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INTRODUCTION L'ENZYMOLOGIE

Les enzymes sont des macromolcules spcialises qui - catalysent les ractions biologiques - transforment diffrentes formes d'nergie. Les enzymes diffrent des catalyseurs chimiques par leurs proprits: 1 - Leur taux de raction est plus lev. Les enzymes ont un pouvoir catalytique de 106 1012 fois suprieur aux ractions non catalyses, et de plusieurs ordres de grandeur suprieur aux ractions catalyses par des ractifs chimiques. 2 - Les ractions enzymatiques se font dans des conditions relativement douces (pH neutre, basse temprature etc). 3 - Les ractions enzymatiques sont trs spcifiques, la fois pour le substrat et pour le type de raction. La raction est efficace 100% et ne gnre normalement pas de produits secondaires. 4 - Les ractions enzymatiques peuvent tre modules. La rgulation de l'activit enzymatique peut s'effectuer de faon allostrique, par des protines rgulatrices, par une modification covalente de l'enzyme, par une activation protolytique, par la quantit d'enzyme produite, etc. Nomenclature: Les enzymes sont classifis selon la raction qu'ils catalysent. Ils sont dsigns par un nom commun (carboxypeptidase A), un nom systmatique (peptidyl-L-amino acide hydrolase) et un numro de classification (EC Enzyme Commission 3.4.17.1). Ce numro, qui est spcifique pour chaque enzyme, est tir d'un tableau qui donne les 6 principales classes de raction que les enzymes peuvent effectuer, puis les sous-classes et les sous-sous-classes. Raction oxydation - rduction Transfre des groupements fonctionnels Ractions hydrolytiques Raction dlimination pour former des liaisons doubles 5 = isomrase Isomrisation 6 = ligase Formation des liaisons avec hydrolyse ATP donc, la carboxypeptidase porte le numro de classe 3 (hydrolase), la sous-classe 4 (lien peptidique), la sous-sous-classe 17 (mtallo-carboxypeptidase) et 1 (numro de l'enzyme dans cette srie).
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1 = oxydorductase 2 = transfrase 3 = hydrolase 4 = lyase

Spcificit pour le substrat. Les interactions par lesquelles les substrats et autres molcules se lient l'enzyme sont les mmes interactions qui dictent la conformation de la protine elle-mme. Tous les deux cas impliqueront des interactions van der Waal, lectrostatiques, ponts hydrognes, et hydrophobiques. Le substrat se fixe au site actif de l'enzyme. Le site actif est dfini la fois comme le site de fixation du substrat et le site catalytique. C'est donc un endroit asymtrique, la surface de la molcule, qui fixe le substrat et qui contient les acides amins ncessaires (ou groupes catalytiques) pour faire ou couper un lien. La conformation et la composition chimique du site actif dterminent alors la spcificit de l'enzyme voir figure dun complexe enzyme-substrat montrant la fois les complmentarits gomtrique et physique entre enzyme et substrat. Les groupes hydrophobiques sont symboliss par un h dans un cercle brun et les lignes en pointills figurent les liaisons hydrognes. On peut dterminer 5 caractristiques du site actif: 1 - Le site actif est une rgion restreinte par rapport la protine totale 2 - Le site actif est une rgion tridimensionnelle bti partir d'acides amins qui proviennent de diffrentes rgions de la chane polypeptidique. 3 - Le substrat se fixe au site actif par des interactions faibles 4 - Les tudes cristallographiques des enzymes indiquent que le site actif est prform, c'est--dire qu'il existe la surface des enzymes (hypothse cl serrure), mme en absence du substrat. Cependant il est quelque peu flexible et s'ajuste aprs fixation du substrat, selon l'hypothse de l'induction de complmentarit ("induced fit"). 5 - La spcificit de l'association enzyme-substrat dpend de l'arrangement prcis des atomes au site actif.

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Co-facteur. Plusieurs enzymes ont besoin de co-facteurs pour agir. Ces co-facteurs peuvent tre des ions (Fe2+, Mg2+, Zn2+, etc), des co-enzymes ou encore les deux la fois. Les co-enzymes sont des molcules organiques, souvent des vitamines, qui servent de transporteurs de groupes fonctionnels ou d'lectrons voir structure de NAD(P)+. Les ions, par contre, peuvent agir au site catalytique, servir de site de liaison au substrat ou encore d'agents qui stabilisent la forme active de l'enzyme. La terme l'holoenzyme dcrit le complexe actif d'enzyme - co-facteur et l'apoenzyme correspond l'enzyme sans co-facteur et qui souvent ne possde pas d'activit. TAUX DE CATALYSE DES RACTIONS ENZYMATIQUES Les enzymes sont des catalyseurs qui sont soumis aux lois de la thermodynamique. Les lois de la thermodynamique nous permettent de dterminer si une raction peut se faire spontanment ou non. La cintique enzymatique nous permet de calculer le taux de catalyse, et comment ce taux peut tre chang en rponse diffrentes conditions physiologiques et/ou pathologiques. La cintique enzymatique permet de dcouvrir - l'affinit d'un substrat ou d'un inhibiteur pour un enzyme - le taux de catalyse maximale - l'efficacit enzymatique - le mcanisme d'action des enzymes - les variations de l'efficacit de l'enzyme dans diffrentes maladies - la rgulation des voies mtaboliques - le quantit d'enzyme prsent dans un tissu Cintique chimique La cintique enzymatique est une sous discipline de la cintique chimique et par consquence possde et utilise le mme formalisme. Ce formalisme dpend des notions suivantes: 4 Ractions lmentaires

Une raction de stoechiomtrie A P peut passer travers une squence de I2 P. La caractrisation des ractions ractions lmentaires de type A I1 lmentaires dcrivant la raction totale constitue la description mcanistique.

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temprature constante, les vitesses des ractions lmentaires varient avec la concentration de faon simple. Mettons aA + bB + . . . . . + zZ P

La vitesse de ce processus est proportionnelle la frquence laquelle les molcules ractives entrent en collision et qui est reprsente par les produits des concentrations des ractifs; donc vitesse = k[A]a[B]b . . . . [Z]z o k est une constante de proportionnalit et est identifie comme constante de vitesse. L'ordre de la raction est dfini par (a + b + . . . . + z), la somme des exposants. La raction de type A P reprsente une raction de premier ordre ou unimolculaire, 2A P ou A + B P reprsentent des ractions de deuxime ordre ou bimolculaire. Les ractions termolculaire sont plutt rares et de plus haute ordre inconnue en biochimie. Exprimentalement en mesurant [A] ou [P] en fonction de temps (vitesse v), il est possible de dterminer l'ordre de la raction; par ex. pour une raction de premier ordre, on a la vitesse exprimentale = - [A]/t = [P]/t. Pour une raction de premier ordre v = - d[A]/dt = k1[A]; si la raction est bimolculaire de type A + B P on obtient v = - d[A]/dt = - d[B]/dt = k2[A][B] noter que les constantes de vitesse possdent des units diffrentes selon l'ordre de la raction. Puisque la vitesse s'exprime en M.s-1, les units de k1 sont s-1 tandis que celle de k2 devient M-1s-1. L'ordre de la raction peut tre ensuite dtermine en comparant l'volution des [ ] en fonction du temps et leur comparaison avec ln [A ] les quations dcrivant les ractions de chaque ordre.
0

Intgration de l'quation de 1er ordre, on obtient


ln [A]

pente = -k1

ln [A] = ln [A]0 - k1t o [A]0 reprsente [A] temps t = 0 donc [ A] = [ A0 ] e


k1t

- courbe demi-log

Temps Quand [A] = [A]0 /2, ln {([A]0 /2) / [A]0 } = - k1t1/2 donc t1/2 = ln 2 /k1 = 0.693/k1 montrant que la demi-vie, t1/2, d'une raction unimolculaire est indpendant de la concentration initiale.

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Intgration de l'quation de deuxime ordre de type 2A 1 / [A] = 1 / [A]0 + k2t.

P, on obtient la relation

Quand [A] = [A]0 /2, pour une raction deuxime ordre, la demi-vie t1/2 = 1 / k2[A]0 dpend de la concentration initiale. Ceci est caractristique de n'importe quel raction bimolculaire. Figure rcapitulant la notion de la vitesse et de lordre de la raction.

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L'tat de transition.

Les lois de la thermodynamique expliquent qu'une raction puisse se faire spontanment. Nous pouvons nous demander maintenant pourquoi une raction possible peut prendre beaucoup de temps se faire et comment les enzymes acclrent le taux de raction. Les ractions enzymatiques obissent aux mmes lois chimiques que les ractions correspondantes sans enzyme. Pour faire un lien chimique entre deux molcules, celles-ci doivent d'abord se rencontrer et se cogner entre elles. Ces collisions doivent de plus se faire dans la bonne orientation, de faon aligner les groupes ractifs. Comme elles se rapprochent, les molcules ont tendance se repousser et s'loigner. Cependant, si les molcules acquirent suffisamment d'nergie, elles peuvent se rapprocher suffisamment et atteindre un point (l'tat de transition) o la probabilit de se sparer ou de former un nouveau lien est gale. L'nergie ncessaire pour amener une molcule l'tat de transition est l'nergie d'activation. L'tat de transition est l'endroit o l'nergie de la molcule est la plus leve. Voir diagramme de ltat de transition de la conversion de chloromthane en mthanol. Plus l'nergie d'activation est leve, plus la probabilit qu'une molcule atteigne l'tat de transition est faible. Lnergie thermique ambiante est la source de lnergie dactivation. La figure montre la relation entre les nombres de molcules avec lnergie, E, et la temprature o T3 > T2 > T1 (la rgion dessous chaque courbe reprsente le nombre total de molcules). Au fur et mesure que T augmente, plus de molcules auront atteint lnergie ncessaire, G, afin de surmonter le barrire dactivation.
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Thermodynamique de l'tat transitionnel

Considrons le schma ractionnel pour une raction bimolculaire qui passe par l'tat transitionnel

K A+B X o X reprsente le complexe activ.

k' P+Q

La vitesse de cette raction est v = d[P]/dt = k2 [A][B] = k' [X] et les constantes tant dfini comme ci haut. L'approximation cl de la thorie de l'tat transitionnel est que le complexe activ est en quilibre rapide avec le ractif, par consquence, il est possible dcrire K = [X] / [A][B] o K est une constante d'quilibre. Par le formalisme thermodynamique, K sexprime en fonction l'nergie libre du complexe activ : soit G = - RT ln K. Donc la vitesse devient d[P]/dt = k' e-G / RT [A][B]. L'importance de cette relation est que la vitesse de la raction dpend : 1) de la concentration de A et B et 2) varie de faon exponentielle avec G. Plus grande la diffrence en nergie libre entre l'tat de transition et les ractifs, moins stable l'tat de transition et plus lente la raction. 4 valuation de k' (Dveloppement peu rigoureux) Mettons k' = kv o v reprsente la frquence vibrationnelle d'une liaison dans le complexe activ qui dcompose en produits et k est dfini comme coefficient de transmission qui reprsente la probabilit que le complexe activ dcompose en produits. Pour la plupart des ractions k varie entre 0.5 et 1. Selon la loi de Planck, la frquence vibrationnelle d'un oscillateur qui possde nergie, , est dfinie par = hv o h est la constante de Planck. L'nergie de cet oscillateur est = kBT o kB - constante de Boltzmann et kBT - l'nergie thermique ambiante. Donc
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k' = kkBT / h et si on assume k = 1 on obtient

k B T G e RT . k2 = h
Cette quation dmontre que la vitesse dune raction dcrot au fur et mesure que l'nergie libre d'activation, G, augmente. 4

Ractions multi tapes

Pour une raction de type A I P o I est un intermdiaire de la raction, il y a un complexe actif par tape lmentaire ractionnelle. Si une des tapes est trs lente, cette tape agit comme embouteillage au point de vue de la raction globale et la vitesse de cette raction lmentaire dtermine la vitesse globale.

Diagramme montrant le trajet ractionnel pour une raction deux tapes.

Catalyse dcrot G

Si un catalyseur rduit le barrire d'activation par 5.71 kJ.mol-1, la vitesse de la raction augmente par un facteur 10. Ceci reprsente en nergie moins que la moiti d'nergie libre d'un pont hydrogne. Une acclration de vitesse par un facteur 106 correspond une rduction par 34.25 kJ.mol-1 - moins que l'nergie contenue dans un lien chimique. Il faut noter que la barrire cintique est rduite de la mme valeur dans les deux directions. Par consquence un catalyseur ne change pas l'quilibre de la raction.

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Voir exemple rcapitulatif : lhydrolyse dun ester par limidazole


Dans le cas des enzymes, ils acclrent les ractions chimiques parce qu'ils abaissent l'nergie d'activation ncessaire pour amener une molcule l'tat de transition. Ceci se produit parce que le complexe enzyme-substrat est plus stable et permet de placer le substrat dans la bonne orientation et sous une forme "distordue" qui correspond l'tat de transition. L'enzyme contribue donc stabiliser l'tat de transition et du mme coup abaisser l'nergie de transition.

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