NUCLEO, CROMATINA y CROMOSOMAS

Ncleo Interfsico
Primer reporte
Antonie van Leeuwenhoek (16321723).
Opera Omnia, seu Arcana Naturae ope exactissimorum Microscopiorum detecta, experimentis variis comprobata, Epistolis ad varios illustres viros.

Descrito por primera vez:

Franz Bauer, 1804

Descrito con detalle por el botnico escocs Robert Brown en una charla dictada ante la Sociedad linneana de Londres en 1831. Brown

FISH

Ncleo
El ncleo es la estructura ms destacada de la clula eucarionte, tanto por su morfologa como por sus funciones:
1. Almacenar la informacin gentica en el ADN.

2. Recuperar la informacin almacenada en el ADN en la forma de ARN.

3. Ejecutar, dirigir y regular las actividades citoplasmticas, a travs del producto de la expresin de los genes: las protenas

Procesos
1. La duplicacin del ADN y su ensamblado con protenas (histonas) para formar la cromatina.
2. La transcripcin de los genes a ARN y el procesamiento de stos a sus formas maduras, muchas de las cuales son transportadas al citoplasma para su traduccin y 3. La regulacin de la expresin gentica.

Estructura
El ncleo est rodeado por la envoltura nuclear, una doble membrana interrumpida por numerosos poros nucleares que actan como una compuerta selectiva a travs de la cual ciertas protenas ingresan desde el citoplasma, y tambin permiten la salida de los distintos ARN y sus protenas asociadas. La envoltura nuclear es sostenida desde el exterior por una red de filamentos intermedios dependientes del citoesqueleto, mientras que la lmina nuclear, la cual se localiza adyacente a la superficie interna de la envoltura nuclear, provee soporte interno. El ncleo tambin tiene un nucleoplasma, en el cual estn disueltos sus solutos y un esqueleto filamentoso, la matriz nuclear la cual provee soporte a los cromosomas y a los grandes complejos proteicos que intervienen en la replicacin y transcripcin del ADN.

MEMBRANAS Y LAMINA NUCLEAR

La membrana interna posee protenas integrales que le son propias, que se unen a la lmina nuclear y a los cromosomas.

La lmina nuclear, capa fibrosa de 10 a 15 nm en la que apoya la membrana interna, est formada por protenas del tipo de los filamentos intermedios, polmeros de lamina o laminina nuclear. Ellas se unen a las protenas integrales de membrana.

 La envoltura nuclear es un derivado del sistema de endomembranas, siendo esto evidente al inicio de la divisin celular, cuando la envoltura se desorganiza y pasa a formar parte del sistema de cisternas y vesculas del retculo endoplsmico. La lmina nuclear confiere estabilidad mecnica a la envoltura nuclear. Adems, al interactuar con la cromatina participa en la determinacin de la organizacin tridimensional del ncleo interfsico.

 Cada CPN es una estructura compleja constituida por un gran nmero de protenas de disposicin octamrica. Est formado por: Ocho columnas proteicas, que forman las paredes laterales del poro. Un anillo externo, formado por ocho unidades proteicas. Un anillo interno, tambin con estructura octamrica.

Protenas de anclaje que fijan cada columna al espacio perinuclear. Protenas radiales que se proyectan desde las columnas hacia la luz del poro, a manera de diafragma Protenas fibrilares fijas al anillo interno y externo. En la cara nuclear convergen para formar una canastilla o cesta. A lo largo de estas fibrillas se ubican nucleoporinas que intervienen en el transporte de sustancias a travs del poro. Un poro central o abertura.

Cuerpos Nucleares
Muchos cuerpos nucleares discretos pueden ser observados dentro del ncleo forma compartamentalizada y libres de membranas. Pueden ser visualizados por diversas tecnicas de microscopia, incluyendo FISH e incluyen, entre los principales: Nucleolo Granulos Intercromaticos Cuerpos de Cajal (CBs) Gems Cuerpos PML.

Arquitectura Nuclear

Nucleolo
zona fibrilar central, formada por ADNribosmico y ARNr naciente zona granular perifrica donde los grnulos estn formados por las subunidades ribosmicas en proceso de ensamblado

Cuerpos Nucleares

a) Granulos intercromaticos, b) nucleolo, c) cuerpos de Cajal, cuerpos PML, e) sondas para cromosomas 13, 14 y 15 y f) ncleo

Puntos Nucleares
4. Las manchas nucleares son estructuras de forma irregular y tamao variado y el nucleo contiene alrededor de 25 a 50 de estos cuerps subnucleares (Spector 2001; Lamond and Sleeman 2003). Son estructuras ricas en factores del splicing incluyendo particulas ribonucleares pequeas (snRNPs) y otros factores no relacionados al espliceosoma (non-snRNP) tales como SC35. Las manchas nucleares son frecuentemente encontradas en estrecha relacin con genes transcripcionalmente activos y actuan como reservorios para el procesamiento de un pre-RNAm emergente, muy cerca de el gen en cuestion.

Cuerpos de Cajal
Son estructuras fibrilares de 0.15 a 1.5 m de dimetro con alta cantidad de factores de transcripcion y pequeas ribonucleoproteinas Su morfologa aparenta una enramada helicoidal de fibras
Frecuentemente aparecen acompaadas de Gems, que son protenas SMN (Survival of Motor Proteins) cuyo malfuncionamiento produce Atrofa Muscular Espinal. Juegan un papel importante el la biogenesis y transporte de los RNP y de los snRNP

Cuerpos Nucleares PML (Promyelocytic leukaemia)

Los cuerpos PML se caracterizan por la presencia de proteinas PML, varian en tamao de 0.3-1 m de dimentro y el nucleo tiene en promedio de 10 a 30 estructuras de este tipo.

Individuos que sufre Leucemia Promielocitica Aguda (APL) tienen una translocacion en el gen de la PML el cual esta fusionado con el gen receptor del cido alfaretinoico lo que resulta en la generacin de una protena hbrida. Celulas de estos individuos exhiben PML fragmentados. Tratamientos con acido retinoico a pacientes con APL puede resultar en reversion del cancer y restauracin de la estructura del los cuerpos PML normales.

Gems (Geminis de los cuerpos de Cajal)

Gems se encuentran ediacentes a los cuerpos de Cajal y se caracterizan por la presencia de restos de productos genicos de neuronas motoras (SMN). SMN citoplasmatico y Gemin 2 estan involucrados en el ensamblaje de snRNPs y por lo tanto puede jugar un papel importante en la maduracin de los snRNP.

Paraspeckles
Se descubieron en en clulas HeLa en 2002. Son compartimentos de forma irregular. Se encuentran entre 1030 por ncleo y se sabe que existen en todas las clulas humanas, Su nombre deriva de su distribucin en el ncleo. El prefijo "para" es una apcope de "paralelo" y "speckles" (mancha o mota, en ingls). Son estructuras dinmicas dependientes de la transcripcin,y en su ausencia desaparecen, y todas las protenas asociadas que lo componen (PSP1, p54nrb, PSP2, CFI(m)68 y PSF) forman un tapn perinucleolar en forma de cuarto creciente en el nuclolo.

 Dominios PIKA y PTF Los dominios PIKA, o Asociaciones Cariosmicas Polimrficas de Interfase, fueron descritos por primera vez en estudios de microscopa en 1991. Su funcin permanece poco clara, aunque se piensa que estn asociados con la replicacin activa de ADN, transcripcin o procesamiento de ARN. Se ha visto que frecuentemente se asocian con dominios discretos definidos por localizaciones densas del factor de transcripcin PTF, que promueve la transcripcin del ARNnp.36

Cuerpos de escisin
Llamados Cleavage bodies, en ingls, se suelen encontrar asociados a los cuerpos de Cajal, con un dimetro de 0,2 a 1,0 m y en nmero de 1-10 por ncleo. A diferencia de otros cuerpos nucleares, aparecen solamente durante determinados periodos del ciclo celular. Algunos de estos contienen el complejo CPSF-100 (por sus siglas en ingls de cleavage and polyadenylation specificity factor: factor de especificidad para el corte y la poliadenilacin), y se pueden observar predominantemente durante las fases S y G, mientras que los que contienen el factor de poliadenilacin CstF-64-containing se observan principalmente en la fase S. Estn asociados con el clster de genes de la histona.

 Cuerpos DDX1 Los cuerpos DDX1 son agregados de la protena DDX1, perteneciente a la familia de helicasas de ARN que contienen el motivo "DEAD box", se encuentran en un nmero que vara de dos a cuatro. Puesto que parece que estos cuerpos son reclutados en lugares en los que se ha producido dao en el ADN que est hibridando con ADN, parece que estos cuerpos desempean un papel en la reparacin de zonas con rupturas de doble cadena, facilitando la reparacin guiada por patrn de regiones del genoma transcripcionalmente activas.

Cuerpos de escisin Llamados Cleavage bodies, en ingls, se suelen encontrar asociados a los cuerpos de Cajal, con un dimetro de 0,2 a 1,0 m y en nmero de 1-10 por ncleo. A diferencia de otros cuerpos nucleares, aparecen solamente durante determinados periodos del ciclo celular. Algunos de estos contienen el complejo CPSF-100 (por sus siglas en ingls de cleavage and polyadenylation specificity factor: factor de especificidad para el corte y la poliadenilacin), y se pueden observar predominantemente durante las fases S y G, mientras que los que contienen el factor de poliadenilacin CstF-64containing se observan principalmente en la fase S. Estn asociados con el clster de genes de la histona.42

CROMOSOMAS Y NUCLEO

Los cromosomas aparecen ocupando lugares especficos. Los genes que codifican productos relacionados, aunque estn localizados en diferentes cromosomas, pueden estar ubicados prximos en el ncleo interfsico. Dichos cromosomas estn agrupados de tal forma que los genes de los ARNr estn todos juntos y confinados en el nuclolo, el lugar donde se sintetizan, procesan y ensamblan los ARNr. Esta separacin fsica asegura que los ARNr puedan ser eficientemente ensamblados dentro de las subunidades ribosomales.

Territorios cromosmicos
A comienzo de los 1980s, las observaciones realizadas tras irradiacin de clulas de Hamster permitieron intuir la existencia de territorios cromosmicos. Sin embargo, fueron las tcnicas de hibridacin in situ con sondas de pintado cromosmico, las que permitieron visualizar de manera directa el material gentico especfico de cada uno de los cromosomas, mostrando que cada uno ocupaba un territorio muy bien delimitado

Thomas and Christoph Cremer

Territorios cromosmicos

A comienzo de los 1980s, las observaciones realizadas tras irradiacin de clulas de Hamster permitieron intuir la existencia de territorios cromosmicos. Sin embargo, fueron las tcnicas de hibridacin in situ con sondas de pintado cromosmico, las que permitieron visualizar de manera directa el material gentico especfico de cada uno de los cromosomas, mostrando que cada uno ocupaba un territorio muy bien delimitado

Territorios cromosmicos

ESPACIO INTERCROMOSOMAL Y ESTRUCTURAS PERICROMATICAS

La apariencia homognea de el territorio cromosomal individual como se observaba en FISH implicaba que la cromatina en estos territorios esta densamente empacada y la trascripcin tenia que llevarse a cabo en la periferia de los territorios

 El espacio entre los territorios cromosamales es conocido como ntercromatina. Finos canales entre los territorios cromosomales conectan a los dominios de la ntercromatina Por estos canales se permite la difusin de trascripcin en el interior del territorio cromosomal

la fibrillas de pericromatina representa un subconjunto de RNA de transcripcin extra nuclear, que en la periferia forman bloques de Heterocromatina,

ENSAMBLAJE DE LA CROMATINA

El primer paso consiste en la unin del ADN a un tetrmero de nueva sntesis (H3-H4)2 para formar una partcula sub-nucleosomal, esto es seguido por la adicin de dos dmeros H2A-H2B.
Esto tiene como resultado la formacin de una partcula nucleosomal compuesta por 146 pares de bases de ADN enrollado alrededor del octmero de histonas. Esta partcula junto con el ADN forman el nucleosoma. Las histonas de nueva sntesis sufren una serie de modificaciones especficas (por ejemplo, la acetilacin de la histona H4).

El siguiente paso es la maduracin, que requiere ATP para establecer el patrn regular de espaciado entre los distintos nucleosomas para dar lugar al nucleofilamento. Durante este paso, las histonas de nueva incorporacin son desacetiladas.

ENSAMBLAJE DE LA CROMATINA

A continuacin, la incorporacin de las histonas de unin se acompaa del plegado del nucleofilamento para dar lugar a la fibra de 30 nm, estructura que permanece por caracterizar. Existen dos modelos principales: el modelo del solenoide y el zig-zag.

Finalmente, los sucesivos plegamientos tienen como consecuencia un nivel de organizacin complejo y la formacin de dominios especficos en el ncleo.
En cada uno de los pasos descritos anteriormente, la modificacin de los componentes bsicos y la actividad de diversos factores de estimulacin implicados en los procesos de ensamblaje tiene como resultado la modificacin en la composicin y actividad de la cromatina.

ESTUDIOS PIONEROS EN CROMATINA

Los filamentos de la cromatina fueron observados por primera vez en los aos 50s y 60s

Estos estudios llevaron al descubrimiento del nucleosoma en los 70s Finalmente de los 80s en adelante la microscopia fluorescente y estudios ultra estructurales de alto orden de organizacin han contribuido a una gran apreciacin en la importancia de la compartimentalizacin estructural de los ncleos.

Imgenes de cromatina en experimentos de entre 1963 y 1994.

La mayora de cromatina existe como 10 y 30 nm de fibras in situ.

La ultraestructura de la cromatina revela las fibras dobladas en diversas rdenes de empaquetado.
El dimetro de los fibras del cromonema reflejados por la microscopia electrnica convencional de transmisin (Belmont y Bruce, 1994), cambio a partir de 100-300 nm en el ncleo temprano G1 a 60-80 nm en ltimo G1 .(Fig.4)

Por ESI, sin embargo, observamos un estado de-condensado de la cromatina, consistiendo sobre todo fibras con 10-30 nm de dimetros (Bazett-Jones y Hendzel, 1999)

MATRIZ NUCLEAR
La matriz nuclear constituye la estructura compleja que proporciona el soporte fsico para los procesos de replicacin, procesamiento y transporte del RNA en eucariotas.

El grado de condensacin de los dominios de cromatina se mantiene principalmente debido a la asociacin con la matriz nuclear y a protenas asociadas como la topoisomerasa II o girasa, encargada de controlar el grado de superenrollamiento del ADN (Fig. 10.11). La unin entre la cromatina y la matriz se da a nivel de zonas altamente conservadas, denominadas secuencias SAR o MAR (scaffold associated regions/ matrix attachment regions). Las SAR son regiones de varios cientos de pares de bases ricas en residuos de adenina y timina, abundantes en la heterocromatina.

El ncleo de los mamferos contiene espacio de reas grandes "cromosoma-free"

Las fibras de Cromatina no se tienen que doblar extensamente para estar en el ncleo de interfase.

Proyeccin de imgenes de espectroscopia electronica de alta resolucin dejan ver el espacio libre en el nucleo con fibras de cromatina de 10 y 30 nm

Aproximadamente 83.5% del volumen del ncleo tpico del fibroblasto serian desprovistos de fibras de cromatina.

Despliegue de imgenes de espectroscopia electronica

El principio de ESI basado en la espectroscopia de la perdida de energia de los e-, causada por la exitacion o ionizacion de los atomos del especimen se requiere un instrumento que actue como un espectrofotometro y como un lente. La perdida de grandes cantidades de energia de los electrones, resultado de una serie de ionizaciones de la capa interna del electron. el resultado es una imagen de campo obscuro, el contraste es muy alto.

 Visualizar el ncleo por medio de despliegue de imgenes de espectroscopia electrnica revelado nuevos detalles de la organizacin de la cromatina en el ncleo en contraste con la percepcin creada por la microscopia fluorescente en relacin a los territorios cromosmicos revelado por FISH, ISI revela que los territorios de los cromosomas no estn densamente empaquetados y estn completamente abiertos a factores reguladores que participan en la trascripcin

ESI tambin permite la observacin de ambas protenas cromosomales y no cromosomales dentro del ncleo