proprits de solubilisation, sans influencer le diamtre moyen des particules et sans modifier le potentiel zta. Il est trs intressant de pouvoir faire varier la composition du cur lipophile, notamment afin de sadapter aux proprits de solubilit de molcules que lon dsirerait encapsuler.

III.4.2. Quantit totale de surfactants


Linfluence de la quantit totale de surfactants par rapport la phase disperse a ensuite t explore. Pour cela, une srie de diffrentes solutions dmulsions a t ralise. Pour toutes les formulations, la phase disperse reprsente 10 % de la masse totale et est compose 75 % de Suppocire NC et 25 % dhuile de soja. La quantit totale de surfactants est variable, mais les proportions molaires entre les deux composants sont toujours de 66,7 % de lcithine et 33,3 % de Myrj 53. La fraction de glycrol est de 2,5 % de la masse totale pour lensemble des formulations. Enfin, le volume de la solution aqueuse (Hepes 0,05M ; EDTA 0,01 M ; pH 7,4) est ajust pour chaque composition afin que la masse totale des solutions soit identique pour toutes les formulations. Les compositions des diffrentes formulations sont regroupes dans le Tableau III8.

Masse (mg) Phase disperse Phase continue Surfactants Huile de soja Suppocire NC Glycrol Solution saline Lcithine Myrj 53

% w/w 2,50 7,50 2,50 65,9 - 85,7 0,7 - 8,4 1,1 13,2

50 150 50 q.s.p 2000 14 - 168 22 - 264

Tableau III8 : Composition des formulations testes pour valuer limpact de la quantit totale de surfactants sur les mulsions (lot de 2 mL).

La Figure III15 reprsente le diamtre moyen pondr en volume des globules en fonction de la quantit totale de surfactants, exprime en millimoles par millilitre de solution.

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300 Diamtre moyen (nm) pondration volume 272 250

Zone sensible

Zone robuste

200 177 150 127 100 92,9 72,7 50 45,7 40,3 37,4 36,6 34,2 35,1 170

0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 Quantit totale de surfactants (mmol/mL)

Figure III15 : Evolution du diamtre en fonction de la quantit totale de surfactants. Le carr rose reprsente la formulation de rfrence.

Linfluence du ratio surfactants / huile est intuitif : plus il y a de surfactants pour la mme quantit de phase huileuse, plus celle-ci peut tre finement disperse. Lanalyse du graphique indique cependant quil existe deux rgimes diffrents qui sont fonction de la quantit totale de surfactants : une zone sensible , et une zone robuste qui correspond aux formulations riches en surfactants. La limite entre les deux zones pour ces formulations se situe autour de 0,1 mmol / mL de surfactants. Dans la zone sensible, le diamtre des globules volue fortement avec la quantit de surfactants, ce qui correspond au comportement classique attendu : plus la quantit de surfactants est importante, plus la surface totale de linterface huile/eau quils peuvent stabiliser est grande et donc plus la taille des globules diminue. Dans la zone robuste en revanche, la diminution du diamtre avec laugmentation de la quantit de surfactants est trs limite. Dans le cadre dapplications des nano-mulsions, notamment dans le domaine biologique, il peut tre utile de se placer dans les conditions de la zone robuste, dans la mesure o de faibles variations de composition entre deux lots de formulation identiques nauront pas dimpact sur le diamtre des particules.

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions

La formulation de rfrence est reprsente sur le graphique par le carr rose. Cette composition se situe dans la zone robuste, ce qui explique la grande reproductibilit observe dun lot lautre.

III.4.3. Ratio phospholipides / surfactants pegyls


La couche de surfactants stabilisant les globules est constitue dun mlange de deux surfactants diffrents : la lcithine et un surfactant pegyl. Les sries dexpriences sur la nature du cur lipophile (III.4.1) et sur la quantit de surfactants (III.4.2) montrent que pour une mme quantit globale de surfactants (0,14 mmol/mL), la taille des globules obtenus est diffrente : environ 30 nm et 35 nm respectivement. Or, entre ces deux sries de formulations, le ratio phospholipides / surfactant pegyl nest pas identique, laissant supposer que la composition des surfactants impacte le diamtre des globules. Une srie de formulations a donc t labore afin dvaluer linfluence de la proportion respective de ces deux surfactants sur la taille finale des globules de la nano-mulsion. Comme prcdemment, la phase disperse reprsente 10 % de la masse totale et est compose 75 % de Suppocire NC et 25 % dhuile de soja. En revanche, la quantit totale en moles de surfactants est cette fois identique pour toutes les formulations (0,14 mmol/mL), tandis que les proportions entre les deux surfactants varient entre 100 % de lcithine et 100 % de Myrj 53. Leurs masses molaires ntant pas identiques, la masse totale de surfactants ne sera par contre pas constante dune solution lautre. Le glycrol reprsente toujours 2,5 % de la masse totale, et le volume de la solution tampon (Hepes 0,05M ; EDTA 0,01 M ; pH 7,4) est ajust pour chaque composition afin que la masse totale des solutions soit identique pour toutes les formulations. Le Tableau III9 rsume les compositions des diffrentes formulations tudies.

Masse (mg) Phase disperse Phase continue Surfactants Huile de soja Suppocire NC Glycrol Solution saline Lcithine Myrj 53

% w/w 2,50 7,50 2,50 53,3 - 77,2 0 -10,3 0 - 34,2

50 150 50 q.s.p 2000 0 -206 0 - 685

Tableau III9 : Composition des formulations testes pour valuer limpact du rapport entre les phospholipides et les surfactants pegyls sur les nano-mulsions (lot de 2 mL).

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Le Figure III16 reprsente le diamtre moyen des mulsions en fonction du pourcentage molaire de surfactants pegyls. La formulation de rfrence est reprsente par un carr rose sur ce graphique.

300

292

Diamtre moyen (nm) pondration volume

250

200

201,9

150 Deux populations 100

50

58,8

48,8 34,3 30,6 27,4 27,5

Ratio 1 0 0 25 Riche en lcithine

Ratio 2 50
% Myrj 53

26,1

75 Riche en Myrj 53

100

Figure III16 : Evolution du diamtre moyen des globules en fonction du pourcentage molaire de surfactant pegyl. La formulation de rfrence est reprsente par le carr rose. Les ratios molaires 1 et 2 correspondent respectivement 66,7 % lcithine / 33,3 % Myrj 53 et 50 % lcithine / 50 % Myrj 53.

Lanalyse de ces donnes indique que le diamtre moyen des globules diminue quand la proportion en surfactants pegyls augmente. Les formulations comportant uniquement de la lcithine ne permettent pas dobtenir des particules infrieures 200 nm. A linverse, lajout de Myrj 53 permet une rduction trs efficace de la taille des globules. Ainsi, pour un ratio molaire de 10 % en Myrj 53, il apparat une population de globules dont le diamtre est de 58,8 nm. Pour un ratio molaire de 25 % en Myrj 53, le diamtre des globules est dj descendu en dessous de 50 nm. Laugmention du pourcentage de surfactants pegyls permet de rduire encore la taille des particules mais la diminution est alors nettement moins prononce. A partir dun ratio molaire de 66,7 %, laugmentation de la quantit de Myrj 53 na que trs peu deffet sur le diamtre.

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions

Sil est impossible dobtenir des nano-mulsions en employant uniquement de la lcithine, il est en revanche possible dobtenir des globules de moins de 30 nm de diamtre en utilisant exclusivement le surfactant pegyl.

La combinaison de toutes les donnes obtenues pour les formulations base de lcithine et de Myrj 53 permet de tracer le graphique reprsent Figure III17. Pour toutes les formulations, la phase disperse (compose 75 % de Suppocire NC et 25 % dhuile de soja) reprsente 10 % de la masse totale de la solution.

0,14 0,12

26,1

27,5

0,1
Myrj53 (mmol/mL)

33,6

27,4 AXE B

0,08
52,9 30,6 34,3 34,2

0,06 0,04 0,02


92,9 88,9 177,0 127,0 72,7 35,1 48,8 201,9 292,0 40,3 45,7 AXE A 37,4 36,6

0 -0,02 -0,02 0 0,02


272,0

170,0

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

Lecithine (mmol/mL)

Figure III17 : Evolution du diamtre en fonction de la quantit de lcithine et de Myrj 53. La taille des particules est reprsente sous la forme dun disque dont le diamtre est proportionnel au diamtre moyen pondr en volume des globules (dont la valeur est indique proximit des disques). La formulation de rfrence est reprsente par le disque violet.

Ce graphique permet de reprsenter la fois linfluence de la quantit totale de surfactants lorsque le ratio molaire lcithine/Myrj 53 66,7 : 33,3 est conserv (AXE A), limpact du ratio lcithine/Myrj pour une quantit globale de surfactant fixe (AXE B), et enfin le diamtre des globules en prsence de surfactant pegyl uniquement (axe des ordonnes). Ce graphique illustre la souplesse de la formulation qui peut ainsi tre adapte en fonction de la taille moyenne souhaite. Il met galement en vidence limportance du - 89 -

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surfactant pegyl dans la rduction du diamtre des particules. En effet, si la lcithine est utilise seule, ou avec une faible quantit de surfactants pegyls (axe des abscisses), la taille des globules ne diminue pas significativement malgr une quantit de surfactants importante. A linverse, en prsence du surfactant pegyl uniquement (axe des ordonnes), une rduction importante du diamtre est observe avec des concentrations trs faibles. La capacit des surfactants pegyls rduire la taille des globules peut tre lie leur structure. En effet, leurs longues chanes polyoxythylne forment une tte hydrophile de taille trs importante, beaucoup plus que celle des phospholipides. Cela induit un rayon de courbure de linterface huile/eau plus grand et favorise donc les globules dont le rayon de courbure est le plus lev, soit ceux de faibles diamtres.

III.4.4. Longueur et structure des chanes pegyles


Nous avons vu dans le paragraphe prcdent limportance du surfactant pegyl sur le contrle de la taille des globules, mais jusqu' prsent toutes les formulations testes contenaient le mme type de surfactant pegyl : le Myrj 53. Un nouveau paramtre a donc t test : il sagit de la nature des surfactants pegyls, avec dune part la longueur des chanes polyoxythylne, et dautre part la structure de ces chanes qui peuvent tre ramifies ou linaires. Les surfactants pegyls utiliss pour cette tude sont des starates de polyoxythylne (Myrj 49 ; Myrj 53 ; Myrj 59) chane linaire et le monoolate de polyoxythylne sorbitane (Tween 80) dont la chane est ramifie. Les structures et les proprits physiques de ces surfactants sont respectivement rappeles Figure III18 et Tableau III10.

OH O
w

OH O
x

a)
C17H35

O O O
n-1

b)
OH C17H33

O O O
z

OH O
y

Figure III18 : Structures des surfactants pegyls. a) Starate de polyoxythylne (avec n = 20 ; 50 ; 100) ; b) Tween 80 (avec w+x+y+z=20).

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions


Surfactant pegyl Tween 80 Myrj 49 Myrj 53 Myrj 59 Nombre de motifs POE 20 20 50 100 Poids molculaire (g/mol) 1310 1164 2484 4684 Masse (mg) pour un lot de 2 mL 180 160 331 644 (322) % w/w 9 8 16,6 32,2 (16,1)

Tableau III10 : Masses molaires et nombre de motifs des surfactants pegyls.

Plusieurs formulations employant ces diffrents surfactants pegyls ont ainsi t prpares (voir Tableau III12 et Tableau III10). Ces formulations sont bases sur celles utilises lors de ltude de limpact du ratio lcithine / surfactant pegyl, et plus particulirement sur les formulations dites Ratio 1 et Ratio 2 (III.4.3). En effet, afin dvaluer limpact de la structure des surfactants pegyls et de mettre en vidence un ventuel effet de la concentration, deux ratios molaires sont tudis : 66,7 % de lcithine / 33,3 % de surfactant pegyl (Ratio 1) et 50 % de lcithine / 50 % de surfactant pegyl (Ratio 2).

Les solutions contiennent 10 % en masse de phase disperse compose 75 % de Suppocire NC et 25 % dhuile de soja. La quantit molaire de surfactants est identique pour toutes les formulations (0,14 mmol/mL), avec soit un ratio molaire de 66,7 % de lcithine / 33,3 % de surfactant pegyl (Ratio 1), soit un ratio molaire de 50 % de lcithine / 50 % de surfactant pegyl (Ratio 2). Toutes les formulations comprennent galement 2,5 % de glycrol, toujours dans le but daugmenter la viscosit pour faciliter le processus dmulsification. Enfin, le volume de solution tampon (Hepes 0,05M ; EDTA 0,01 M ; pH 7,4) est ajust pour chaque composition, afin que la masse totale des solutions soit identique pour toutes les formulations. La masse molaire du Myrj 59 est leve ; par consquent, la quantit de surfactant pegyl ncessaire est galement trs grande puisquelle va reprsenter plus de 20 % ou plus de 30 % de la solution selon le ratio considr. Cela va induire une viscosit trop importante et perturber le processus dmulsification. Cest pourquoi, pour les solutions base de Myrj 59, une concentration deux fois plus faible en phase disperse (5 %) a t utilise. Les quantits de surfactant ncessaires ont t adaptes en consquence. Les valeurs utilises pour ces solutions dilues sont indiques entre parenthses dans les Tableau III11 et Tableau III 12.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo
Ratio 1 Surfactant pegyl Tween 80 Myrj 49 Myrj 53 Myrj 59 Masse (mg) pour un lot de 2 mL 120 107 228 431 (215) % w/w 6,0 5,4 11,4 21,5 (10,8) Ratio 2 Masse (mg) pour un lot de 2 mL 180 160 331 644 (322) % w/w 9,0 8,0 16,6 32,2 (16,1)

Tableau III11 : Quantit massique des surfactants pegyls. Ratio 1 : 66,7% lcithine / 33,3% surfactant pegyl ; Ratio 2 : 50% lcithine / 50% surfactant pegyl.

Masse (mg) Phase disperse Phase continue Huile de soja Suppocire NC Glycrol Solution saline Lcithine Ratio 1 Ratio 2 Surfactant pegyl

% w/w 2,50 (1,25) 7,50 (3,75) 2,50 65,9 - 73,9 6,90 (3,45) 5 (2,5) 5,4 - 16,6

50 (25) 150 (75) 50 1384 138 (69) 100 (50) 107 - 331

Surfactants

Tableau III12 : Composition des formulations testes (lot de 2 mL).

La Figure III19 reprsente le diamtre moyen des globules en fonction du ratio Lcithine / Myrj et de la nature du surfactant pegyl.

67 % lcithine / 33 % surfactant pegyl

50 % lcithine / 50 % surfactant pegyl

712
Diamtre moyen (nm) pondration volume

140 700 120 100 80 60 40 20 0 TWEEN 80 Myrj 49 Myrj 53 Myrj 59 28 27 29 35 29 33 36 67

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Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions


Figure III19 : Evolution du diamtre moyen en fonction de la nature du surfactant pegyl. Ratio 1 : 66,7% lcithine / 33,3% surfactant pegyl ; Ratio 2 : 50% lcithine / 50% surfactant pegyl. La solution ralise avec le tween 80 et le ratio 1 est compose de deux populations distinctes de globules, lune autour de 28 nm de diamtre et lautre plus de 700 nm de diamtre.

Les rsultats montrent que pour les concentrations en surfactants pegyls importantes (Ratio 2), la structure de la chane polyoxythylne a peu dinfluence sur le diamtre des globules. En effet, il ny a pas dcart significatif entre les solutions contenant le Tween 80, le Myrj 49 et le Myrj 53, les globules stabiliss par le Myrj 59 tant quant eux trs lgrement plus gros. Nanmoins, dans le cas o la concentration en surfactants pegyls est plus faible (Ratio 1), la structure semble avoir une importance plus importante sur le diamtre des globules. Il apparat effectivement que pour un mme nombre de motifs polyoxythylne, une structuration ramifie (Tween 80) conduise deux populations de globules, lune avec un diamtre denviron 28 nm et lautre largement plus grande (712 nm de diamtre). Pour une chane linaire (Myrj 49) en revanche, une seule population avec un diamtre autour de 67 nm est observe.

Ces rsultats illustrent le rle essentiel des chanes polyoxythylne dans le contrle du diamtre des globules. Cette influence est lie la quantit de surfactants pegyls mais galement leurs structures.

III.5. Conclusions
La problmatique tait de concevoir des nanoparticules organiques biocompatibles furtives et stables. Nous avons ainsi dvelopp des nano-mulsions de type huile dans eau de quelques dizaines de nanomtres de diamtre, dont la phase disperse est compose dun mlange dhuile de soja et de Suppocire NC, les globules tant stabiliss par lassociation de lcithine et de surfactants pegyls. La solubilisation de la lcithine dans la phase disperse grce lutilisation de la Suppocire NC permet de grandement faciliter la production de formulations riches en surfactants, et simplifie ainsi lobtention de particules dont le diamtre est infrieur 100 nm par rapport ce qui tait propos prcdemment dans la littrature. La technique de fabrication permet ainsi de pouvoir facilement et rapidement obtenir des nano-mulsions de - 93 -

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

taille contrle. De plus, la formulation est suffisamment souple pour permettre de modifier certains paramtres tels que la composition de la phase disperse, la nature du surfactant pegyl ou la taille des particules (voir Figure III17). La taille des nano-mulsions est un paramtre cl matriser car elle impacte non seulement les proprits de circulation dans le systme sanguin, mais galement les possibilits de strilisation des solutions et leur stabilit collodale. En effet, la littrature indique que les globules de faibles diamtres chappent plus facilement la capture par les macrophages que les particules submicromtriques [64]. Or les nano-mulsions issues de la formulation de rfrence ont un diamtre de 35 nm. La faible taille des globules permet une strilisation des solutions par filtration, mthode moins agressive que les techniques de strilisation par la chaleur couramment employes. Enfin les particules sont suffisamment petites pour saffranchir des phnomnes de dstabilisation collodale rversibles que sont le crmage et la sdimentation. Les nano-mulsions dveloppes sont dune grande stabilit puisque quon ne mesure aucune variation de la taille ou du potentiel zta, mme aprs plus de dix-huit mois de conservation temprature ambiante. Cest le choix des surfactants et surtout lutilisation de surfactants pegyls qui vont gnrer une barrire strique autour des globules qui permet de prvenir leur coalescence. En effet, la stabilit des globules vis--vis des phnomnes de floculation et de coalescence nest pas due aux forces de rpulsions lectrostatiques comme dans dautres cas rapports dans la littrature puisque les nano-mulsions prsentent un potentiel zta proche de la neutralit. Cette stabilit est lie la formation par les chanes polyoxythylne des surfactants pegyls dune couche de rpulsion strique suffisamment dense pour prvenir la fusion des gouttelettes. Les caractristiques des globules sont dailleurs trs sensibles la concentration en surfactants pegyls et, quand ceux-ci sont prsents en faible quantit, leur structure. Toutefois, le principal facteur de vieillissement rapport dans la littrature pour les mulsions nanomtriques est le mrissement dOstwald. Nous navons cependant pas observ dvolution dans la distribution en taille des particules. Les formulations choisies permettent donc de rduire ce phnomne grce la faible solubilit dans leau de lhuile de soja, confrant ainsi aux nano-mulsions une stabilit trs importante.

La dsignation de ces nanoparticules sous le terme de nano-mulsions peut parraitre injustifie. On observe effectivement sur les chlich de CryoTEM que les nanoparticules lipidiques ont une forme en plaquette qui est couramment observe pour les SLN. De plus - 94 -

Chapitre III : Nouvelles formulations de nano-mulsions

lutilisation de la Suppocire NC, une huile cristalisable solide temprature ambiante mais pas la temprature de letre humain, laisse penser que le cur des nanoparticules est solide. Nanmoins les tudes par calorimtrie diffrentielle balayage montrent que le cur des nanoparticules nest pas solide, mais liquide, cela est sans doute d un retard la cristalisation. Ainsi les nanoparticules que nous avons dvllopes ne peuvent pas etre classes parmis les SLN, elles se situent plus vraisemblament linterface entre les nanomulsions cur liquides et les SLN cur solide. Le terme de nano-mulsions pouvant englober les deux dfinitions cest celui que nous avons utilis pour dsigner ces objets.

Mme si dans ce chapitre la furtivit relle des nano-mulsions na pas t value (voir Chapitre V), limportante stabilit des particules, malgr la faible valeur absolue du potentiel zta associe la forte densit de la couche de chanes polyoxythylne, est de bon augure en ce qui concerne la furtivit in vivo de ces nanoparticules. Dautre part, tous les constituants des nano-mulsions sont reconnus comme inoffensifs par la FDA. Cependant, le fait quils soient structurs sous forme de nanoparticules est susceptible dengendrer une certaine toxicit comme cela a pu tre observ pour des nanomatriaux inorganiques. Il est vident quune tude complte de toxicit est indispensable avant de pouvoir rellement statuer sur linnocuit de ces nano-mulsions. Nous pouvons malgr tout supposer que leur toxicit sera relativement faible, notamment du fait des grandes similitudes de structure existant entre ces particules et celles naturellement en circulation dans les organismes vivants (chylomicrons et lipoprotines). De plus, le fait que des microorganismes aient pu se dvelopper, voire assimiler les lipides constituant les nanomulsions apparat comme positif vis--vis de leur biocompatibilit.

Ainsi les nanoparticules organiques dveloppes sont stables, biocompatibles et, nous lesprons, furtives. Toutes les raisons nonces ici font donc des nano-mulsions des particules de choix pour transporter in vivo des molcules dintrt, et notamment des fluorophores pour limagerie optique.

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Chapitre IV : Nano mulsions fluorescentes

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Le chapitre II a permis dillustrer les avantages de limagerie de fluorescence in vivo dans le domaine du proche infrarouge en termes de sensibilit, de contraintes de manipulation, de rapidit dacquisition, et de cot de fonctionnement, par rapport aux autres techniques dimagerie molculaire. Cependant, sil existe de nombreuses molcules organiques utilisables en tant quagent de contraste pour ces types dimagerie, les traceurs de type nanoparticules sont rares, lexception principale des nano-cristaux semi-conducteurs de type Quantum dots (ou botes quantiques en franais) dont la composition soulve nanmoins de nombreuses interrogations lies leur toxicit potentielle [88, 89]. Pourtant, lutilisation de nanoparticules permettrait de disposer plus facilement de traceurs plus performants et plus modulables que les fluorophores organiques. Les nanoparticules dcrites dans le chapitre III sont des nano-mulsions dhuile naturelle dans leau, stabilises par de la lcithine et des surfactants pegyls, dont les globules ont un diamtre moyen de 35 nm. Leur facilit de production, leur stabilit, leurs proprits physiques et leur composition biocompatible font de ces systmes des candidats pertinents pour le dveloppement de nouveaux traceurs. Cependant, pour tre utilisables en tant quagent de contraste pour limagerie de fluorescence in vivo, les nano-mulsions doivent avoir des proprits dabsorption et dmission dans le proche infrarouge. Or les constituants des nanomulsions nont aucune proprit optique satisfaisante de ce point de vue ; il convient donc de les doper avec des molcules fluorescentes. Ce chapitre est donc consacr au dopage des nano-mulsions par des fluorophores absorbant et mettant dans le proche infrarouge, et ltude des proprits optiques de ces nanoparticules fluorescentes. Dans un premier temps, le choix de la localisation des molcules fluorescentes au sein des nano-mulsions, ainsi que le choix des fluorophores seront discuts. Ensuite, le protocole gnral de dopage, son efficacit et son impact sur les proprits physiques des nano-mulsions seront dtaills. Les proprits optiques de ces nanoparticules fluorescentes, telles que les spectres dabsorption et dmission, le rendement quantique, la dure de vie de fluorescence, et le photoblanchiment seront tudis. Pour finir, la stabilit du dopage en fluorophore des nano-mulsions sera prsente.

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Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes

IV.1. Localisation du fluorophore au sein des nanoparticules


Le dopage des nano-mulsions implique de dterminer au pralable la zone dincorporation des molcules fluorescentes. Etant donne la structure des globules, trois localisations diffrentes sont envisageables pour accueillir les fluorophores (Figure IV1):

Figure IV1 : Localisations envisageables des fluorophores : 1: Le fluorophore est lextrieur du globule, li de faon covalente un surfactant, ou juste adsorb sur la couche de surfactants. 2: Le fluorophore fait partie intgrante de la couche de surfactants. 3: Le fluorophore est situ dans le cur lipophile du globule.

Chacun des trois cas implique que les fluorophores possdent des proprits physicochimiques et donc des structures adaptes la localisation prvue : ils doivent tre hydrophiles pour la localisation en surface, amphiphiles pour prendre place dans la couche de surfactants, et lipophiles pour rester dans le compartiment huileux. Ainsi une mme molcule ne peut pas occuper les trois localisations en mme temps de faon durable. Le Tableau IV-1 rsume les avantages et les inconvnients attendus en fonction du type dincorporation, pour cinq paramtres importants : ltape dincorporation (flexibilit de ltape de dopage au cours du processus de fabrication); le choix des molcules fluorescentes (nombre de molcules commerciales candidates); limpact sur les proprits de surface (telle que la modification du potentiel zta ou laltration de la furtivit) ; la stabilit physique du dopage (diffusion du fluorophore dans le milieu continu) ; et la stabilit chimique (dgradation chimique ou extinction de la fluorescence par des molcules du milieu continu par exemple).

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo
Critre valu Localisation des fluorophores Surface Incorporation lors de l'mulsification ou fonctionnalisation postmulsification +++ Choix des molcules Interface Incorporation lors de l'mulsification, possibilit d'incorporation postmulsification + Cur Incorporation lors de l'mulsification + -

Etape d'incorporation

Grand choix de Peu de molcules ont de molcules fluorescentes bonnes proprits hydrophiles greffables optiques et surfactantes +++ --Impact faible car la L'exposition des partie hydrophile devrait fluorophores la surface tre masque par la peut diminuer la furtivit couche de PEG --La molcule est susceptible de se dsolidariser de la nanomulsion --Trs sensible au milieu extrieur + Molcule amphiphile donc soluble en milieu aqueux (au moins faiblement) Peu sensible au milieu extrieur +

Choix restreint Pas d'impact sur la surface +++ Une molcule lipophile a peu de probabilit de passer en phase aqueuse +++ Trs peu sensible au milieu extrieur +++

Impact sur les proprits de surface

Stabilit physique

Stabilit Chimique

- : Inconvnient

+ : Avantage

Tableau IV-1 : Avantages et inconvnients des trois localisations envisageables.

Le principal avantage de lincorporation du fluorophore au niveau de la surface est le nombre important de molcules hydrophiles greffables disponibles commercialement. Cependant, ce type de localisation expose fortement le fluorophore au milieu extrieur, ce qui peut entraner des modifications rapides et irrversibles des proprits optiques en fonction du milieu continu. En outre, les changes constants de surfactants entre la membrane et le milieu continu sont problmatiques car la prsence de molcules fluorescentes libres en solution va perturber linterprtation du signal de fluorescence associ la nanoparticule. Lencapsulation des molcules fluorescentes dans le cur des globules permet quant elle de les isoler du milieu extrieur, et donc de protger leurs proprits optiques tout en ne modifiant pas la surface des nano-mulsions. Cependant le dopage des globules aprs mulsification est difficilement envisageable, ce qui impose de le raliser durant la production des nano-mulsions.

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Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes

Enfin, lincorporation des molcules fluorescentes au sein de la membrane de surfactants offre peu davantages par rapport une encapsulation dans le cur, et peu de molcules commerciales ont de plus les proprits amphiphiles recherches. Parmi les objectifs dfinis lors de la conception des nano-mulsions, la stabilit dans le temps ainsi que la facilit dindustrialisation ont t identifies comme primordiales. Cest pourquoi il a t choisi de localiser le fluorophore au niveau du cur lipophile, puisque cette localisation propose lencapsulation la plus stable et la moins sensible au milieu extrieur. Ce choix impose cependant de trouver des molcules lipophiles absorbant et mettant dans le proche infrarouge.

IV.2. Choix des fluorophores

IV.2.1. Structure gnrale de fluorophores compatibles avec limagerie de fluorescence in vivo


Il existe diffrents types de fluorophores absorbant et mettant dans le proche infrarouge qui peuvent ds lors tre compatibles avec limagerie de fluorescence : on peut citer les oxazines [90-92], les borondipyromethenes (Bodipy) [93, 94], les squaraines [95], et dans une moindre mesure les bactriochlorines [96-98], mais la grande majorit des fluorophores dans ce domaine de longueur donde fait partie de la classe des cyanines [99] (Figure IV2).

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Figure IV2 : Structures gnrales de fluorophores pouvant mettre et absorber dans le proche infrarouge : a) squaraines ; b) borondipyromethenes ; c) oxazines ; d) cyanines ; e) bactriochlorines.

Les bactriochlorines sont trop faiblement fluorescentes dans le proche infrarouge. La prsence dun cycle cyclobutne hautement ractif rend les squaraines chimiquement peu stables. Ces deux types de molcules nont donc pas t tests. Les trois autres structures sont envisageables pour le dopage des nano-mulsions. Ainsi des essais dencapsulation ont t raliss avec loxazine 750 ( abs 665 nm ;
max

max 700 fluo

nm (mthanol))1 et un boron

dipyromethene, le Bodipy 665/676 ( abs 665 nm ;


max

max 676 nm (mthanol)), dont les fluo

structures sont reprsentes la Figure IV3. Cependant, il est apparu que loxazine diffuse rapidement vers le milieu continu, et que le Bodipy 665/676 nest pas chimiquement stable dans les nano-mulsions, o il se dgrade rapidement et perd ses proprits de fluorescence. Ltude de leur encapsulation a donc t stoppe et seules les tudes ralises avec les cyanines, prsentes au paragraphe suivant, ont t poursuivies.

Les notations

max abs

et

max fluo

correspondent respectivement aux longueurs donde pour lesquelles

labsorption et lmission du fluorophore sont maximales.

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Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes

Figure IV3 : Structures des fluorophores tests : a) Oxazine 750 ; b) Bodipy 665/676.

IV.2.2. Cyanines
Les cyanines sont des chromophores synthtiques ayant de trs bonnes proprits optiques. Leur structure de base se compose de deux atomes dazote, jouant le rle de donneur ou daccepteur dlectrons, relis par une chane conjuge de longueur variable (Figure IV2). Les atomes dazote font gnralement partie dhtrocycles et notamment de noyaux indoliques. Ces molcules sont couramment utilises dans certaines applications biologiques (tel le marquage de protines ou dacides nucliques) et dans lindustrie (la couche chimique des disques compacts enregistrables (CD-R) est en effet base de cyanines).

Sil existe de nombreuses cyanines commerciales, les fabricants ne prcisent que rarement les structures et les proprits physico-chimiques de leurs molcules. Il faut nanmoins prciser qutant donn que ces fluorophores sont principalement utiliss en biologie, leur solubilit dans leau a t optimise, notamment grce lajout de groupements sulfonates sur les molcules. Parmi les cyanines hydrophiles absorbant et mettant dans le proche infrarouge, on peut notamment citer : la Cyanine 5 ( abs 650 nm ;
max

max 665 nm) fluo

et la Cyanine 7 ( abs 750 nm ;


max

max 775 nm) commercialises par Amersham ou leurs fluo


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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

quivalents dans le catalogue dInvitrogen, respectivement lAlexa 647 et lAlexa 750 (Figure IV4 et IV5). Cependant, pour tre incorpors de faon optimale dans le cur des nano-mulsions, les fluorophores doivent tre lipophiles. Les dialkylcarbocyanines, une sous-classe de cyanines, et en particulier celles dont les chanes alkyles portes par les azotes sont composes dau moins 12 atomes de carbone, possdent une lipophilie importante. Ces molcules ont initialement t dveloppes pour marquer la bicouche de phospholipides formant la membrane cellulaire, et ainsi tre utilises en tant que traceur pour les neurones [100]. Elles ont galement t employes pour marquer la membrane de cellules hmatopotiques ex vivo, puis suivre leur dplacement in vivo aprs injection dans des souris, les animaux tant imags grce un systme dimagerie de fluorescence similaire celui dcrit dans le Chapitre II [101]. Un autre exemple dutilisation de ces fluorophores lipophiles est le marquage de lipoprotines modifies. Des lipoprotines de basse densit sont prleves dans le plasma de donneurs sains, puis sont marques aprs purification par intercalation du fluorophore dans la monocouche de phospholipides. La lipoprotine (apoB-100) est ensuite modifie chimiquement par des acides foliques. Les lipoprotines ainsi modifies sont dans un premier temps incubes avec des cellules cancreuses exprimant des rcepteurs lacide folique, puis injectes dans des souris porteuses des mmes cellules cancreuses, le ciblage des tumeurs tant observ par imagerie de fluorescence in vivo [31]. Parmi les dialkylcarbocyanines commercialises par Invitrogen, le DiD et le DiR possdent les caractristiques ncessaires pour doper efficacement les nano-mulsions, savoir la fois une bonne lipophilie, et des proprits dabsorption et dmission dans le proche infrarouge compatibles avec limagerie optique in vivo. Le DiD ou perchlorate de 1,1'dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine est un analogue de la Cyanine 5 (Figure IV4), tandis que le DiR ou iodure de 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-

tetramethylindotricarbocyanine est un analogue de la Cyanine 7 (Figure IV5). Les structures des dialkylcarbocyanines et celles de leurs analogues hydrophiles prsentent de grandes similitudes, en particulier au niveau de la partie aromatique, reprsente en rouge sur les Figure IV4 et Figure IV5. Or cest cette partie aromatique qui dtermine les proprits optiques des cyanines ; seuls les groupements de solubilit diffrent entre les molcules hydrophiles Cyanine 5 / Cyanine 7 (groupement sulfonate) et lipophiles DiD / DiR (groupement octadcyl).

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Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes

Figure IV4 : Structure des molcules fluorescentes a) Cyanine 5 (Cy5) ; b) DiD. Les sousstructures reprsentes en rouge font ressortir lanalogie structurelle entre les deux fluorophores en ce qui concerne la partie aromatique responsable des proprits optiques. La sous-structure du fluorophore hydrophile reprsente en violet correspond aux groupes de greffage, ici des esters activs par un groupement N-hydroxysuccinimide capable de former une liaison amide avec des amines.

Figure IV5 : Structure des molcules fluorescentes a) Cyanine 7 (Cy7) ; b) DiR. Les sousstructures reprsentes en rouge font ressortir lanalogie structurelle entre les deux fluorophores en ce qui concerne la partie aromatique des proprits optiques. La sous-structure du fluorophore hydrophile reprsente en violet correspond aux groupes de greffage, ici des esters activs par un groupement Nhydroxysuccinimide capable de former une liaison amide avec des amines.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Les proprits optiques des deux cyanines lipophiles (DiD et DiR) en solution dans un solvant organique ou encapsules dans les nano-mulsions sont dtailles dans les paragraphes suivants.

IV.3. Incorporation des fluorophores dans les nano-mulsions

IV.3.1. Production de nano-mulsions fluorescentes

IV.3.1.1. Mode de production

Comme nonc prcdemment, lutilisation de fluorophores lipophiles impose un dopage des nano-mulsions avant mulsification. Les molcules fluorescentes sont donc ajoutes dans la phase huileuse (compose du mlange huile / cire et de la lcithine) avant le mlange avec la phase continue et la sonication. Pour faciliter leur dispersion dans la phase huileuse, les fluorophores sont pralablement dissous dans un solvant organique comme le chloroforme, le dichloromthane, le mthanol, lthanol, ou le DMSO. Cette solution de fluorophores est ensuite ajoute la phase huileuse, la solution est homognise et le solvant organique est retir par vaporation sous vide. La suite du protocole de fabrication est similaire celui dcrit dans le paragraphe III.2.3 (voir Chapitre III). Brivement, la phase aqueuse, contenant entre autres le surfactant pegyl, est ajoute la phase huileuse et ce mlange diphasique est homognis par ultrasons, de manire former des nanoparticules pigeant en leurs curs les fluorophores lipophiles. Les solutions de nano-mulsions ainsi obtenues sont ensuite purifies par dialyse de manire liminer les molcules nayant ventuellement pas t encapsules. Le protocole complet dobtention de nano-mulsions dopes DiD est dcrit dans lannexe V. Un clich photographique reprsentant des solutions de nano-mulsions aprs dialyse est visible en Figure IV6 ; il permet de visualiser lencapsulation des fluorophores DiD et DiR.

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Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes

Figure IV6 : Photographie de solutions de nano-mulsions : de gauche droite, nano-mulsions dopes DiR, non dopes et dopes DiD.

IV.3.1.2. Efficacit dencapsulation

Le mode de fabrication dcrit ci-dessus assure lencapsulation totale des fluorophores (DiD ou DiR) dans les globules. En effet, la comparaison des spectres dabsorption avant et aprs purification par dialyse montre bien que la totalit des molcules fluorescentes est pige dans les nanoparticules (ceci sera dtaill au paragraphe IV.5.1). Le taux dincorporation du fluorophore dans les nano-mulsions tant de 100%, la quantit de fluorophores encapsuls correspond donc la quantit de fluorophores initialement introduite lors de la fabrication (prparation de la phase huileuse).

Le dopage en fluorophores est ici exprim en micro molaire (M). Cette valeur correspond la quantit en moles de fluorophores pour 1 litre de solution de nano-mulsions, avec un pourcentage de phase disperse (huile + cire) de 10%. Par exemple, un lot de 2 mL de la formulation classique (10% de phase disperse) contenant 800 nmol de fluorophores correspond un dopage de 400 M ( 400 10 6 = 800 10 9 ). 2 10 3

IV.3.2. Calcul du nombre de fluorophores par globule


En se basant sur le fait que le taux dencapsulation (ou taux de dopage) est de 100%, et sachant que le diamtre moyen des nano-mulsions nest pas modifi par lencapsulation des fluorophores (ceci sera dtaill au paragraphe IV.5.1), il est possible dobtenir une indication sur le nombre de molcules de fluorophores contenues dans chaque globule dmulsion. Ce

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

calcul reste cependant trs approximatif tant donn le nombre dhypothses et dapproximations qui vont tre utilises pour obtenir le rsultat. Le nombre de molcules fluorescentes par globule N Fluo / Glob est calcul grce la formule suivante (quation IV-1)
N Fluo / Glob = N Fluo (quation IV-1) N Glob

Le nombre de fluorophores N Fluo sobtient grce lquation IV-2, o C dopage correspond au taux de dopage, Vlot au volume du lot, et N A au nombre dAvogadro.
N Fluo = C dopage Vlot N A (quation IV-2)

La dtermination du nombre de globules N Glob est accessible via lquation IV-3, dans laquelle < v > reprsente le volume moyen dun globule (directement obtenu partir de son diamtre moyen < d > et de lquation IV-4), et V d le volume total de la phase disperse.
N Glob = V d <v>

(quation IV-3)

< v >=

< d >3 (quation IV-4) 6

La dtermination de V d constitue le point critique du calcul car elle repose sur une hypothse et une approximation. La proportion des surfactants par rapport la quantit d huile est telle quelle ne peut tre nglige. On fait donc lhypothse que la totalit des surfactants participe la stabilisation des globules. Ainsi le volume peut tre estim grce lquation IV-5, partir de la masse totale de la phase disperse (huile, cire, lcithine, et surfactants pegyls) et de la densit globale de la phase disperse (cette densit varie en fonction des formulations ; elle sera approxime 1,1).
V d = m d d d = 1 d d mhuile + mcire + mlcithine + ms.

pegyls

) (quation IV-5)

On obtient ainsi pour des nano-mulsions de la formulation de rfrence, dope 400 M en DiD (lot de 2 mL) et dont le diamtre moyen est de 35 nm, environ 21 molcules de fluorophores par globule.

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Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes

IV.3.3. Impact de lencapsulation sur les proprits des nano-mulsions

IV.3.3.1. Distribution en taille et taille moyenne

Le diamtre des nano-mulsions est mesur par diffusion quasi-lastique de la lumire (voir Chapitre 3). Cependant, la longueur donde du faisceau laser utilis par lappareil de mesure pour clairer la solution collodale est de 633 nm, longueur donde laquelle le DiD absorbe fortement (IV.4.1.2). Cela induit donc une augmentation de labsorption du faisceau lumineux par les particules dopes DiD, mais entrane galement lapparition dun signal de fluorescence qui risque de perturber la mesure. En effet, une volution de la distribution en taille est observe entre des chantillons concentrs ou dilus : la distribution est plus fine et plus homogne pour les mesures ralises avec les solutions dilues. Le graphique ci-dessous reprsente la distribution en taille (avec une pondration en volume) de trois solutions de nano-mulsions, dont la formulation de base est identique (formulation de rfrence) except pour le dopage : nano-mulsions non dopes ; nano-mulsions dopes DiD 400 M ; nanomulsions dopes DiR 400 M (Figure IV7). Avec ces formulations, les solutions sont suffisamment dilues pour quaucune diffrence significative ne soit observe entre les nanomulsions non dopes et dopes DiD ou DiR. Dans ce cas, lencapsulation de molcules fluorescentes ne modifie pas le diamtre des nano-mulsions : les globules de la formulation de rfrence ont ainsi un diamtre moyen de 35 2 nm, quils soient dops en fluorophores ou non.

- 109 -

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

30 25 20
% volume

non dopes

dopes DiD

dopes DiR

15 10 5 0 1 10
d (nm)

100

1000

Figure IV7 : Comparaison de la distribution en taille de nano-mulsions en fonction du dopage

IV.3.3.2. Potentiel zta

Lencapsulation des molcules de fluorophores ne perturbe pas la double couche ionique qui se forme autour des globules en solution dans leau. Ainsi le potentiel zta des nano-mulsions dopes en fluorophore (DiD) est identique celui mesur pour les nanomulsions non dopes, soit -5 2 mV.

IV.3.3.3. Morphologie

Les clichs de CryoTEM reprsents Figure IV8 sont similaires ceux dcrits dans le Chapitre III. Lencapsulation de fluorophores (DiD) au sein des nano-mulsions ne modifie donc pas la morphologie de ces dernires.

- 110 -

Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes

Figure IV8 : Clichs de Cryo-microscopie lectronique en transmission de nano-mulsions encapsulant du DiD.

IV.4. Proprits

optiques

des

nano-

mulsions fluorescentes
Nous allons au cours de cette section dtailler les proprits optiques des nanomulsions dopes en fluorophores. La majorit des expriences porte sur les nano-mulsions dopes DiD, car les tests biologiques in vitro et in vivo ont principalement t raliss avec ce type de dopage.

IV.4.1. Spectres dabsorption et dmission

IV.4.1.1. Nano-mulsions non dopes

Bien que translucides, les solutions de nano-mulsions non dopes ne sont pas totalement transparentes dans le domaine du visible : elles possdent une lgre coloration jaune. La Figure IV9 reprsente le spectre dabsorption dune nano-mulsion non dope en fluorophores.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo
2,5

1,5 A 1 0,5 0 200

300

400

500 nm

600

700

800

900

Figure IV9 : Spectre dabsorption dune nano-mulsion non dope.

Les nano-mulsions non dopes absorbent principalement dans lultraviolet (entre 200 et 300 nm) puis, entre 300 et 900 nm, labsorption dcroit avec une dpendance en 4 . Cette dcroissance est caractristique des phnomnes de diffusion de la lumire dus la taille des nanoparticules. En effet, lapproximation de Rayleigh est valable dans ce cas puisque le diamtre des particules est infrieur au dixime de la longueur donde de la lumire diffuse. Il ny a donc pas dabsorption significative dans la fentre optique utilise en imagerie de fluorescence (650-900 nm), seule une lgre diffusion est observe. Les nano-mulsions non dopes ne sont pas fluorescentes.

IV.4.1.2. Nano-mulsions dopes DiD

Comme attendu au regard de leur structure (Figure IV4), les spectres dabsorption et dmission du DiD dans le mthanol et ceux du Cy5 en milieu aqueux sont similaires (Figure IV10).

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Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes


1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 400

500

600 nm

700

800

900

Cy5 (PBS)
Absorption Fluorescence

DiD (mthanol)
Absorption Fluorescence

Figure IV10 : Spectres d'absorption et d'mission de la Cyanine 5 en solution dans une solution tampon PBS (Phosphine Buffer Saline) et du DiD en solution dans le mthanol.

Les valeurs des longueurs donde pour lesquelles labsorption et lmission sont maximales sont regroupes pour chaque fluorophore dans le Tableau IV-2.

Fluorophore Cy5 (PBS) DiD (mthanol)

max abs
646 644

max fluo
663 665

Tableau IV-2 : Longueurs donde dabsorption et dmission maximales du Cy5 dans le PBS et du DiD dans le mthanol.

Le DiD est une molcule trs lipophile et est donc peu soluble dans leau. En effet, en milieu aqueux, il sagglomre puis prcipite afin de diminuer les interactions avec les molcules deau. Le spectre dabsorption du DiD en solution aqueuse, reprsent Figure IV 11, montre une forte augmentation de la bande 600 nm, ce qui est caractristique de la formation de dimres. Dans cette configuration, les molcules perdent leur proprit de fluorescence [102].

- 113 -

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo
1,2

0,8 Absorption

0,6

0,4

0,2

0 400

500

600 nm

700

800

900

Figure IV11 : Spectre d'absorption du DiD en solution aqueuse.

Lencapsulation du fluorophore dans le cur des nano-mulsions via le protocole dcrit prcdemment (IV.3.1.1) ne modifie pas ses spectres dabsorption et dmission par rapport ceux obtenus dans le mthanol (Figure IV12). Seul un lger dcalage de quelques nanomtres vers le rouge est observ aprs incorporation du DiD dans les particules (Tableau IV-3). On retrouve sur le spectre dabsorption la forme caractristique du signal du fluorophore, mais galement le phnomne de diffusion d la taille des nanoparticules qui se traduit par une faible absorbance sur tout le spectre, cette absorbance augmentant lgrement dans les faibles longueurs donde.

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Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes


1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 400

500

600 nm

700

800

900

DiD (nano-mulsion)
Absorption Fluorescence

DiD (mthanol)
Absorption Fluorescence

Figure IV12 : Comparaison des spectres d'absorption et d'mission de nano-mulsions dopes DiD avec ceux du DiD en solution dans le mthanol.

Fluorophore DiD (nano-mulsion) DiD (mthanol)

max abs
646 644

max fluo
668 665

Tableau IV-3 : Longueurs donde dabsorption et dmission maximales des nano-mulsions dopes DiD et du DiD en solution dans le mthanol.

Le spectre dabsorption est donc la rsultante de deux composantes distinctes : labsorption par le fluorophore, et la diffusion par les nanoparticules. Le rapport entre labsorbance 400 nm (due a la diffusion) et celle 650 nm (due au fluorophore) est uniquement li au dopage, donc au nombre moyen de fluorophores par globule, et est indpendant de la dilution de lchantillon. Ainsi, plus les nano-mulsions sont dopes en fluorophores, plus le phnomne de diffusion devient faible par rapport labsorption du fluorophore, pour une mme taille de nanoparticules.

IV.4.1.3. Nano-mulsions dopes DiR

Le DiR a une structure chimique trs proche de celle du DiD (Figure IV4 et Figure IV5). En effet, les deux molcules se diffrencient uniquement par la longueur de la chane carbone conjugue entre les 2 noyaux indoliques : celle du DiR est compose dune

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

insaturation supplmentaire, ce qui dcale ses spectres dabsorption et dmission dune centaine de nanomtres vers linfrarouge. Nanmoins, except du point de vue optique, leurs proprits physico-chimiques sont similaires. La Figure IV13 illustre, comme pour le DiD, labsence de diffrences significatives entre les spectres dabsorption et dmission du DiR en solution dans du mthanol et encapsul dans les nano-mulsions (Tableau IV-4). Le spectre dabsorption des nanomulsions encapsulant le DiR prsente galement le phnomne de diffusion, qui est particulirement visible dans les faibles longueurs donde.

1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 400

500

600 nm

700

800

900

DiR (nano-mulsion)
Absorption Fluorescence

DiR (mthanol)
Absorption Fluorescence

Figure IV13 : Comparaison des spectres d'absorption et d'mission de nano-mulsions dopes DiR avec ceux du DiR en solution dans le mthanol.

Fluorophore DiR (nano-mulsion) DiR (mthanol)

max abs
748 747

max fluo
775 774

Tableau IV-4 : Longueurs donde dabsorption et dmission maximales des nano-mulsions dopes DiR et du DiR en solution dans le mthanol.

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Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes

IV.4.2. Rendement quantique de fluorescence

IV.4.2.1. Dfinition et mthode de calcul

Le rendement quantique de fluorescence est la valeur caractristique de lefficacit relative de la fluorescence (dsexcitation radiative) compare aux autres voies de dsexcitation non radiatives du fluorophore dans son tat excit. Il correspond au rapport du nombre de photons mis par seconde sur le nombre de photons absorbs par seconde. Les rendements quantiques de fluorescence des fluorophores organiques dans le proche infrarouge sont gnralement compris entre 0,10 et 0,30. Ils sont fortement dpendants des conditions de solvatation : solvant, temprature, pH. Ainsi, outre les problmes de solubilit, le rendement quantique dun fluorophore est souvent plus faible en milieu aqueux que dans un solvant organique. Dune manire gnrale, plus la fluorescence est dcale vers linfrarouge, plus le rendement quantique diminue [103]. La dtermination directe du rendement quantique dun fluorophore est relativement difficile, puisquelle impose de connatre de faon exacte le nombre de photons absorbs et mis. Il est plus couramment obtenu par comparaison avec une molcule fluorescente de rfrence dont le rendement quantique est connu (quation IV-6).

ch = rf
avec ch
rf

I I

ch fluo rf fluo

2 d 1 10 nrf (quation IV-6) ch 2 Abs d nch 1 10

Abs

rf

: Rendement quantique de la solution tudie : Rendement quantique de la solution de rfrence : Intgrale du spectre de fluorescence de la solution tudie : Intgrale du spectre de fluorescence de la solution de rfrence : Absorbance de la solution tudie la longueur donde dexcitation : Absorbance de la solution de rfrence la longueur donde

I fluo d
ch

I fluo d
rf
Abs ch

Abs

rf

dexcitation
nch

: Indice de rfraction du solvant de la solution tudie : Indice de rfraction du solvant de la solution de rfrence

nrf

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

La molcule utilise en tant que rfrence doit tre excite la mme longueur donde que la solution tudie ; elles doivent donc avoir des proprits spectrales proches.

IV.4.2.2. Nano-mulsions dopes DiD

Le rendement quantique de fluorescence () du DiD en solution dans le mthanol a t mesur en utilisant la Cyanine 5 comme molcule fluorescente de rfrence (Tableau IV-5). Lefficacit de fluorescence est suprieure pour le DiD en milieu organique que pour la Cyanine 5 en milieu aqueux. Le rendement quantique de fluorescence du DiD en milieu aqueux est lui quasi nul.

Fluorophore Cy5 (PBS) DiD (Mthanol)

0,28 0,02 0,33 0,02

Tableau IV-5 : Rendement quantique de fluorescence du Cy5 en solution dans le PBS et du DiD en solution dans le mthanol. Les solutions de fluorophores sont excites 600 nm.

Les mesures dabsorption ont montr que les nano-mulsions diffusent lgrement la lumire et ce, galement la longueur donde dexcitation du fluorophore, soit 600 nm (IV.4.1.1). Ce phnomne engendre une diminution du rendement quantique puisque la valeur dabsorption du fluorophore est alors surestime. En consquence, les rendements quantiques sont corrigs de manire tenir compte de la diffusion des particules, afin de mettre en vidence leffet de la seule encapsulation sur les proprits optiques du fluorophore. On obtient ainsi, pour la formulation de rfrence dope DiD 400 M, un rendement quantique de fluorescence = 0,38 0,02 (non corrig = 0,31).

Les variations effectues sur la composition du cur lipophile ne montrent quune trs lgre influence sur le rendement quantique de fluorescence (Tableau IV-6). Cependant, il semblerait que lefficacit de fluorescence augmente faiblement avec le pourcentage de Suppocire NC.

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Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes


Composition du cur lipophile 100 % Suppocire NC 75% Suppocire NC / 25% huile de soja 25% Suppocire NC / 75% huile de soja

0,38 0,02 0,37 0,02 0,36 0,02

Tableau IV-6 : Rendements quantiques de fluorescence (corrigs) de nano-mulsions dopes DiD 400 M en fonction de la composition du cur lipophile.

La diffusion de la lumire augmente fortement avec la taille moyenne des particules. Ainsi une diminution consquente du rendement quantique de fluorescence brut (non corrig) est attendue pour les particules dont le diamtre est important. Cest effectivement ce qui est observ pour des nano-mulsions dopes 400 M en DiD dont le diamtre moyen varie de 35 200 nm. Toutefois, la correction de labsorbance permet de retrouver des valeurs de rendements quantiques similaires celles prcdemment obtenues (Tableau IV-7).

Diamtre (nm) 35 nm 45 nm 100 nm 200 nm

brut 0,31 0,02 0,27 0,02 0,22 0,02 0,05 0,02

corrig 0,38 0,02 0,38 0,02 0,38 0,02 0,39 0,02

N Fluo / Glob
21 45 490 3922

Tableau IV-7 : Evolution du rendement quantique avant et aprs correction en fonction de la taille des globules, pour un taux de dopage en DiD de 400 M.

Les molcules de type cyanines ayant la proprit dteindre mutuellement leur fluorescence si elles sont suffisamment proches dans lespace [102], on pourrait craindre qu partir dune valeur seuil de dopage, le rendement quantique de fluorescence diminue avec laugmentation de la quantit de fluorophores inclus dans les nanoparticules. Le Tableau IV-8 indique les valeurs des rendements quantiques (corrigs) obtenues pour des nano-mulsions (issues de la formulation de rfrence) possdant des taux de dopages en fluorophores diffrents. Ce tableau indique que pour des dopages allant jusqu 1000 M, aucun phnomne significatif dextinction de fluorescence nest observ.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo
Dopage DiD (M) 78 156 234 313 400 1000 0,37 0,02 0,37 0,02 0,36 0,02 0,36 0,02 0,38 0,02 0,35 0,02

N Fluo / Glob
4 8 12 16 21 53

Tableau IV-8 : Evolution du rendement quantique en fonction du taux de dopage en DiD des nano-mulsions. Tous les globules ont un diamtre de 35 nm.

En conclusion, les nano-mulsions dopes DiD ont un excellent rendement quantique de fluorescence ( = 0,38) pour des fluorophores tant in fine disperss en milieu aqueux. Laugmentation du rendement quantique entre le DiD en solution dans du mthanol ( = 0,33) et le DiD encapsul dans les nano-mulsions ( = 0,38) pourrait sexpliquer par la diffrence de viscosit entre les deux milieux (IV.6.1).

IV.4.2.3. Nano-mulsions dopes DiR

Les rendements quantiques de fluorescence () du DiR, en solution dans le mthanol et encapsul dans les nano-mulsions, ont t calculs grce lquation IV-6 en utilisant lHITC ou iodure de 1,1,3,3,3,3-Hexamthylindotricarbocyanine comme molcule fluorescente de rfrence (Figure IV14). Le HITC est une cyanine dont la structure, et notamment la partie aromatique, est trs proche de celle du DiR. Son rendement quantique est de 0,28 lorsquelle est solubilise dans le mthanol et excite 700 nm.

Figure IV14 : Structure du HITC.

Le Tableau IV-9 indique les rsultats obtenus pour le DiR en solution dans le mthanol et pour des nano-mulsions dopes en DiR 400 M. On observe ici une trs faible diminution du rendement quantique lors de lencapsulation du fluorophore dans les nanomulsions.

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Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes

Solution HITC (mthanol) DiR (mthanol) Nano-mulsions dopes DiR

0,28 0,02 0,28 0,02 0,25 0,02

Tableau IV-9: Rendement quantique de fluorescence du HITC en solution dans le mthanol, du DiR en solution dans le mthanol, et de nano-mulsions dopes en DiR 400 M. Les solutions de fluorophores sont excites 700 nm.

IV.4.3. Dure de vie de fluorescence


La dure de vie de l'tat excit, ou dure de vie de fluorescence, correspond au temps moyen pendant lequel la molcule reste l'tat excit avant de retourner son tat fondamental par mission de fluorescence ou par dsexcitation non radiative. Ce paramtre est primordial pour limagerie de fluorescence rsolue en temps. Cette technique vise en effet rduire lauto-fluorescence des tissus biologiques qui parasite le signal, en utilisant des sondes fluorescentes dont la dure de vie est suprieure celle de lauto-fluorescence des tissus. Lexcitation est alors ralise par un laser puls, et le signal de fluorescence est recueilli dans une fentre temporelle dcale par rapport limpulsion dexcitation. Ceci permet dobserver uniquement le signal mis par le traceur en vitant le signal dauto-fluorescence des tissus (Figure IV15). Ainsi, plus la dure de vie de fluorescence de lagent de contraste est leve, plus la fentre dobservation sera grande, et donc plus la sensibilit sera importante.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Figure IV15 : Schma illustrant le principe de limagerie de fluorescence rsolue en temps. Aprs une excitation brve (quelques picosecondes), lauto-fluorescence des tissus dcrot plus vite que lmission de fluorescence du traceur dans le cas o la dure de vie de fluorescence du traceur est suprieure celle des tissus. Lobservation de la fluorescence peut alors tre ralise sur une fentre dcale dans le temps par rapport limpulsion dexcitation, de manire prendre en compte uniquement le signal dintrt (celui du traceur) et en saffranchissant des signaux parasites (auto-fluorescence des tissus et signal dexcitation). La rptition haute cadence des acquisitions permet dobtenir un signal de bonne qualit.

Les dures de vie de fluorescence sont calcules partir des dclins de fluorescence enregistrs sur des bancs exprimentaux au laboratoire (voir annexe II). Le Tableau IV-10 regroupe les valeurs obtenues pour les fluorophores DiD et DiR en solution dans le mthanol ou encapsuls dans des nano-mulsions (en suspension dans du PBS - 10 mM - pH 7,3).

Fluorophore DiD en solution dans le mthanol DiD encapsul dans une nano-mulsion DiR en solution dans le mthanol DiR encapsul dans une nano-mulsion

Dure de vie de fluorescence (ps) 1200 50 2000 50 800 50 1200 50

Tableau IV-10 : Dure de vie de fluorescence pour les fluorophores DiD et DiR en solution dans le mthanol ou encapsuls dans les nano-mulsions avec un dopage de 400 M.

Les rsultats montrent que plus les fluorophores mettent loin dans le proche infrarouge, plus la dure de vie de fluorescence est courte, mais linformation la plus intressante est laugmentation significative de la dure de vie de fluorescence avec

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Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes

lencapsulation. En effet, les valeurs obtenues sont nettement suprieures celle des fluorophores hydrophiles analogues Cy5 et Cy7 en milieu aqueux : respectivement 1000 50 ps et 450 10 ps. Cela reprsente une amlioration de 100 % entre les cyanines hydrophiles et les nano-mulsions fluorescentes.

IV.4.4. Vitesse de photoblanchiment


Le photoblanchiment est un phnomne photo-induit conduisant la dgradation du fluorophore. Lorsque la molcule est l'tat excit, il existe une certaine probabilit pour qu'elle participe des ractions chimiques (on parle alors de ractions photochimiques), en particulier avec l'oxygne sous forme de radicaux libres. Le fluorochrome perd alors ses proprits de fluorescence. Autrement dit, quand on excite une solution de molcules fluorescentes, une certaine proportion d'entre elles est dtruite chaque instant, ce qui induit une dcroissance de lintensit de fluorescence au cours du temps. Le photoblanchiment reprsente un inconvnient majeur des fluorophores organiques par rapport aux nano-cristaux semi-conducteurs (botes quantiques ou quantum dots). Pour dterminer la vitesse de photoblanchiment, un dispositif dimagerie du laboratoire a t utilis. Le spectre dexcitation est centr autour de 633 nm et la densit de puissance de lclairage est de 2 W/mm2. Cinq solutions ont t testes : Cyanine 5 en solution dans du PBS (Phosphine Buffer Saline); Cyanine 5 en solution saline ([NaCl] = 154 mM) ; DiD en solution dans du mthanol ; DiD encapsul dans des nano-mulsions disperses dans une solution saline ([NaCl] = 154 mM) ; DiD encapsul dans des nano-mulsions disperses dans du PBS. Toutes ces solutions ont une concentration en fluorophores (Cy5 ou DiD) de 10 M. 100 L de chaque solution sont introduits dans des capillaires ferms puis les cinq capillaires sont placs sous la zone dclairage de la camra de la FRI. Une squence permet alors denregistrer une srie de clichs intervalles rguliers (toutes les 2 minutes pendant 180 minutes puis toutes les 10 minutes entre 225 minutes et 24 heures), lclairage tant constamment allum tout au long de lexprience. Des zones dintrt de surface identique et centres sur chaque capillaire permettent davoir accs la fluorescence mise par chaque chantillon en fonction du temps.

(Fluorescence capillaire(t ) fond ) (Fluorescence capillaire(t ) fond ) 100 en fonction du temps.


0

Le graphique Figure IV16 reprsente lvolution pour chaque solution du rapport

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo
Cy5 (PBS) Cy5 (NaCl) DiD (Mthanol) Nano-mulsions DiD (NaCl) Nano-mulsions DiD (PBS)

100 95 Pourcentage de fluorescence 90 85 80 75 70 65 60 55 50 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 180000 200000 mJoules/mm
Figure IV16 : Evolution de la fluorescence mise par cinq solutions en fonction du nombre de joules par millimtre carr. Les solutions sont soumises une excitation continue pendant toute la dure de la mesure, soit 24 heures.

Pour toutes les solutions, le graphique montre une rapide diminution de la fluorescence dans les premiers instants, puis une dcroissance linaire avec des vitesses de dgradation diffrentes en fonction des solutions. Les variations sinusodales observes pour toutes les solutions de faon synchronise sont dues la fluctuation rgulire dans le temps de la puissance dexcitation. Cette fluctuation ne perturbe pas la dcroissance globale qui peut tre considre comme uniquement due au photoblanchiment.

Il ressort de lanalyse de ces rsultats que le DiD est trs stable en milieu organique (mthanol). Son encapsulation dans les nano-mulsions le rend lgrement plus sensible au photoblanchiment, mais il reste nettement plus stable que les solutions de Cyanine 5. Il semble galement que la vitesse de dgradation pour les fluorophores encapsuls dans les nanoparticules dpende du milieu continu ; cela est galement vrai pour la Cyanine 5 mais dans une moindre mesure. Les molcules de DiD piges dans les nanoparticules en solution dans le PBS se dgradent en effet plus vite que celles dilues dans la solution saline. La diffrence de sensibilit au photoblanchiment entre le fluorophore en solution dans le mthanol et le fluorophore encapsul dans les nanoparticules peut donc tre attribue, au moins en partie, des changes entre lintrieur des globules et le milieu continu. Quoi quil

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Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes

en soit, les nano-mulsions dopes en fluorophores sont plus rsistantes au photoblanchiment que les cyanines hydrophiles.

IV.5. Encapsulation et stabilit


Un des paramtres primordiaux dans le dveloppement des nano-mulsions est la stabilit du dopage en fluorophores. En effet, le fluorophore ne doit pas diffuser des globules vers le milieu continu au cours du temps (stabilit physique), et il ne doit galement pas se dgrader chimiquement lintrieur du cur lipidique (stabilit chimique).

IV.5.1. Stabilit de lencapsulation


La faible solubilit des fluorophores DiD et DiR en milieu aqueux permet de supposer que lencapsulation dans les nano-mulsions sera dune part totale, mais aussi quelle sera stable dans le temps. Le taux dencapsulation et la stabilit physique des molcules fluorescentes peuvent tre vrifis par simple dialyse dune solution de nano-mulsions fluorescentes, en enregistrant un spectre dabsorption avant et aprs la purification. La dialyse permet dliminer les molcules dont la taille est infrieure la taille des pores de la membrane sparant la solution purifier du dialysat. Lors de la dialyse, le systme tend quilibrer chaque ct de la membrane. Les molcules dont la taille est infrieure au seuil de coupure (notamment le fluorophore dont la taille est proche de 1 kDa) galisent leurs concentrations de part et dautre de la membrane. Etant donn que le volume du dialysat est plusieurs centaines de fois suprieur au volume dialys, cela permet dliminer presque totalement les petites molcules de la solution dialyse. Cependant, comme la concentration des objets dont la taille est suprieure au seuil de coupure ne peut squilibrer par passage au travers de la membrane, cest donc leau qui va traverser la membrane en sens inverse afin de diminuer la concentration de ces objets par dilution, et ce jusqu' ce que la pression lintrieur de la membrane empche larrive de molcules deau supplmentaires. Il en rsulte une dilution de la solution dialyse, ce qui ne permet pas de comparer directement les spectres dabsorption des solutions avant et aprs

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

dialyse, la concentration en nano-mulsions ntant pas conserve. Une correction est donc applique au spectre de la solution dialyse de manire faire correspondre les parties des signaux lis la diffusion engendre par la prsence des nanoparticules. La Figure IV17 reprsente les spectres dabsorption corrigs du facteur de dilution dune nano-mulsion dope avec du DiD, avant et aprs dialyse. La solution a t dialyse pendant 15 jours 37C contre de leau dionise et avec une membrane dont le seuil de coupure est de 12-14000 kDa. Aprs correction, les parties des spectres dabsorption lies aux fluorophores se superposent parfaitement, indiquant tout dabord que le taux dencapsulation du fluorophore est bien de 100 %, mais aussi quil ny a pas de diffusion des molcules fluorescentes vers le milieu continu. Etant donnes les similitudes entre les structures du DiD et du DiR, on peut lgitimement extrapoler ce rsultat aux nano-mulsions encapsulant du DiR.
0,2 0,18 0,16 0,14 Absorbance 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 100 0,02 0 400 0 900 200 400 Fluorescence 600

500

300

500 Absorption

600

nm

700

800 Absorption Fluorescence

Avant dialyse
Fluorescence

Aprs dialyse

Figure IV17 : Spectres d'absorption et dmission dune nano-mulsion dope 400 M en DiD avant et aprs dialyse (15 jours 37C contre de leau dionise ; seuil de coupure de la membrane : 1214000 kDa). Lunit de fluorescence est une unit arbitraire.

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Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes

IV.5.2. Stabilit chimique du fluorophore


La stabilit physique de lencapsulation du fluorophore tant maintenant admise, il convient dtudier la stabilit chimique du fluorophore. En effet, le fluorophore peut se dgrader au cours du temps, perdant ainsi ses proprits optiques. Certaines solutions de nano-mulsions encapsulant du DiD ont par exemple tendance changer de couleur au cours de leur stockage temprature ambiante, passant du bleu au vert, voire au jaune clair dans certains cas. Pour valuer ce phnomne, nous avons choisi danalyser linfluence du pH, paramtre connu pour altrer les cyanines, sur la fluorescence de solutions de nanoparticules encapsulant du DiD. Pour cela, deux nano-mulsions (formulation de rfrence - voir annexe V) avec une concentration en DiD de 400 M ont t prpares, lune avec un tampon HBS (Hepes : 0,02 M / EDTA : 0,01 M) qui correspond au tampon de greffage qui sera utilis ultrieurement (voir Chapitre 6), et lautre avec de leau dionise. Ces solutions sont ensuite aliquotes et dilues (respectivement avec le tampon HBS et de leau dionise) de manire obtenir une concentration en DiD de 100 M. Le pH de chaque aliquot est ajust via lajout de base ou dacide forts (NaOH 1 M / HCl 1M). Neuf solutions dans le tampon HBS (pH compris entre 3 et 11) et treize solutions dans leau dionise (pH compris entre 1,5 et 12,75) ont ainsi t prpares. Rgulirement, 10 L de chaque aliquot sont prlevs et dilus dans 990 L deau dionise de manire obtenir une concentration de fluorophores de 1 M, puis les spectres dabsorption et dmission de ces solutions sont enregistrs. Il est noter quune drive du pH a t observe au cours du temps. En effet, une acidification des solutions les plus basiques a t observe, notamment pour les solutions prpares avec leau dionise. Cette acidification peut tre due la migration des acides gras pigs dans les globules vers la surface, librant ainsi leur hydrogne labile dans le milieu continu. Cependant, elle est plus srement lie lapparition de certains produits de dgradation acides lors de loxydation des lipides [86, 87] (voir Chapitre III). La Figure IV18 reprsente lintgrale du signal de fluorescence en fonction du pH des solutions, juste aprs leur prparation et aprs 100 jours de conservation 4C et labri de la lumire. Lorsque le pH a t modifi aprs 100 jours, le nouveau point correspondant est indiqu par une flche. La Figure IV19 reprsente quant elle lvolution de la fluorescence dans le temps pour trois solutions caractristiques (pH 1,5 ; pH 6 ; pH 10).

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo
90000 80000 Intgrale de fluorescence (u.a.) 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 pH HBS (0 jours) Eau (100 jours)

pH < 3

3 < pH < 8

pH > 8

Eau (0 jours)

HBS (100 jours)

Figure IV18 : Evolution de la fluorescence en fonction du pH.

90000 80000 70000 60000


Intgrale de fluo

50000 40000 30000 20000 10000 0 0 20 40 60 80 100 120

temps (jours)
pH 1,5 pH 6 pH 10

Figure IV19 : Evolution de la fluorescence en fonction du temps pour trois solutions de pH diffrents.

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Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes

Lanalyse de ces deux graphiques met en vidence lexistence de trois comportements diffrents qui sont fonction du pH : Pour les pH compris entre 3 et 8, la fluorescence est stable au cours du temps. Pour les pH suprieurs 8 (faiblement basiques basiques), le signal de fluorescence diminue quand le pH augmente. Cette baisse de fluorescence est relativement rapide puisquelle intervient dans les premiers jours. Dun point de vue visuel, la diminution de la fluorescence saccompagne dune volution de la coloration : les solutions passent du bleu au vert puis au jaune pour les solutions les plus basiques. Lanalyse des spectres dabsorption permet dexpliquer ce phnomne de jaunissement des solutions par une dgradation chimique du fluorophore. En effet, la comparaison des spectres dune solution pH 6 (reste bleue) et dune solution pH 10 (devenue jaune) met en vidence la disparition de la bande dabsorption du fluorophore 650 nm, ainsi que lapparition dune nouvelle bande 465 nm pour la solution pH 10 (Figure IV20). Lexcitation de cette nouvelle bande dabsorption engendre de la fluorescence avec un maximum dmission 497 nm. Les conditions basiques entranent donc une dgradation chimique du fluorophore qui modifie ses proprits optiques.
0,2 0,18 0,16 0,14 Absorbance 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 400

500

600 nm pH 6

700

800

900

pH 10

Figure IV20 : Comparaison des spectres d'absorption de solutions dont le pH est basique et neutre.

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Pour les pH infrieurs 3 (fortement acides), le signal de fluorescence diminue dans le temps. Cependant, cette dcroissance est beaucoup plus lente que celle observe en milieu basique. Dun point de vue visuel, on observe la formation de grains et les solutions deviennent opaques. Ce constat est confirm par lanalyse des spectres dabsorption de la solution pH fortement acide (Figure IV21) ; celle-ci montre en effet une trs forte augmentation de labsorbance lie au phnomne de diffusion, ainsi quune diminution de labsorbance du fluorophore. La diminution de lintensit de fluorescence est donc la fois lie une dgradation du fluorophore mais aussi une dstabilisation collodale. Nanmoins, la dgradation du fluorophore doit suivre un mcanisme diffrent de celle observe en milieu en basique car le phnomne de jaunissement na pas t dtect.

0,2 0,18 0,16 0,14 Absorbance 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 400

500

600 nm pH 1,5

700

800

900

pH 6

Figure IV21 : Comparaison des spectres d'absorption de solutions dont le pH est acide et neutre.

En conclusion, nous pouvons dire que les fluorophores de type dialkylcarbocyanine (DiD et DiR) sont bien encapsuls dans les nano-mulsions. Cependant, ils restent sensibles au milieu extrieur et plus particulirement au pH. En effet, deux types de dgradation ont t - 130 -

Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes

observs : lun en milieu basique et lautre en milieu fortement acide, ce dernier saccompagnant dune dstabilisation des nano-mulsions. Toutefois, pour un pH compris entre 3 et 8, la fluorescence est trs stable puisquelle est suprieure une anne (Figure IV 22).

80000 70000 60000 Fluorescence 50000 40000 30000 20000 10000 0 0 50 100 150 200 Temps (jours) 250 300 350 400

Figure IV22 : Evolution de la fluorescence avec le temps. La solution suivie est une nanomulsion issue de la formulation de rfrence dope en DiD 400 M. Le pH de la solution tampon (Hepes : 0,02 M / EDTA : 0,01 M) est denviron 5,5. La solution est conserve temprature ambiante et labri de la lumire. Lunit de fluorescence est une unit arbitraire.

IV.6. Discussion et conclusions

IV.6.1. Discussion
Les rsultats obtenus dmontrent que l'encapsulation de fluorophores lipophiles dans les nanoparticules confre aux nano-mulsions de trs bonnes proprits optiques. Elle nengendre pas de dcalage significatif des spectres dabsorption et dmission des fluorophores lipophiles DiD ( abs = 644 nm ;
max

max = 665 fluo

nm) et DiR ( abs = 748


max

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nm ;

max = 775 nm) par rapport leur solvatation dans le mthanol fluo

(IV.4.1). On observe

nanmoins une augmentation de la dure de vie de fluorescence lors de lencapsulation dans les nanoparticules des fluorophores DiD ( = 2000 ps dans les nano-mulsions contre = 1200 ps dans le mthanol) et DiR ( = 1200 ps dans les nano-mulsions contre = 800 ps dans le mthanol) (IV.4.3). En ce qui concerne les rendements quantiques de fluorescence, seul le DiD semble profiter de lencapsulation ( = 0,38 dans les nano-mulsions contre = 0,33 dans le mthanol) puisque lefficacit de fluorescence du DiR est lgrement infrieure celle mesure lorsque le DiR est en solution dans le mthanol ( = 0,25 dans les nano-mulsions contre = 0,28 dans le mthanol) (IV.4.2). Nous pensons que le paramtre qui entrane les amliorations des proprits optiques est la viscosit du milieu dans lequel voluent les fluorophores, qui module les probabilits de dsexcitations non radiatives.

Il est connu que certains fluorophores peuvent, pour des raisons nergtiques, changer de configuration l'tat excit, par exemple par rotation de la molcule autour d'au moins une de ses liaisons, pour prendre une autre gomtrie ; on parle alors de photo-isomrisation. Le cas de la photo-isomrisation du 11-cis rtinal qui est l'origine du mcanisme de la vision en est un parfait exemple (Figure IV23). Ainsi, aprs absorption de lnergie lumineuse, les deux tiers des molcules de 11-cis rtinal ltat excit changent de configuration pour devenir tout trans rtinal, ce qui dclenche une cascade ractionnelle aboutissant lenvoi dimpulsions lectriques dans le nerf optique destination du cerveau.

Figure IV23 : Photo-isomrisation du 11-cis rtinal en tout trans rtinal.

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Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes

Les cyanines, dont font partie le DiD et le DiR, ont galement t dcrites comme pouvant se photo-isomriser par un processus similaire celui prcdemment dcrit [104]. Ainsi une fois excites (tat S1), une partie des molcules de cyanines (probabilit kconf) vont changer de configuration (tat S1conf) car ce nouvel tat est nergtiquement plus stable. Cependant, ltat S1conf nest pas un tat missif ; la molcule retourne donc ltat fondamental par une dsexcitation non radiative (Figure IV24). Ce phnomne de photoisomrisation est concurrent de lmission de fluorescence et contribue donc diminuer la concentration de molcules ltat excit (S1), ce qui entrane une diminution de lefficacit de fluorescence.

Figure IV24 : Schma simplifi des tats lectroniques fondamentaux et excits dune molcule fluorescente pouvant changer de configuration ltat excit en fonction de la viscosit du milieu.

En simplifiant, il y a ainsi pour le fluorophore ltat excit S1 trois voies de retour ltat fondamental : lmission de fluorescence (avec un taux k f 1 ) la dsexcitation non radiative (avec un taux k dnr 1 )
S
S

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le changement de configuration (avec un taux kconf )

Le rendement quantique de fluorescence ( ) et la dure de vie de fluorescence ( f )


f

peuvent galement tre dcrits partir des diffrents taux de dsexcitation grce aux quations suivantes (quations IV-7 et IV-8 respectivement) :
f = kf
i S1

k
1
i i

=
i

kf k dnr 1 + k f
S

S1 S1

+ k conf

(quation IV-7)

f =

k
i

k dnr

S1

1 (quation IV-8) S + k f 1 + k conf

k
i

qui reprsente lensemble des phnomnes de dsexcitation possible est ici

ramen aux trois phnomnes prcdemment dcrits. Le rendement quantique et la dure de vie de fluorescence sont ainsi lis par la relation suivante (quation IV-9) :
f = k f 1 f (quation IV-9)
S

Le changement de configuration relatif la photo-isomrisation est influenc par la viscosit. En effet, plus le solvant sera visqueux, plus la vitesse de formation de la nouvelle configuration ltat excit sera lente car la rotation sera mcaniquement gne (Figure IV 24). Ainsi kconf diminue en milieu visqueux, et la dure de vie de ltat excit augmente (quation IV-8). De plus, le rapport de lmission de fluorescence ( k f 1 ) sur lensemble des processus de dsexcitation augmente puisque kconf est plus faible, ce qui explique
S

lamlioration du rendement quantique de fluorescence (quation IV-7). Cela confirmerait galement lvolution de lefficacit de fluorescence observe lors de ltude de la modification du cur lipophile des nanoparticules, au cours de laquelle il a t dmontr que plus la phase huileuse est riche en Suppocire NC plus le rendement quantique est important (Tableau IV-6). Ces explications correspondent aux observations effectues sur les nano-mulsions dopes en DiD, et partiellement celles ralises avec les nano-mulsions dopes DiR. Comme la chane polythyne du DiR est plus longue que celle du DiD, la molcule est plus flexible ; on peut alors supposer que leffet de la viscosit sera plus faible et que kconf diminuera plus lgrement que dans le cas du DiD. Ainsi cette flexibilit pourrait expliquer - 134 -

Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes

les gains moins importants sur la dure de vie de fluorescence engendrs par lencapsulation de DiR par rapport au DiD. Cependant, cela nexplique toujours pas pourquoi le rendement quantique du DiR est plus faible quand il est encapsul dans les particules que lorsquil est en solution dans le mthanol. Comme la dure de vie de fluorescence augmente mais le rendement quantique diminue et que ces deux paramtres sont lis par lquation IV-9, cela implique que k f
S1

est

plus faible quand le DiR est confin dans les nanoparticules que lorsquil est en solution dans le mthanol. Il semble ainsi que leffet de lencapsulation ne soit pas uniquement d la viscosit mais galement la nature mme du solvant. La viscosit lintrieur des globules permet de diminuer kconf , mais le mlange de glycrides qui compose le cur lipidique semble par ailleurs affaiblir k f
S1

et a aussi certainement une influence sur les autres processus de

dsexcitation non radiatifs.

Lencapsulation des fluorophores lipophiles dans les nano-mulsions est dun point de vue optique trs bnfique. Nanmoins, dun point de vue de la stabilit chimique et de la protection des molcules fluorescentes vis--vis du milieu extrieur, lencapsulation semble moins profitable (IV.5.2). En effet, le fluorophore se dgrade rapidement en milieu basique (pH > 8) et en milieu fortement acide (pH < 3) ce qui indique que des espces chimiques, et plus particulirement des protons peuvent diffuser du milieu continu vers le cur des globules. La gamme de pH pour laquelle la fluorescence reste stable (3 < pH < 8) est tout de mme suffisamment large pour tre compatible avec les milieux biologiques. Le sang, qui est le principal milieu dans lequel les nano-mulsions sjourneront in vivo, a en effet une valeur de pH autour de 7,4. Lexprience de photoblanchiment a dautre part montr une plus grande stabilit de la fluorescence des fluorophores encapsuls dans les nano-mulsions par rapport celle des molcules fluorescentes hydrophiles analogues au DiD. Lencapsulation des fluorophores est galement satisfaisante du point de vue de la stabilit physique puisque nous nobservons pas de diffusion des molcules fluorescentes des globules vers le milieu continu. Ce paramtre est primordial pour limagerie de fluorescence
in vivo si lon veut pouvoir associer le signal dtect la prsence des nano-mulsions et non

uniquement au fluorophore. - 135 -

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

IV.6.2. Conclusion
En conclusion, lencapsulation de fluorophores lipophiles ne perturbe ni la taille des nanoparticules, ni leur potentiel zta et ne modifie pas non plus leur stabilit dans le temps. En revanche, linsertion de molcules fluorescentes (DiD ou DiR) dans le cur des nanoparticules permet de confrer ces dernires de trs bonnes proprits optiques (rendement quantique et dure de vie de fluorescence). Les nanoparticules fluorescentes tant in fine en solution aqueuse, ces proprits doivent tre compares celles des fluorophores hydrophiles analogues tels que le Cy5, le Cy 7 et lAlexa 750, qui sont parmi les fluorophores organiques les plus performants disponibles commercialement (Tableau IV-11).

Fluorophore Cy5 DiD DiD Cy7 Alexa 750 DiR DiR

Solvant PBS Mthanol Nano-mulsions PBS PBS Mthanol Nano-mulsions

max abs
646 nm 644 nm 646 nm 749 nm 747 nm 747 nm 748 nm

max Fluo
663 nm 665 nm 668 nm 774 nm 775 nm 774 nm 775 nm

0,28 0,33 0,38 0,13 0,11 0,28 0,25

1000 ps 1200 ps 2000 ps 450 ps 500 ps 800 ps 1200 ps

Tableau IV-11 : Rsum des principales caractristiques optiques des fluorophores lipophiles en milieu organique et encapsuls dans les nano-mulsions, ainsi que celles des molcules fluorescentes hydrophiles analogues au DiD et au DiR.

Il est vident, daprs les donnes rassembles dans ce tableau, que les nano-mulsions fluorescentes sont dun point de vue optique nettement plus performantes que les fluorophores hydrophiles commerciaux actuels. Leurs proprits optiques leur permettent de soutenir la comparaison avec les nano-cristaux semi-conducteurs de type bote quantique (quantum dots). Ces nanoparticules inorganiques possdent en effet des caractristiques optiques remarquables. Elles ont des rendements quantiques compris entre 0,20 et 0,65, une trs grande stabilit au photoblanchiment, des dures de vie de fluorescence de lordre de la dizaine de nanosecondes, un spectre dabsorption trs large, et un spectre dmission troit [39, 105]. Cependant, leur caractre inorganique et notamment la prsence de mtaux lourds et toxiques (cadmium, plomb, mercure ou arsenic par exemple) rend leur utilisation in vivo problmatique

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Chapitre IV : Nano-mulsions fluorescentes

[88, 89]. Les nano-mulsions fluorescentes apparaissent donc comme une alternative biocompatible ces particules, pour lesquelles le comportement en milieu biologique reste tudier.

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Chapitre V : Comportement des nano-mulsions en milieu biologique

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Les chapitres prcdents ont prsent le dveloppement et ltude de nouvelles nanoparticules fluorescentes dans le proche infrarouge. Ils ont montr que les proprits physico-chimiques et optiques de ces nouvelles formulations de nano-mulsions font de ces objets des traceurs prometteurs pour limagerie de fluorescence in vivo. Les objectifs de ce chapitre sont dtudier le comportement des nano-mulsions dans la souris saine, et notamment dobtenir des premires indications sur la toxicit et la biodistribution de ces nanoparticules.

Dans un premier temps, il convient de dterminer la voie dadministration des nanomulsions dans les souris. Le systme sanguin irriguant tous les organes et tissus de lorganisme, cela fait de lui une voie privilgie pour atteindre les tissus ou cellules cibls. Il existe plusieurs voies daccs au systme sanguin : les voies entrales (principalement au niveau de la muqueuse gastro-intestinale et de la zone sublinguale), la voie percutane, la voie pulmonaire et les voies parentrales (injection sous-cutane, musculaire ou veineuse). Le mode dadministration que nous avons privilgi pour ltude des nano-mulsions est linjection par voie veineuse, car elle permet de saffranchir des diffrents problmes dabsorption lis aux autres voies et permet ainsi de matriser rellement la quantit en circulation dans le sang au moment de ladministration.

V.1. Le sang, un vhicule de distribution et dlimination des nanoparticules


Comme expliqu dans lintroduction, les nano-mulsions vont tre injectes directement dans le sang afin de saffranchir de leur passage travers certaines barrires biologiques (intestin, peau, ). Cest lors de leur sjour dans le compartiment sanguin que se joue le devenir des particules. Il est donc utile de rappeler la composition de ce milieu ainsi que les processus dlimination qui participent au maintien de ses nombreuses et indispensables fonctions.

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Chapitre V : Comportement des nano-mulsions en milieu biologique

V.1.1. Composition du sang


Le sang est un fluide corporel dont la fonction principale est de transporter les nutriments et loxygne vers les tissus biologiques. Il joue galement un rle primordial dans le systme immunitaire. Les cellules du sang sont les rythrocytes ou globules rouges (environ 99 % des cellules du sang), les leucocytes ou globules blancs (0,2%) et les thrombocytes ou plaquettes (entre 0,6 et 1 %). Les globules rouges ne sont pas rellement des cellules car ils ne possdent pas de noyau ni dorganites. Ils contiennent principalement de lhmoglobine, une protine dont la fonction est de transporter loxygne mais galement le dioxyde de carbone issu de la respiration cellulaire. Les globules blancs regroupent diffrentes cellules du systme immunitaire : les granulocytes, les lymphocytes et les monocytes. Les thrombocytes ne sont pas non plus des cellules en tant que telles car linstar des globules rouges ils nont pas de noyau. Ils initient la polymrisation du fibrinogne, protine du plasma, et sont ainsi responsables de la coagulation sanguine.

Ces cellules reprsentent seulement 45 % du sang complet. Les 55 % restant constituent le plasma sanguin, liquide assurant la suspension des cellules sanguines. Le plasma est une solution aqueuse (leau reprsente 91% de la masse totale du plasma) contenant de nombreuses molcules organiques et inorganiques. Il est effectivement compos de nombreux ions participant entre autres lactivit catalytique de plusieurs enzymes, la stabilisation des membranes cellulaires, et au maintien du pH sanguin entre 7,35 et 7,45 grce leur pouvoir tampon. La pression osmotique et le pH du sang sont ainsi des paramtres critiques et il est important de ne pas les modifier lors des injections au risque de dtruire les globules rouges. Le plasma transporte galement de nombreuses molcules organiques que lon peut classer en deux catgories : les substances en transit et les protines plasmatiques. Les substances en transit correspondent aux nutriments tels que le glucose, les acides amins et les lipides (sous forme de lipoprotines), les hormones et les dchets mtaboliques comme lure. Les protines plasmatiques, quant elles, sont des protines qui ont vocation rester dans le sang. Elles contribuent notamment maintenir le pH et quilibrer la pression osmotique. Parmi - 141 -

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les protines plasmatiques, on peut entre autres citer lalbumine, le fibrinogne, mais galement les anticorps (immunoglobulines) et les protines du complment qui jouent un rle prpondrant dans le systme immunitaire.

V.1.2. La circulation sanguine des nanoparticules


Linjection des nano-mulsions se fait dans la veine caudale de la souris. Cette veine permet au sang de remonter vers loreillette droite du cur, puis de passer dans le ventricule droit qui lenvoie dans lartre pulmonaire en direction des poumons pour tre r-oxygn. Il retourne ensuite vers le cur au niveau de loreillette gauche via la veine pulmonaire, puis passe dans le ventricule gauche qui va le projeter dans laorte. Cette dernire, en se subdivisant en de nombreuses artres et artrioles, permet dirriguer tous les organes de lorganisme. Le sang est ensuite collect au niveau des organes par un rseau de veines qui vont ensuite se dverser dans loreillette droite du cur, et entamer ainsi un nouveau cycle.

Figure V1 : Schma de la circulation sanguine.

Les plus petits vaisseaux sanguins humains font autour de 4 m de diamtre ; pour la souris ce diamtre est lgrement plus faible (3 m) [106]. Les globules des nano-mulsions - 142 -

Chapitre V : Comportement des nano-mulsions en milieu biologique

ont un diamtre infrieur 100 nm ; ils ne devraient donc pas rester bloqus dans les vaisseaux pour des raisons gomtriques. Cependant, il est possible quils puissent schapper de la circulation sanguine travers des fenestrations dans les cellules endothliales qui forment les vaisseaux sanguins. La taille de ces fenestrations dpend de chaque organe.

V.1.3. Llimination des nanoparticules du sang


Le sang a galement pour fonction de transporter les lments indsirables vers les organes qui vont les traiter. Ces lments indsirables sont en grande majorit des dchets lis au fonctionnement de lorganisme (acide lactique, ure ou dchets de cellules sanguines par exemple), mais peuvent aussi tre de nature trangre (toxines, mtabolites de mdicament, bactries, et vecteurs collodaux). Les lments indsirables sont soit directement excrts hors de lorganisme, soit pris en charge par le systme rticuloendothlial afin dtre dgrads, puis excrts. Les principaux organes dexcrtion sont les reins, et dans une moindre mesure le foie. Les paragraphes suivants dtaillent brivement le rle des reins, du systme rticuloendothlial et de deux organes fortement associs lentretien du sang, le foie et la rate.

V.1.3.1. Le rein

Le rein est le principal organe dexcrtion. La purification est effectue par filtration du sang suivi de la rabsorption de certains des lments filtrs. Le rein est notamment responsable de lexcrtion de lure et de lacide lactique, du maintien du pH sanguin et plus largement de la concentration dans le sang de nombreux ions et molcules. Il est galement responsable dune grande partie de llimination des mtabolites des principes actifs des mdicaments. Il semble cependant quil y ait une taille limite au-del de laquelle les objets ne peuvent plus tre limins par le rein, car trop volumineux pour tre filtrs. La taille des pores, appels galement fenestrations, est denviron 60 nm. Cependant, ces pores sont recouverts dun diaphragme en forme de roue toile qui obstrue une grande partie de louverture [107, 108]. Ainsi llimination des particules collodales est souvent lie dautres processus impliquant notamment le systme rticuloendothlial.

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V.1.3.2. Le systme rticuloendothlial

Le systme rticuloendothlial correspond une partie du systme immunitaire en charge de llimination des corps trangers (particules ou bactries) et des cellules sanguines en fin de vie. Au cours de leur transit, les objets indsirables sont marqus par des opsonines ce qui va dclencher leur phagocytose par les macrophages. Les opsonines regroupent les anticorps et certaines protines du complment qui vont se lier la surface des lments liminer. Les anticorps sont spcifiques des antignes prsents la surface des corps trangers, les antignes tant gnralement des protines, des polysaccharides ou des drivs lipidiques. Les protines du complment peuvent quant elles se fixer spontanment sur toutes les surfaces. Des mcanismes de rgulation permettent nanmoins de supprimer rapidement la complexation des protines du complment sur les cellules de lorganisme, vitant ainsi leur destruction. Les macrophages possdent leur surface des rcepteurs spcifiques des opsonines actives. Une fois les particules opsonises reconnues par les macrophages, ceux-ci vont dvelopper une invagination de manire encapsuler la particule dans une vsicule appele phagosome qui va tre internalise au sein de la cellule. Celle-ci fusionne ensuite avec un lysosome pour former un phagolysosome afin de dgrader la particule. Si la particule est dgrade par le cocktail denzymes, par le peroxyde dhydrogne ou par les anions superoxydes gnrs dans le phagolysosome, alors les produits de dgradation sont absorbs par le macrophage ou rejets lextrieur de la cellule. En revanche, si les particules ne sont pas dgrades, alors elles restent piges dans les phagosomes au sein des cellules phagocytaires, jusqu' la mort du macrophage.

Figure V2 : Phagocytose d'une particule par un macrophage : (a) internalisation de la particule dans un phagosome ; (b) dgradation de la particule aprs fusion du phagosome et dun lisosome ; (c) les produits de dgradation sont absorbs par le macrophage ou expulss hors de la cellule ; (d) les particules non dgradables sont conserves par la cellule dans ses phagosomes.

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Chapitre V : Comportement des nano-mulsions en milieu biologique

V.1.3.3. Le foie

Le foie est le principal lieu de mtabolisation de lorganisme, il est galement responsable dune partie de lexcrtion, et il joue aussi un rle important dans le systme rticuloendothlial. Les veines irrigant le foie se subdivisent en sinusodes, sorte de capillaires dont les parois sont fortement fenestres. Les fenestrations font entre 100 et 300 nm de diamtre et sont dpourvues de diaphragme ; elles reprsentent entre 6 et 8 % de la surface totale des capillaires [109]. On peut donc considrer les sinusodes comme un tamis autorisant ou non le passage des particules vers les hpatocytes. Ainsi les nanoparticules dont la taille est infrieure celles des pores vont pouvoir traverser lendothlium et passer dans lespace de Disse o elles seront en contact avec les hpatocytes. Le passage des fenestrations est double sens et les nanoparticules peuvent repasser de lespace de Disse vers la sinusode. A linverse, les particules dont la taille est trop importante pour franchir les fenestrations vont rester dans la circulation sanguine. La principale fonction du foie est la mtabolisation. Les hpatocytes sont effectivement fortement impliqus dans de nombreux processus mtaboliques : celui des lipoprotines au cours duquel les fenestrations de lendothlium jouent un rle primordial puisquil discrimine les chylomicrons selon leur diamtre, mais aussi les mtabolismes du glucose et de certaines protines. Ces cellules sont galement en charge de la dtoxification de lorganisme, et en particulier de la dgradation des toxines et des principes actifs absorbs lors de la digestion. Le foie est en effet le premier organe travers lequel le sang charg des molcules issues de lintestin va passer. Les hpatocytes sont aussi responsables de la production de la bile, qui sert la digestion des graisses ingres. Certaines molcules absorbes (et dgrades) par les hpatocytes peuvent ainsi tre libres dans les canalicules biliaires en mme temps que la bile. Cest pourquoi le foie est galement considr comme un organe dexcrtion. Enfin, le foie est fortement impliqu dans le systme rticuloendothlial puisquune grande majorit des particules opsonises sont phagocytes par les macrophages rsidents du foie : les cellules de Kupffer. Ces cellules, qui se situent en contact avec la circulation sanguine au niveau des sinusodes du foie, reprsentent la moiti de tous les macrophages du corps humain.

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Figure V3 : Schma de la structure fine du foie.

V.1.3.4. La rate

La rate peut tre considre comme deux organes distincts : un organe du systme immunitaire (la pulpe blanche) et un organe phagocytaire (la pulpe rouge). Une des fonctions principales de la rate est llimination des rythrocytes en fin de vie, le foie soccupant plus particulirement des globules rouges endommags [110]. Llimination des globules rouges vieillissants se base sur un procd de filtration. Les artrioles apportant le sang depuis lartre splnique dans la pulpe rouge aboutissent dans des sinusodes nomms cordons cellulaires. Ces cordons sont en contact avec les sinus veineux qui permettent lvacuation du sang. Cependant, ces sinus sont structurs de telle faon que seuls les globules rouges suffisamment flexibles puissent passer. En effet, la paroi des sinus est constitue de cellules endothliales qui sont toutes parallles entre elles et par rapport laxe du vaisseau sanguin comme les planches de bois dun tonneau. Un systme de fibres de stress permet la formation dinterstices plus ou moins importants entre ces cellules endothliales. Les fentes ainsi formes sont de forme rectangulaire denviron 5 m de long sur moins de 1 m de large avec une profondeur de 2 3 m [111]. Les rythrocytes ayant une taille denviron 7 m, ils doivent se dformer pour pouvoir traverser les interstices. Cependant, en vieillissant ils perdent leur capacit se dformer et ne peuvent donc plus passer dans les sinus. Les particules ne pouvant pas passer travers les interstices des sinus - 146 -

Chapitre V : Comportement des nano-mulsions en milieu biologique

sont alors prises en charge par les macrophages rsidant dans les cordons cellulaires de la pulpe rouge qui liminent les objets indsirables de la circulation sanguine. La structuration de larborescence sanguine de la rate implique quune partie importante du sang transite galement travers la pulpe blanche riches en lymphocytes T. Celle-ci regroupe galement une multitude de compartiments lymphodes (follicules lymphatiques), ressemblant autant de ganglions lymphatiques rassemblant de nombreux lymphocytes B. Cette organisation favorise la reconnaissance des antignes dj connus par lorganisme, mais galement ltablissement dune rponse immunitaire dite adaptative face de nouveaux pathognes.

Figure V4 : a - Schma de la rate ; b - Schma dun sinus veineux situ dans un cordon cellulaire de la pulpe rouge.

La structure histologique de lendothlium vasculaire de la rate, linstar de celle du foie, va donc favoriser laccumulation des vecteurs collodaux dans ces organes. Mme en limitant la capture des nanoparticules par les macrophages, notamment grce un revtement

- 147 -

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

et des charges de surface adapts, celles-ci peuvent saccumuler de manire passive (par convection) dans ces tissus.

V.2. Compatibilit ex vivo entre le sang et les nano-mulsions


Avant de passer aux tests in vivo sur lanimal, il est important de vrifier que les nanomulsions fluorescentes et le sang sont compatibles.

V.2.1. Stabilit de la fluorescence des nano-mulsions en milieu sanguin


Un des premiers points vrifier est la stabilit de la fluorescence des mulsions dans le systme sanguin. Lexprience prsente ici a donc pour objectif dvaluer limpact de la dispersion des nano-mulsions dans le sang sur leur fluorescence.

V.2.1.1. Protocole exprimental

Le sang utilis est du sang dorigine humaine fourni par ltablissement franais du sang (EFS). Il a t additionn dEDTA (acide thylne-diamine-ttraactique) pour viter sa coagulation. Une partie du sang est centrifuge (5000 g pendant 5 minutes temprature ambiante) pour isoler le plasma. Une nano-mulsion (formulation de rfrence) dope 400 M en DiD est prpare selon le protocole dcrit prcdemment dans le chapitre IV. La solution saline dans laquelle la nano-mulsion est prpare est une solution de chlorure de sodium 154 mM ; elle est donc isotonique avec le sang. Enfin la nano-mulsion est dilue avec une solution de PBS dont le pH est auparavant ajust 7,4, elle aussi isotonique avec le sang, de manire obtenir une concentration en fluorophores de 50 M. La solution est strilise par filtration (0,22 m) avant utilisation.

- 148 -

Chapitre V : Comportement des nano-mulsions en milieu biologique

Quatre solutions sont ensuite prpares selon les donnes fournies dans le tableau cidessous (Tableau V1).

Nom de la solution A (Plasma + NE) B (Sang + NE) C (PBS + NE) D (Sang)

Composition 1,1 mL de plasma 3 mL de sang 1,1 mL PBS (pH 7,4) 2 mL sang 200 L nano-mulsion 300 L nano-mulsion 200 L nano-mulsion

Tableau V1 : Composition des solutions utilises pour l'tude de l'volution de la fluorescence dans le sang. Les 3 mL de sang de la solution B contiennent 1,65 mL de plasma, ainsi la concentration en nano-mulsion (NE) dans le plasma est similaire celle de la solution A.

Les solutions sont incubes 37 C pendant la dure de lexprience. Des prlvements sont ensuite effectus diffrents temps (30 minutes ; 1 heure ; 5 heures ; 24 heures et 48 heures) de manire pouvoir mesurer lvolution de la fluorescence du plasma ou de la solution saline. Pour les chantillons contenant du sang complet (B et D), 300 L de solution sont centrifugs (5000 g pendant 5 minutes temprature ambiante) afin de pouvoir prlever 99 L de plasma qui sont ensuite disperss dans 551 L de PBS (pH 7,4). Pour les chantillons A et C, 99 L de plasma sont directement prlevs et disperss dans 551 L de PBS (pH 7,4). Les solutions ainsi prpares sont rapidement analyses par spectromtrie de fluorescence : les solutions sont soumises une excitation 600 nm, et leur mission est recueillie entre 620 et 770 nm.

V.2.1.2. Rsultats et discussion

La Figure V5 reprsente lvolution de lintgrale du spectre de fluorescence (exprime en unit arbitraire) en fonction du temps dincubation pour les 4 solutions.

- 149 -

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo
A (Plasma + NE) 80000 70000 60000 Fluorescence (u.a.) 50000 40000 30000 20000 10000 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Temps (heures) B (Sang + NE) C (PBS + NE) D (Sang)

Figure V5 : Evolution de la fluorescence en fonction du temps. A : 1,1 mL de plasma + 200 L de nano-mulsion ; B : 3 mL de sang + 300 L de nano-mulsion ; C : 1,1 mL de PBS (pH 7,4) + 200 L de nano-mulsion ; D : 2 mL de sang. La fluorescence est exprime en unit arbitraire.

Premirement, cette exprience confirme que la dgradation de la fluorescence en milieu lgrement basique est rapide (voir Chapitre IV), puisque la fluorescence dans le PBS (pH de 7,4) a diminu denviron 50 % en 48 heures dincubation. Il est de plus vraisemblable que la temprature dincubation (37C) favorise la dgradation chimique du fluorophore. Lincubation des nano-mulsions avec le plasma ou le sang complet entrane galement une diminution de la fluorescence au cours du temps, mais celle-ci est moins importante quavec la solution tampon (PBS ; pH 7,4) puisque quelle est infrieure 20 %. Ainsi la dispersion des nanoparticules dans le plasma permet dattnuer la dgradation du fluorophore, ce qui laisse supposer que la dtrioration du fluorophore nest pas uniquement due au pH, mais sans doute aussi la prsence de certains ions en solution. Il est noter que la fluorescence du plasma est tout fait ngligeable. La diminution de la fluorescence dans le sang complet est donc relativement faible (20 %) sur 48 heures dincubation 37C, ce qui est suffisant pour que les nano-mulsions fluorescentes soient utilisables en imagerie in vivo.

- 150 -

Chapitre V : Comportement des nano-mulsions en milieu biologique

V.2.2. Stabilit des globules rouges en prsence de nanomulsions


Si lexprience prcdente portait sur limpact du sang sur la fluorescence des nanomulsions, celle dcrite ici se focalise sur leffet des nano-mulsions sur le sang, et plus particulirement sur lhmolyse des globules rouges.

Les globules rouges sont des cellules sensibles aux variations de leur environnement. La modification de leur milieu peut en effet induire leur lyse (on parle alors dhmolyse) qui conduit la destruction des globules et la libration dhmoglobine dans le plasma.

V.2.2.1. Protocole exprimental

Cest labsorption spcifique de lhmoglobine qui est utilise ici pour valuer lhmolyse. Cette protine absorbe fortement autour de 400 nm mais galement 538 nm et 575 nm. Cependant, labsorption 400 nm peut tre fausse par labsorption dautres protines et la diffusion des particules, et la bande dabsorption 575 nm est trop proche de celle du fluorophore ; cest donc labsorbance 538 nm qui est utilise. Ainsi quatre solutions ont t prpares selon les donnes fournies dans le tableau cidessous (Tableau V2), afin de visualiser linfluence du pH, de la prsence de surfactant pegyl (Myrj 53), et de la prsence des nanoparticules, sur lhmolyse.

Nom de la solution E1 E2 E3 E4 300 L de sang 300 L de sang 300 L de sang 300 L de sang

Composition 200 L de solution de nano-mulsion (NE) pH 7,4 200 L de PBS pH 7,4 200 L de PBS pH 7,4 + 2 % Myrj 53 200 L de solution de nano-mulsion (NE) pH 7,4 dialyse

Tableau V2 : Composition des solutions utilises pour l'tude de lhmolyse.

Aprs 24 heures dincubation 37 C, ces solutions sont centrifuges (5000g pendant 5 minutes temprature ambiante) afin de pouvoir prlever 99 L de plasma qui sont ensuite dilus dans 551 L de PBS (pH 7,4). Ces solutions sont ensuite rapidement analyses par spectrophotomtrie dabsorption.

- 151 -

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

V.2.2.2. Rsultats et discussion

La Figure V6 reprsente labsorbance 538 nm de toutes les solutions prpares.

0,080

0,070

Sang + NE Sang + PBS (2% Myrj 53)

0,060 Absorbance 538 nm

0,050

Sang + NE dialyse

0,040

0,030

Sang + PBS

0,020

0,010

0,000 E1 E2 E3 E4

Figure V6 : Absorbance 538 nm en fonction des solutions.

Le graphique montre que la prsence des nanoparticules, et plus particulirement des surfactants en solution, favorise lhmolyse. On observe en effet, une augmentation de la concentration dhmoglobine dans le plasma lors de lincubation de la solution E1 (sang + nano-mulsion) par rapport la solution E2 (sang + PBS). Le rle des surfactants pegyls est mis en avant car leur ajout favorise lhmolyse mme en labsence de nanoparticules (solution E3). Ces molcules peuvent en effet entraner une perturbation de la membrane cellulaire, conduisant ainsi sa rupture. La dialyse de la nano-mulsion (solution E4) de manire liminer lexcs de surfactants permet dailleurs de limiter lhmolyse par rapport la solution non dialyse (solution E1).

Un effet hmolytique des nanoparticules est donc observ, mais il est modr et reste tout fait acceptable. Il peut toutefois tre minimis en dialysant les solutions afin de supprimer lexcs de surfactants. De plus, une tude de Morey et al. sur lhmolyse engendre - 152 -

Chapitre V : Comportement des nano-mulsions en milieu biologique

par des micro-mulsions de taille nanomtrique a galement montr que ce phnomne pouvait tre considr comme ngligeable [112].

V.2.3. Conclusions
Les expriences de compatibilit ex vivo entre le sang et les nano-mulsions fluorescentes ont montr que les nanoparticules nengendrent pas une hmolyse significative des globules rouges, et que leur fluorescence est suffisamment stable pour pouvoir envisager de raliser des expriences dimagerie in vivo sans risque majeur pour les animaux.

V.3. Etude

de

la

biodistribution

des

nanoparticules sur souris saine


Avant dutiliser des nano-mulsions fluorescentes pour imager un processus biologique donn, il est primordial de connatre leur biodistribution au sein de lorganisme, et notamment de savoir quels organes accumulent les globules fluorescents et quelle est lvolution de cette accumulation au cours du temps. Lutilisation des systmes dimagerie de fluorescence permet daccder facilement et qualitativement la biodistribution des nanoparticules organe par organe. De plus, diffrentes formulations sont testes afin dvaluer limpact de certains paramtres, tels que la taille des particules et la nature des surfactants pegyls, sur la biodistribution. Il est important de rappeler que limagerie par fluorescence ne permet pas dobserver les particules proprement dites mais uniquement le signal mis par le fluorophore. En effet, il nest pas possible de savoir si le fluorophore, dont la fluorescence est nulle en milieu aqueux (voir Chapitre IV), est rest encapsul dans les nanoparticules ou sil a t pris en charge par une autre structure lipophile naturellement prsente dans lorganisme des animaux (lipoprotine, membrane cellulaire ). Toutes les expriences avec les animaux ont t ralises linstitut Albert Bonniot La Tronche par Vronique Josserand et ses collaborateurs.

- 153 -

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

V.3.1. Evolution de la biodistribution des nanoparticules en fonction du temps

V.3.1.1. Protocole

V.3.1.1.1. Nano-mulsions issues de la formulation de rfrence

Une nano-mulsion issue de la formulation de rfrence dope 312 M en DiD est prpare selon le protocole dcrit prcdemment (voir Chapitres III et IV). La solution saline dans laquelle la nano-mulsion est prpare est une solution de chlorure de sodium 154 mM. Afin dliminer les molcules non dsires (glycrol, surfactants pegyls en excs) et dajuster le pH, la solution est dialyse pendant 90 minutes contre une solution de chlorure de sodium 154 mM dont le pH est ajust 7,4, le dialysat tant chang toutes les trente minutes. La concentration finale en fluorophores aprs purification est dtermine par dosage fluorimtrique. La solution est ensuite dilue avec une solution de NaCl 154 mM (pH 7,4) de manire obtenir une concentration en fluorophores de 50 M, et est enfin strilise par filtration (0,22 m). Cette solution peut ensuite tre directement utilise comme traceur fluorescent pour l'imagerie fonctionnelle in vivo.

V.3.1.1.2. Animaux

Huit souris Swiss Nude femelles de 5 6 semaines (IFFA-Credo, Marcy l'Etoile, France) maintenues sous conditions sans pathognes sont utilises comme modle animal pour analyser la biodistribution des nanoparticules dans lorganisme. Toutes les injections et acquisitions d'images sont ralises alors que les souris sont maintenues sous anesthsie gnrale par voie gazeuse (isoflurane). Linjection des nano-mulsions se fait dans la queue de la souris par voie intraveineuse raison de 200 L de solution 50 M par souris (denviron 20 25 g). Cela correspond 10 nmol de fluorophores DiD et 3,2 mg de phase huile (huile de soja et Suppocire NC).

V.3.1.1.3. Imagerie

Les animaux anesthsis sont imags laide dun dispositif dimagerie de fluorescence par rflectance comportant comme source dexcitation une couronne de LEDs

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Chapitre V : Comportement des nano-mulsions en milieu biologique

munies de filtres interfrentiels et mettant 633 nm (puissance dclairement 50 W.cm-2) [113]. Les images sont recueillies par une camra CCD (Orca BTL, Hamamatsu) avec un temps dexposition de 20 ms, aprs passage travers un filtre color RG665 de densit optique suprieure 5 la longueur donde dexcitation. Les signaux sont quantifis laide du logiciel de traitement dimages Wasabi. Les souris sont images plusieurs intervalles de temps aprs injection : 20 minutes, 1 heure, 3,5 heures, 5 heures, 24 heures, 48 heures et 144 heures (6 jours).

V.3.1.1.4. Analyse du sang et des organes

Afin dtudier lvolution de la biodistribution dans le temps, deux animaux sont sacrifis et dissqus aprs 1 heure, 5 heures, 24 heures et 144 heures aprs injection. Les principaux organes sont prlevs et disposs sous le dispositif dimagerie de fluorescence par rflectance afin de mesurer le signal mis par chacun dentre eux. Lors de la dissection, une partie du sang est galement prleve puis centrifuge afin de rcuprer le plasma et den mesurer la fluorescence grce au spectrofluorimtre. Le volume sanguin total dune souris est compris entre 1,5 et 2 mL. Pour le calcul de la quantit de fluorophore en circulation, la valeur maximale (2 mL) est utilise, ce qui correspond 1,1 mL de plasma. Comme 200 L de solution reprsentant 10 nmol de fluorophores sont injects, la concentration plasmatique thorique juste aprs injection est de 7,7 M, ce qui correspond la valeur de 100 % sur la Figure V8. Les mesures de fluorescence permettent alors de remonter une concentration en fluorophores dans le plasma lors du prlvement, qui est ensuite convertie en pourcentage de la quantit de fluorophores restant en circulation. Dans un second temps, afin dvaluer cette fois limpact de la formulation sur la biodistribution, les animaux sont sacrifis 24 h aprs injection.

V.3.1.2. Rsultats

V.3.1.2.1. Clichs de fluorescence

Lanalyse des clichs de fluorescence obtenus montre une bonne distribution des nanoparticules dans lorganisme des souris : la totalit de la souris met du signal (Figure V 7). Dans les premires minutes aprs linjection, le systme sanguin est clairement visible au travers de la peau. On observe toutefois une accumulation prfrentielle dans le foie mais

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

galement, pour certains animaux, une augmentation du signal au niveau du postrieur de la souris.

Figure V7 : Clichs de fluorescence raliss diffrents intervalles de temps aprs l'injection dans la queue de lanimal de 200L de nano-mulsion fluorescente contenant 10 nmol de fluorophores. Les animaux sont positionns sur le dos de manire ce que leur ventre soit face la camra (M20ms / 2000-20000).

V.3.1.2.2. Dosage plasmatique

Le dosage de la fluorescence dans le plasma permet davoir un ordre de grandeur de la quantit de nano-mulsion fluorescente restant en circulation sanguine. Le graphique cidessous (Figure V8) reprsente ainsi lvolution du pourcentage de la quantit de nanomulsion prsente dans le plasma en fonction du temps. Cette courbe ne tient cependant pas compte de la dgradation chimique du fluorophore dans le systme sanguin, ce qui signifie que les valeurs prsentes sont sans doute sous-estimes. La valeur de 100 % sur le graphique correspond la concentration thorique en fluorophores dans le plasma aprs injection dtermine par calcul (7,7 M).

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Chapitre V : Comportement des nano-mulsions en milieu biologique


25

% de fluorophore dans le plasma

20

15

10

0 -

20

40

60

80 temps (heures)

100

120

140

160

Figure V8 : Evolution de la quantit de fluorophores dans le plasma en fonction du temps. Cette quantit est exprime en pourcentage de la quantit totale injecte.

V.3.1.2.3. Analyse des organes

Le sacrifice et la dissection des souris permettent dobserver la fluorescence mise par diffrents organes. La Figure V9 reprsente les principaux organes susceptibles daccumuler ou dliminer les nanoparticules aprs leur injection par voie intraveineuse. Les poumons sont, aprs linjection intraveineuse dans la queue de la souris, le premier rseau de capillaires que vont rencontrer les nanoparticules. Le foie et la rate sont dimportants sites dlimination/squestration des corps trangers ; ils possdent en effet des quantits importantes de macrophages pouvant phagocyter les nanoparticules. Ces organes se caractrisent galement par un endothlium vasculaire fortement fenestr qui peut favoriser lextravasion des nanoparticules hors de la circulation sanguine. Le systme digestif est quant lui fortement vascularis. Enfin, le systme rnal (rein et vessie) constitue la voie dexcrtion majoritaire de lorganisme.

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20 000 18 000 16 000
Intensit de fluorescence (u.a.)

to

1h

5h

24 h

6J

14 000 12 000 10 000 8 000 6 000 4 000 2 000 poumon foie rate estomac intestin rein vessie

Figure V9 : Evolution de la fluorescence des principaux organes d'limination des nanoparticules en fonction du temps aprs l'injection dans la queue de lanimal de 200L de nanomulsion fluorescente contenant 10 nmol de fluorophores.

Les organes peuvent tre classifis suivant deux comportements : pour certains, la fluorescence mise par les tissus diminue avec le temps ; pour dautres, la fluorescence augmente avec le temps au moins jusqu' 24 h aprs injection puis diminue ensuite. Ltude de la fluorescence dautres organes de la souris permet de retrouver ces deux types de cintiques (Figure V10).

20 000 18 000 16 000


Intensit de fluorescence (u.a.)

to

1h

5h

24 h

6J

14 000 12 000 10 000 8 000 6 000 4 000 2 000 peau ext coeur muscle graisse pancras cerveau surrnale utrus ovaire

Figure V10 : Evolution de la fluorescence de divers organes en fonction du temps aprs l'injection dans la queue de lanimal de 200L de nano-mulsion fluorescente contenant 10 nmol de fluorophores.

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Chapitre V : Comportement des nano-mulsions en milieu biologique

V.3.1.3. Discussion

V.3.1.3.1. Clichs de fluorescence

Les clichs de fluorescence montrent une distribution relativement homogne dans lorganisme des animaux, et ce ds les premires minutes aprs linjection du traceur. En effet, on observe labsence de squestration du fluorophore par un organe en particulier, avec toutefois une accumulation plus ou moins importante au niveau du foie (Figure V7). Le signal global de fluorescence mesur augmente au cours des premires 24 h suivant linjection puis diminue jusqu atteindre un signal de fluorescence qui reste non ngligeable aprs 144 h (6 jours). La lente augmentation du signal dans les premires heures correspond lextravasion du traceur, ou tout du moins du fluorophore, du compartiment sanguin vers les tissus et notamment vers les tissus superficiels tels que le derme. En effet, plus le fluorophore est proche de la surface de lanimal, moins la lumire quil reoit ou celle quil met en retour est absorbe ou diffuse, et donc plus le signal de fluorescence recueilli est important. Autrement dit, le dispositif dimagerie dtecte plus facilement et plus intensment la fluorescence mise prs de la surface de lanimal. On note galement partir de ces clichs que la zone postrieure (base de la queue) de nombreux animaux met un signal de fluorescence suprieur la zone environnante. Cela est dautant plus visible sur les vues de flanc ou de dos (Figure V11).

Figure V11 : Clichs de fluorescence d'une souris dans diffrentes positions 3h30 aprs l'injection dans la queue de lanimal de 200L de nano-mulsion fluorescente contenant 10 nmol de fluorophores. (M20ms / 2000-30000).

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Lors de linjection intraveineuse du traceur, cette partie de lanimal est irrite par frottement, ce qui peut expliquer lmission de signal de fluorescence dans cette zone. En rponse une irritation, les capillaires sanguins se vasodilatent en effet de manire faciliter le passage de lendothlium (les fenestrations peuvent alors atteindre 700 nm), que se soit pour lvacuation des toxines gnres au niveau de linflammation, ou pour apporter les lments ncessaires la gurison, en particulier des globules blancs. La prsence des nanoparticules fluorescentes dans la zone dinflammation peut ainsi sexpliquer par deux mcanismes : soit laugmentation de lespace entre les cellules endothliales des vaisseaux sanguins cause par la vasodilatation favorise lextravasion des nanoparticules vers les tissus inflamms ; soit les nano-mulsions sont pralablement captures par les leucocytes qui migrent ensuite dans la zone irrite.

V.3.1.3.2. Dosage plasmatique

Les mesures de fluorescence dans le plasma montrent une diminution du signal de fluorescence dans le temps qui est plus importante que celle observe lors des tests de stabilit de la fluorescence dans le sang (V.2.1). Ce rsultat prvisible confirme quen plus de la dtrioration physico-chimique du fluorophore, il se produit une extravasion des fluorophores, et fortiori des nanoparticules, du sang vers dautres tissus. Nanmoins, il semble que la furtivit du traceur soit suffisante pour maintenir en circulation prs de 20 % de la dose injecte en fluorophores aprs 5 h et 5 % aprs 24 h. La courbe de la concentration en fluorophores dans le plasma ne suit toutefois pas une dcroissance exponentielle classique. On nobserve effectivement quune trs faible diminution de la fluorescence entre 1 heure et 5 heures aprs linjection du traceur. Cela pourrait tre d soit la libration des nanoparticules fluorescentes aprs leur squestration dans une zone telle que lespace de Disse du foie ou les sinus de la rate, soit la remise en circulation du fluorophore sous une nouvelle forme aprs destruction des nanoparticules. La fluorescence mesure ici est celle de nanoparticules dans le plasma ; cela signifie quelle nenglobe pas celle mise par les nanoparticules ventuellement captures par les globules blancs. Ainsi cette mesure montre bien que les nanoparticules sont circulantes et quelles disposent dune certaine furtivit vis--vis des dfenses de lorganisme. Il semble donc que les nano-mulsions fluorescentes ont une bonne furtivit mais ce rsultat doit cependant tre nuanc tant donn que lon suit uniquement le fluorophore et non la particule.

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Chapitre V : Comportement des nano-mulsions en milieu biologique

V.3.1.3.3. Analyse des organes

La dissection et lanalyse de fluorescence mise par les organes a mis en vidence deux classes dorganes avec deux cintiques diffrentes : Classe I : on observe une diminution de la fluorescence ds la premire heure suivant linjection. Classe II : on observe une augmentation progressive du signal dans les premires heures suivant linjection puis une diminution du signal pour les temps plus longs. La Figure V12 et la Figure V13 reprsentent les valeurs obtenues pour les organes appartenant respectivement au premier et au second types de cintique en fonction du temps.

10 000 9 000 8 000


Intensit de fluorescence (u.a.)

to

1h

5h

24 h

6J

7 000 6 000 5 000 4 000 3 000 2 000 1 000 poumon rein pancras muscle vessie coeur cerveau

Figure V12 : Evolution de la fluorescence mise par les organes dont la cintique est de classe I en fonction du temps aprs l'injection dans la queue de lanimal de 200L de nano-mulsion fluorescente contenant 10 nmol de fluorophores. Les organes sont classs en fonction de leur fluorescence moyenne 24 heures aprs linjection du traceur. Les valeurs t0 correspondent lauto-fluorescence des organes (fluorescence sans injection de traceurs).

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20 000 18 000 16 000
Intensit de fluorescence (u.a.)

to

1h

5h

24 h

6J

14 000 12 000 10 000 8 000 6 000 4 000 2 000 surrnale ovaire foie intestin utrus rate peau graisse estomac

Figure V13 : Evolution de la fluorescence mise par les organes dont la cintique est de classe II en fonction du temps aprs l'injection dans la queue de lanimal de 200L de nano-mulsion fluorescente contenant 10 nmol de fluorophores. Les organes sont classs en fonction de leur fluorescence moyenne 24 heures aprs linjection du traceur. Les valeurs t0 correspondent lauto-fluorescence des organes (fluorescence sans injection de traceurs).

Le premier type de cintique (classe I) sapparente fortement celle de la quantit de fluorophores dans le plasma. Les organes qui sont soumis cette cintique sont les poumons, les reins, les muscles, le cur, le cerveau, et dans une moindre mesure la vessie. Les poumons et les reins sont des organes fortement vasculariss ; une grande partie de la fluorescence mise par ces organes peut donc tre lie leur forte teneur en sang. Il est effectivement important de rappeler que les organes nont pas t traits pour liminer le sang rsiduel. Il est ainsi lgitime de supposer quil ny a pas ou peu daccumulation du traceur fluorescent dans ces organes. Le poumon joue galement un rle dans le systme rticuloendothlial grce aux macrophages alvolaires. La faible fluorescence de cet organe semble donc indiquer que la phagocytose par les macrophages rsidents nest pas trs importante, attestant ainsi dune bonne furtivit des nanoparticules. Il est galement noter que la fluorescence mise par le cerveau est trs faible ; les nanoparticules ne semblent donc pas franchir de faon notable la barrire hmato-encphalique protgeant le cerveau. Ces rsultats indiquent galement quil ny a pas ou peu dexcrtion des nanoparticules par la voie rnale. En effet, le signal mis par la vessie est faible et volue peu avec le temps, confirmant ainsi que la taille des nanoparticules est trop importante pour quelles puissent passer travers les pores des reins. De plus, la fluorescence des reins volue selon le premier type de cintique, ce qui traduit labsence daccumulation dans ces organes. Cette donne est intressante pour la dlivrance de mdicaments pour laquelle laccumulation

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Chapitre V : Comportement des nano-mulsions en milieu biologique

au niveau des reins et la toxicit rnale qui en dcoule est souvent un effet secondaire important et rdhibitoire.

Le deuxime type de cintique observ (classe II) traduit quant lui une accumulation des nanoparticules, ou tout du moins du fluorophore, au sein des tissus concerns. On observe ainsi une relle accumulation dans le foie, lintestin et la rate. Le comportement du foie et de la rate tait prvisible tant donn leurs structures fenestres et labondance de macrophages dans ces tissus. En revanche, laugmentation tardive du signal au niveau de lintestin semble tre plutt lie un mcanisme diffrent. En effet, il est possible que ce signal soit li un phnomne de recapture du traceur fluorescent. Les nanoparticules qui saccumulent dans le foie sont au moins en partie internalises par les hpatocytes (peut-tre cause de leur mimtisme avec les lipoprotines). Ces cellules hpatiques dgradent ensuite les particules et vacuent ainsi le fluorophore par les canalicules biliaires, la bile tant une voie dlimination de lorganisme. La bile contenant les fluorophores passe ensuite dans lintestin afin de rtablir le pH et dmulsionner les graisses ingres. Les cellules intestinales absorbent alors le fluorophore en parallle des graisses, librant ensuite les lipides sous forme de chylomicrons dans la lymphe. On peut alors supposer que le fluorophore suit la mme route et se retrouve de nouveau encapsul dans ces particules lipidiques.

Le cas des organes reproducteurs (ovaire et utrus) est dlicat analyser car le cycle de la souris est trs court (4 5 jours). Or de nombreuses modifications de la vascularisation des organes reproducteurs ont lieu au cours de ce cycle, et ces changements sont susceptibles de fortement favoriser lextravasion des nanoparticules vers les tissus.

V.3.1.3.4. Conclusions

Linjection de nano-mulsions fluorescentes entrane une distribution homogne de la fluorescence au sein de lanimal. Le dosage plasmatique et lvolution de la biodistribution dans les organes indiquent clairement que les nanoparticules sont circulantes et quelles possdent donc une bonne furtivit leur permettant dchapper laction du systme rticuloendothlial. Il semble cependant que les nanoparticules suivent la voie de dgradation des lipoprotines, comme le suggre lvolution du signal de fluorescence des intestins.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

La technique dimagerie de fluorescence ne permet pas de connatre la localisation exacte des nanoparticules fluorescentes, et ne renseigne pas compltement sur le mcanisme daccumulation. On observe par exemple une accumulation dans le foie, mais celle-ci peut tre engendre par la capture des nanoparticules par les macrophages, par lextravasion des nanoparticules travers les fenestrations de lendothlium ou par la combinaison des deux processus. Cela illustre lutilit deffectuer des analyses histologiques complmentaires afin davoir une comprhension plus fine des phnomnes daccumulation dans les organes. De plus, cause des proprits optiques dabsorption et de diffusion des tissus, on ne peut pas comparer quantitativement les signaux dun organe un autre. Cette technique apporte nanmoins trs rapidement et moindre cot une information qualitative sur le devenir des nano-mulsions.

V.3.2. Evolution de la biodistribution en fonction de la formulation


Afin dvaluer limpact de la taille des particules et de la nature du surfactant pegyl sur la pharmacocintique des nano-mulsions fluorescentes, la biodistribution des nanoparticules a t analyse pour diffrentes formulations 24 h aprs linjection du traceur.

V.3.2.1. Protocole

V.3.2.1.1. Nano-mulsions

Pour valuer limpact de la taille des nanoparticules, trois types de nano-mulsions sont prpars selon les formulations dcrites dans le Chapitre III afin dobtenir des solutions pour lesquelles le diamtre des nanoparticules est denviron 35, 45 et 100 nm (diamtre mesur par diffusion quasi-lastique de la lumire et pondr en volume). De la mme manire, afin dvaluer linfluence de la nature du surfactant pegyl, quatre types de nano-mulsions sont prpars afin dobtenir des particules denviron 30 nm de diamtre stabilises par les surfactants suivants : Tween 80 : surfactant dont la chane est ramifie et qui comporte 20 motifs polyoxythylnes. - 164 -

Chapitre V : Comportement des nano-mulsions en milieu biologique

Myrj 49 : surfactant dont la chane est linaire et qui comporte 20 motifs polyoxythylnes. Myrj 53 : surfactant dont la chane est linaire et qui comporte 50 motifs polyoxythylnes. Myrj 59 : surfactant dont la chane est linaire et qui comporte 100 motifs polyoxythylnes.

Chacune des sept nano-mulsions est dope 400 M en DiD selon les protocoles dcrits dans le chapitre IV. Avant leur injection, les solutions sont dialyses pendant 90 minutes en changeant le dialysat toutes les 30 minutes. La dialyse se fait contre une solution de chlorure de sodium 154 mM dont le pH est ajust 7,4. La concentration en fluorophores aprs purification est dtermine par dosage fluorimtrique puis les solutions sont dilues avec une solution de NaCl 154 mM (pH 7,4) de manire obtenir une concentration finale en fluorophores de 50 M. Enfin les solutions sont strilises par filtration (0,22 m) avant injection.

V.3.2.1.2. Animaux

Pour chacune des sept formulations, trois souris Swiss Nude femelles de 5 6 semaines (IFFA-Credo, Marcy l'Etoile, France) sont utilises comme modle animal. Toutes les injections et acquisitions d'image sont ralises alors que les souris sont maintenues sous anesthsie gnrale par voie gazeuse (isoflurane). Linjection des nano-mulsions se fait dans la queue de la souris par voie intraveineuse raison de 200 L de solution 50 M par souris (denviron 20 25 g). Cela correspond 10 nmol de fluorophores DiD et 2,5 mg de phase huile (huile de soja et Suppocire NC).

V.3.2.1.3. Imagerie

Les animaux anesthsis sont imags 24 heures aprs linjection du traceur laide du dispositif dimagerie de fluorescence dcrit prcdemment (V.3.1.1.3).

V.3.2.1.4. Analyse des organes

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Aprs avoir t imags, les animaux sont sacrifis et dissqus. Les principaux organes sont prlevs et sont placs sous le dispositif dimagerie de fluorescence par rflectance afin de mesurer le signal mis par chacun dentre eux.

V.3.2.2. Rsultats

V.3.2.2.1. Clichs de fluorescence

La Figure V14 et la Figure V15 reprsentent les clichs de fluorescence obtenus 24 h aprs injection des traceurs.

Figure V14 : Clichs de fluorescence raliss 24 h aprs l'injection dans la queue de lanimal de 200L de nano-mulsion fluorescente contenant 10 nmol de fluorophores, en fonction de la taille moyenne des nanoparticules. Les animaux sont positionns sur le dos de manire ce que leur ventre soit face la camra (M200ms / 2500-65500).

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Chapitre V : Comportement des nano-mulsions en milieu biologique

Figure V15 : Clichs de fluorescence raliss 24 h aprs l'injection dans la queue de lanimal de 200L de nano-mulsion fluorescente contenant 10 nmol de fluorophores pour des nanoparticules stabilises par diffrents surfactants pegyls. Les animaux sont positionns sur le dos de manire ce que leur ventre soit face la camra (M200ms / 2500-32500).

V.3.2.2.2. Analyse des organes

Le sacrifice des animaux 24 h aprs injection du traceur permet, aprs dissection, de mesurer lintensit de fluorescence de diffrents organes. La Figure V16 et la Figure V17 comparent respectivement limpact de la taille des nanoparticules et de la nature du surfactant pegyl sur la biodistribution.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo
8000 Intensit de fluorescence (u.a.) 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
ea u Su rr na le te st in U t ru s Pe au
Myrj 59

35 nm

45 nm

100 nm

us cl e

Fo ie

R ei n Pa nc r as

Figure V16 : Intensit de fluorescence mise par diffrents organes en fonction de la taille des nanoparticules, 24 h aprs l'injection dans la queue de lanimal de 200L de nano-mulsion fluorescente contenant 10 nmol de fluorophores.

5000 4500 Intensit de fluorescence (u.a.) 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

Tween 80

Myrj 49

Myrj 53

na le

in

Pe au

ea u

ie

us cl e

R ei n Pa nc r as

Su rr

Figure V17 : Intensit de fluorescence mise par diffrents organes en fonction de la nature du surfactant pegyl, 24 h aprs l'injection dans la queue de lanimal de 200L de nano-mulsion fluorescente contenant 10 nmol de fluorophores.

Les ovaires ne sont pas reprsents sur ces deux graphiques car leur intensit de fluorescence est trop importante et masque les donnes des autres organes. En effet, lintensit de fluorescence mesure est environ trois fois suprieure celle du foie, et cela quel que soit le paramtre considr (taille des nanoparticules ou nature du surfactant pegyl), ce qui ntait pas le cas lors de ltude de la biodistribution de la formulation de rfrence. Ceci est sans doute d au fait que ces expriences ont t ralises diffrentes tapes du cycle de la souris. - 168 -

ra is se Es to m ac

Po um on

Ve ss ie

oe ur

t ru

es t

Fo

C er v

In t

at e

ra is se Es to m ac

Po um on

Ve ss ie

oe ur

er v

In

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Chapitre V : Comportement des nano-mulsions en milieu biologique

V.3.2.3. Discussion

V.3.2.3.1. Impact de la taille des globules

Les clichs de fluorescence (Figure V14) montrent que lintensit globale de la fluorescence diminue quand le diamtre des nanoparticules augmente. Cette observation nous permet de supposer que laccumulation dans la peau est plus faible pour les nanoparticules de taille suprieure. En effet, cause des phnomnes dabsorption et de diffusion de la lumire par les tissus biologiques, la peau, de par sa position (directement sous la camra), contribue fortement lintensit globale de fluorescence mesure par le dispositif. Cette hypothse est confirme par lanalyse de la fluorescence mise par les organes aprs dissection (Figure V16). Effectivement, le signal de fluorescence mis par la peau diminue avec laugmentation du diamtre des particules. La taille des nanoparticules semble galement avoir la mme incidence relativement faible sur la distribution au sein des autres organes. Ainsi ces rsultats nous laissent penser que les particules de plus grand diamtre sont limines de la circulation sanguine plus rapidement que les celles de faible diamtre, qui seraient plus furtives. Cela expliquerait la fluorescence plus faible des organes naccumulant pas les nanoparticules tels que les poumons, les reins et le pancras. On note galement une diffrence significative du signal mis par les intestins en fonction du diamtre des particules. Ainsi, il semble que le phnomne dlimination biliaire du fluorophore suivi de sa recapture par les intestins soit moins prononc pour les nanoparticules dont le diamtre est proche de 100 nm. Nanmoins, les variations de biodistribution entre les particules de diamtres diffrents sont trs faibles. Aucune modification majeure nest observe, la fluorescence restant toujours relativement homogne entre tous les organes. Cela peut sexpliquer par le fait quil ny a, en ce qui concerne le diamtre, quun facteur 3 entre les diffrentes particules testes. De plus, toutes les nano-gouttelettes restent dun diamtre infrieur aux fenestrations du foie (150 nm) et suprieur celles des reins (autour de 5 nm en tenant compte du diaphragme).

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo V.3.2.3.2. Influence de la nature du surfactant pegyl

Comme le montrent la Figure V15 et la Figure V17, la nature du surfactant pegyl semble navoir aucun impact sur le devenir des particules in vivo. En effet, aucune diffrence significative de la biodistribution nest observe. Cela peut laisser supposer que quel que soit le surfactant choisi, la couche de polyoxythylne est suffisamment dense pour quil ny ait pas ou peu de diffrences au niveau de la partie accessible des nanoparticules. Toutes les particules prsentent ainsi une surface similaire, ce qui conduit une biodistribution identique.

V.4. Conclusion
Les premiers tests biologiques ont confirm lintrt des nano-mulsions fluorescentes pour limagerie optique. Premirement, les expriences de compatibilit ex vivo entre le sang et les nanomulsions fluorescentes montrent que les traceurs sont injectables, tant dun point de vue optique que biologique. En effet, la stabilit de la fluorescence des nanoparticules dans le sang est largement suffisante pour permettre leur observation plus de 48 heures aprs injection. La mise en contact des nanoparticules avec le sang nengendre en outre quun faible phnomne dhmolyse. Ladministration de nano-mulsions fluorescentes par injection en intraveineuse dans des souris montre galement que le traceur a une distribution homogne. Il ne saccumule pas au niveau des reins, ni au niveau de certains organes riches en macrophages tels que les poumons et la rate. Cela laisse prsumer que les nano-mulsions ont une furtivit suffisante pour limiter leur phagocytose. Des analyses par cytomtrie en flux de leucocytes prlevs sur une souris 24 heures aprs linjection dune nano-mulsion fluorescente montrent dautre part que seule une partie des monocytes (macrophages circulants) deviennent fluorescents (Rsultats non prsents raliss par Sandrine Duffort lInstitut Albert Bonniot). Ainsi, les surfactants pegyls confrent aux nano-mulsions une furtivit efficace pour chapper au systme rticuloendothlial. Llimination des nanoparticules ntant pas prise en charge par la voie rnale ni par le systme rticuloendothlial, elle semble incomber aux hpatocytes par un mcanisme similaire celui du mtabolisme des lipoprotines ou des chylomicrons [64, 114].

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Chapitre V : Comportement des nano-mulsions en milieu biologique

Les variations de la formulation nont pas mis en vidence de modification significative de la biodistribution des nano-mulsions fluorescentes, traduisant ainsi la grande robustesse de cette dernire.

Enfin, en ce qui concerne la toxicit ventuelle des nano-mulsions, il est impossible, en labsence dexpriences ddies, dapporter des conclusions prcises. On peut nanmoins signaler quaucun animal nest dcd avant la fin prvue de lexprimentation (soit 19 jours aprs injection pour le suivi le plus long). Ce rsultat va donc dans le sens de linocuit de ces nanoparticules, mme sil est toutefois envisageable, au vue de la biodistribution observe, que les nano-mulsions perturbent le mtabolisme des lipoprotines.

En conclusion, le comportement des nano-mulsions dans lorganisme montre que grce leur furtivit, les nanoparticules esquivent le systme rticuloendothlial et une capture massive par le foie. Elles restent circulantes suffisamment longtemps pour envisager de cibler un tissu spcifique ou dimager un processus biologique donn.

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionnalises pour la dtection des tumeurs

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Les chapitres prcdents ont illustr les proprits physiques et optiques des nanomulsions, ainsi que leur comportement in vivo. Outre leur grande stabilit et la robustesse du procd de fabrication, les nano-mulsions, via lencapsulation de fluorophores organiques, possdent des proprits optiques remarquables pour des particules organiques en milieu aqueux. Leur formulation leur confre de plus une furtivit suffisante pour rester dans la circulation sanguine pendant plusieurs heures aprs linjection, conduisant ainsi une biodistribution homogne au sein de lorganisme des animaux. Ce chapitre se focalisera sur lutilisation des nano-mulsions pour la dtection de tumeurs. Nous montrerons galement lintrt de la fonctionnalisation de la surface des nanoparticules pour favoriser un ciblage spcifique de la zone tumorale et/ou linternalisation des particules par les cellules cibles.

VI.1. Les tumeurs, considrations gnrales

VI.1.1. Description
Le terme tumeur est issu du latin tumere qui signifie enfler, et dsigne en mdecine laugmentation de volume dun tissu. Il existe de nombreux types de tumeurs qui peuvent tre classs en deux catgories : les tumeurs bnignes, qui se caractrisent par la croissance lente et dlimite dans lespace de cellules matures et bien diffrencies. les tumeurs malignes, qui se caractrisent par une croissance rapide et invasive de cellules immatures ayant de nombreuses altrations au sein de leurs gnomes. Les tumeurs bnignes (verrues ou grains de beaut par exemple) sont, comme leur nom lindique, sans gravit pour lorganisme. Cependant, certaines dentre elles peuvent dgnrer et devenir malignes. Les tumeurs malignes, appeles galement cancers, ont un dveloppement rapide qui dgrade le fonctionnement de lorgane dont elles sont issues ; elles ont galement la proprit de gnrer des cellules filles qui sont transportes par le sang ou la lymphe vers dautres tissus o elles vont dvelopper des mtastases, autrement dit de nouvelles tumeurs.

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs

Les cancers sont la cause denviron 150 000 dcs par an en France et prs de 7 millions lchelle mondiale, daprs les chiffres de lInstitut National du Cancer (http://www.e-cancer.fr). Les tumeurs reprsentent donc un problme de sant majeur dont lincidence risque encore daugmenter avec le vieillissement de la population mondiale. Il existe aujourdhui plusieurs stratgies pour le traitement des cancers, les trois principales tant la chimiothrapie, la radiothrapie et lexrse (ablation chirurgicale), auxquelles sajoutent lhormonothrapie et limmunothrapie pour certains types de tumeurs. Si ces techniques font lobjet dimportants travaux de recherche conduisant lamlioration de leur efficacit, le principal facteur de gurison reste la dtection prcoce de la tumeur. En effet, il est primordial de prendre en charge les tumeurs le plus tt possible afin de limiter leur dveloppement et surtout leur dispersion sous forme de mtastases dans lorganisme. Toutes les techniques dimagerie dcrites dans le Chapitre II sont utilises pour le dpistage des cancers.

VI.1.2. Langiognse,

un

phnomne

cl

dans

le

dveloppement et la dtection des tumeurs


La tumeur dbute partir dune seule cellule, qui mute de telle manire que les mcanismes de suicide cellulaire ne sont plus fonctionnels, et qui se multiplie alors rapidement. Cependant, cette division exagre des cellules tumorales aboutit la formation dun tissu cancreux trs dense qui limite larrive des nutriments indispensables au dveloppement de ces cellules. Or, lorsque les cellules ont besoin de plus doxygne, elles librent des molcules dclenchant la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins. Ainsi, au cours du dveloppement des tumeurs, les cellules cancreuses vont librer dans leur environnement de nombreuses molcules, et plus particulirement une protine appele facteur de croissance de lendothlium vasculaire ou VEGF (sigle anglais pour Vascular Endothelial Growth Factor ). Le VEGF stimule langiognse, c'est--dire la cration de nouveaux vaisseaux sanguins qui vont irriguer la tumeur, permettant ainsi son dveloppement mais aussi le passage dans la circulation sanguine de cellules filles responsables des mtastases (Figure VI1).

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Figure VI1 : Schma du processus dangiognse associ au dveloppement tumoral. Les cellules tumorales librent dans le milieu extracellulaire une protine, le VEGF, qui stimule la formation de nocapillaires qui vont irriguer la tumeur et lui apporter tous les nutriments ncessaires sa croissance. Ces nouveaux vaisseaux sanguins permettent aussi le passage dans la circulation sanguine de cellules tumorales qui vont essaimer dans lorganisme et former des mtastases. Daprs www.genetech.com.

La libration du VEGF et langiognse qui en dcoule impliquent souvent une hypervascularisation des tumeurs solides. Cependant, les no-capillaires nont pas une structure aussi organise que les vaisseaux sanguins classiques. Les parois des capillaires sont normalement constitues dune couche de cellules endothliales paisse de seulement une cellule, ce qui permet la diffusion des nutriments du sang vers les tissus environnants. Nanmoins, les cellules endothliales se recouvrent partiellement au niveau des jonctions entre les cellules de manire empcher le passage dobjets de taille importante dans les interstices. La couche de cellules endothliales est entoure par une membrane basale qui assure la cohsion de lensemble. La formation lors de langiognse de nouveaux vaisseaux sanguins conduit une structure imparfaite de la paroi vasculaire. La jonction entre les cellules endothliales est plus lche, formant ainsi des interstices de taille importante entre les cellules. Ces pores, appels galement fenestrations, peuvent atteindre dans ce cas plusieurs centaines de nanomtres de diamtre. De plus, la membrane basale est galement interrompue en de nombreux lieux ; les fenestrations traversent donc toute la paroi vasculaire. Du fait de ces dfauts, les nocapillaires ont une porosit suprieure celle des capillaires classiques (Figure VI2).

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs

Figure VI2 : Schma de la structure dune artriole, dun capillaire et dun no-capillaire. Les capillaires sont forms par une couche de cellules endothliales entoures par la membrane basale qui leur offre un support et permet le maintien de la structure. Lartriole relie les artres aux capillaires ; elle se diffrencie de ces derniers par la prsence dune couche de cellules musculaires lisses sur la face extrieure de la membrane basale qui permet de rguler par contraction le dbit dans les capillaires. Les no-capillaires induits par le phnomne dangiognse sont des capillaires pour lesquels les jonctions entre deux cellules endothliales adjacentes sont imparfaites, formant ainsi des interstices importants entre les cellules nomms fenestrations. La membrane basale entourant ces cellules endothliales est elle aussi perturbe dans les no-capillaires puisquelle y est fortement lacunaire. Daprs www.genetech.com.

Les tumeurs solides sont donc caractrises par un rseau vasculaire important mais fenestr et un drainage lymphatique faible. En effet, la rapide croissance tumorale induit une forte densit, ce qui rduit lespace intercellulaire et limite le drainage par la lymphe. Ces caractristiques induisent au niveau des tumeurs solides un phnomne nomm EPR en anglais (pour Enhanced Permeation and Retention ) : ce phnomne correspond un accroissement de la permation engendr par les fenestrations de lendothlium vasculaire, ainsi qu une augmentation de la rtention cause du faible drainage lymphatique. Leffet EPR favorise notamment laccumulation de macromolcules et de nanoparticules au sein des tumeurs solides [115]. Cest pourquoi la grande majorit des systmes de dlivrance de mdicaments par des collodes se base sur leffet EPR pour apporter les principes actifs au sein des tumeurs.

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VI.2. Le ciblage des tumeurs


Afin damliorer laccumulation des nanoparticules dans les tumeurs, leur surface peut en outre tre fonctionnalise par des ligands de ciblage spcifique (anticorps, protines, peptides, aptamres ou saccharides par exemple), de manire favoriser leur capture par les cellules de la zone tumorale. Dans un premier temps le choix des rcepteurs, ainsi que celui des ligands associs utiliss pour fonctionnaliser la surface des nano-mulsions, seront discuts. Ensuite, la technique de couplage de ces ligands et son application la fabrication de nano-mulsions fonctionnalises seront prsentes.

VI.2.1. Le couple ligand / rcepteur


Le choix de la cible biologique doit rpondre aux critres suivants : La cible doit tre accessible : elle doit tre expose sur la surface des cellules, et si possible sur des cellules en contact avec la circulation sanguine, afin de maximiser les chances dinteraction avec les particules en suspension dans le sang. La cible doit tre spcifique de la zone tumorale, ou au moins exprime plus fortement au sein des tumeurs que dans les autres organes. La cible doit pouvoir tre accroche par un ligand ou un anticorps possdant une grande affinit et une forte slectivit pour la cible.

VI.2.1.1. Le rcepteur : lintgrine V3

Comme indiqu prcdemment, le dveloppement de tumeurs solides saccompagne souvent dun phnomne dangiognse (VI.1.2). La cible biologique que nous avons choisie est un marqueur de ce phnomne : il sagit de lintgrine V3 qui est surexprime par les cellules de lendothlium vasculaire au cours de la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins. Les intgrines sont des protines rceptrices transmembranaires. Elles se prsentent sous la forme dhtrodimres constitus de deux sous-units appeles et . Actuellement,

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs

18 sous-units et 8 sous-units ont t identifies chez les vertbrs, mais seulement 24 intgrines ont t dcouvertes lheure actuelle [116]. Ces rcepteurs sont composs de trois domaines : le domaine extracellulaire qui correspond lextrmit N de chaque sous-unit et qui forme le site de reconnaissance de leur ligand ; le domaine transmembranaire qui permet dancrer la protine dans la bicouche lipidique de la membrane cellulaire ; le domaine intracellulaire qui est reli au cytosquelette via de nombreuses protines (Figure VI3).

Figure VI3 : Schma d'une intgrine.

De nombreuses intgrines reconnaissent une courte squence peptidique : arginine glycine - acide aspartique (RGD). Cette squence est prsente dans de nombreuses protines de la matrice extracellulaire (MEC), notamment la fibronectine et la vitronectine. Les intgrines assurent en effet une part importante de ladhsion des cellules sur la MEC mais elles sont galement impliques dans la transduction du signal via leur connexion avec le cytosquelette, permettant notamment la migration et la prolifration des cellules. Lintgrine V3 fait partie des rcepteurs de la squence peptidique RGD, et plus spcifiquement de la vitronectine. Cette intgrine est particulirement implique dans langiognse. Les cellules endothliales qui forment les parois des novaisseaux expriment en grande quantit cette intgrine, et bien quelles soient lies ladhsion des cellules avec la matrice extracellulaire, les intgrines V3 sont galement exprimes sur la surface luminale de ces cellules et sont donc accessibles depuis la circulation sanguine [117]. Les intgrines

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

V3 sont en consquence des cibles de choix pour la dtection de langiognse et plus largement des tumeurs.

VI.2.1.2. Le ligand : cRGD

Les intgrines V3 sont des rcepteurs intressants pour la dtection de tumeurs. Cependant leur ligand, qui est une courte squence peptidique, est galement reconnu par dautres intgrines. Celles-ci nont toutefois pas toutes la mme affinit pour les diffrentes protines porteuses de la squence RGD. Ainsi chaque intgrine semble privilgier une conformation diffrente de la squence. En effet, bien que lenchanement des trois peptides RGD soit prsent dans de nombreuses protines de la matrice extracellulaire, lenvironnement proche du tripeptide est diffrent pour chacune dentre elles et la conformation de la squence nest donc pas identique. Il a ainsi t dmontr que certains peptides synthtiques dont la conformation est bloque par cyclisation ont une affinit et une slectivit suprieures celles de peptides analogues mais linaires. Le choix des acides amins qui participent au cyclopeptide (de part et dautre de lenchanement arginine - glycine - acide aspartique) permet de contrler la conformation et donc la slectivit du ligand vis--vis des diffrents types dintgrines reconnaissant la squence RGD [118, 119]. Le ligand que nous utilisons pour cibler les intgrines V3 est un cyclopentapeptide (Figure VI4) dont la squence est la suivante : L-arginine ; L-glycine ; L-acide aspartique ; D-phnylalanine ; L-lysine (soit cRGDfK selon le code une lettre). La prsence de la lysine et de la phnylalanine favorise une conformation du cyclopeptide qui est reconnue spcifiquement par les intgrines V3, confrant ainsi au cRGDfK une grande affinit et une slectivit leve pour ces intgrines. La lysine permet en outre, grce sa fonction amine prsente sur sa chane latrale, de greffer le peptide sur des vecteurs et plus particulirement sur les nano-mulsions. Un analogue de cette molcule dans lequel la glycine est substitue par lalanine est utilis en tant que tmoin ngatif, le cRADfK. Cette molcule na en effet aucune affinit pour les intgrines V3. Afin dallger la notation dans la suite du travail, le cRGDfK sera nomm uniquement cRGD et le cRADfK sera appel cRAD.

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs

Figure VI4 : Structure chimique du cRGD gauche et du cRAD droite. La substitution de la glycine par lalanine au sein du cRAD est reprsente en rouge.

VI.2.2. Le

couplage

chimique

des

ligands

sur

les

nanoparticules
Afin dobtenir un ciblage actif, les ligands doivent tre relis la surface de la nanoparticule, prfrentiellement par une liaison covalente de manire limiter les dissociations entre les particules et les ligands. Cela impose donc de modifier les nanomulsions afin de pouvoir greffer les ligands de manire covalente. La surface des nanoparticules tant constitue dune couche de molcules amphiphiles, il est donc ncessaire, en vue de raliser le greffage, dintroduire des surfactants fonctionnalisables dans la couche stabilisatrice des gouttelettes. Le greffage, qui correspond au couplage chimique entre le surfactant et le ligand, peut tre ralis deux tapes distinctes du processus de fabrication des nano-mulsions fonctionnalises : soit le couplage est ralis dans un premier temps, puis les surfactants fonctionnaliss sont ajouts la formulation qui est ensuite mulsifie ; soit linverse les surfactants fonctionnalisables sont incorpors dans la formulation et ragissent avec les ligands aprs mulsification (on parle alors de greffage in situ). Le greffage avant mulsification ncessite de raliser un lot dmulsion pour chaque ligand. Cela impose donc dutiliser des quantits importantes de ligands, lmulsification devenant dlicate en dessous dun volume total de 2 mL. Le couplage in situ permet quant - 181 -

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

lui de travailler avec des quantits de ligands plus faibles puisquil est possible de raliser le greffage sur le volume dmulsion dsir : il est ainsi envisageable de raliser diffrentes fonctionnalisations avec le mme lot de nano-mulsion fonctionnalisable. Etant donn quun seul lot dmulsion est suffisant pour raliser de nombreuses expriences biologiques (que se soit in vitro ou in vivo), cest la technique de greffage in situ qui sera utilise. Le choix de la raction chimique de couplage doit rpondre de nombreux critres pour tre compatible avec un greffage in situ : elle doit se drouler en milieu aqueux, un pH compatible avec la stabilit collodale, ne doit pas modifier la stabilit chimique des fluorophores encapsuls dans les globules, tout en tant la plus quantitative, rapide, et spcifique possible. La raction chimique choisie pour greffer les cRGD, et plus gnralement les ligands biologiques la surface des nano-mulsions, est base sur la ractivit entre les malimides et les thiols [120]. Cette raction seffectuant en milieu aqueux et pH neutre conduit la formation dune liaison covalente de type thioester entre le surfactant porteur dun groupement malimide et un ligand prsentant une fonction thiol (Figure VI5).

Figure VI5 : Principe du greffage in situ de ligands biologiques la surface des nanoparticules.

Les cRGD et cRAD dcrits dans le paragraphe prcdent ne portent pas de fonction thiol. Cependant, le groupe amine port par la chane latrale de la lysine peut tre modifi. Les ligands utiliss sont donc transforms par drivation de lamine par un groupement contenant une fonction thiol sous une forme protge par un groupe S-actyle. Cette protection sera clive juste avant raction avec le malimide afin de limiter les ractions parasites lies la ractivit des thiols.

Une vision schmatique des globules fluorescents et fonctionnaliss est prsent cidessous (Figure VI6).

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs

Figure VI6 : Reprsentation graphique en 3 dimensions de la structure dun globule fluorescent et fonctionnalis par un ligand biologique.

VI.2.3. Prparation de nano-mulsions fonctionnalises


Comme dcrit dans le paragraphe prcdent, la fonctionnalisation des nanoparticules seffectue in situ, soit aprs mulsification. Elle ncessite cependant lincorporation de surfactants fonctionnalisables dans la formulation de la nano-mulsion. En vue des validations biologiques, trois types de fonctionnalisation sont raliss pour chaque lot de nano-mulsion : cRGD (ciblant spcifiquement les intgrines V3) ; cRAD (peptide tmoin ngatif pour les intgrines V3) ; et OH (nanoparticule non fonctionnalise par un peptide mais par une courte molcule possdant une fonction hydroxyle tmoin ngatif).

VI.2.3.1. Surfactant fonctionnalisable

Le surfactant fonctionnalisable est un driv de la phosphatidylthanolamine, dont lamine terminale est implique dans la formation dune liaison amide avec une chane pegyle (note PEG) elle-mme porteuse lautre extrmit dun groupement malimide (not MAL) (Figure VI7). Le poids de la chane PEG est de 5000 g/mol, ce qui correspond environ 110 motifs polyoxythylnes. Cette taille a t choisie pour tre suprieure celle des polymres formant la couche strique des nano-mulsions (dont le poids est de 2250 g/mol,

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

soit environ 50 motifs dans le cas de la formulation dite de rfrence). Cela permet aux ligands de ne pas tre pigs dans cette couche et favorise donc leur libert de mouvement audessus des chanes de PEG. Le surfactant fonctionnalisable, ou PE-PEG-MAL, est prpar selon le protocole dcrit dans lannexe VI et rsum sur la Figure VI7. Brivement, la phosphatidylthanolamine et le polymre bisfonctionnel sont dissous dans du dichloromthane. La solution est basifie par ajout de trithylamine puis le mlange est agit pendant 2 heures temprature ambiante sous argon. Le solvant est ensuite vapor sous vide et le produit redispers dans un volume connu de dichloromthane. La solution de PE-PEG-MAL obtenue entre directement dans la composition des nano-mulsions sans autre purification, les sous-produits de la raction tant en effet limins lors de la dialyse finale des nano-mulsions. La masse molaire du surfactant fonctionnalisable ainsi obtenu est de 5886 g/mol.

Figure VI7 : Synthse du surfactant fonctionnalisable PE-PEG-MAL.

VI.2.3.2. Prparation des mulsions

La fabrication des nano-mulsions fonctionnalisables est similaire celle des nanomulsions prcdemment dcrites (voir Chapitre III), except quune partie des surfactants pegyls est remplace par le surfactant fonctionnalisable.

VI.2.3.2.1. Compositions

Deux formulations bases sur la formulation de rfrence ont t conues, chacune contenant des quantits de surfactant fonctionnalisable diffrentes. Le nombre de moles de surfactants est identique pour les deux formulations et est similaire celui de la formulation - 184 -

Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs

de rfrence soit 0,138 mmol/mL (ou 0,276 mmol de surfactants pour un lot de 2 mL). Lajout de PE-PEG-MAL est donc compens par une diminution de la quantit de Myrj 53 afin de conserver la mme quantit molaire globale de surfactants. Les deux compositions testes contiennent respectivement 0,5 % et 2,5 % en masse de surfactant fonctionnalisables (Tableau VI1 et Tableau VI2). Dans tous les cas, les nano-mulsions sont dopes DiD hauteur de 400 M (voir Chapitre IV pour plus de dtails sur le dopage).

Masse (mg) Phase disperse Phase continue Huile de soja Suppocire Glycrol Solution saline Lcithine Surfactants Myrj 53 PE-PEG-MAL 50 150 50 q.s.p 2000 138 224 10

% m/m 2,5 7,5 2,5 66,4 6,9 11,2 0,5

mol / / / / 183,5 90,1 1,7

Tableau VI1 : Composition de la formulation 0,5 % m/m de surfactant fonctionnalisable (lot de 2 mL). Les variations entre les deux compositions sont prsentes en rouge.

Masse (mg) Phase disperse Phase continue Huile de soja Suppocire Glycrol Solution saline Lcithine Surfactants Myrj 53 PE-PEG-MAL 50 150 50 q.s.p 2000 138 207 49

% m/m 2,5 7,5 2,5 65,3 6,9 10,4 2,5

mol / / / / 183,5 83,3 8,4

Tableau VI2 : Composition de la formulation 2,5 % m/m de surfactant fonctionnalisable (lot de 2 mL). Les variations entre les deux compositions sont prsentes en rouge.

VI.2.3.2.2. Prparation

Le protocole dmulsification est proche de ceux dcrits dans les chapitres prcdents, la diffrence notable que le PE-PEG-MAL est ajout dans la phase huileuse et non dans la phase aqueuse, contrairement aux surfactants pegyls classiques, afin de favoriser leur participation la stabilisation des globules. Brivement, la fabrication des nano-mulsions consiste prparer dans un premier temps une phase aqueuse correspondant une solution saline (Hepes 0,05M ; EDTA 0,01 M ;

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

pH 7,4) dans laquelle le surfactant pegyl et le glycrol sont dissous, et une phase huileuse contenant lhuile de soja, la Suppocire NC, la lcithine, le fluorophore et le surfactant fonctionnalisable. La phase aqueuse est ensuite ajoute chaud la phase huileuse et le mlange est soniqu afin dobtenir une solution de nanoparticules fluorescentes et fonctionnalisables exposant des groupements malimides en surface.

VI.2.3.3. Fonctionnalisation

La solution de nanoparticules ainsi obtenue est divise en trois parties, une pour chacune des fonctionnalisations (cRGD ; cRAD ; OH). Les peptides cRGD et cRAD (Asynth Service B.V., Pays-Bas), dont les fonctions thiols sont masques par un groupement S-actyle, sont pralablement mis en solution dans leau dionise avec deux quivalents de TCEP pendant 30 minutes. Le TCEP (acronyme pour tris(2-carboxythyl)phosphine) est un agent de rduction couramment utilis en biologie pour couper les ponts disulfures. Il est galement capable de cliver le groupement protecteur S-actyle, librant ainsi la fonction thiol des ligands indispensable au greffage. Son utilisation pour ce type de dprotection est prfre par rapport celle plus classique de lhydroxylamine, car cette dernire entrane une dgradation du fluorophore encapsul dans les nanoparticules. Les solutions de cRAD et de cRGD dprotgs, ainsi quune solution contenant uniquement du TCEP en mme proportion (qui conduira aux nanoparticules OH) sont ensuite ajoutes aux nanoparticules disperses dans une solution tampon adquate pour le greffage (Hepes 0,05M ; EDTA 0,01 M ; pH 7,4). Les quantits de cyclopeptides ajoutes correspondent environ 1,5 quivalents de peptides par rapport la quantit de malimides. Chacune des trois solutions ainsi formes est agite pendant 2 heures temprature ambiante et labri de la lumire, avant lajout de 3 quivalents (toujours par rapport aux malimides) de -mercapto-thanol. Les solutions sont ensuite agites pendant 30 minutes

supplmentaires. Le -mercapto-thanol possde une fonction thiol ; cest pourquoi il est utilis pour neutraliser les malimides nayant ventuellement pas ragi avec les ligands et tous les groupements de la solution ne contenant pas de peptides. Les solutions sont ensuite dialyses contre une solution de NaCl 154 mM de manire liminer les diffrents sous-produits et les molcules non greffes, ainsi que pour remplacer le tampon de greffage par une solution saline adquate pour une injection intraveineuse. Les

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs

solutions sont dialyses contre 500 fois leur volume ; le dialysat est chang 3 fois (toutes les 30 minutes dagitation) afin dliminer toutes les molcules indsirables. Aprs purification, les solutions sont doses par spectromtrie de fluorescence et dilues avec une solution de NaCl 154 mM de manire obtenir une concentration en fluorophores de 50 M. Elles sont enfin strilises par filtration (0,22 m) avant leur utilisation lors des expriences biologiques. Un protocole complet de fonctionnalisation de nano-mulsion pour la formulation 2,5 % m/m de surfactant fonctionnalisable est disponible dans lannexe VII.

Figure VI8 : Schma des 3 types de nano-mulsion fonctionnalise (cRAD; cRGD; OH).

VI.2.3.4. Calcul du nombre de ligands biologiques exposs en surface

De la mme manire que pour les fluorophores, il est possible de calculer une valeur approximative du nombre de ligands biologiques exposs la surface des nanoparticules. En se basant sur le diamtre moyen des nanoparticules, et en supposant dune part que lincorporation du surfactant fonctionnalisable est totale, et que tous ces surfactants ont bien t coupls avec les ligands dautre part, on peut obtenir une indication sur le nombre de ligands exposs la surface de chaque globule. Le principe de calcul est similaire celui dcrit dans le Chapitre IV. Ainsi, le nombre de ligands par globule ( N Ligands / Glob ) est calcul grce lquation VI.1 :

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

N Ligands / Glob =

N Ligands N Glob

(quation VI.1)

Le nombre de ligands ( N Ligands ), ici assimil celui des surfactants fonctionnalisables, sobtient grce lquation VI.2 o N S .
Fonc

, M S.

Fonc

, nS .

Fonc

, mS .

Fonc

reprsentent

respectivement le nombre de molcules de PE-PEG-MAL, sa masse molaire, la quantit en moles de surfactant fonctionnalisable, et la masse correspondante ; enfin N A est le nombre dAvogadro.

N Ligands = N S .

Fonc

= nS .

NA = Fonc

mS . M S.

Fonc Fonc

N A (quation VI.2)

La dtermination du nombre de globules N Glob est identique celle dcrite dans le Chapitre IV. Pour rappel, le nombre de globules est calcul grce lquation VI.3 dans laquelle V d correspond au volume total de la phase disperse et < v > reprsente le volume moyen dun globule (directement obtenu grce lquation VI.4 o < d > reprsente le diamtre moyen du globule).
N Glob = V d <v>

(quation VI.3)

< v >=

< d >3 (quation VI.4) 6

La dtermination de V d est base sur lhypothse que lensemble des surfactants de la formulation participe la stabilisation des globules. Le volume peut ainsi tre estim grce lquation VI.5, partir de la masse totale de la phase disperse (huile, cire, lcithine, surfactants pegyls et surfactants fonctionnalisables) et de la densit globale de la phase disperse (cette densit globale varie en fonction des formulations ; elle sera arbitrairement fixe 1,1).
V d = m d d d = 1 d d mhuile + mcire + mlcithine + ms.

pegyls

+ mS .

Fonc

) (quation VI.5)

Le diamtre moyen des globules nest pas influenc par la fonctionnalisation : il est en effet denviron 35 nm pour les deux formulations. Ainsi, en fonction des compositions indiques prcdemment (Tableau VI1 et Tableau VI2), les globules issus des formulations 0,5 % m/m et 2,5 % m/m en surfactant fonctionnalisable possdent respectivement environ 44 et 208 ligands exposs leur surface (Tableau VI3).

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs

PE-PEG-MAL Formulation masse (mg) 0,5 % 2,5 % 10 49 quantit (mol) 1,699 8,325

N Ligands
1,023.10 5,013.10
18 18

N Glob
2,316.10 2,405.10
16 16

N Ligands / Glob
44 208

Densit (Ligands/nm) 0,011 0,054

Tableau VI3 : Calcul du nombre thorique de ligands par globule pour les formulations 0,5 % m/m et 2,5 % m/m en surfactant fonctionnalisable.

Ces valeurs calcules sont des valeurs maximales puisque nous navons pas de valeur ni dinformation sur la quantit de surfactant fonctionnalis rellement incorpore au sein des nanoparticules, et nous ne disposons pas non plus du taux de greffage des ligands lors du couplage in situ. Ces valeurs sont dautant plus approximatives que les diamtres mesurs par diffusion quasi-lastique de la lumire sont des diamtres hydrodynamiques qui englobent par consquent aussi les couches de solvatation. La densit de ligands (exprime en ligands par nm2) se rvle aprs calcul relativement faible pour les deux formulations, puisque lon trouve environ 1 ligand tous les 80 nm2 pour la formulation 0,5 % m/m et 1 tous les 20 nm2 pour la formulation 2,5 % m/m.

VI.3. Les modles tumoraux et validation in vitro

VI.3.1. Modles de cellules tumorales


Diffrentes lignes cellulaires tumorales, humaines ou animales, ont t utilises pour valuer lintrt des nano-mulsions pour la dtection des tumeurs. Les protocoles de culture des diffrentes ligns sont dtaills dans lannexe VIII.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

VI.3.1.1. Cellules tumorales Ts/Apc

Les cellules tumorales Ts/Apc ou TSA sont issues du cancer du sein de souris femelle de la ligne BALB/c [121]. Elles se caractrisent par une croissance tumorale rapide engendrant la formation de nombreux novaisseaux fortement fenestrs.

VI.3.1.2. Cellules tumorales OVCAR-3

Les cellules OVCAR-3 sont des cellules tumorales issues dun adnocarcinome ovarien humain. De manire similaire aux Ts/APC, ces cellules ont une croissance rapide conduisant un endothlium vasculaire imparfait.

VI.3.1.3. Cellules tumorale HEK 3

La ligne HEK293(3) est un sous-clone de la ligne de cellules embryonnaires humaines de rein HEK293, transfecte de manire stable par un plasmide codant pour la sousunit humaine de lintgrine 3. Ces cellules tumorales nommes par la suite HEK 3 surexpriment ainsi les intgrines V3 leur surface. La croissance de telles cellules, une fois implantes dans des souris, est nanmoins plus lente que celle des cellules Ts/Apc ou OVCAR-3. Les tumeurs qui se dveloppent partir des cellules HEK 3 sont moins bien vascularises et les vaisseaux sanguins qui les irriguent ont moins de fenestrations.

VI.3.2. Test in vitro de reconnaissance cellulaire des nanoparticules - cRGD


Les cellules HEK 3 exposent naturellement leur surface un grand nombre dintgrines V3, ce qui permet de les utiliser pour raliser des tests in vitro de reconnaissance cellulaire, et ainsi valider le couplage des ligands sur les diffrents types de nanoparticules fonctionnalises. Les trois fonctionnalisations dcrites prcdemment (cRGD, cRAD et OH) ont ainsi t testes.

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs

VI.3.2.1. Protocoles exprimentaux

Pour raliser les tests de reconnaissance cellulaire, un million de cellules HEK 3 sont resuspendues dans 200 L de PBS (Phosphine Buffer Saline), ou de DMEM (Dulbeccos Modied Essential Medium) 10 % de srum de veau ftal (SVF), contenant les nanomulsions fonctionnalises dont la concentration finale est de 0,2 M en fluorophores. Aprs 15 minutes dincubation 4C, les cellules sont rinces et resuspendues avant dtre analyses par cytomtrie en flux. Pour les analyses par microscopie de fluorescence, les cellules sont cultives sur des lamelles. Elles sont rinces avec du PBS avant dtre mises en contact avec 200 L dune solution de PBS contenant les nano-mulsions fonctionnalises, dont la concentration finale est de 0,2 M en fluorophores. Aprs une incubation de 15 minutes 4C, les cellules sont rinces puis fixes avec du PFA (paraformaldhyde). Le noyau des cellules est color par une solution de Hoechst et les lames sont enfin observes au microscope optique fluorescence. Les protocoles exprimentaux des analyses par cytomtrie de flux et dobservation par microscopie de fluorescence sont dtaills dans lannexe VIII. Ces exprimentations cellulaires ont t rlises lIAB ds lquipe de Jean-Luc Coll par Sandrine Duffort.

Les nano-mulsions utilises pour ces deux analyses sont issues de la formulation 2,5 % m/m en surfactant fonctionnalisable, ce qui correspond environ 200 ligands par particule, soit une concentration thorique en ligands de 2 M dans les milieux dincubation.

VI.3.2.2. Rsultats

La Figure VI9 regroupe les clichs de microscopie et les donnes de cytomtrie en flux pour les trois fonctionnalisations testes, pour deux conditions dincubation diffrentes. Les clichs montrent la prsence des nanoparticules (coloration rose) uniquement dans le cas o elles sont fonctionnalises par les cRGD. On observe galement une modification de la morphologie des cellules en prsence des nanoparticules cRGD : elles sont moins tales et prennent une forme plus ronde que les cellules incubes en prsence des nanoparticules cRAD ou OH. Les analyses ralises en cytomtrie en flux prsentent des rsultats identiques quel que soit le milieu dincubation (PBS ou DMEM 10 % en SVF). Seuls les rsultats raliss

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

avec le milieu contenant le srum de veau ftal sont donc prsents. Les donnes obtenues indiquent un nombre de cellules fortement fluorescentes nettement plus important dans le cas des nano-mulsions cRGD que pour les autres types de fonctionnalisation.

Figure VI9 : Observations microscopiques de cellules HEK 3 incubes en prsence de nanoparticules fonctionnalises et graphiques de cytomtrie en flux correspondants pour deux conditions dincubation : 15 minutes 4C, et 15 minutes 4C puis 1 heure 37C.

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs

VI.3.2.3. Discussion

Les observations en microscopie de fluorescence et les analyses en cytomtrie en flux confirment lexistence dune reconnaissance spcifique par les cellules HEK 3 des nanoparticules fonctionnalises avec le cRGD, puisque que seules les cellules incubes avec ce type de particules deviennent fluorescentes. Dautre part, les clichs de microscopie montrent que lincubation 4C permet uniquement la fixation entre les ligands et les rcepteurs, linternalisation des nanoparticules ne se produisant que si les cellules sont ensuite maintenues 37C. Les nanoparticules fluorescentes semblent alors se concentrer dans certaines zones du cytoplasme. Ces rsultats prouvent la fois lefficacit du greffage des ligands la surface des particules, ainsi que la reconnaissance et la disponibilit des cRGD pour la formation de complexes avec les intgrines V3. Le fait que la prsence de srum de veau ftal lors des analyses de cytomtrie en flux ne modifie pas les rsultats obtenus par rapport des conditions plus idales est galement important, car cela signifie que la prsence de protines ne gne pas la reconnaissance des cRGD par les intgrines V3. Les rsultats prsents ont t obtenus avec des nano-mulsions issues de la formulation 2,5 % m/m en surfactant fonctionnalisable, mais des rsultats similaires en cytomtrie en flux ont t observs avec des solutions issues de la formulation 0,5% m/m (qui comportent environ 5 fois moins de ligands exposs en surface). Cela indique que mme une densit de ligands plus faible (1 ligand tous les 80 nanomtres carrs pour la formulation 0,5% m/m) est suffisante pour permettre un couplage significatif avec des cellules exprimant les intgrines V3 dans des conditions in vitro.

VI.4. Ciblage actif des tumeurs in vivo

VI.4.1. Mise en vidence de leffet EPR ( Enhanced Permeation and Retention )


Avant dvaluer limpact rel de la fonctionnalisation de la surface des nanoparticules pour le ciblage des tumeurs, il est utile de connatre le comportement des nano-mulsions non - 193 -

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

fonctionnalises vis--vis des tissus cancreux. Il est effectivement connu que les dfauts de la vascularisation des tumeurs associs au faible drainage lymphatique favorisent laccumulation passive des nanoparticules au sein de la zone tumorale : cest leffet EPR (VI.1.2).

Afin de visualiser laccumulation passive des nanoparticules fluorescentes non fonctionnalises dans les tumeurs, 200 L dune solution de nano-mulsion (issue de la formulation de rfrence et dope 400 M en DiD) correspondant 10 nmol de fluorophores ont t injects des souris porteuses de tumeurs sous-cutanes (voir annexe VIII). Deux modles tumoraux diffrents ont t tudis : OVCAR et HEK 3.

Les clichs de fluorescence raliss 24 heures aprs linjection du traceur montrent des diffrences importantes au niveau des zones tumorales. En effet, un signal intense de fluorescence est mis depuis la tumeur OVCAR, contrairement la tumeur HEK 3 qui nest pas distinguable sur le clich de fluorescence.

Figure VI10 : Clich de fluorescence de souris porteuses de tumeurs sous-cutanes OVCAR (gauche) et HEK 3 (droite) 24 h aprs injection de 200 L de nano-mulsion non fonctionnalise (50 M en fluorophores). Les tumeurs sont dlimites par les lignes pointilles.

Ainsi, il apparat que leffet EPR est dans certains cas suffisamment favorable pour induire une accumulation passive des nanoparticules dans la zone tumorale, mais cela dpend fortement de la tumeur et plus particulirement de la vascularisation de celle-ci. Dans les expriences suivantes utilisant les nano-mulsions fonctionnalises, lutilisation de nano-mulsions OH (non fonctionnalises par un peptide) permettront de mettre en vidence la part de laccumulation lie leffet EPR.

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs

VI.4.2. Exprimentation in vivo : premire srie


Une exprience sur souris porteuses de tumeurs TSA est ralise dans le but dobserver laccumulation des nanoparticules fluorescentes et fonctionnalises (cRGD ; cRAD ; OH) dans les tumeurs en fonction du temps. Il sera ainsi possible, grce cette tude, de dterminer le temps dobservation aprs injection le plus pertinent pour quantifier laccumulation ventuelle des globules dans la zone tumorale.

VI.4.2.1. Protocole exprimental

Au cours de cette exprience, 9 souris Swiss Nude femelles porteuses de tumeurs issues de cellules Ts/Apc sont utilises comme modle animal (annexe VIII). Les nanomulsions sont injectes par voie intraveineuse dans la queue raison de 200 L de solution par souris et de trois souris par type de fonctionnalisation. Les solutions injectes sont issues de la formulation 0,5% m/m en surfactant fonctionnalisable prcdemment dcrite (VI.2.3.2.1). La quantit administre pour chaque injection correspond donc 10 nmol de fluorophores DiD et environ 20 nmol de ligands. Toutes les injections et acquisitions d'images sont ralises alors que les souris sont maintenues sous anesthsie gnrale par voie gazeuse (isoflurane). Les animaux anesthsis sont imags avec le dispositif dimagerie de fluorescence par rflectance prcdemment dcrit (voir Chapitres II et V). Les images sont enregistres 30 minutes, 1 heure, 2 heures, 3 heures, 4 heures, 5 heures, 6 heures, 24 heures, 31 heures, 48 heures, 72 heures et 96 heures aprs les injections de nano-mulsions fluorescentes fonctionnalises.

VI.4.2.2. Rsultats

Les clichs enregistrs 24 heures aprs linjection (Figure VI11) montrent une accumulation plus importante au niveau de la tumeur quau niveau du reste de lanimal. Ce constat est cependant valable pour tous les animaux et semble donc indpendant de la fonctionnalisation des nanoparticules.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Figure VI11 : Clichs de fluorescence de souris porteuses de tumeurs Ts/Apc sous-cutanes (10 millions de cellules implantes 12 jours avant linjection des nano-mulsions) 24 h aprs injection de 200 L de nano-mulsions fonctionnalises (50 M en fluorophores). Les tumeurs sont dlimites par les lignes pointilles.

Le traitement de lensemble des clichs obtenus permet de dterminer le rapport tumeur / peau via lquation VI.1 o le rapport tumeur sur peau est not RTumeur et o I Tumeur ,
Peau

I Peau , I Fond dsignent respectivement lintensit moyenne de fluorescence de la tumeur, de la peau, et du fond (ce qui correspond au bruit de la camra).

RTumeur =
Peau

I Tumeur I Fond (quation VI.1) I Peau I Fond

Lvolution de ce rapport avec le temps (Figure VI12) confirme laccumulation des nanoparticules dans la zone tumorale, les meilleurs contrastes tant atteints pour des temps aprs injection suprieurs 24 heures. On note cependant une diffrence significative entre les nano-mulsions fonctionnalises (cRGD et cRAD) et celles qui ne sont pas fonctionnalises par un peptide (OH).

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs


Nano-mulsion cRAD 3 Nano-mulsion cRGD Nano-mulsion OH

2,5 Rapport Tumeur/Peau

1,5

0,5 0 10 20 30 40 50 heures 60 70 80 90 100

Figure VI12 : Evolution du rapport tumeur sur peau en fonction de la fonctionnalisation.

VI.4.2.3. Discussion

Les clichs de fluorescence montrent la prsence dune accumulation des nanoparticules fluorescentes plus importante dans la zone tumorale que dans les tissus annexes tels que la peau, et ce quel que soit la fonctionnalisation des particules. Les rapports tumeur sur peau calculs montrent en effet labsence de diffrence entre les globules exposant les cRGD ou les cRAD. Le rapport tumeur sur peau des nanoparticules OH est quant lui sensiblement plus faible que pour les deux autres types de fonctionnalisation. Ainsi 24 heures aprs injection, le rapport tumeur sur peau est denviron 1,7 pour les globules OH alors quil est suprieur 2,1 pour les nanoparticules cRGD ou cRAD (Figure VI13). En analysant plus prcisment les rsultats, il apparat cependant que le signal mis par les tumeurs est similaire pour les trois fonctionnalisations, et quune accumulation plus prononce dans la peau dans le cas des nanoparticules OH est en ralit la cause de la diffrence observe entre les rapports tumeur sur peau (Figure VI13).

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo
Tumeur 14 000 Peau Rapport Tumeur / Peau 5

12 000 4 Rapport Tumeur / Peau 10 000 RLU / pixel / 20 ms 3

8 000

6 000

4 000 2,2 2,1 1,7 1

2 000

Nano-mulsion cRAD Nano-mulsion cRGD Nano-mulsion OH

Figure VI13 : Intensits de fluorescence des tumeurs et de la peau (corriges de la fluorescence du noir) mesures 24 heures aprs injection des nano-mulsions fonctionnalises. La barre verte reprsente le rapport tumeur sur peau calcul partir des intensits sus-mentionnes.

Laccumulation au sein de la tumeur nest donc pas modifie par la fonctionnalisation des nanoparticules, ce qui signifie quil sagit uniquement dun phnomne daccumulation passif li la forte fenestration de lendothlium vasculaire des capillaires irriguant les tumeurs (effet EPR). Le rapport tumeur sur peau augmente au cours des premires 24 heures puis se stabilise pour toutes les nanoparticules. Cela confirme encore une fois que les nanoparticules ont une dure de demi-vie plasmatique importante, et galement que laccumulation au sein des tumeurs est un processus lent.

VI.4.3. Exprimentation in vivo : deuxime srie


La premire exprience a permis dtablir lvolution du rapport tumeur sur peau en fonction du temps. Au vu des rsultats obtenus, le temps dobservation pertinent en terme de contraste a t dfini 24 heures aprs injection.

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs

La deuxime srie dexprimentations est destine valuer la biodistribution des globules fluorescents dans les organes en fonction de leur fonctionnalisation, 24 heures aprs administration des nano-mulsions.

VI.4.3.1. Protocole exprimental

Les mmes solutions de nanoparticules fonctionnalises sont injectes (1 semaine aprs la premire exprience) sept souris Swiss Nude femelles porteuses de tumeurs Ts/Apc, raison de trois souris pour les nanoparticules cRGD et deux souris pour les globules OH et cRAD. Le protocole est identique celui dcrit prcdemment (VI.4.2.1), except que les souris sont cette fois-ci images uniquement 24 heures aprs linjection des nano-mulsions, et que les animaux sont ensuite sacrifis et dissqus afin dobserver la fluorescence mise par les diffrents organes.

VI.4.3.2. Rsultats

Lanalyse des rapports tumeur sur peau (Figure VI14) ne met plus en vidence de diffrence entre les nanoparticules fonctionnalises et non fonctionnalises par les peptides. De plus, les rapports obtenus sont suprieurs ceux observs lors de la premire exprience (environ 2,5 contre 2,1). On peut galement noter que lintensit de fluorescence de la peau chez les souris ayant reu les nano-mulsions non fonctionnalises est similaire celle des deux autres types de particules et correspond aux valeurs obtenues pour les globules fonctionnaliss par les cyclopeptides dans la premire exprience (Figure VI13).

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo
Tumeur 14 000 Peau Rapport Tumeur / Peau 5

12 000 4 Rapport Tumeur / Peau 10 000 RLU / pixel / 20 ms 3

8 000

6 000

2,6

2,4

2,6

4 000

2 000

Nano-mulsion cRAD Nano-mulsion cRGD Nano-mulsion OH

Figure VI14 : Intensits de fluorescence des tumeurs et de la peau (corriges de la fluorescence du noir) mesures 24 heures aprs injection des nano-mulsions fonctionnalises. La barre verte reprsente le rapport tumeur sur peau calcul partir des intensits sus-mentionnes.

Enfin, lanalyse de la fluorescence mise par les organes montre une biodistribution proche de celle observe dans le cas des souris saines, lexception bien entendu de la tumeur (Figure VI15 et Figure VI16).

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs


Nano-mulsion cRAD 20000 18000 16000 14000 RLU / pixel / 20ms 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 Poumon Foie Rate Estomac Intestin Rein Vessie Tumeur Nano-mulsion cRGD Nano-mulsion OH Tmoin

Figure VI15 : Intensits de fluorescence mises par diffrents organes en fonction de la fonctionnalisation des nanoparticules, 24 h aprs l'injection dans la queue de lanimal de 200L de nanomulsion fluorescente contenant 10 nmol de fluorophores. Le tmoin est une souris non injecte et correspond lauto-fluorescence des organes.
Nano-mulsion cRAD 30000 Nano-mulsion cRGD Nano-mulsion OH Tmoin

25000

RLU / pixel / 20ms

20000

15000

10000

5000

0 Coeur cerveau muscle graisse pancras peau surrnale utrus ovaire

Figure VI16 : Intensits de fluorescence mises par diffrents organes en fonction de la fonctionnalisation des nanoparticules, 24 h aprs l'injection dans la queue de lanimal de 200L de nanomulsion fluorescente contenant 10 nmol de fluorophores. Le tmoin est une souris non injecte et correspond lauto-fluorescence des organes.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

VI.4.3.3. Discussion

Le calcul du rapport tumeur sur peau indique une diffrence de comportement entre les deux exprimentations. En effet, bien que lon nobserve toujours pas de signal spcifique dans le cas des nano-mulsions cRGD, le rapport tumeur sur peau et les intensits de fluorescence de la peau et de la tumeur sont dans la seconde serie dexpriences similaires pour toutes les particules, y compris celles qui sont fonctionnalises OH. Il semble ainsi que le vieillissement de quelques jours des nano-mulsions fonctionnalises OH ait modifi leurs proprits, notamment en ce qui concerne leur accumulation par la peau, ce qui nest observ que dans le cas de cette fonctionnalisation. Aucune volution significative nest en effet observe au niveau de lintensit de fluorescence de la peau pour les nano-mulsions cRAD et cRGD entre les deux expriences. Pour expliquer cette diffrence de biodistribution des nanoparticules OH une semaine dintervalle, on peut mettre lhypothse dun changement des proprits de surface des globules. En effet, il est envisageable que certains groupements malimides des surfactants de fonctionnalisation naient pas t neutraliss au cours de ltape de greffage. Les conditions de neutralisation par le -mercapto-thanol ne sont peut-tre pas suffisantes dans le cas des particules OH. Les groupements malimides shydrolysent alors lentement en milieu aqueux, ce qui entrane une modification de la surface des nanoparticules OH et peut donc expliquer le changement de biodistribution observ. Dautre part, la faible augmentation du rapport tumeur sur peau par rapport lexprience prcdente est engendre par une accumulation lgrement plus prononce dans les tumeurs. Enfin, lanalyse des organes aprs sacrifice et dissection des souris montre que la prsence de tumeurs ninflue pas sur la biodistribution globale des nanoparticules. On retrouve effectivement des niveaux daccumulation par organe similaires ceux dcrits dans le Chapitre V. Ainsi la fonctionnalisation des nanoparticules fluorescentes ne modifie pas non plus leur distribution dans lorganisme. En ce qui concerne le signal mis par les tumeurs, il est suprieur celui du foie, comparable celui des glandes surrnales mais reste infrieur celui des ovaires.

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs

VI.4.4. Conclusions
Les deux expriences montrent quil existe un important phnomne daccumulation au sein des tumeurs Ts/Apc. Cependant, laccumulation est identique quelle que soit la fonctionnalisation ; il sagit donc uniquement dun phnomne passif li leffet EPR. Il est en effet difficile de visualiser la composante lie au ciblage actif dans laccumulation au niveau des tumeurs pour les souris ayant reu les doses de nano-mulsions cRGD. Labsence daccumulation prfrentielle des particules couples au cRGD peut tre explique par la faible densit de ligands exposs en surface par la formulation 0,5 % m/m en surfactant fonctionnalisable, qui est de 0,011 ligands par nm2 soit moins dun peptide tous les 80 nm2 (Tableau VI3). Le fait quil y ait plus de signal mis par la tumeur que le foie par exemple est un bon rsultat qui nest pas reflt par le calcul du rapport tumeur sur peau. En effet, laccumulation dans la peau pnalise fortement les valeurs obtenues. Ainsi, si on compare les intensits de fluorescence mises par la tumeur et par les muscles aprs dissection des animaux, on obtient des rapports tumeur sur muscle denviron 15 soit jusqu' plus de six fois suprieurs aux rapports tumeur sur peau. Quoi quil en soit, la furtivit des nano-mulsions fonctionnalises est suffisante pour viter laction du systme rticuloendothlial, et ainsi permettre une importante accumulation passive dans les tumeurs en traversant les fenestrations de la paroi des vaisseaux sanguins les irrigant.

VI.5. Modle de cellules tumorales HEK 3


Lexprience qui va suivre consiste injecter des nano-mulsions fonctionnalises des animaux porteurs de tumeurs HEK 3, afin dvaluer limpact du greffage sur laccumulation au sein des tumeurs dont les cellules surexpriment les intgrines V3.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

VI.5.1. Protocole exprimental


Cette exprience est mene sur neuf souris Swiss Nude femelles de 6 semaines (Janvier, France) porteuses de tumeurs HEK 3. Les nano-mulsions sont injectes par voie intraveineuse dans la queue raison de 200 L de solution par souris et de trois souris par type de fonctionnalisation. Les solutions injectes sont cette fois issues de la formulation 2,5% m/m en surfactant fonctionnalisable prcdemment dcrite (VI.2.3.2.1). La quantit administre lors de chaque injection correspond ainsi 10 nmol de fluorophores DiD et environ 100 nmol de ligands (contre 20 pour les solutions bases sur la formulation 0,5% m/m). Toutes les injections et acquisitions d'images sont ralises alors que les souris sont maintenues sous anesthsie gnrale par voie gazeuse (isoflurane). Les animaux anesthsis sont imags laide du dispositif dimagerie de fluorescence par rflectance prcdemment dcrit (voir Chapitres II et V). Les images sont enregistres 30 minutes, 1 heure, 3 heures, 7 heures, 24 heures, 48 heures, 120 heures, et 144 heures aprs les injections de nano-mulsions fluorescentes fonctionnalises.

VI.5.2. Rsultats
Les clichs de fluorescence enregistrs 24 heures aprs injection des nano-mulsions montrent une intensit de fluorescence suprieure au niveau de la zone tumorale par rapport aux zones annexes (Figure VI17).

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs

Figure VI17 : Images de fluorescence de souris porteuses de tumeurs HEK 3 sous-cutanes (20 millions de cellules implantes environ 6 semaines avant linjection des nano-mulsions), 24 h aprs injection de 200 L de nano-mulsions fonctionnalises (50 M en fluorophores). La localisation des tumeurs est dlimite par les lignes noires pointilles.

Lanalyse de lensemble des clichs permet de tracer lvolution du rapport tumeur sur peau en fonction du temps pour les trois types de nanoparticules injectes (Figure VI18) selon la formule dtaille prcdemment (VI.4.2.2). Le dtail de lintensit de fluorescence des tumeurs et de la peau ainsi que le rapport tumeur sur peau obtenus 24 heures aprs injection sont prsents Figure VI19.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo
Nano-mulsion cRAD 1,60 1,50 1,40 1,30 1,20 1,10 1,00 0,90 0,80 0 20 40 60 80 heures 100 120 140 160 Nano-mulsion cRGD Nano-mulsion OH

Rapport Tumeur/Peau

Figure VI18 : Evolution du rapport tumeur sur peau en fonction de la fonctionnalisation.

Tumeur 50 000 45 000 40 000 35 000 RLU / pixel / 200 ms 30 000 25 000 20 000 15 000 10 000 1,37 5 000 Nano-mulsion cRAD

Peau

Rapport Tumeur / Peau 5

4 Rapport Tumeur / Peau

1,53

1 1,18

0 Nano-mulsion cRGD Nano-mulsion OH

Figure VI19 : Intensits de fluorescence des tumeurs et de la peau (corriges de la fluorescence du noir), mesures 24 heures aprs injection des nano-mulsions fonctionnalises. La barre verte reprsente le rapport tumeur sur peau calcul partir des intensits sus-mentionnes.

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs

VI.5.3. Discussion
Les rsultats obtenus lors de cette exprience confirment laccumulation passive des nano-mulsions dans les tumeurs puisque que le rapport tumeur sur peau est suprieur 1 pour toutes les fonctionnalisations. Cependant, contrairement aux rsultats obtenus avec les souris porteuses de tumeurs Ts/Apc (VI.3), on observe cette fois-ci des diffrences de comportement notables entre les trois fonctionnalisations. En effet, laccumulation est nettement plus importante dans la tumeur que dans la peau dans le cas des nano-mulsions cRGD, les deux tmoins ngatifs (nanoparticules cRAD et OH) ayant un rapport tumeur sur peau toujours infrieur celui des globules portant le ligand reconnu par les intgrines. Cependant, les valeurs obtenues pour ces deux fonctionnalisations (cRAD et OH) ne sont pas identiques : les particules cRAD sont accumules prfrentiellement par rapport aux particules OH. La prsence dun ligand peptidique la surface semble donc modifier laccumulation dans la zone tumorale. Lobservation des donnes obtenues 24 heures aprs injection des agents de contraste permet daffirmer que la fonctionnalisation des nanoparticules a bien un effet sur laccumulation au niveau des tumeurs, et que les variations du rapport tumeur sur peau ne sont pas uniquement dues une fluctuation du signal mis par la peau. Le ciblage actif permet ainsi une amlioration du rapport tumeur sur peau de 30 % entre les nano-mulsions cRGD et celles qui ne sont pas fonctionnalises par un peptide. Cette faible augmentation de laccumulation lie la reconnaissance des cRGD par les intgrines V3 peut sexpliquer par deux phnomnes : - La densit de ligands la surface des globules est faible. Or, le fait quils soient supports par une nanoparticule diminue encore la probabilit de leur complexation avec les rcepteurs. - Les cellules HEK 3 surexpriment bien les intgrines V3 mais elles ne sont pas directement accessibles aux nanoparticules qui doivent auparavant schapper de la circulation sanguine, notamment par les fenestrations formes dans la paroi des capillaires irriguant la tumeur. Or, il semble que la vascularisation des tumeurs HEK 3 est moindre par rapport celle des tumeurs Ts/Apc, et leur croissance tumorale tant plus lente, les vaisseaux sanguins sont mieux structurs et donc moins fenestrs. Le passage des nanoparticules des capillaires vers les cellules tumorales est ainsi moins favoris, ce qui diminue les chances de complexation.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Malgr la prsence dun ciblage actif, laccumulation globale des nanoparticules reste moindre dans les tumeurs issues des cellules HEK 3 que dans le cas des tumeurs Ts/Apc. En effet, le rapport tumeur sur peau est denviron 1,5 24 heures pour les nano-mulsions cRGD avec les tumeurs HEK 3 alors quil est de 2,6 avec les tumeurs Ts/Apc. Ceci est probablement d un effet EPR moins prononc au sein des tumeurs HEK 3 car celles-ci sont certainement moins bien vascularises. On observe galement une diminution du rapport tumeur sur peau aprs 24 heures alors quil tait considr comme stable avec le premier modle de tumeur. Cette diminution de la fluorescence mise par les tumeurs pourrait sexpliquer par un drainage lymphatique plus efficace : les tumeurs HEK 3 se dveloppant plus lentement, les rseaux lymphatiques ont plus de chance de se dvelopper.

Cette exprience ralise avec des souris porteuses de tumeurs HEK 3 a donc permis de mettre en avant lexistence dun ciblage spcifique in vivo. Il est cependant ncessaire de raliser des tudes complmentaires afin de mieux comprendre la localisation des nanoparticules au sein mme du tissu tumoral.

VI.6. Conclusions
Les diverses expriences prsentes dans ce chapitre ont permis de montrer quil tait possible de fonctionnaliser la surface des nano-mulsions afin damliorer leur affinit pour des rcepteurs donns. En effet, le greffage de cRGD sur les nano-mulsions permet leur fixation spcifique sur les cellules HEK 3 exprimant le rcepteur de la squence peptidique, les intgrines V3. Cette reconnaissance nest pas perturbe in vitro par la prsence de protines dans le milieu dincubation. De plus, la fonctionnalisation des particules est durable car des analyses en cytomtrie en flux ralises sur des particules plus de six mois aprs leur prparation montre toujours un net marquage spcifique des cellules HEK 3 par les nanomulsions cRGD.

Linjection des nano-mulsions fluorescentes dans des animaux porteurs de tumeurs mis en vidence deux mcanismes daccumulation dans la zone tumorale : un mcanisme passif li leffet EPR, et un mcanisme actif li la reconnaissance spcifique de rcepteurs par des ligands.

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Chapitre VI : Nano-mulsions fonctionalises pour la dtction des tumeurs

Le phnomne passif sapparente celui dcrit pour les zones inflammatoires. Il est en effet li des dfauts de la paroi vasculaire qui favorisent lextravasion des particules hors de la circulation sanguine. Le faible drainage lymphatique au niveau des zones tumorales autorise alors une accumulation importante des nanoparticules. Ce phnomne est cependant fortement dpendant de la tumeur et en particulier de sa vascularisation. Le ciblage actif li la fixation spcifique de ligands (cRGD) sur des rcepteurs cellulaires (intgrine V3) permet une augmentation de laccumulation au sein des tissus cibls. Cependant ce phnomne est, comme on pouvait sy attendre, moins efficace in vivo que dans les conditions in vitro.

Les nano-mulsions fluorescentes constituent donc un agent de contraste capable de saccumuler passivement dans les tumeurs. La fonctionnalisation des particules rend en outre possible une amlioration de la slectivit, bien que le gain soit encore faible. Dimportantes possibilits doptimisation du ciblage actif peuvent cependant tre envisages. Il serait notamment intressant daugmenter la densit de ligands la surface des nanoparticules en vue daugmenter leurs chances de complexation avec les cellules cibles.

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Conclusion gnrale

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

La problmatique de ce travail tait de concevoir des nanoparticules organiques biocompatibles, furtives, et stables afin de vectoriser des agents thrapeutiques ou dimagerie. Nous avons, pour y rpondre, dvelopp des nano-mulsions de type huile dans eau de quelques dizaines de nanomtres de diamtre, dont la phase disperse est compose dun mlange dhuile de soja et de Suppocire NC, les globules tant stabiliss par lassociation de phospholipides et de surfactants pegyls. Tous ces constituants sont reconnus comme inoffensifs par la FDA et sont autoriss linjection chez lhomme.

La technique de fabrication, base sur lutilisation dultrasons, permet dobtenir facilement et rapidement des nano-mulsions avec une taille de globules contrle. Dautre part, la formulation est suffisamment souple pour permettre de modifier certains paramtres tels que la composition de la phase disperse, la nature du surfactant pegyl ou la taille des particules, sans altrer la stabilit des nano-mulsions. Les nano-mulsions dveloppes prsentent en effet une importante stabilit. Ainsi, pour la formulation de rfrence (globules de 35 nm de diamtre), aucune volution de la distribution en taille des nanoparticules ou du potentiel zta nest observe, mme aprs plus de dix-huit mois de conservation temprature ambiante. Cette importante stabilit serait due lutilisation de surfactants pegyls qui gnrent une barrire strique autour des globules, permettant ainsi de prvenir leur coalescence. Cependant, il est important de noter quen rgle gnrale, la principale cause de dstabilisation irrversible des nano-mulsions nest pas le phnomne de coalescence mais le mrissement dOstwald. Or, nous navons pas observ dvolution au cours du temps de la distribution en taille des nanoparticules dveloppes ; il est donc vraisemblable que lutilisation dune huile insoluble contribue stabiliser les globules vis--vis de ce second phnomne.

En outre, lencapsulation de fluorophores organiques lipophiles (DiD ou DiR) au sein des nanoparticules permet de leur confrer de trs bonnes proprits optiques telles quun rendement quantique et une dure de vie de fluorescence levs, sans modifier pour autant ni les proprits physiques ni la stabilit des nanoparticules. Ainsi, les nano-mulsions fluorescentes sont, dun point de vue optique, plus performantes que les fluorophores hydrophiles commerciaux actuels. Si lincorporation de fluorophores nous permet avant tout de suivre les nanoparticules aprs injection, ils peuvent galement tre considrs comme des modles de molcules lipophiles dintrt mdical permettant dvaluer les capacits dencapsulation des - 212 -

Conclusion gnrale

nanoparticules vis--vis de ce type de molcules. Les rsultats obtenus sont de ce point de vue intressants puisque les nano-mulsions fluorescentes sont stables dans le temps et quaucun relargage na t observ lors de leur stockage temprature ambiante pendant plus dun an.

Aprs avoir vrifi la compatibilit physique et biologique entre les nanoparticules et le sang, les nano-mulsions fluorescentes ont t administres des souris saines par injection en intraveineuse. Le suivi des particules par imagerie de fluorescence in vivo a permis de mettre en vidence la biodistribution homogne de ces traceurs, sans accumulation massive dans le foie, la rate ou les poumons. Ce rsultat signifie que la furtivit des nanoparticules est suffisante pour chapper en grande partie au systme immunitaire. Il semblerait galement quune des voies privilgies du mtabolisme des nanoparticules soit lie aux hpatocytes avec une excrtion par voie biliaire. Dautre part, les variations de la formulation nont pas mis en vidence de modification significative du comportement in vivo des nanoparticules fluorescentes, traduisant ainsi la grande robustesse de la biodistribution de ces traceurs.

Enfin, linjection des nano-mulsions des souris porteuses de tumeurs conduit leur accumulation au niveau de la zone tumorale. Ce phnomne est plus ou moins marqu en fonction de la vascularisation des tumeurs : il est en effet li dune part aux dfauts de la paroi vasculaire qui favorisent lextravasion des particules hors de la circulation sanguine, et au faible drainage lymphatique qui limite dautre part leur limination hors de la zone tumorale (effet EPR). De plus, la fonctionnalisation de la surface des nanoparticules par des ligands biologiques tels que les cRGD permet, in vitro, leur fixation et leur internalisation par des cellules exprimant le rcepteur associ ces ligands : lintgrine V3. Linjection de ces particules fonctionnalises des animaux porteurs de tumeurs met ainsi en vidence, en complment du mcanisme daccumulation passif prcdemment dcrit, un mcanisme actif daccumulation li la reconnaissance spcifique des rcepteurs par les ligands. Le gain apport par la fonctionnalisation des nanoparticules est lheure actuelle denviron 30 % pour le rapport tumeur sur peau. Ces rsultats pourraient tre encore amliors mais ils apportent dj une preuve de concept sur la capacit des nano-mulsions fonctionnalises cibler in vivo un type cellulaire donn.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Les tudes ralises au cours de ces travaux ont pu mettre en vidence les avantages lis lutilisation des nano-mulsions dveloppes. Les rsultats de ltude de biodistribution ralise peuvent nanmoins tre nuancs. En effet, limagerie de fluorescence in vivo permet uniquement de suivre le fluorophore encapsul et non les nanoparticules elles-mmes. Il est effectivement impossible de dterminer, avec ce type de nano-mulsions fluorescentes, si le fluorophore est toujours contenu dans le cur de la particule ou sil en a t dissoci. Cest pourquoi il est important de dvelopper une nouvelle gnration de nano-mulsions fluorescentes qui permettrait de savoir si la particule est intacte ou non. Lutilisation de couples de fluorophores compatibles avec le transfert dnergie par rsonance Frster, ou lutilisation dinhibiteurs de fluorescence sont des solutions envisageables pour atteindre cet objectif.

Le transfert dnergie par rsonance Frster (plus connu sous lacronyme anglais FRET pour Frster resonance energy transfer ) est dfini comme un transfert dnergie non radiatif entre deux molcules (donneur et accepteur dnergie). Ce phnomne physique ncessite une compatibilit nergtique entre ces molcules. Cela signifie que le spectre dmission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre dabsorption de laccepteur. Si un donneur et un accepteur dnergie sont suffisamment proches dans lespace (quelques nanomtres), il peut alors se produire un transfert dnergie par rsonance entre la molcule donneuse dans son tat excit et la molcule acceptrice dans son tat fondamental, conduisant lexcitation de cette dernire et au retour ltat fondamental de la premire. Dans les conditions adquates, il est ainsi possible dobserver la fluorescence de la molcule acceptrice quand on excite le fluorophore donneur. Comme ce phnomne dcrot rapidement avec la distance sparant les deux molcules, il a souvent t mis profit pour tudier des coupures enzymatiques ou des changements de conformation de protines. Dans notre cas, lencapsulation dun couple de fluorophores adquats au sein des nanoparticules nous permettrait dobtenir des informations sur lintgrit de ces dernires. En effet, la destruction et/ou la mtabolisation des nanoparticules conduiraient invitablement lloignement des deux types de fluorophores, ce qui impliquerait la disparition du phnomne de FRET. Il serait alors possible, laide dun dispositif dimagerie adapt, de visualiser les particules intactes (excitation lumineuse du fluorophore donneur et mission de fluorescence de la molcule acceptrice), puis dobserver les tissus dgradant les

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Conclusion gnrale

nanoparticules et enfin de suivre le devenir des fluorophores une fois librs (en utilisant des filtres dexcitation et dmission adapts chaque fluorophore). Parmi les couples de fluorophores commerciaux envisags, on peut citer le couple DiD / DiR et le couple DiR / ICG. Des tests dencapsulation et de mesure de lefficacit de FRET sont actuellement en cours au laboratoire.

Un phnomne similaire bas sur lencapsulation dinhibiteurs de fluorescence ( quencher en anglais) peut galement tre utilis pour visualiser la stabilit in vivo des nano-mulsions. Dans ce cas, des molcules ayant la proprit de dsactiver ltat excit des molcules fluorescentes sans mettre de fluorescence en retour sont encapsules avec les fluorophores. De manire similaire au FRET, il se produit un transfert dnergie par rsonance entre le fluorophore dans son tat excit et linhibiteur de fluorescence uniquement si les deux molcules sont suffisamment proches dans lespace. Il serait ainsi possible, avec les dispositifs dimagerie actuels, de visualiser les organes ou les cellules responsables de la dgradation des nanoparticules : la fluorescence napparatrait en effet que si le fluorophore est suffisamment loign de linhibiteur de fluorescence.

En guise douverture, il est important de signaler que mme si nous nous sommes focaliss principalement sur le dveloppement de nano-mulsions encapsulant le DiD et le DiR, nous avons galement travaill sur dautres molcules dintrt. En effet, si ces fluorophores confrent aux nano-mulsions des performances optiques trs honorables, ils ne sont pas autoriss linjection humaine. Cest pourquoi nous avons paralllement tudi lencapsulation de lunique molcule ayant des proprits dabsorption et dmission des longueurs donde comprises entre 650 et 900 nm qui est autorise linjection chez lhomme : le vert dindocyanine (ICG). Cette molcule est une cyanine qui, contrairement au DiD et au DiR, nest pas lipophile mais amphiphile (Figure II-8). Cette proprit physico-chimique limite son taux dencapsulation au sein des nanoparticules mais nentrane pas de relargage du fluorophore au cours du temps. Dautre part, lencapsulation de lICG au sein des nanoparticules ne modifie pas les spectres dabsorption et dmission du fluorophore par rapport ceux mesurs en solvant organique (Figure C-1). Enfin, lencapsulation du fluorophore entrane laugmentation de sa dure de vie de fluorescence, de son rendement quantique (par rapport celui obtenu dans leau), et de sa stabilit en milieu aqueux.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo
1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 400 450 500 550 600 650 nm 700 750 800 850 900

ICG (nano-mulsion) Absorption Fluorescence

ICG (mthanol) Absorption Fluorescence

Figure C-1 : Comparaison des spectres d'absorption et d'mission de nano-mulsions dopes ICG avec ceux de l'ICG en solution dans le mthanol.

Il est donc envisageable dinjecter chez lhomme de telles nanoparticules fluorescentes, notamment dans le cadre de la dtection du ganglion sentinelle. Le ganglion sentinelle est le premier ganglion par lequel transite la lymphe issue du drainage lymphatique au sein dune tumeur. Or, certaines cellules cancreuses peuvent se dsolidariser de la tumeur et tre vacues par le systme lymphatique ; ces cellules vont se loger dans ce ganglion et risquent ainsi dinitier le dveloppement de mtastases. La dtection et lanalyse du ganglion sentinelle sont donc primordiales dun point de vue clinique, en particulier dans le cas du cancer du sein. En effet, si le ganglion sentinelle est sain, il nest alors pas ncessaire de retirer la quasi-totalit des ganglions de la rgion. Dans le cas contraire, la dtection de la chane ganglionnaire devient essentielle afin de rduire au maximum le risque de dveloppement mtastatique.

Des expriences ralises sur la souris ont mis en vidence lintrt des nanomulsions fluorescentes dans la dtection des ganglions sur souris saine et du ganglion sentinelle sur souris porteuse de tumeurs (Figure C-2).

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Conclusion gnrale

Figure C-2 : Observation du drainage lymphatique et dtection du ganglion sentinelle aprs injection pri-tumorale de nano-mulsion (20 L 50 M en fluorophore).

Dautre part, lencapsulation au sein des nanoparticules dagents thrapeutiques tels que des photosensibilisateurs et des principes actifs anticancreux (taxol) est galement en cours au sein du laboratoire.

En conclusion, ce travail de thse constitue une preuve de concept : les nanomulsions dveloppes ont la capacit de vhiculer in vivo des agents dintrt au sein de tumeurs, la fois par des mcanismes daccumulation passifs mais galement par ciblage actif via la reconnaissance slective de rcepteurs exprims la surface de certaines cellules. Pour complter les travaux raliss, des tudes complmentaires doivent tre menes afin de mieux comprendre leur biodistribution, damliorer la slectivit de ces nano-transporteurs, ou encore dtudier leur toxicit. Il est galement ncessaire dtudier lactivit dagents thrapeutiques dlivrs par ces nanoparticules afin de mieux valuer le potentiel prometteur de ces nano-vecteurs.

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Annexes

Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Annexe I : Matriels
La Suppocire NC a t gracieusement offerte par Gattefoss (France). Les surfactants pegyls Myrj 49, Myrj 53 et Myrj 59 sont un don de la socit Croda (France). Les fluorophores DiD et DiR ont t achets chez Invitrogen (France). Le MAL-PEG5000-SCM a t acquis chez Creative Biochem (USA). Les peptides cRGD et cRAD ont t fournis par la socit Asynth Service B.V. (Pays-Bas). Tous les autres produits chimiques ont t achets la socit Sigma-Aldrich (France), notamment lhuile de soja sous la rfrence 8001-22-7 et la lcithine de soja sous la dnomination L--Phosphatidylcholine BioChemika, from soybean, 30% as phosphatidylcholine avec la rfrence 61758.

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Annexes

Annexe II : Dispositifs de mesure

Spectres dabsorption
Les spectres dabsorption sont enregistrs sur un spectrophotomtre CARY 300 scan de Varian.

Spectres dmission
Les spectres de fluorescence sont enregistrs sur un spectrophotomtre LS50B de Perkin Elmer.

Diffusion quasi-lastique de la lumire


Les mesures de taille des nanoparticules par diffusion quasi-lastique de la lumire sont ralises sur un Nano ZS (Malvern, Royaume-Uni). Environ 1 L de nano-mulsion est dispers dans 999 L de solution de chlorure de sodium 154 mM ; 800 L de cette solution sont ensuite disposs dans une cuve usage unique PLASTIBRAND semi micro (PMMA). Les mesures sont ralises temprature ambiante.

Potentiel zta
Le potentiel zta des nanoparticules est enregistr laide dun Nano ZS (Malvern, Royaume-Uni). Environ 1 L de nano-mulsion est dispers dans 999 L de solution de PBS dilue dix fois ; cette solution est ensuite dispose dans une cuve jetable de mesure du potentiel zta (DTS1060C, Malvern, Royaume-Uni). Les mesures sont ralises temprature ambiante.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Dure de vie de fluorescence (Fluorophore : DiD)


Le dispositif se compose dune diode laser mettant 635 nm (50Mhz) (Becker&Hickel, Allemagne) place lentre dune fibre qui claire lchantillon. La lumire diffuse ou la fluorescence mise est collecte par une seconde fibre, dont la seconde extrmit est place devant un tube photomultiplicateur (Hamamatsu, Japon) coupl une carte de comptage de photon unique (TCSPC) (Becker&Hickel, Allemagne). Lors de la mesure de la fluorescence mise, un systme de filtrage est positionn entre la fibre optique et le photomultiplicateur afin dliminer le signal dexcitation. Un tel dispositif permet de mesurer l'intensit de la fluorescence et de tracer les courbes refltant le dclin de la fluorescence, c'est--dire lvolution de la fluorescence (exprime en units arbitraires) en fonction du temps (picosecondes). Les dures de vie de fluorescence sont ensuite obtenues en utilisant le logiciel SPCImage (Becker&Hickel, Allemagne) grce lajustement par un dclin mono-exponentiel (r2 = 1.0) des courbes de dclin de fluorescence dconvolues de la fonction de rponse instrumentale (IRF).

Dure de vie de fluorescence (Fluorophore : DiR)


Le systme utilis pour obtenir les dclins de fluorescence du DiR, en solution dans le mthanol ou encapsul dans les nanoparticules en suspension dans du PBS (10 mM, pH 7,3), est diffrent de celui dcrit plus haut car les spectres dabsorption et de fluorescence des deux fluorophores sont diffrents. Les mesure sont ralises avec un dispositif exprimental utilisant un laser saphirtitane (Tsunami, Spectra-Physics, USA) (80Mhz, 100 femtosecondes), pomp par un laser continu nodyme-vanadate (Millennia Pro, Spectra-Physics, USA)) (532 nm, 5W), et dont la longueur donde est accordable entre 700 nm et 1000 nm. Pour ces mesures, la longueur donde dexcitation est fixe 740 nm. Le reste du dispositif est identique celui utilis pour mesurer les dures de vie de fluorescence du DiD, except les filtres optiques qui sont bien sr adapts au spectre de fluorescence du DiR ainsi qu la longueur donde dexcitation applique. Le calcul des dures de vie de fluorescence seffectue de manire similaire celui dcrit plus haut.

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Annexes

Annexe III : Paramtres de sonication


Lappareil de sonication utilis pour obtenir les nano-mulsions est un sonificateur AV505

(Sonics, Newtown USA). Le Tableau A-1 regroupe le type de sonde et les

paramtres techniques de sonication en fonction de la taille du lot de nano-mulsion fabrique.

Volume du lot 2 mL 5 mL 100 mL

Sonde 3 mm 3 mm 13 mm

Puissance 25% 30% 65%

Temps de sonication 5 min 5 min 25 min

Pulse on 10 s 10 s 10 s off 30 s 30 s 30 s

Tableau A-1 : Paramtres de sonication en fonction de la taille du lot de nano-mulsion produire.

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Annexe IV : Prparation

dune

nano-mulsion

non dope issue de la formulation de rfrence


Un lot de 2 mL de nano-mulsion non dope issue de la formulation de rfrence (Tableau A-2) est prpar par dispersion dune phase huileuse dans une phase aqueuse par sonication. La phase huileuse est prpare par ajout dun mlange dhuile de soja (50 mg), de Suppocire NC (150 mg) et de lcithine (138 mg) dans 1 mL de dichloromthane. Le mlange est agit jusqu' complte dissolution, puis le solvant organique est vapor sous vide 45C. La phase aqueuse est prpare par ajout de Myrj 53 (228 mg) une solution aqueuse contenant 50 mg de glycrol et 1,384 mL de solution saline ([NaCl] = 154 mM). Le mlange est agit 50C jusqu' dissolution du surfactant pegyl. La phase aqueuse est ensuite ajoute la phase huileuse, le mlange est chauff 50C puis la solution est sonique directement jusqu' obtention dune nano-mulsion (voir Annexe III pour les paramtres de sonication).

Masse (mg) Phase disperse Phase continue Surfactants Huile de soja Suppocire NC Glycrol Solution saline Lcithine Myrj 53

% w/w 2,50 7,50 2,50 69,20 6,90 11,40

50 150 50 q.s.p 2000 138 228

Tableau A-2 : Composition de la formulation de rfrence pour un lot de 2 mL.

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Annexes

Annexe V : Prparation

dune

nano-mulsion

fluorescente issue de la formulation de rfrence


Un lot de 2 mL de nano-mulsion dope DiD 400 M issue de la formulation de rfrence est prpar par dispersion dune phase huileuse contenant les fluorophores dans une phase aqueuse par sonication. Le fluorophore DiD est dissous dans du dichloromthane afin dobtenir une solution 10 mM. La phase huileuse est prpare par ajout dhuile de soja (50 mg), de Suppocire NC (150 mg), de lcithine (138 mg), et de la solution de fluorophore (80 L ; 800 nmol) dans 1 mL de dichloromthane. Le mlange est agit jusqu' complte dissolution, puis le solvant organique est vapor sous vide 45C. La phase aqueuse est prpare par ajout de Myrj 53 (228 mg) une solution aqueuse contenant 50 mg de glycrol et 1,384 mL de solution saline ([NaCl] = 154 mM). Le mlange est agit 50C jusqu' dissolution du surfactant pegyl. La phase aqueuse est ensuite ajoute la phase huileuse, le mlange est chauff 50C puis la solution est sonique directement jusqu' obtention dune nano-mulsion (voir Annexe III pour les paramtres de sonication).

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

Annexe VI : Synthse du surfactant ractif : PEPEG-MAL


Le surfactant ractif est obtenu par couplage du MAL-PEG5000-SCM sur la phosphatidylthanolamine (Figure A-1). Le Tableau A-3 regoupe les informations sur les ractifs engags au cours de la raction.

Figure A-1 : Schma de synthse du PE-PEG5000-MAL.

Masse Molaire MAL-PEG5000-SCM Phosphatidylthanolamine Trithylamine 5284 715,99 101,19

q. 1 1,85 1,90

Densit / / 0,726

Nb mol 18,925 35,011 35,873

Masse (mg) 100 25,068 3,630

Volume (L) / / 5,000

Tableau A-3 : Informations sur les ractifs engags.

100 mg (0,019 mmol) de MAL-PEG5000-SCM et 5 L (3,630 mg ; 0,036 mmol ; 1,9 q.) de trithylamine sont ajouts une solution de phosphatidylthanolamine (25 mg ; 0,035 mmol de PE ; 1,85 q.) dans 1 mL de dichloromthane anhydre. Le mlange ractionnel est agit pendant 2h sous argon. Le contrle de lavancement de la raction seffectue par chromatographie sur couche mince avec un luant chloroforme-mthanol 95 : 5 (v/v). Le mlange ractionnel est ensuite vapor sous vide et redissous dans 2 mL de dichloromthane.

La masse molaire du PE-PEG5000-MAL est de 5885,99 g/mol. La solution finale a une concentration en PE-PEG5000-MAL de 9,463 mM ou 55,696 g/L. - 236 -

Annexes

Annexe VII : Prparation

dune nano-mulsion

fluorescente issue de la formulation 2,5 % m/m de surfactant fonctionnalisable


Le protocole de prparation des nano-mulsions fonctionnalises est proche de ceux dj dcrits (Annexes IV et V). La principale diffrence rside dans le remplacement (moles moles) dune partie du surfactant pegyl par le surfactant fonctionnalisable (Tableau A-4), ce surfactant fonctionnalisable tant par contre incorpor au sein de la phase huileuse.

Masse (mg) Phase disperse Phase continue Huile de soja Suppocire NC Glycrol Solution saline Lcithine Surfactants Myrj 53 PE-PEG-MAL 2 mL).

% m/m 2,5 7,5 2,5 65,3 6,9 10,4 2,5

mol / / / / 183,5 83,3 8,4

50 150 50 q.s.p 2000 138 207 49

Tableau A-4 : Composition de la formulation 2,5 % m/m de surfactant fonctionnalisable (lot de

La phase huileuse est prpare par mlange dans 0,5 mL de dichloromthane dhuile de soja (50 mg), de Suppocire NC (150 mg), de lcithine (138 mg), du fluorophore (800 nmol soit 80 L dune solution de DiD 10 mM dans le dichloromthane), et de PEPEG5000-MAL (49 mg ; 8,4 mol soit 880 L de la solution dcrite dans lannexe VI). Le mlange est agit jusqu' complte dissolution de tous les composants, puis le solvant organique est vapor sous vide 45C. La phase aqueuse est prpare par ajout de Myrj 53 (207 mg) une solution aqueuse contenant 50 mg de glycrol et 1,356 mL de solution tampon de greffage (Hepes 0,05M ; EDTA 0,01 M ; pH 7,4). Le mlange est agit 50C jusqu' dissolution du surfactant pegyl. La phase aqueuse est ensuite ajoute la phase huileuse, le mlange est chauff 50C puis la solution est sonique directement jusqu' obtention dune nano-mulsion (voir Annexe II pour les paramtres de sonication).

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Nano-mulsions pour la vectorisation dagents thrapeutiques ou diagnostiques ; tude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo

La solution de nanoparticules fonctionnalisables est ensuite divise en 3 fractions de 600 L chacune, auxquelles sont ajouts 400 L de solution tampon de greffage (Hepes 0,05M ; EDTA 0,01 M ; pH 7,4). Chacune de ces solutions de nanoparticules fonctionnalisables contient environ 2,5 mol de groupement malimide.

Le cRGD (2,697 mg ; 3,747 mol ; 1,5 q.) et le cRAD (2,751 mg ; 3,747 mol ; 1,5 q.) sont chacun dissous dans 200 L dune solution de TCEP (40 mM soit 8 mol pour 200 L) dans de leau dionise. Ces deux solutions, ainsi quune troisime compose uniquement de 200 L de solution de TCEP (40 mM) dans de leau dionise, sont agites pendant 30 minutes temprature ambiante et labri de la lumire. Ces trois solutions sont ensuite ajoutes aux 3 solutions de nanoparticules fonctionnalisables et les mlanges sont agits pendant 2 heures temprature ambiante et labri de la lumire. Le -mercapto-thanol (7,5 mol ; 3 q.) est ensuite ajout chacune des trois solutions, qui sont agites pendant 30 minutes supplmentaires temprature ambiante et labri de la lumire. Les nano-mulsions fonctionnalises sont ensuite dialyses sparment (seuil de coupure : 12-14000 Da) contre 600 mL dune solution de NaCl 154 mM, pendant 90 minutes en changeant le dialysat toutes les 30 minutes. Aprs purification, les solutions sont doses par spectromtrie de fluorescence et dilues avec une solution de NaCl 154 mM afin dajuster la concentration en fluorophores 50 M. Enfin les solutions sont strilises par filtration (0,22 m).

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Annexes

Annexe VIII : Protocoles cellulaires

Cultures cellulaires
Les cellules Ts/Apc sont cultives dans un milieu de culture RPMI 1640 (Gibco, France) supplment avec du glucose 4,5 g/l (Sigma-Aldrich), 10 % de srum de veau ftal (dcomplment pendant 30 minutes 56C), 1% de glutamine (Sigma-Aldrich), de la pnicilline (50 U.mL-1) (Sigma-Aldrich), de la streptomycine (50 g.mL-1) (Sigma-Aldrich) et du -mercapto-thanol (50 nM) (Sigma-Aldrich). Les cellules OVCAR sont cultives dans du milieu RMPI 1640 (Gibco), supplment avec 20 % de srum de veau ftal (dcomplment pendant 30 minutes 56C), 1% de glutamine, de la pnicilline (50 U.mL-1) et de la streptomycine (50 g.mL-1). Les cellules HEK 3 sont cultives dans du milieu DMEM (Gibco), supplment avec du glucose 4,5 g/L, 10 % de srum de veau ftal (dcomplment pendant 30 minutes 56C), 1% de glutamine (Sigma-Aldrich), de la pnicilline (50 U/mL) (Sigma-Aldrich), de la streptomycine (50 g/mL) (Sigma-Aldrich) et de la G418 (700 g/mLl)(Gibco).

Les cellules sont maintenues 37C sous atmosphre humide enrichie 5% de CO2. Elles sont repiques deux fois par semaine, aprs dissociation du tapis cellulaire avec un mlange trypsine/EDTA (Gibco).

Les cellules tumorales (10 millions de cellules pour les Ts/Apc ou OVCAR et 20 millions pour les HEK 3) sont implantes en sous-cutan au niveau du haut de la patte des souris Swiss Nude NMRI femelles (Janvier, France), ges de 6 8 semaines. Linjection du traceur est ralis entre 2 et 6 semaines apres limplatation des cellules en fonction de la ligne tumorales (les tumeurs ont alors un diamtre compris entre 6 et 8 mm).

Analyse par cytomtrie en flux


Les cellules adhrentes HEK 3 sont mises en suspension avec de la trypsine, puis elles sont rinces une fois avec du PBS 1X temprature ambiante et une fois avec du PBS - 239 -

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froid (4C) contenant 1 mM de MgCl2 et 1 mM de CaCl2. Pour chaque condition exprimentale, un million de cellules est resuspendu dans 200 L de PBS 1X Mg2+/Ca2+ou de DMEM 10% de srum de veau ftal, contenant les nanoparticules une concentration finale de 0,2 M en DiD. Lincubation est ralise 4C pendant 15 minutes. Les cellules sont ensuite rinces deux fois avec du PBS 1X Mg2+/Ca2+, puis resuspendues dans 500 L de PBS 1X Mg2+/Ca2+ avant dtre analyses par un cytomtre en flux (FacsAria, Becton Dickinson, France). Les cellules sont ensuite incubes avec les nanoparticules (OH cRGD - cRAD) pendant une heure 37C et analyses par cytomtrie en flux toutes les quinze minutes.

Analyse par microscopie de fluorescence


Les cellules adhrentes HEK 3 sont cultives sur des lamelles, en plaque de 24 puits, pendant 24h. Les cellules sont rinces une premire fois avec du PBS 1X temprature ambiante, puis par du PBS 1X froid (4C) contenant 1 mM de MgCl2 et 1 mM de CaCl2. Les cellules sont ensuite incubes 15 minutes 4C dans 200 L de PBS 1X Mg2+/Ca2+, contenant les nanoparticules une concentration finale de 0,2 M en DiD. Aprs deux rinages avec du PBS 1X Mg2+/Ca2+ 4C, les cellules sont fixes pendant 10 minutes avec du PFA 0,5 % et les noyaux des cellules sont colors avec une solution de Hoechst 5 M pendant 10 minutes. Les lames sont montes avec du Mowiol et observes avec un microscope optique fluorescence (Axiophot quip dune camra CCD).

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Annexes

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