Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences vol. 38, n. 2, abr./jun.

, 2002

Administrao oral de peptdios e protenas: I. Estratgias gerais para aumento da biodisponibilidade oral
Catarina Silva1, Antnio Ribeiro2, Domingos Ferreira3, Francisco Veiga1*
1

Laboratrio de Tecnologia Farmacutica, Faculdade de Farmcia, Universidade de Coimbra, Coimbra, Portugal, Laboratrio de Tecnologia Farmacutica, Instituto Superior de Cincias da Sade do Norte, Gandra, Paredes, 3 Laboratrio de Tecnologia Farmacutica, Faculdade de Farmcia, Universidade do Porto, Porto, Portugal

*Correspondncia: Prof. Francisco Veiga Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra 3000 COIMBRA - Portugal E-mail: fveiga@ci.uc.pt

Existem, atualmente, centenas de peptdios e protenas com ao teraputica. Os obstculos inerentes sua administrao oral tm impulsionado a investigao de estratgias capazes de os ultrapassar. Nesta reviso so abordados estes dois aspectos. A microencapsulao, pela sua versatilidade, sobressai entre as demais estratgias, afirmando-se como escolha potencial na administrao oral de frmacos peptdicos.

Unitermos: Frmacos peptdicos Formulaes farmacuticas Inibidores das proteases Microencapsulao Promotores da absoro

INTRODUO
As protenas e os peptdios podem ser considerados frmacos ideais porque intervm, essencialmente, em todos os processos biolgicos e reaes, caracterizando-se por elevada eficincia e potncia, ou seja, atuam especificamente e em baixas concentraes. Os desenvolvimentos mais recentes na biotecnologia tornaram possvel produo em larga escala de grande variedade de protenas. Encontram-se, atualmente, comercializadas ou em ensaios clnicos centenas de protenas com ao teraputica, incluindo anticorpos monoclonais, enzimas, agentes antimicrobianos, inibidores enzimticos, vacinas, agentes imunomoduladores, fatores de crescimento, citocinas e hormnios. Por outro lado, a descodificao do genoma humano permitir trazer ao conhecimento geral novas protenas, entre as quais algumas tero inevitavelmente aplicaes teraputicas (Burke, 2000; Putney, 1999; Zhou, Li Wan Po, 1991). Apesar das vantagens teraputicas das protenas e dos peptdios, estes agentes no so, de um modo geral, ativos por via oral. A biodisponibilidade oral reduzida, sobretudo, por rpida e intensa degradao pr-sistmica pelas enzimas proteolticas e por fraca permeabilidade

intestinal face sua elevada massa molecular (MM) e hidrofilicidade. As baixas biodisponibilidades obtidas conduzem a elevada variabilidade inter e intraindividual na administrao de frmacos peptdicos e implicam desperdcio elevado de princpio ativo (p.a.) (Sarciaux, Acar, Sado, 1995; Zhou, 1994). A exigncia de administrao parenteral acarreta diversos inconvenientes, em particular, a necessidade de repetidas injees devido ao reduzido tempo de meia-vida de peptdios e protenas (Burke, 2000) e possibilidade do aparecimento de efeitos indesejados, como a tromboflebite e a necrose tecidual (Zhou, Li Wan Po, 1991), responsveis por baixa adeso dos doentes a esta via de administrao. Tem-se procurado desenvolver formulaes de liberao controlada ou recorrer a outras vias de administrao, nomeadamente, oral, bucal, retal, nasal, ocular, vaginal ou transdrmica (Putney, 1999). A via oral via preferencial devido facilidade de administrao, convenincia e aceitao. So diversas as estratgias utilizadas para aumentar a biodisponibilidade oral de frmacos peptdicos, nomeadamente, a utilizao de inibidores das enzimas proteolticas, promotores da absoro, modificao qumica e formulaes farmacuticas especficas, como siste-

126

C. Silva, A. Ribeiro, D. Ferreira, F. Veiga

mas de partculas, emulses, sistemas de liberao targeting e sistemas bioadesivos. Na escolha do mtodo a utilizar, h a considerar o fato de os peptdios serem molculas de elevada labilidade, que em condies fsicoqumicas extremas podem sofrer desnaturao ou agregao com perda da sua atividade (Putney, 1999). Esta reviso descreve os aspectos associados administrao oral de peptdios e protenas, bem como as estratgias possveis a adotar para alcanar esse fim. Numa segunda parte, ser abordada a microencapsulao e a sua aplicao neste mbito e, numa terceira parte, estes vrios aspectos sero focados na administrao oral da insulina.

OBSTCULOS ADMINISTRAO ORAL DE PROTENAS E PEPTDIOS

Degradao enzimtica pr-sistmica A atividade proteoltica talvez um dos maiores obstculos na administrao oral de frmacos peptdicos. Em indivduos normais, 94-98% do total de protenas so completamente digeridas e absorvidas. A extenso da degradao protica dependente da estrutura do peptdio ou protena e no constante nos vrios segmentos intestinais (Langguth et al., 1997). A protelise tem incio no estmago, na presena de pepsina, e prolonga-se no intestino delgado, por ao das enzimas proteolticas pancreticas e das peptidases da mucosa intestinal. As proteases pancreticas mais relevantes so a tripsina, a a-quimotripsina e a elastase, endopeptidases que clivam as ligaes peptdicas internas, e as carboxipeptidases A e B, exopeptidases que digerem os fragmentos produzidos pelas enzimas anteriores (Langguth et al., 1997). A atividade enzimtica das proteases do lmen apenas pode ser avaliada tendo em considerao as unidades secretadas pelo pncreas por minuto (Bernkop-Schnurch, 1998). As peptidases associadas mucosa intestinal localizam-se em 3 fraes subcelulares dos entercitos: no citosol, nos lisossomas e nas microvilosidades, onde a atividade proteoltica mais importante. A peptidase mais abundante das microvilosidades a aminopeptidase N, uma amino-exopeptidase, tal como as aminopeptidases A, W e P, a dipeptidilaminopeptidase IV e a -glutamiltranspeptidase, tambm presentes, juntamente com endopeptidases (endopeptidase 24.11 e endopeptidase 24.18) e carboxiexopeptidases (carboxipeptidases P e M e a enzima de converso da angiotensina). No citosol, esto presentes enzimas solveis, sobretudo dipeptidases, uma aminotripeptidase e as prolina-dipeptidases (prolinase e

prolidase), que completam a hidrlise intracelular de die tripeptdios transportados ativamente atravs das microvilosidades por um transportador transmembranar dependente de prtons. Por outro lado, necessrio ter em considerao a microflora presente na zona distal do intestino delgado e no intestino grosso, responsvel por variedade de reaes metablicas, como desglicuronidao, descarboxilao, reduo de ligaes duplas, hidrlise de steres ou amidas e desidroxilao (Langguth et al., 1997). A protelise no clon cerca de 20 a 60 vezes mais baixa do que ao nvel do leo e so as enzimas do ecossistema microbiano as principais responsveis pela atividade proteoltica, embora tambm exista alguma atividade proteoltica residual das enzimas pancreticas (Rubinstein et al., 1997). Fraca permeabilidade A passagem atravs do epitlio intestinal fundamental para obter disponibilidade sistmica de um frmaco administrado por via oral. Esta barreira formada por uma monocamada de clulas epiteliais (entercitos, entre outras), que se ligam nas superfcies apicais por junes paracelulares e esto cobertas superfcie por uma camada de muco. Os frmacos podem ultrapassar este obstculo por transporte transcelular atravs das clulas epiteliais, o que inclui a difuso passiva, o transporte ativo ou facilitado, a endocitose e a transcitose, ou por transporte transcelular atravs das junes paracelulares (Figura 1) (Kolac, Streichhan, Lehr, 1996; Zhou, 1994). Na via transcelular existem duas barreiras, a membrana celular apical e basolateral, enquanto que na via paracelular s existe uma barreira, as junes paracelulares (Kolac, Streichhan, Lehr, 1996). Os aminocidos, dipeptdios e tripeptdios so capazes de penetrar na membrana mucosa, pela via transcelular, atravs de transportadores especficos preEndo/transcitose Paracelular Transcelular Transporte ativo

FIGURA 1 - Mecanismos de transporte atravs das clulas epiteliais (Adaptado de Kolac, Streichhan, Lehr, 1996)

Administrao oral de peptdios e protenas

127

sentes no intestino delgado ou por pinocitose (endocitose de fluidos), mas os peptdios maiores e as protenas so, de um modo geral, impedidos de o fazer (Rouge, Doelker, 1996; Zhou, 1994). O transporte transcelular depende primariamente das propriedades fsico-qumicas do frmaco, coeficiente de partio e massa molecular (MM). Limita-se, normalmente, a compostos hidrofbicos e relativamente pequenos porque necessria partio do composto entre a membrana apical e a membrana basolateral do epitlio intestinal (Lipka, Crison, Amidon, 1996; Hochman, Artursson, 1994). A pinocitose no um mecanismo de transporte de contribuio significativa. Contudo, algumas molculas de maiores dimenses, como os peptdios e as protenas so absorvidas por este mecanismo, nos entercitos e nas regons das placas de Peyer (Rouge, Doelker, 1996). A entrada dos peptdios nos entercitos, por pinocitose, leva formao de fagossomas, que se fundem com os lisossomas, permitindo o ataque pelas enzimas presentes nos lisossomas e uma quase completa degradao do seu contedo. As clulas M das placas de Peyer no contm lisossomas, apresentando elevado nvel de pinocitose, pelo que o transporte de peptdios por pinocitose-exocitose (transcitose), pelas clulas M, pode ser mais eficaz do que atravs dos entercitos (Lenaerts, 1996). As placas de Peyer esto localizadas primariamente no leo e permitem o transporte das macromolculas para o sistema linftico. A atividade de aminopeptidase ao nvel do jejuno e leo, em coelhos albinos, apenas cerca de 20-30% daquela presente nas zonas vizinhas sem placas de Peyer (Hayakawa, Lee, 1992). Embora a sua permeabilidade seja elevada, representa apenas uma pequena percentagem da superfcie total da mucosa intestinal, pelo que somente pequenas quantidades de macromolculas podem ser transportadas (Kolac, Streichhan, Lehr, 1996). Alm disso, este pode no ser um bom local para vetorizao de frmacos, uma vez que, depois da meia-idade, as placas de Peyer diminuem drasticamente com o envelhecimento (Rouge, Doelker, 1996). Outro mecanismo para absoro de macromolculas a endocitose mediada por receptores, que, semelhana da pinocitose, no permite o transporte de quantidades elevadas de macromolculas. Aps a ligao do frmaco ao receptor, o complexo formado internalizado para formar vesculas, que se fundem com os lisossomas citoslicos ou so transportadas atravs do citosol diretamente para a membrana basolateral (Kolac, Streichhan, Lehr, 1996). Alternativamente, a passagem das molculas ocorre atravs das junes paracelulares entre as clulas. As junes paracelulares tornam-se progressivamente mais apertadas em direo ao clon, o que acompanhado de dimi-

nuio da permeabilidade da membrana para os compostos polares (Rouge, Doelker, 1996). A passagem das molculas atravs da via paracelular depende da sua forma, tamanho e carga e da seletividade e dimenses da via (Adson et al., 1994). Para avaliar o raio do poro, foi utilizada a monocamada celular Caco-2, uma linha celular de adenocarcinoma do clon humano, que se diferencia espontaneamente em clulas representativas do intestino delgado (Hilgers, Conradi, Burton, 1990). Os estudos mais recentes apontam para valores de 4,41,1 (Okumu et al., 1997) e de 4,50,1 (Watson, Rowland, Warhurst, 2001). Porm, as propriedades das junes paracelulares nas clulas da Caco-2 so idnticas s do clon humano in vivo (Artursson, 1993) e como os espaos paracelulares no intestino delgado so mais permeveis, a probabilidade de absoro de frmacos peptdicos, nesta regon, dever ser superior. No clon de ratos, o raio do poro foi estimado em 8-9 (Tomita et al., 1988). Embora o grau de permeabilidade das junes paracelulares varie para os diferentes tipos de epitlio, normalmente, as junes paracelulares so impermeveis a molculas com um raio superior a 11-15 (Pauletti et al., 1996). Para os peptdios de baixa MM, a carga seletiva, sendo a permeabilidade superior para os peptdios de carga positiva. Com o aumento da MM, o tamanho torna-se fator mais predominante e o efeito da carga menos significativo (Pauletti, Okumu, Borchardt, 1997). Formadas por quatro componentes polipeptdicos identificados, as junes paracelulares esto intimamente associadas a um anel de actina-miosina presente no citoplasma epitelial, que, ao se contrair, provoca um relaxamento da estrutura. A abertura das junes paracelulares pode ser causada por diferentes mecanismos, conforme avaliado por diminuio na resistncia eltrica transepitelial (transepithelial electrical resistance, TEER), nomeadamente, alterao do estado de fosforilao dos seus componentes por ativadores da protena quinase A, remoo de AMPc ou depleo de ons clcio. Outros mecanismos envolvidos incluem a depleo de ATP, a absoro de nutrientes dependente de ons sdio ou alteraes gerais na estrutura da actina por oxidantes, ativadores da protena quinase C, quelantes de ons clcio, toxina A do Clostridium difficile ou citochalasinas (Hochman, Artursson, 1994). O transporte ativo de glicose e aminocidos (a.a.) da mucosa intestinal para os espaos laterais intercelulares est acoplado ao transporte de ons sdio, criando uma fora osmtica, que desencadeia a contrao do anel de actina-miosina perijuncional e o aumento da permeabilidade paracelular (Lee, 1990). A barreira de muco igualmente importante para os frmacos peptdicos devido s interaes que so estabelecidas. Os frmacos com carga aninica ou neutra

128

C. Silva, A. Ribeiro, D. Ferreira, F. Veiga

apresentam menor interao com a superfcie da membrana celular, carregada negativamente (Zhou, 1994). As protenas com MM superior a 5 KDa s dificilmente conseguem atravessar a camada de muco (Bernkop Schnurch, Fragner, 1996). Instabilidade qumica e fsica A natureza fsico-qumica complexa das protenas, que lhes confere potencial como agentes teraputicos, tambm responsvel pela sua fragilidade. A alterao no enzimtica das protenas pode ser de dois tipos: qumica e fsica. A instabilidade qumica definida como um processo que modifica a protena, por clivagem ou formao de ligaes covalentes, para originar uma nova entidade qumica. As alteraes qumicas incluem a desamidao, oxidao, hidrlise, trocas de dissulfeto, racemizao e -eliminao (Chen, 1992; Manning, Patel, Borchardt, 1989). A instabilidade fsica no envolve a modificao covalente da protena, podendo ocorrer desnaturao, adsoro superfcie, agregao e precipitao (Manning, Patel, Borchardt, 1989). A desnaturao diz respeito a uma alterao do enrolamento global da molcula, com perda da estrutura terciria e, freqentemente, da estrutura secundria. Pode ser causada por aumento ou diminuio da temperatura, valores de pH extremos, adio de solventes orgnicos, agentes desnaturantes (Manning, Patel, Borchardt, 1989), adio de sais, presso elevada, adsoro superfcie e liofilizao (Chen, 1992). O processo pode ser reversvel ou irreversvel. O desdobramento favorece a ocorrncia de outras reaes de inativao, como a agregao a outras molculas proticas e/ou alteraes qumicas, o que conduz a perda da atividade biolgica, formao de partculas e precipitao (Chen, 1992; Manning, Patel, Borchardt, 1989). No que respeita administrao oral de frmacos peptdicos, a auto-agregao de particular importncia porque os agregados, de maior dimenso, apresentam menor permeabilidade atravs da membrana intestinal, alm de possvel atividade biolgica diminuda (Fix, 1996a).

como foi demonstrado em vrios estudos in vivo (Langguth et al., 1997; Kimura et al., 1996; Morishita et al., 1992a). Contudo, a utilizao de inibidores enzimticos em terapias de longa durao, como ocorre freqentemente com este tipo de frmacos, no isenta de efeitos adversos importantes. Alm dos efeitos txicos ao nvel sistmico e danos diretos na mucosa intestinal, os inibidores enzimticos continuam a ter um potencial txico causado pela sua prpria ao inibidora. Alm de distrbios na digesto das protenas, de se esperar a estimulao da secreo de proteases, devida regulao por feedback negativo, que pode resultar em hipertrofia e hiperplasia do pncreas ou at mesmo no desenvolvimento de focos neoplsicos, freqentemente progressivos para carcinoma invasivo. A reduo ou a excluso deste mecanismo de regulao possvel pelo desenvolvimento de sistemas de administrao de frmacos, resultantes da imobilizao dos inibidores em matrizes polimricas mucoadesivas no absorvveis, que mantenham o inibidor concentrado em rea restrita do intestino, onde ir decorrer a liberao e subseqente absoro do frmaco (Bernkop-Schnurch, 1998). A seleo dos inibidores das proteases depende do tipo de protease e da sua distribuio subcelular. Quando a principal atividade proteoltica citoslica fundamental que os prprios agentes inibidores sejam absorvidos para a clula, o que no fcil, visto ser estes compostos normalmente demasiado grandes ou hidroflicos para atravessar as membranas biolgicas (Lee, 1990). Os diversos inibidores enzimticos das enzimas proteolticas secretadas para o lmen (Tabela I) e ligadas s microvilosidades intestinais (Tabela II) podem ser classificados, de acordo com a estrutura qumica, em quatro categorias (Bernkop-Schnurch, 1998), a seguir descritas. i. Inibidores que no so baseados em aminocidos Excetuando poucos casos, esta classe de inibidores tem mais interesse terico do que prtico, j que a maioria altamente txica. Contudo, so inibidores muito potentes e a sua imobilizao em matrizes no-absorvveis ou o desenvolvimento de anlogos modificados quimicamente podem reduzir ou at eliminar este inconveniente. Esto includos neste grupo o diisopropilfluorofosfato (DFP), o fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), o fluoreto de 4-(2-amino-etil)-benzenossulfonato (AEBSF), o cloridrato do fluoreto de (4-aminofenil)-metanossulfonila (APMSF), potentes inibidores das serinaproteases, mas de elevada toxicidade. O mesilato de 4-(4isopropilpiperidinocarbonil)fenil-1,2,3,4-tetraidro-1naftoato (FK-448), o mesilato de camostato e o glicocolato de sdio j apresentam menor toxicidade.

ESTRATGIAS PARA AUMENTAR A BIODISPONIBILIDADE ORAL DE PROTENAS E PEPTDIOS

Inibidores das enzimas proteolticas A co-administrao de agentes inibidores das enzimas proteolticas estratgia possvel para o aumento da biodisponibilidade oral de peptdios e protenas,

Administrao oral de peptdios e protenas

129

TABELA I - Inibidores das proteases secretadas no lmen Proteases secretadas no lmen Tripsina (EC 3.4.21.4) Co-factor Clcio Inibidas por Aprotinina, inibidor de Bowman-Birk, inibidor tripsnico de soja, mesilato de camostato, inibidores flavonides, antipana, leupeptina, p-aminobenzamidina, AEBSF, TLCK (clorometilcetona de tosil-lisina), APMSF, DFP, PMSF, derivados do poliacrilato Aprotinina, inibidor de Bowman-Birk, inibidor tripsnico de soja, quimostatina, benziloxicarbonil-Pro-Phe-CHO, FK448, ovoinibidor de galinha, complexos de acares e cido bifenilbornico, DFP, PMSF, -fenilpropionato, derivados do poliacrilato Elastatina, metoxissuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-clorometilcetona (MPCMK), inibidor de Bowman-Birk, inibidor tripsnico de soja, ovomucide de galinha, DPF, PMSF EDTA, conjugados quitosana-EDTA, derivados do poliacrilato EDTA, conjugados de quitosana-EDTA, derivados do poliacrilato

Quimotripsina (EC 3.4.21.1)

Clcio

Elastase (EC 3.4.21.36)

Clcio

Carboxipeptidase A (EC 3.4.17.1) Carboxipeptidase B (EC 3.4.17.2)

Zinco Zinco

(Adaptado de Bernkop-Schnurch, 1998) ii. Aminocidos e aminocidos modificados De um modo geral, os a.a. modificados so praticamente desprovidos de toxicidade e podem ser produzidos a um custo relativamente baixo. Porm, devido baixa MM e elevada solubilidade so extensivamente diludos no intestino e rapidamente absorvidos, o que exige grandes quantidades para conseguir um efeito inibidor contra as proteases do lmen intestinal. Este fato limita o seu interesse na via oral, mas pode ser minimizado em sistemas que garantam a reduo ou at a excluso do efeito de diluio. Os a.a. exibem fraca atividade inibitria contra a aminopeptidase N, o que impulsionou a sua modificao em compostos mais potentes como os derivados do cido a-aminobrico: boroleucina, boro-valina e boro-alanina. A N-acetilcistena tem um forte efeito inibidor contra a atividade enzimtica da aminopeptidase N, sendo promissora na inibio das proteases pela sua baixa toxicidade e propriedades mucolticas adicionais, que reduzem a barreira de difuso. iii. Peptdios e peptdios modificados A bacitracina A, um dodecapeptdio de 1423 Da obtido a partir do Bacillus licheniformis, apresenta grande resistncia s enzimas proteolticas e tem atividade inibitria contra a aminopeptidase N. Alm disso, possui efeitos promotores da absoro sem que conduza a danos graves na mucosa intestinal. O grande inconveniente o seu efeito nefrotxico, que poder ser excludo por imobilizao em matrizes noabsorvveis. Os dipeptdios e tripeptdios apresentam uma atividade inibitria fraca e no especfica contra algumas exopeptidases e, por analogia, com os a.a., a sua atividade inibitria pode ser melhorada por modificao qumica. O inibidor fosfinato VI um inibidor do estado de transio com forte atividade contra aminopeptidases. A pepstana um pentapeptdio modificado muito potente na inibio da pepsina. Um grupo de peptdios modificados, com uma funo aldedo, nomeadamente, a antipana, leupeptina, quimostatina e elastatinal so inibidores reversveis e potentes da quimotripsina. Outros peptdios modificados que atuam como inibidores reversveis incluem a fosforamida, bestatina, puromicina e amastatina. iv. Polipeptdios Devido sua elevada MM, os inibidores das proteases polipeptdicos podem concentrar-se mais facilmente em sistemas de administrao baseados em matrizes transportadoras de frmacos. A liberao lenta do inibidor a partir de uma formulao permite a sincronizao com a liberao do frmaco polipeptdico e, conseqentemente, aumento da sua biodisponibilidade. Por esta razo e pela sua baixa toxicidade e forte atividade inibitria, os inibidores polipeptdicos so os agentes auxiliares mais usados para superar a barreira enzimtica. A aprotinina um inibidor bsico de 58 a.a., com efeito inibitrio da tripsina e

130

C. Silva, A. Ribeiro, D. Ferreira, F. Veiga

TABELA II - Inibidores das proteases ligadas s microvilosidades intestinais Proteases das microvilosidades Aminopeptidase N (EC 3.4.11.2) Co-factor(es) Zinco, cobalto Inibidas por Aminocidos, di- e tripeptdios, EDTA, amastatina, bestatina, puromicina, anlogos dipeptdicos do cido fosfnico, derivados do cido -aminobornico conjugados de quitosana-EDTA, glicocolato de sdio Anlogos dipeptdicos do cido fosfnico, derivados do cido -aminobornico, puromicina, EDTA, 1,10fenantrolina PMSF, bestatina, anlogos dipeptdicos do cido fosfnico, derivados do cido -aminobornico Anlogos dipeptdicos do cido fosfnico, derivados do cido -aminobornico Bestatina, amastatina, anlogos dipeptdicos do cido fosfnico, inibidores flavonides, derivados do cido -aminobornico Anlogos cido N-peptidil-O-acilidroxilamina bornico da prolina e alanina, DFP Acivicina (cido amino-(3-cloro-4,5-diidro-isoxazol5-il)-actico), L-serina borato Inibidores da enzima de converso da angiotensina (em teoria) cido D,L-2-mercaptometil-3-guanidinoetiltiopropanico 1,10-Fenantrolina, tiorfano (cido (2-mercaptometil3-fenil-propionilamino)-actico), fosforamido, SQ 28,603 (N-(2-(mercaptometil)-1-oxo-3-fenilpropil)-alanina)

Aminopeptidase A (EC 3.4.11.7)

Zinco, clcio

Aminopeptidase P (EC 3.4.11.9) Aminopeptidase W (EC 3.4.11.16) Leucina aminopeptidase (EC 3.4.11.1)

Zinco, mangans Zinco Zinco, magnsio, mangans Zinco Magnsio Zinco Zinco Zinco, mangans Zinco

Dipeptidil peptidase IV (EC 3.4.14.5) g-glutamil transpeptidase (EC 2.3.2.2) Peptidil dipeptidase A (EC 3.4.15.1) Carboxipeptidase M (EC 3.4.17.12) Carboxipeptidase P (EC 3.4.17.16) Endopeptidase neutra (EC 3.4.24.11)

Endopeptidase-24.18 (EC 3.4.24.18) (Adaptado de Bernkop-Schnurch, 1998)

Zinco

quimotripsina. O inibidor de Bowman-Birk (71 a.a.) e o inibidor tripsnico de Kunitz (184 a.a.), tambm conhecido por inibidor tripsnico da soja, inibem a tripsina, a quimotripsina e a elastase. Outros inibidores desta classe incluem o inibidor tripsnico da ovalbumina ou ovomucide (186 a.a.) e o inibidor tripsnico pancretico humano (56 a.a.). parte destas classes qumicas de inibidores enzimticos, encontram-se os agentes complexantes, que devido sua capacidade em capturar ctions divalentes, cofatores de muitas proteases, podem apresentar atividade inibitria. A inibio da tripsina, quimotripsina e elastase pelos agentes complexantes dependente da concentrao do agente complexante e da concentrao de ons clcio nos

fluidos gstrico e intestinal. Os agentes complexantes tambm podem inibir as exopeptidases dependentes de zinco, tais como, as carboxipeptidases A e B e a aminopeptidase N. Agentes representantes desta classe incluem o EDTA, o EGTA, a 1,10-fenantrolina e a hidroxicolina. Devido complexao dos ctions divalentes, estes agentes inibitrios apresentam propriedades promotoras de penetrao adicionais (Bernkop-Schnurch, 1998). Promotores da absoro Pelo fato de as membranas mucosas serem resistentes penetrao pela maioria dos peptdios e protenas, a

Administrao oral de peptdios e protenas

131

co-administrao destas com promotores da absoro alternativa vlida. A utilizao dos promotores da absoro limitada pelas freqentes alteraes na mucosa, nomeadamente, a remoo das protenas da membrana, perda de clulas, secreo excessiva de muco e ciliotoxicidade, alm do risco de toxicidade sistmica decorrente da absoro destes agentes (Zhou, 1994). Existem vrias teorias para explicar os mecanismos de ao dos promotores de absoro: o aumento da solubilidade por dissociao dos agregados proticos ou peptdicos (Shao et al., 1994; Touitou et al., 1987), a inibio no-especfica das enzimas proteolticas (Shao et al., 1993), a reduo da viscosidade da camada de muco aderente superfcie (Bernkop-Schnurch, Valenta, Daee, 1999) e a diminuio da integridade da membrana mucosa (Schilling, Mitra, 1990; Uchiyama et al., 1999). Existem quatro grandes tipos de promotores da absoro (Fix, 1996b; Hochman, Artursson, 1994; Shao et al., 1993; Lee, 1990): 1) agentes quelantes EDTA, EGTA, cido ctrico, salicilatos, derivados N-acil de colgeno e enaminas (derivados N-aminoacil de -dicetonas); 2) tensoativos aninicos (dodecil sulfato de sdio, lauril sulfato de sdio), catinicos (brometo hexadecil de trimetilamnio), no-inicos (Tween 80, polioxietileno20-cetilter, polioxietileno-(24)-colesterol-ter, polioxietileno-9-laurilter) e fisiolgicos (sais biliares, como desoxicolato sdico, glicocolato sdico e taurocolato sdico e os seus derivados como o taurodiidrofusidato sdico e o glicodiidrofusidato sdico); 3) cidos graxos cido olico, cido caprlico e os seus derivados, como as acilcarnitinas (palmitoilcarnitina), acilcolinas e mono- e diglicerdios; 4) no-tensoativos, tais como, urias cclicas nosaturadas e derivados 1-alquil e 1-alquenilazacicloalcanona. Os quelantes de clcio aumentam a permeabilidade intestinal por abertura das junes paracelulares num processo mediado pelas protena quinases. A depleo de ons clcio no ocorre diretamente nas junes paracelulares, induz alteraes globais nas clulas incluindo ruptura dos filamentos de actina, ruptura das junes aderentes, diminuio da adeso celular e ativao das protena quinases. Contudo, como a formulao tem apenas acesso superfcie da mucosa e as concentraes do on clcio so variveis, pouco provvel que os quelantes possam ser administrados em quantidade adequada para baixar suficientemente os nveis de ons clcio, para induzir a abertura das junes paracelulares de um modo rpido, reversvel e reprodutvel (Hochman, Artursson, 1994).

Os tensoativos interagem com as membranas celulares, aumentando a permeabilidade de um modo dependente da dose. Para baixas concentraes, os tensoativos so incorporados na bicamada lipdica, alterando as propriedades fsicas das membranas celulares. Quando a bicamada lipdica fica saturada, formam-se micelas mistas, que causam a remoo dos fosfolipdios das membranas e a solubilizao destas (Hochman, Artursson, 1994). Contudo, um aumento da permeabilidade da membrana celular no explica todos os efeitos dos tensoativos, j que o aumento da absoro de peptdios pode ocorrer atravs das junes paracelulares (Anderberg, Lindmark, Artursson, 1993). A potencial natureza ltica dos tensoativos um inconveniente, uma vez que o epitlio intestinal fornece uma barreira contra a entrada de toxinas, bactrias e vrus do exterior (Hochman, Artursson, 1994). Outras formas de promover a absoro oral de peptdios e protenas consistem na utilizao de ciclodextrinas (Shao et al., 1994) e agentes mucolticos (Bernkop-Schnurch, Valenta, Daee, 1999). Um dos mecanismos mais provveis para a atuao das ciclodextrinas a dissociao dos agregados peptdicos (Shao et al., 1994), enquanto que os agentes mucolticos reduzem a barreira exercida pela camada de muco (Bernkop-Schnurch, Valenta, Daee, 1999). Estes agentes mucolticos podem atuar por diferentes mecanismos: 1) atividade proteoltica que cliva o ncleo protico da mucina; 2) quebra das ligaes dissulfeto das mucoprotenas em compostos sulfidrila e 3) ao detergente, que quebra as ligaes no-covalentes no muco (Bernkop-Schnurch, Valenta, Daee, 1999). As proteases e os compostos sulfidrila so mais eficazes na diminuio da viscosidade do muco do que os detergentes. No entanto, apresentam o inconveniente de serem incompatveis com alguns frmacos. Os derivados do cido poliacrlico e as quitosanas foram sugeridos como nova classe de promotores de absoro, pelo fato de aumentarem o transporte de peptdios atravs da barreira epitelial. Outras vantagens so: pelo fato de no serem absorvidos devido sua MM, no se esperar toxicidade sistmica, as suas propriedades bioadesivas e, no caso dos poliacrilatos, proteo contra a degradao proteoltica (Lueben et al., 1994). Modificao qumica A modificao qumica de peptdios com converso em pr-frmacos permite obter compostos mais lipoflicos do que a molcula original. Estes pr-frmacos conferem maior proteo contra a degradao proteoltica e ao mesmo tempo permitem que haja reconverso para os peptdios originais mediante reao espontnea ou

132

C. Silva, A. Ribeiro, D. Ferreira, F. Veiga

catalisada por enzimas no-especficas, aps a absoro. Este tipo de abordagem tem maior aplicao em frmacos peptdicos com menos de 10 aminocidos, j que os polipeptdios e protenas bioativas podem sofrer desnaturao (Zhou, 1994; Bundgaard, 1992). Os derivados N--hidroxialqulicos ao nvel da ligao peptdica so pr-frmacos normalmente mais resistentes degradao enzimtica do que os respectivos peptdios e, em meio aquoso, so convertidos no peptdio e correspondente aldedo, a uma velocidade dependente do pH. A derivatizao do grupo hidroxilo, por exemplo, por esterificao, para obter derivados N--aciloxialqulicos que so clivados por esterases no especficas, permite aumentar a estabilidade e lipofilicidade (Bundgaard, 1992). Formulaes farmacuticas Sistemas de partculas As condies fisiolgicas do trato gastrointestinal (GI) obrigam a que os sistemas de partculas obedeam a dois critrios para serem eficazes na administrao oral de frmacos. Primeiro, tm de ser resistentes degradao no trato GI para conseguirem proteger os frmacos. Segundo, os frmacos encapsulados nas partculas tm de ser absorvidos com elevada eficincia do trato GI para serem terapeuticamente eficazes (Chen, Langer, 1998). As prprias partculas podem ser eficazmente absorvidas para liberar o frmaco no seu alvo (Chen, Langer, 1998). Foram propostos diferentes mecanismos para explicar a translocao de partculas atravs do intestino: captao pelas placas de Peyer ou folculos linfides isolados, captao intracelular (endo/transcitose) e passagem intracelular/ paracelular (Couvreur, Dubernet, Puisieux, 1995). Aps administrao oral, a absoro de partculas na mucosa intestinal pode ser realizada atravs das clulas M das placas de Peyer, pertencentes ao tecido linfide associado ao intestino (gut associated lymphoid tissue, GALT), pelos folculos isolados do GALT e tambm pelos entercitos. Os fatores que promovem a captao de partculas atravs do GALT incluem: estabilidade da partcula no lmen intestinal, dimetro de partcula inferior a 5 mm (de preferncia inferior a 1 mm), ausncia de cargas superfcie, hidrofobicidade da partcula e presena de ligantes especficos na partcula (Ex.: lectinas) (Florence, 1997). No que respeita ao tamanho das partculas, cerca de 2-3% das partculas submicronizadas podem ser absorvidas (Florence, 1997), tendo-se verificado que as partculas com 100 nm mostram eficincia de captao 15-250 vezes superior s partculas de maior dimenso (Desai et al., 1996) e que as partculas com mais de 10 mm no so

captadas pelas clulas M (Eldridge et al., 1990). As partculas com menos de 5 mm so transportadas para os vasos linfticos eferentes, enquanto que a maioria das partculas com mais de 5 mm de dimetro permanecem fixas s placas de Peyer (Eldridge et al., 1990). Os sistemas de partculas podem subdividir-se em:

Partculas polimricas A incorporao ou encapsulao de peptdios ou protenas em partculas polimricas de tamanho inferior ao mcron (nanopartculas) at vrias centenas de mcron (micropartculas) deve ter, pelo menos, um efeito: a proteo contra a degradao pelas substncias presentes no trato GI (Allemann, Leroux, Gurny, 1998). Os polmeros utilizados para administrao oral so normalmente biodegradveis, o que permite proteo no trato GI at as partculas sofrerem eroso ou degradao num certo nvel do intestino. No entanto, podem ser utilizadas outras estratgias, como ser descrito na segunda parte desta reviso, especialmente, recorrendo a polmeros sensveis ao pH ou bioadesivos. As partculas biodegradveis tm sido muito exploradas no campo da imunizao por administrao oral, devido ao seu transporte mediado pelas clulas M do tecido linfide associado mucosa intestinal, onde so induzidas respostas imunolgicas locais e/ou sistmicas (Alpar, Eyles, Williamson, 1998). Porm esta rea sai fora do mbito desta reviso. Partculas lipdicas As partculas lipdicas mais comuns so os lipossomas, vesculas esfricas formadas por bicamadas concntricas, que rodeiam um ncleo aquoso. Os lipossomas podem transportar frmacos lipossolveis nas suas bicamadas e simultaneamente frmacos hidrossolveis nos ncleos aquosos. A sua preparao no exige condies rigorosas, o que minimiza a desnaturao de frmacos peptdicos durante a encapsulao. Porm, a maioria das formulaes lipdicas no pode ser usada em administrao oral pela sua suscetibilidade ao dos sais biliares e das fosfolipases intestinais. A ruptura das membranas lipossmicas no trato GI leva exposio do material encapsulado e, conseqentemente, perda das suas funes protetoras (Chen, Langer, 1998). A estabilidade dos lipossomas pode ser aumentada por revestimento com diferentes polmeros, entre os quais, derivados do PEG, cadeias sacardicas da mucina (Iwanaga et al., 1997), quitosana, polivinillcool com uma cadeia alqulica longa e cido poliacrlico com um grupo colesterila (Takeuchi et al., 1996). Os niossomas, outro tipo de partculas lipdicas, so vesculas de lipdios

Administrao oral de peptdios e protenas

133

sintticos de natureza no-inica, desenvolvidas com o objetivo de aumentar a estabilidade e a reproducibilidade dos lipossomas (Handjani-Vila, Vanlerberghe, 1985). Esta forma farmacutica foi utilizada na administrao oral de peptdios (Yoshida et al., 1992). Embora a estabilidade qumica e fsica dos niossomas seja baixa, os tensoativos ou lipdios, que os constituem, podem atuar como promotores da absoro e aumentar o fluxo de peptdio atravs da mucosa intestinal. A fixao das vesculas parede intestinal ou a prpria migrao das vesculas contendo o frmaco atravs da parede intestinal podem explicar o aumento da estabilidade do peptdio encapsulado em niossomas (Yoshida et al., 1992). A preparao de lipossomas polimerizados, nos quais as molculas de fosfolipdios esto ligadas covalentemente, permitiu melhorar o perfil de liberao de uma protena em fludos GI simulados em relao aos lipossomas regulares (Okada, Cohen, Langer, 1995).

adicionada a mistura hidroflica/lipoflica de duas fases, origina sistema termodinamicamente estvel, formado por microgotculas com um tamanho inferior a 100 nm. A captao dos frmacos peptdicos, no trato GI, a partir das microemulses dependente do tamanho da partcula, tipo de fase lipdica da microemulso, digestibilidade do lipdio usado, tipo de agentes emulsificantes, pH e quantidade de frmaco que passa para os entercitos. A absoro dos peptdios pode ocorrer pelos vasos linfticos, evitando-se o efeito de primeira passagem, ou, ainda, pelas veias mesentricas (Sarciaux, Acar, Sado, 1995). Podem formar-se microemulses utilizando steres da cidos graxos como tensoativos no-inicos (baixa irritao e elevada estabilidade qumica) e lcoois de cadeia curta como co-tensoativos (Ho, Hsiao, Sheu, 1996). Sistemas de liberao targeting

Revestimentos entricos
A liberao dos frmacos peptdicos e proticos no estmago favorece a sua degradao pelas enzimas e pH gstricos. O revestimento das formulaes com materiais gastro-resistentes, liberando os frmacos ao nvel intestinal, permitir proteo contra essa degradao. Os polmeros poliacrlicos tm sido amplamente utilizados para este propsito, especialmente, os co-polmeros de cido metacrlico-metilmetacrilato Eudragit RS1, RS2, L100 e S100 (Carino, Mathiowitz, 1999).

Clulas A utilizao de membranas de eritrcitos como transportadores de frmacos vantajosa pela sua biocompatibilidade e volume interno relativamente elevado comparativamente a outros sistemas de micropartculas, permitindo o transporte de elevadas quantidades de frmaco (Juliano, 1987). Este tipo de sistema foi aplicado administrao oral de peptdios com um sucesso significativo (Al Achi, Greenwood, 1998).

Emulses A administrao oral de frmacos peptdicos em emulses pode ser vantajosa por diversas razes. As emulses leo em gua (o/w) permitem superar a baixa solubilidade aquosa de peptdios lipoflicos, como a ciclosporina, enquanto que as emulses gua em leo (w/ o) protegem os peptdios hidroflicos dissolvidos na fase interna contra a destruio enzimtica pelos fluidos do trato GI. Neste ltimo caso, a absoro reduzida porque o frmaco dissolvido permanece envolvido e protegido pela fase oleosa. Porm, na presena de lipases e sais biliares h aumento significativo da absoro motivado pela degradao da fase oleosa (Trenktrog, Muller, Seifert, 1995). As emulses mltiplas gua em leo em gua (w/ o/w) so sistemas vesiculares aquosos constitudos por gotas de leo dispersas, que, por sua vez, contm gotas aquosas ainda mais pequenas, nos quais o frmaco encapsulado na fase interna para ser protegido contra a protelise (Matsuzawa et al., 1995). As microemulses so sistemas quaternrios contendo mistura de tensoativo/co-tensoativo, que, quando

Liberao especfica no clon

A protelise no clon mais baixa do que ao nvel do leo. Contudo, o tempo de residncia no clon cerca de 10 vezes superior e os processos de absoro so mais lentos. Como resultado, a exposio s enzimas proteolticas mais prolongada no clon, mesmo que a atividade seja inferior. O clon saudvel pode ser considerado como um depsito, no qual os nutrientes no absorvidos, e a gua, bem como a matria de excreo, se acumulam por perodos longos. Por esta razo, para algumas molculas, o clon comporta-se como um reservatrio homogneo, que proporciona absoro constante de frmaco. Alm disso, a baixa taxa de turnover de muco e a baixa sensibilidade a estmulos de secreo fazem do clon um local mais apropriado para a mucoadeso do que o estmago e jejuno (Rubinstein et al., 1997). A liberao especfica de peptdios e protenas no clon pode ser conseguida por intermdio de sistemas base de polmeros, que apresentam diferentes mecanismos de decomposio. O modo mais simples de conseguir uma libera-

134

C. Silva, A. Ribeiro, D. Ferreira, F. Veiga

o no clon consiste em utilizar um revestimento entrico estvel para os valores de pH do estmago e do intestino delgado e com espessura suficiente para prevenir a difuso nestas zonas do trato GI. Nos sistemas de liberao controlados pelo tempo (time-clock systems), o frmaco liberado a intervalo de tempo especfico, com base no tempo de trnsito esperado para o sistema atingir o clon. O tempo que antecede a liberao do frmaco controlado pela espessura de uma camada hidrofbica (por exemplo, monoestearato de glicerol ou leo de rcino) ou de uma camada de um polmero hidroflico como a hidroxipropilmetilcelulose. Estas duas abordagens no garantem que a liberao se faa especificamente no clon, devido s grandes variaes no tempo de trnsito e pH intestinais, de acordo com a dieta, ingesto de alimentos e motilidade intestinal (Rubinstein et al., 1997; Tozaki et al., 1997). Alternativamente, possvel recorrer a polmeros azo-biodegradveis (azopolmeros) e a polissacardeos. Os azopolmeros so hidrogis reticulados com grupos azo-aromticos, que protegem os frmacos nos meios gstrico e intestinal. Quando a formulao chega ao clon, a microflora local reduz as ligaes azo, quebrando a reticulao do filme polimrico, e permite a liberao do frmaco (Tozaki et al., 2001). O grau de entumescimento destes polmeros aumenta proporcionalmente com o pH no trato GI, sendo mais importante do que a natureza das ligaes azo nas caractersticas da degradao (Rubinstein et al., 1997). A utilizao de polissacardeos baseia-se na existncia, no clon, de quantidades significativas de polissacaridases, -D-glucosidase, -D-galactosidase, amilase, pectinase, xilanase, -D-glucosidase e dextranases. Os polissacardeos utilizados podem ser sintticos ou naturais e, neste caso, a sua hidrossolubilidade e propriedades entumescentes podem ser reduzidas para que a degradao especfica no clon no seja afetada, mantendo a especificidade das enzimas do clon para os polmeros. So candidatos a este propsito a pectina, goma de guar, dextranos, amilose e sulfato de condroitina (Rubinstein et al., 1997). A pectina reticulada com cloreto de clcio forma o pectinato de clcio, um polmero insolvel e hidroflico, que se mostra promissor como transportador de protenas para liberao no clon (Sriamornsak, 1998). Os veculos polimricos, alm das suas caractersticas de degradao especficas, tambm devero ser capazes de proteger o frmaco da protelise, o que pode ser conseguido por incorporao de inibidores das enzimas proteolticas na formulao ou por utilizao de polmeros inibidores de peptidases, especificamente, os polmeros acrlicos reticulados Carbopol (carbomer) e polycarbophil. Pela sua elevada entumescncia, a disperso em soluo aquo-

sa destes polmeros ocorre em poucos minutos, sendo adequado incorporar outros polmeros (hidrofbicos) de forma a controlar a taxa de eroso e minimizar o efeito na barreira de difuso (Bai, Chang, Guo, 1995). A quitosana tambm pode ser til como veculo de peptdios especificamente para o clon. A sua desintegrao especfica poder ser devida a diminuio do pH no clon ascendente, em comparao com o leo terminal, ou presena de enzimas bacterianas capazes de degradar o polissacardeo (Tozaki et al., 1997).

Transcitose mediada pelo receptor

A transcitose mediada pelo receptor uma abordagem eficaz na liberao especfica de protenas e peptdios atravs de barreiras celulares com a vantagem de, ao contrrio dos promotores de absoro, no alterar a estrutura das membranas ou das junes paracelulares. Entre vrios receptores, o receptor da transferrina (Tfr) apresenta-se como bom candidato porque a transferrina (Tf) resistente digesto trptica e quimotrptica (Xia, Wang, Shen, 2000). A conjugao de um peptdio com a Tf permite, efetivamente, o transporte atravs das clulas epiteliais intestinais (Shah, Shen, 1996). Sistemas bioadesivos A utilizao de sistemas bioadesivos na liberao controlada de frmacos aumenta o tempo de permanncia do frmaco no local de absoro, diminuindo a frequncia de administrao, e intensifica o contato com a mucosa epitelial. Esta maior intimidade com a mucosa origina um gradiente de concentrao, que favorece a absoro de frmacos pouco solveis e minimiza a eliminao prsistmica de frmacos suscetveis degradao, como os peptdios e as protenas (Lueben et al., 1994; BernkopSchnurch, 1998; Lehr, 2000). Os polmeros bioadesivos distinguem-se em dois tipos: aqueles que aderem camada de muco que cobre o epitlio intestinal, designados por mucoadesivos, e aqueles que aderem especificamente membrana celular, designados por citoadesivos ou de segunda gerao. Os polmeros citoadesivos englobam as lectinas, que interagem especificamente com a membrana celular, sendo independentes do turnover do muco (Lehr, 2000). Existem duas grandes classes de polmeros mucoadesivos, os derivados aninicos do cido poliacrlico e as quitosanas, carregados positivamente (Lehr et al., 1992). Pelo fato de interagirem com a camada de muco, o tempo mximo que estes polmeros podem permanecer ligados ao tecido mucoso intestinal limitado pelo tempo

Administrao oral de peptdios e protenas

135

de turnover da camada de muco, que foi estimado entre 47 e 270 minutos (Lehr, 1991). Embora este fator fisiolgico seja determinante na eficcia dos sistemas mucoadesivos foram descobertas outras propriedades, mencionadas a seguir, que impulsionam o interesse por estes polmeros. Os polmeros poliacrlicos, carbmero e policarbofil, tm propriedades inibitrias da atividade proteoltica das enzimas intestinais tripsina, a-quimotripsina, carboxipeptidases A e B e leucina aminopeptidase citoslica. Esta ao no compartilhada pelas quitosanas (Lueben et al., 1996; Lueben et al., 1997). A principal razo apontada para este efeito inibitrio so as fortes propriedades complexantes de catons bivalentes, como os ons Ca2+ e Zn2+, cofatores das enzimas inibidas. Esta complexao dependente do pH, aumentando para valores de pH compreendidos entre 4 e 6 (Lueben et al., 1996). A atividade inibitria da degradao proteoltica de frmacos peptdicos, no clon, tambm foi atribuda capacidade dos polmeros poliacrlicos em reduzir o pH do lmen (Bai, Chang, Guo, 1995). Os conjugados de quitosana-EDTA exibem propriedades mucoadesivas e tambm apresentam um efeito inibitrio da atividade enzimtica de proteases dependentes de Zn2+, como a aminopeptidase N e carboxipeptidase A, devido capacidade de complexao com catons multivalentes (Bernkop-Schnurch, 1998). Por outro lado, ambas as classes de polmeros mostraram-se capazes de promover o transporte paracelular. Os derivados poliacrlicos, provavelmente, atuam por depleo de ons de Ca2+ extracelular (Borchard et al., 1996), enquanto que as quitosanas promovem a abertura das junes paracelulares devido interao dos seus grupos amino, carregados positivamente, com grupos silicos, carregados negativamente, das glicoprotenas ligadas membrana (Artursson et al., 1994). A induo do transporte paracelular mais acentuada com a quitosana, mas a atividade protetora contra a degradao proteoltica exibida pelo policarbofil faz com que o efeito final, no aumento do transporte de frmacos peptdicos atravs do tecido intestinal, seja semelhante para os dois polmeros (Lueben et al., 1997). Os alginatos tambm possuem propriedades mucoadesivas, que mostraram ser superiores s do poliestireno, quitosana, carboximetilcelulose e cido poliltico (Chickering, Jacob, Mathiowitz, 1992; Chickering, Mathiowitz, 1995). Devido aos seus grupos carboxlicos, os alginatos so classificados como polmeros mucoadesivos aninicos (Gombotz, Wee, 1998). Combinao de estratgias A combinao de diferentes estratgias prtica comum para obter maior biodisponibilidade oral de

frmacos peptdicos e proticos. freqente combinar estratgias, que permitam ultrapassar simultaneamente as barreiras intestinais enzimtica e fsica, como por exemplo, a combinao de um inibidor enzimtico e um promotor da absoro (Geary, Schlameus, 1993) ou a incorporao de inibidores das enzimas proteolticas e/ou promotores de absoro em partculas polimricas (Morishita et al., 1992b), emulses (Suzuki et al., 1998) ou sistemas de liberao no clon (Hosny et al., 1998). O efeito inibitrio da atividade proteoltica exercido pelos polmeros mucoadesivos, especificamente, derivados poliacrlicos e quitosana-EDTA, pode ser melhorada pela ligao covalente a inibidores enzimticos (Bernkop-Schnurch, 1998). As propriedades mucoadesivas dos polmeros conjugados no so influenciadas pelas modificaes qumicas. A imobilizao dos inibidores em matrizes no-absorvveis permite um contato mais ntimo e prolongado com a membrana intestinal, o que apresenta vantagens: diminuio da distncia entre o sistema de administrao e a membrana absorvente, minimizando a eliminao pr-sistmica do frmaco polipeptdico; concentrao dos inibidores ligados covalentemente no sistema de liberao evitando o efeito de diluio e, conseqentemente, os distrbios na digesto das protenas nutritivas e os efeitos txicos sistmicos e reduo da quantidade de inibidor co-administrado por excluso dos efeitos de diluio (Bernkop-Schnurch, 1998).

ESCOLHA DE UMA ESTRATGIA

As abordagens que permitem proteger peptdios e protenas contra a protelise (Tabela III) incluem: - co-administrao de inibidores das proteases, - modificao qumica da molcula de frmaco para reduzir a ao proteoltica das enzimas presentes no trato GI, - encapsulao em pequenas partculas ou utilizao de emulses que transportem o frmaco at ao local de absoro, - incorporao do frmaco em sistemas bioadesivos, que aumentem o contato entre o sistema de administrao e o local de absoro, - liberao especfica em locais do trato GI com menor atividade enzimtica (liberao no clon, revestimento entrico). Por outro lado, as estratgias capazes de promover a absoro atravs da mucosa intestinal incluem: - co-administrao de promotores como os sais biliares ou outros agentes capazes de abrir as junes paracelulares,

136

C. Silva, A. Ribeiro, D. Ferreira, F. Veiga

- modificao qumica da molcula de frmaco para aumentar a sua lipofilicidade, - encapsulao em partculas polimricas ou lipossomas que promovam a absoro atravs das junes paracelulares ou por endocitose, - incluso do frmaco em sistemas bioadesivos, que aumentem o tempo de contato entre o frmaco e o local de absoro, - utilizao de microdisperses lipdicas para tirar partido da via transcelular de transporte de lipdios e - liberao targeting em locais de maior absoro (transcitose mediada pelo receptor). De menos relevo que a proteo contra a protelise ou a promoo da absoro a diminuio da instabilidade qumica e fsica do frmaco, que pode ser conseguida pela co-administrao de determinados promotores, especificamente, os tensoativos, ou por modificao qumica da molcula. A probabilidade de aumentar a biodisponibilidade oral de um frmaco peptdico pode aumentar pela combinao das diferentes estratgias apresentadas, mas tambm se houver mtodos, que, simultaneamente, protejam contra a degradao e promovam a absoro. A microencapsulao, sendo um mtodo verstil para administrar frmacos, enquadra-se nesta ltima situao. A versatilidade resulta das tcnicas de preparao e polmeros utilizados, o que permite que para cada molcula de frmaco possa existir um processo de formulao adequado. Por outro lado, a microencapsulao tambm pode ser combinada com praticamente qualquer outra estratgia (inibidores da protelise, promotores da absoro, modificao qumica, sistemas de liberao targeting, sistemas bioadesivos), aumentando as hipteses de eficcia.

CONCLUSO
Os frmacos peptdicos assumem papel importante como agentes teraputicos no controle de diversas doenas, que, muitas vezes, requerem tratamentos prolongados. A administrao oral , pela facilidade de aplicao, convenincia e aceitao, via privilegiada, mas a sua potencial utilidade est dependente, sobretudo, da superao das barreiras enzimtica e fsica presentes nas vias de administrao no-parenteral. A combinao de vrias estratgias, atuando simultaneamente para circunscrever as barreiras absoro, poder ser vantajosa. A microencapsulao, que inerentemente uma combinao de estratgias, mostra-se uma alternativa vlida, pois as micropartculas protegem os frmacos da degradao proteoltica e, dependendo da natureza das partculas utilizadas (tipo de polmero, tamanho, adjuvantes), estes sistemas podem tambm promover a absoro de peptdios e protenas por diferentes mecanismos. A combinao da microencapsulao com outras estratgias tambm possvel. Na segunda parte desta reviso, sero descritos os diversos mtodos de microencapsulao e a sua aplicao na administrao oral de peptdios e protenas.

ABSTRACT
Oral delivery system for peptides and proteins: I. Approaches to improve oral bioavailability There are hundreds of peptides and proteins clinically relevant. The difficulties associated with their oral administration have been responsible for the major efforts in developing ways to improve oral bioavailability. Both

TABELA III - Obstculos passveis de serem ultrapassados pelas vrias estratgias Estratgia Proteo contra a protelise Promoo da absoro Diminuio das instabilidades qumica e fsica

Inibidores das proteases Promotores da absoro Modificao qumica Encapsulao em sistemas de partculas Emulses Liberao no clon Revestimento entrico Transcitose mediada pelo receptor Sistemas bioadesivos

Administrao oral de peptdios e protenas

137

these subjects are described in this review. The potentiality of microencapsulation presents this technique as a privileged approach for the oral delivery of peptide and protein drugs. UNITERMS: Absorption enhancer. Formulation. Microencapsulation. Peptide drugs. Protease inhibitors.

BERNKOP-SCHNURCH, A. The use of inhibitory agents to overcome the enzymatic barrier to perorally administered therapeutic peptides and proteins. J. Control Release, Amsterdam, v. 52, p. 1-16, 1998. BERNKOP-SCHNURCH, A., VALENTA, C., DAEE, S. M. Peroral polypeptide delivery. A comparative in vitro study of mucolytic agents. Arzneimittelforschung, Aulendorf, v. 49, p. 799-803, 1999. BORCHARD, G., LUEBEN, H. L., DE BOER, A. G., VERHOEF, J. C., LEHR, C.-M., JUNGINGER, H. E. The potencial of mucoadhesive polymers in enhancing intestinal peptide drug absorption. III: Effects of chitosanglutamate and carbomer on epithelial tight junctions in vitro. J. Controlled Release, Amsterdam, v. 39, p. 131138, 1996. BUNDGAARD, H. The utility of the prodrug approach to improve peptide absorption. J. Controlled Release, Amsterdam, v. 21, p. 63-72, 1992. BURKE, P. A. Controlled release protein therapeutics: Effects of process and formulation on stability. In: WISE, D. L., ed. Handbook of pharmaceutical controlled release technology. New York: Marcel-Dekker, 2000. p. 661-692. CARINO, G. P., MATHIOWITZ, E. Oral insulin delivery. Adv. Drug Deliv. Rev., Amsterdam, v. 35, p. 249-257, 1999. CHEN, H., LANGER, R. Oral particulate delivery: status and future trends. Adv. Drug Deliv. Rev., Amsterdam, v. 34, p. 339-350, 1998. CHEN, T. Formulation concerns of protein drugs. Drug Dev. Ind. Pharm., New York, v. 18, p. 1311-1354, 1992. CHICKERING, D. E., JACOB, P., MATHIOWITZ, E. A tensile technique to evalute the interaction of bioadhesive microspheres with intestinal mucosa. Proc. Int. Symp. Control Release Bioact. Mater., v. 19, p. 88-89, 1992. CHICKERING, D. E., MATHIOWITZ, E. Bioadhesive microspheres: I. A novel electrobalance-based method to study adhesive interactions between individual microspheres and intestinal mucosa. J. Controlled Release, Amsterdam, v. 34, p. 251-261, 1995.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
ADSON, A., RAUB, T. J., BURTON, P. S., BARSUHN, C. L., HILGERS, A. R. Quantitative approaches to delineate paracellular diffusion in cultured epithelial cell monolayers. J. Pharm. Sci., Washington, v. 83, p. 1529-1536, 1994. AL ACHI, A., GREENWOOD, R. Erythrocytes as oral delivery systems for human insulin. Drug Dev. Ind. Pharm., New York, v. 24, p. 67-72, 1998. ALLEMANN, E., LEROUX, J. C., GURNY, R. Polymeric nano- and microparticles for the oral delivery of peptides and peptidomimetics. Adv. Drug Deliv. Rev., Amsterdam, v. 34, p. 171-189, 1998. ALPAR, H. O., EYLES, J. E., WILLIAMSON, E. D. Oral and nasal immunization with microencapsulated clinically relevant proteins. STP Pharma. Sci., Paris, v. 8, p. 31-39, 1998. ANDERBERG, E. K., LINDMARK, T., ARTURSSON, P. Sodium caprate elicits dilatations in human intestinal tight junctions. Pharm. Res., Stuttgart, v. 10, p. 857-864, 1993. ARTURSSON, P. Cell cultures as models for intestinal peptide transport. STP Pharma. Sci., Paris, v. 3, p. 5-10, 1993. ARTURSSON, P., LINDMARK, T., DAVIS, S. S., ILLUM, L. Effect of chitosan on the permeability of monolayers of intestinal epithelial cells (Caco-2). Pharm. Res., Stuttgart, v. 11, p. 1358-1361, 1994. BAI, J. P., CHANG, L. L., GUO, J. H. Effects of polyacrylic polymers on the lumenal proteolysis of peptide drugs in the colon. J. Pharm. Sci., Washington, v. 84, p. 12911294, 1995. BERNKOP SCHNURCH, A., FRAGNER, R. Investigations into difusion behaviour of polypeptides in native intestinal mucus with regard to their peroral administration. Pharm. Sci., v. 2, p. 361, 1996.

138

C. Silva, A. Ribeiro, D. Ferreira, F. Veiga

COUVREUR, P., DUBERNET, C., PUISIEUX, F. Controlled drug delivery with nanoparticles: current possibilities and future trends. Eur. J. Pharm. Biopharm., Stuttgart, v. 41, p. 2-13, 1995. DESAI, M. P., LABHASETWAR, V., AMIDON, G. L., LEVY, R. J. Gastrointestinal uptake of biodegradable microparticles: effect of particle size. Pharm. Res., Stuttgart, v. 13, p. 1838-1844, 1996. ELDRIDGE, J. H., HAMMOND, C. J., MEULBROEK, J. A., STAAS, J. K., GILLEY, R. M., TICE, T. R. Controlled vaccine in the gut-associated lymphoid tissues. I. Orally administered biodegradable microspheres target the payers patches. J. Controlled Release, Amsterdam, v. 11, p. 205-214, 1990. FIX, J. A. Oral controlled release technology for peptides: status and future prospects. Pharm. Res., Stuttgart, v. 13, p. 1760-1764, 1996a. FIX, J. A. Strategies for delivery of peptides utilizing absorption-enhancing agents. J. Pharm. Sci., Washington, v. 85, p. 1282-1285, 1996b. FLORENCE, A. T. The oral absorption of micro- and nanoparticulates: neither exceptional nor unusual. Pharm. Res., Stuttgart, v. 14, p. 259-266, 1997. GEARY, R. S., SCHLAMEUS, H. W. Vancomycin and insulin used as models for oral delivery of peptides. J. Controlled Release, Amsterdam, v. 23, p. 65-74, 1993. GOMBOTZ, W. R., WEE, S. F. Protein release from alginate matrices. Adv. Drug Deliv. Rev., Amsterdam, v. 31, p. 267-285, 1998. HANDJANI-VILA, R. M., VANLERBERGHE, G. Les niosomes. In: BURI, P., PUISIEUX, F., DOELKER, E., BENOIT, J. P., eds. Formes pharmaceutiques nouvelles. Aspects technologique, biopharmaceutique & medical. Paris: Tecnique et documentation (Lavoisier), 1985. p. 561-575. HAYAKAWA, E., LEE, V. H. L. Aminopeptidase activity in the jejunal and ileal Peyers patches of the albino rabbit. Pharm. Res., Stuttgart, v. 9, p. 535-540, 1992. HILGERS, A. R., CONRADI, R. A., BURTON, P. S. Caco2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharm. Res., Stuttgart, v. 7, p. 902910, 1990.

HO, H. O., HSIAO, C. C., SHEU, M. T. Preparation of microemulsions using polyglycerol fatty acid esters as surfactant for the delivery of protein drugs. J. Pharm. Sci., Washington, v. 85, p. 138-143, 1996. HOCHMAN, J., ARTURSSON, P. Mechanisms of absorption enhancement and tight junction regulation. J. Controlled Release, Amsterdam, v. 29, p. 253-267, 1994. HOSNY, E. A., KHAN GHILZAI, N. M., AL NAJAR, T. A., ELMAZAR, M. M. Hypoglycemic effect of oral insulin in diabetic rabbits using pH-dependent coated capsules containing sodium salicylate without and with sodium cholate. Drug Dev. Ind. Pharm., New York, v. 24, p. 307311, 1998. IWANAGA, K., ONO, S., NARIOKA, K., MORIMOTO, K., KAKEMI, M., YAMASHITA, S., NANGO, M., OKU, N. Oral delivery of insulin by using surface coating liposomes: improvement of stability of insulin in GI tract. Int. J. Pharm., Amsterdam, v. 157, p. 73-80, 1997. JULIANO, R. L. Microparticulate drug carriers: liposomes, microspheres, and cells. In: ROBINSON, J. R., LEE, V. H. L., eds. Controlled drug delivery. Fundamentals and applications. New York: Marcel-Dekker, 1987. p. 555580. KIMURA, T., SATO, K., SUGIMOTO, K., TAO, R., MURAKAMI, T., KUROSAKI, Y., NAKAYAMA, T. Oral administration of insulin as poly(vinyl alcohol)-gel spheres in diabetic rats. Biol. Pharm. Bull., Tokyo, v. 19, p. 897-900, 1996. KOLAC, C., STREICHHAN, P., LEHR, C. M. Oral bioavailability of proteolytic enzymes. Eur. J. Pharm. Biopharm., Stuttgart, v. 42, p. 222-232, 1996. LANGGUTH, P., BOHNER, V., HEIZMANN, J., MERKLE, H. P., WOLFFRAM, S., AMIDON, G. L., YAMASHITA, S. The challenge of proteolytic enzymes in intestinal peptide delivery. J. Controlled Release, Amsterdam, v. 46, p. 39-57, 1997. LEE, V. H. L. Protease inhibitors and penetration enhancers as approaches to modify peptide absorption. J. Controlled Release, Amsterdam, v. 13, p. 213-223, 1990.

Administrao oral de peptdios e protenas

139

LEHR, C.-M. An estimate of turnover time of intestinal mucus gel layer in the rat in situ loop. Int. J. Pharm., Amsterdam, v. 70, p. 235-240, 1991. LEHR, C.-M. Lectin-mediated drug delivery: the second generation of bioadhesives. J. Controlled Release, Amsterdam, v. 65, p. 19-29, 2000. LEHR, C.-M., BOUWSTRA, J. A., SCHACHT, E. H., JUNGINGER, H. E. In vitro evaluation of mucoadhesive properties of chitosan and some other natural polymers. Int. J. Pharm., Amsterdam, v. 78, p. 43-48, 1992. LENAERTS, V. Systems for the oral delivery of peptides Proc. Formulation of poorly-available drugs for oral administration. Paris, 1996. p. 59-65. LIPKA, E., CRISON, J., AMIDON, G. L. Transmembrane transport of peptide type compounds: prospects for oral delivery. J. Controlled Release, Amsterdam, v. 39, p. 121-129, 1996. LUEBEN, H. L., LEEUW, B. J., PRARD, D., LEHR, C.M., DE BOER, A. G., VERHOEF, J. C., JUNGINGER, H. E. Mucoadhesive polymers in peroral peptide drug delivery. I. Influence of mucoadhesive excipients on the proteolytic activity of intestinal enzymes. Eur J. Pharm. Sci., Amsterdam, v. 4, p. 117-128, 1996. LUEBEN, H. L., LEHR, C.-M., RENTEL, C.-O., NOACH, A. B. J., DE BOER, A. G., VERHOEF, J. C., JUNGINGER, H. E. Bioadhesive polymers for the peroral delivery of peptide drugs. J. Control Release, Amsterdam, v. 29, p. 329-338, 1994. LUEBEN, H. L., RENTEL, C.-O., KOTZE, A. F., LEHR, C.M., DE BOER, A. G., VERHOEF, J. C., JUNGINGER, H. E. Mucoadhesive polymers in peroral peptide drug delivery. IV. Polycarbophil and chitosan are potent enhancers of peptide transport across intestinal mucosae in vitro. J. Controlled Release, Amsterdam, v. 45, p. 1523, 1997. MANNING, M. C., PATEL, K., BORCHARDT, R. T. Stability of protein pharmaceuticals. Pharm. Res., Stuttgart, v. 6, p. 903-918, 1989. MATSUZAWA, A., MORISHITA, M., TAKAYAMA, K., NAGAI, T. Absorption of insulin using water-in-oil-inwater emulsion from an enteral loop in rats. Biol. Pharm. Bull., Tokyo, v. 18, p. 1718-1723, 1995.

MORISHITA, I., MORISHITA, M., TAKAYAMA, K., MACHIDA, Y., NAGAI, T. Hypoglycemic effect of novel oral microspheres of insulin with protease inhibitor in normal and diabetic rats. Int. J. Pharm., Amsterdam, v. 78, p. 9-16, 1992a. MORISHITA, M., MORISHITA, I., TAKAYAMA, K., MACHIDA, Y., NAGAI, T. Novel oral microspheres of insulin with protease inhibitor protecting from enzymatic degradation. Int. J. Pharm., Amsterdam, v. 78, p. 1-7, 1992b. OKADA, J., COHEN, S., LANGER, R. In vitro evaluation of polymerized liposomes as an oral drug delivery system. Pharm. Res., Stuttgart, v. 12, p. 576-582, 1995. OKUMU, F. W., PAULETTI, G. M., VANDER VELDE, D. G., SIAHAAN, T. J., BORCHARDT, R. T. Effect of restrcited conformational flexibility on the permeation of model hexapeptides across Caco-2 cell monolayers. Pharm. Res., Stuttgart, v. 14, p. 169-175, 1997. PAULETTI, G. M., GANGWAR, S., KNIPP, G. T., NERURKAR, M. M., OKUMU, F. W., TAMURA, K., SIAHAAN, T. J., BORCHARDT, R. T. Structural requirements for intestinal absorption of peptide drugs. J. Controlled Release, Amsterdam, v. 41, p. 3-17, 1996. PAULETTI, G. M., OKUMU, F. W., BORCHARDT, R. T. Effect of size and charge on the passive diffusion of peptides across Caco-2 cell monolayers via the paracellular pathway. Pharm. Res., Stuttgart, v. 14, p. 164-168, 1997. PUTNEY, S. D. Advances in protein drug delivery. Pharmaceutical News, v. 6, 1999. ROUGE, N., DOELKER, E. Drug absorption sites in the gastrointestinal tract and dosage forms for site-specific delivery. Int. J. Pharm., Amsterdam, v. 136, p. 117-139, 1996. RUBINSTEIN, A., TIROSH, B., BALUOM, M., NASSAR, T., FRIEDMAN, M., ET AL. Rationale for peptide drug delivery to the colon and the potential of polymeric carriers as effective tools. J. Controlled Release, Amsterdam, v. 46, p. 59-73, 1997. SARCIAUX, J. M., ACAR, L., SADO, P. A. Using microemulsion formulations for oral drug delivery of therapeutic peptides. Int. J. Pharm., Amsterdam, v. 120, p. 127-136, 1995.

140

C. Silva, A. Ribeiro, D. Ferreira, F. Veiga

SCHILLING, R. J., MITRA, A. K. Intestinal mucosal transport of insulin. Int. J. Pharm., Amsterdam, v. 62, p. 53-64, 1990. SHAH, D., SHEN, W. C. Transcellular delivery of an insulintransferrin conjugate in enterocyte-like Caco-2 cells. J. Pharm. Sci., Washington, v. 85, p. 1306-1311, 1996. SHAO, Z., LI, Y., CHERMAK, T., MITRA, A. K. Cyclodextrins as mucosal absorption promoters of insulin. Part 2. Effects of beta-cyclodextrin derivatives on alpha-chymotryptic degradation and enteral absorption of insulin in rats. Pharm. Res., Stuttgart, v. 11, p. 11741179, 1994. SHAO, Z., LI, Y., KRISHNAMOORTHY, R., CHERMAK, T., MITRA, A. K. Differential effects of anionic, cationic, nonionic, and physiologic surfactants on the dissociation, alpha-chymotryptic degradation, and enteral absorption of insulin hexamers. Pharm. Res., Stuttgart, v. 10, p. 243251, 1993. SRIAMORNSAK, P. Investigation of pectin as a carrier for oral delivery of proteins using calcium pectinate gel beads. Int. J. Pharm., Amsterdam, v. 169, p. 213-220, 1998. SUZUKI, A., MORISHITA, M., KAJITA, M., TAKAYAMA, K., ISOWA, K., CHIBA, Y., TOKIWA, S., NAGAI, T. Enhanced colonic and rectal absorption of insulin using a multiple emulsion containing eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid. J. Pharm. Sci., Washington, v. 87, p. 1196-1202, 1998. TAKEUCHI, H., YAMAMOTO, H., NIWA, T., HINO, T., KAWASHIMA, Y. Enteral absorption of insulin in rats from mucoadhesive chitosan-coated liposomes. Pharm. Res., Stuttgart, v. 13, p. 896-901, 1996. TOMITA, M., SHIGA, M., HAYASHI, M., AWAZU, S. Enhancement of colonic drug absorption by the paracellular permeation route. Pharm. Res., Stuttgart, v. 5, p. 341-346, 1988. TOUITOU, E., ALHAIQUE, F., FISHER, P., MEMOLI, A., RICCIERI, F. M., SANTUCCI, E. Prevention of molecular self-association by sodium salicylate: Effect on insulin and 6-carboxyfluorescein. J. Pharm. Sci., Washington, v. 76, p. 791-793, 1987.

TOZAKI, H., KOMOIKE, J., TADA, C., MARUYAMA, T., TERABE, A., SUZUKI, T., YAMAMOTO, A., MURANISHI, S. Chitosan capsules for colon-specific drug delivery: improvement of insulin absorption from the rat colon. J. Pharm. Sci., Washington, v. 86, p. 1016-1021, 1997. TOZAKI, H., NISHIOKA, J., KOMOIKE, J., OKADA, N., FUJITA, T., MURANISHI, S., KIM, S. I., TERASHIMA, H., YAMAMOTO, A. Enhanced absorption of insulin and (Asu(1,7))eel-calcitonin using novel azopolymer-coated pellets for colon-specific drug delivery. J. Pharm. Sci., Washington, v. 90, p. 89-97, 2001. TRENKTROG, T., MULLER, B. W., SEIFERT, J. In vitroinvestigation into the enhancement of intestinal peptide absorption by emulsion systems. Eur. J. Pharm. Biopharm., Stuttgart, v. 41, p. 284-290, 1995. UCHIYAMA, T., SUGIYAMA, T., QUAN, Y. S., KOTANI, A., OKADA, N., FUJITA, T., MURANISHI, S., YAMAMOTO, A. Enhanced permeability of insulin across the rat intestinal membrane by various absorption enhancers: their intestinal mucosal toxicity and absorption-enhancing mechanism of n-lauryl-beta-D-maltopyranoside. J. Pharm. Pharmacol., London, v. 51, p. 1241-1250, 1999. WATSON, C. J., ROWLAND, M., WARHURST, G. Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers. Am. J. Physiol. Cell Physiol., v. 281, p. C388-C397, 2001. XIA, C. Q., WANG, J., SHEN, W. C. Hypoglycemic effect of insulin-transferrin conjugate in streptozotocin-induced diabetic rats. J. Pharmacol. Exp. Ther., Baltimore, v. 295, p. 594-600, 2000. YOSHIDA, H., LEHR, C.-M., KOK, W., JUNGINGER, H. E., VERHOEF, J. C., BOUWSTRA, J. A. Niossomes for oral delivery of peptide drugs. J. Controlled Release, Amsterdam, v. 21, p. 145-154, 1992. ZHOU, X. H. Overcoming enzymatic and absorption barriers to nonparenterally administered protein and peptide drugs. J. Controlled Release, Amsterdam, v. 29, p. 239-252, 1994. ZHOU, X. H., LI WAN PO, A. Peptide and protein drugs: I. Therapeutic applications, absorption and parenteral administration. Int. J. Pharm., Amsterdam, v. 75, p. 97115, 1991. Recebido para publicao em 23/04/02.