UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

Q.F.B. Luca Bailn Lira Q.F.B. Roberto Cruz Gonzlez Melndez M. en C. Armando Cervantes Sandoval
2003. Universidad Nacional Autnoma de Mxico
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CONTENIDO
Pgina Introduccin Generalidades de bacterias Morfologa y estructura Nutricin Quimiohetertrofos Auttrofos Fotoauttrofos Fotohetertrofos Reproduccin Transformacin Conjugacin Transduccin Identificacin bacteriana Medios de cultivo Medios bsicos Medios enriquecidos Medios selectivos, diferenciales y de enriquecimiento Medios especiales Clasificacin por consistencia Slidos Semislidos Lquidos Clasificacin por composicin Sintticos No sintticos 7 9 9 10 12 12 12 12 13 14 14 15 16 16 18 19 20 22 23

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Tcnicas de inoculacin En placa Estra cruzada Estra en Z Estra simple Siembra masiva Vaciado en placa En tubo: medio semislido Siembra en medios lquidos En tubo: medios slidos Incubacin de los medios Morfologa colonial Identificacin basada en caractersticas metablicas: Pruebas bioqumicas Fermentacin de carbohidratos Prueba de citrato Licuefaccin de gelatina Prueba de leche con tornasol Reduccin de leche con azul de metileno Prueba de fermentacin y oxidacin (O/F) Prueba de ureasa Prueba de Voges - Proskauer Prueba de rojo de metilo Reduccin de nitratos Prueba de fenilalanina Sulfuro, indol y movilidad: SIM Agar hierro triple azcar: TSI Agar lisina hierro: LIA Movilidad, indol y ornitina: MIO

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27 28 29 30 31 35 35 42 48 52 59 63 69 73 78 82 87 92 102 112 116

Metabolismo Produccin de energa Va de degradacin de las hexosas Gluclisis Entner-Duodoroff Pentosa fosfato Ciclo de Krebs Fermentacin Lctica Heterolctica Alcohlica Propinica cido mixta (frmica) De metano Butilenglucoltica (acetonica) Respiracin anaerbica con aceptores inorgnicos de hidrgeno Fijacin de nitrgeno Reduccin de sulfatos Mtodos para el aislamiento e identificacin de bacterias Enterobacterias Coprocultivo Familia Micrococaceae Estafilococos Estreptococos Urocultivo Hemocultivo Exudado faringeo Referencias Direcciones electrnicas

125 128 130 134 135 139 142 143 144 144 146 147 148 148 149 149 151

153 155 157 158 160 162 163 164 165 168

NDICE DE FIGURAS
No. 1 2 3 4 5 6 Figura Morfologa bacteriana Formas de nutricin de bacterias Reproduccin bacteriana Reproduccin bacteriana: Transformacin Reproduccin bacteriana: Conjugacin Superficie de placas de agar EMB que ilustra el brillo verde producido por miembros de las Enterobacterias que fermentan vidamente lactosa: Escherichia coli. Placa de agar soya - tripticasa, inoculado con una bacteria que produce un pigmento amarillo. La produccin de pigmento es una importante caracterstica diferencial para identificar bacilos Gram negativos no fermentadores. Superficie de placas de agar EMB que ilustra cultivo mixto de Escherichia coli y Shigella sp. Morfologa colonial en agar sangre. Superficie de placas de agra EMB que ilustra el brillo verde producido por Escherichia coli. Agar BCYE Streptococcus sp. Pruebas bioqumicas: Fermentacin de carbohidratos Pruebas bioqumicas: Citrato Pruebas bioqumicas: Licuefaccin de gelatina Micrococcus sp Pruebas bioqumicas: Leche con tornasol Pruebas bioqumicas: Leche con azul de metileno Salmonella sp. Pruebas bioqumicas: Oxidacin/fermentacin Interpretacin O/F Pruebas bioqumicas: Urea Salnonella typhi Pruebas bioqumicas: Voges - Proskauer Escherichia coli Pruebas bioqumicas: Rojo de metilo Escherichia coli, observese pili Pruebas bioqumicas: Reduccin de nitratos Pruebas bioqumicas: Fenilalanina desaminasa Salmonella typhi Pruebas bioqumicas: SIM Salmonella typhi Escherichia coli Pruebas bioqumicas: TSI Salmonella sp. Fundamento: TSI Pruebas bioqumicas: LIA Pruebas bioqumicas: MIO Shigella Produccin de quesos Produccin de vino Referencia Enciclopedia Encarta, 2002 Enciclopedia Encarta, 2002 Enciclopedia Encarta, 2002 Enciclopedia Encarta, 2002 Enciclopedia Encarta, 2002 Koneman, 1992 Pg. 9 11 13 14 15 16

Koneman, 1992

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8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41

Koneman, 1992 Enciclopedia Encarta, 2002 Koneman, 1992 Koneman,1992 Museun of History Natural

19 20 21 31 37 38 45 50 51 57 61 62 66 67 71 72 76 77 80 81 85 91 96 99 101 101 107 107 110 114 121 124 144 145

Sullivan, 2002

Enciclopedia Encarta, 2002

Enciclopedia Encarta, 2002 Prskznki, 2002

University of east Anglia Norwich, 2002

Pfeizer, 2002

Koneman, 2002

Museum of History Natural, 2002 Black, 1996 Black, 1996

ndice de Tablas
No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Tabla Reporte de resultados: prueba de oxidacin y fermentacin Reporte de resultados: Sulfuro, indol y movilidad (SIM) Aplicaciones: SIM Aplicaciones: TSI Aplicaciones: LIA Reporte de resultados: MIO Aplicaciones: MIO Caractersticas bioqumicas de bacilos Gram negativos Caractersticas bioqumicas de la Familia Micrococcaeae Caractersticas bioqumicas de Staphylococcus Caractersticas bioqumicas de Streptococcus Pg. 68 98 101 111 115 123 124 154 157 159 161

ndice de Esquemas
No. 1 2 3 4 5 6 7 8 Esquema Gluclisis Va de Hexosa monofosfato Ciclo de Krebs Coprocultivo Aislamiento de bacterias patgenas de heces Aislamiento de Staphylococcus Urocultivo Exudado faringeo Pgina 133 138 141 155 156 158 162 164

Introduccin
Como estudiante la licenciatura de Q.F.B. la cual abarca en gran parte el estudio bacteriolgico he observado que la mayora de las veces, los alumnos al realizar las pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias no tienen un conocimiento real o suficiente de los principios o bases para realizarlas as como las precauciones e inconvenientes que se presentan en cada prueba bioqumica. Para poder conocer los principios, bases bioqumicas, mtodos, aplicaciones, interpretacin y precauciones as como los resultados esperados en cada prueba es necesario a menudo recurrir a muchas referencias bibliogrficas y publicaciones que no siempre se encuentran a disposicin de los alumnos o microbilogos en general. En este atlas de pruebas bioqumicas se han seleccionado las pruebas que se utilizan a lo largo de la licenciatura de Qumico Farmacutico Bilogo en la Facultad de Estudios Superiores Zaragoza. Por lo tanto el usuario encontrar la informacin suficiente y necesaria pero sobre todo, sencilla y amena de cada prueba, su principio fundamental, bases bioqumicas, medios de cultivo, reactivos empleados, resultados, interpretacin, reporte de resultados, precauciones y observaciones, tcnicas de inoculacin y condiciones de incubacin as como referencias bibliogrficas. Estas han sido reunidas al final para permitir, cuando se desee una profundizacin acerca de un aspecto determinado de algn
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tema, donde se podr tambin observar diferentes imgenes de algunas especies bacterianas. En las ilustraciones a color de los resultados de cada prueba tambin se incluyen medios no inoculados para una mejor y mayor comparacin para los lectores. Antes de la parte dedicada a la explicacin de las bases para cada prueba bioqumica se encontrarn tambin clasificaciones concretas y ejemplos de los medios de cultivo, as como las tcnicas de inoculacin ms empleadas. No se ha tratado de simplificar en exceso (pero tampoco se ha profundizado en cada prueba), sino de hacer que este atlas resulte til especialmente para los estudiantes no solo de la licenciatura de Q.F.B., sino tambin para otras carreras, laboratorios de anlisis clnicos y por que no, para otras instituciones. Este atlas de colores y texto de microbiologa ha sido descrito con el objeto de proporcionar a estudiantes de microbiologa, tecnlogos mdicos, residentes de patologa y otros interesados en microbiologa clnica, una introduccin prctica a la identificacin de laboratorio de los agentes microbianos asociados con enfermedades infecciosas y de las pruebas bioqumicas ms empleadas o las mnimas necesarias para su identificacin.

Figura 1. Morfologa bacteriana 1.

Morfologa y estructura.
Las bacterias son microorganismos procariotas de organizacin muy sencilla. La clula bacteriana consta de: !" Citoplasma. Presenta un aspecto viscoso, y en su zona central aparece un nucleoide que contiene la mayor parte del ADN bacteriano, y en algunas bacterias aparecen fragmentos circulares de ADN con informacin gentica, dispersos por el citoplasma: son los plsmidos.

membrana plasmtica !" presenta La invaginaciones, que son los mesosomas, donde se encuentran enzimas que intervienen en la y los pigmentos sntesis de ATP, fotosintticos en el caso de bacterias fotosintticas. En el citoplasma se encuentran inclusiones de diversa naturaleza qumica.
!"Muchas bacterias pueden presentar flagelos generalmente rgidos, implantados en la membrana mediante un corpsculo basal. Pueden poseer tambin, fimbrias o pili muy numerosos y cortos, que pueden servir como pelos sexuales para el paso de ADN de una clula a otra. !"Poseen ARN y ribosomas caractersticos, para la sntesis de protenas. !"Pared celular rgida y con molculas exclusivas de bacterias.

2.

Nutricin

El xito evolutivo de las bacterias se debe en parte a su versatilidad metablica. Todos los mecanismos posibles de obtencin de materia y energa podemos encontrarlos en las bacterias.

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Segn la fuente de carbono que utilizan, los seres vivos se dividen en auttrofos, cuya principal fuente de carbono es el CO2, y hetertrofos cuando su fuente de carbono es materia orgnica. Por otra parte segn la fuente de energa, los seres vivos pueden ser fottrofos, cuya principal fuente de energa es la luz, y los organismos quimiotrofos, cuya fuente de energa es un compuesto qumico que se oxida.

Figura 2. Formas de nutricin de las bacterias

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Atendiendo a las anteriores categoras, entre las bacterias podemos encontrar las siguientes formas, como puede apreciarse en el esquema:

quimiohetertrofas, utilizan un bacterias 1. Las compuesto qumico como fuente de carbono, y a su vez, este mismo compuesto es la fuente de energa. La mayor parte de las bacterias cultivadas en laboratorios y las bacterias patgenas son de este grupo.

2. Las bacterias quimioauttrofas, utilizan compuestos inorgnicos reducidos como fuente de energa y el CO2 como fuente de carbono. Como por ejemplo, Nitrobacter yThiobacillus.

3. Las bacterias fotoauttrofas, utilizan la luz como fuente de energa y el CO2 como fuente de carbono. Bacterias purpreas.

4. Las bacterias fotohetertrofas, utilizan la luz como fuente de energa y biomolculas como fuente de carbono. Ejemplos como Rhodospirillum y Chloroflexus.

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3.

Reproduccin
Generalmente las bacterias se reproducen biparticin, como se ve en el siguiente esquema: por

Figura 3. Reproduccin bacteriana

Tras la duplicacin del ADN, que esta dirigida por la ADNpolimerasa que se encuentra en los mesosomas, la pared bacteriana crece hasta formar un tabique transversal separador de las dos nuevas bacterias. Pero adems de este tipo de reproduccin asexual, las bacterias poseen unos mecanismos de reproduccin sexual o parasexual, mediante los cuales se intercambian fragmentos de ADN. Este tipo de reproduccin puede realizarse por:

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!" TRANSFORMACION: Consiste en el intercambio gentico producido cuando una bacteria es capaz de captar fragmentos de ADN, de otra bacteria que se encuentran dispersos en el medio donde vive.

Figura 4. Reproduccin bacteriana: Transformacin

!" CONJUGACIN: En este proceso, una bacteria donadora F+ transmite a travs de un puente o pili, un fragmento de ADN, a otra bacteria receptora F-. La bacteria que se llama F+ posee un plsmido, adems del cromosoma bacteriano.

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Figura 5. Reproduccin bacteriana: Conjugacin

!" TRANSDUCCIN: En este caso la transferencia

de ADN de una bacteria a otra, se realiza a travs de un virus bacterifago, que se comporta como un vector intermediario entre las dos bacterias.
(Biblioteca de Consulta Microsoft Encarta 2002. 1993-2001 Microsoft Corporation.)

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En la naturaleza los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas de una gran variedad de tipos diferentes. Sin embargo, el desarrollo de la microbiologa se ha conseguido mediante el estudio de especies aisladas, crecidas en medios desprovistos de cualquier otra forma de vida contaminante. Los microorganismos necesitan nutrientes apropiados as como condiciones ambientales favorables. En primer lugar el medio de cultivo debe contener aquellos nutrientes esenciales para el crecimiento de una determinada especie. Como la mayor parte de los estudios en el laboratorio se realizan los cultivos puros (una sola especie bacteriana), se debe esterilizar el medio de cultivo y mantenerlo en condiciones estriles hasta que sea utilizado.

Un medio de cultivo es cualquier sustancia que puede ser usada para el cultivo de microorganismos, puede ser llamada un medio o, dicho con mayor precisin un medio de cultivo.
Figura 6. Crecimiento de Escherichia coli en agar EMB

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Los medios sirven para dos propsitos principales: a) Fomentar el crecimiento microbiano en forma que puedan comprobarse las caractersticas de cultivo. b) Facilitar algunas reacciones bioqumicas que luego puedan ser demostrables por observacin directa, o bien, indirectamente por la reaccin en presencia de algunos reactivos adicionales. Todas las reacciones de cultivo as como las bioqumicas, dependen de la composicin del medio y de la naturaleza del cultivo que se estudie. Los medios de cultivo se pueden clasificar en cuatro tipos diferentes: 1. Medios bsicos 2. Medios enriquecidos 3. Medios selectivos, diferenciales y de enriquecimiento 4. Medios especiales

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1. Medios bsicos
Solo contienen algn extracto de carne u otra infusin simple, peptona, sal y agua. El extracto o la infusin de carne proporcionan al organismo los aminocidos, vitaminas, sales, y pequeas cantidades de carbono, nitrgeno, hidrgeno y otros elementos. Las sales (usualmente cloruro de sodio) sirven para obtener isotonicidad requerida para el mantenimiento de presiones osmticas constantes. El agua sirve como disolvente, como medio de transporte, o para ambos fines (siempre se debe usar agua destilada para preparar los medios de cultivo). Los medios de cultivo que solo contienen extracto de carne, peptona, sal y agua, son lquidos; para el estudio de las caractersticas de las colonias es indispensable el uso de medios slidos. La solidificacin se consigue agregando agar, gelatina, albmina de suero o de huevo, a los otros ingredientes.

Figura 7. Agar Soya - tripticasa

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Es preferible utilizar el agar, ya que es un medio slido que no se desintegra por los medios fsicos usados en el cultivo de la mayora de los microorganismos. Ejemplos de ste tipo de medios son los siguientes: 1. Caldo y agar nutritivo 2. Caldo de triptona y soya 3. Caldo de infusin de cerebro y corazn 4. Agar de infusin de cerebro y corazn 5. Caldo de infusin de corazn 6. Agar y extracto de hgado 7. Dextrosa de Saboraud

Figura 8. Agar EMB con cultivo mixto de Escherichia coli y Shigella sp.

2. Medios enriquecidos
Son aquellos medios bsicos que han sido complementados con lquidos corporales, vitaminas especficas, aminocidos, protenas y otros nutrientes claramente definidos como tales.

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Ejemplos: 1. Agar proteosa 2. Agar sangre 3. Agar chocolate 4. Caldo de suero 5. Agar con suero 6. Suero de Loeffler con sangre

7. Medios inclinados con suero 8. Agar de Bordet Gengou 9. Medio de Levinthal 10.Agar de Mueller-Hinton infusin de 11.Agar cerebro corazn 12.Agar sangre

Figura 9. Morfologa colonial en Agar sangre

3. Medios selectivos, enriquecimiento

diferenciales

de

Los medios selectivos son usualmente medios de agar bsico, o enriquecidos, a los cuales se les han agregado ciertos reactivos que impiden el crecimiento de la mayora de las bacterias, permitiendo por lo tanto el aislamiento de unas cuantas, seleccionadas en los especimenes que contengan grandes nmeros de organismos indeseables. Los medios diferenciales son medios bsicos o enriquecidos, a los cuales se les han agregado ciertos reactivos que reaccionarn con algunos tipos especficos de bacterias en cierta forma observable.

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Los medios de enriquecimiento son por lo general medios lquidos enriquecidos, que contienen algunas sustancias inhibidoras, con lo que se crea un ambiente especialmente favorable para lmites ms bien estrechos de bacterias. Ejemplos: 1. Medio de Thayer Martin 2. Agar con feniletanol 3. Agar con sangre y bilis al 40% 4. Agar con esculina y bilis 5. Agar con sangre y telurito de Tinsdale 6. Medio modificado 7. Agar con Lowenstein Jensen en tubos inclinados 8. Agar con citrato y desoxicolato 9. Agar de sulfito de bismuto 10.Caldo selenito de sodio 11. Agar XLD ( xilosa,

lactosa, desoxicolato) 11. Agar sangre con azida 12. Agar con sal y manitol 13. Agar de Mc Conkey 14. Agar Salmonella Shigella 15. Agar con eosina y azul de metileno (EMB) 16. Agar de bilis y rojo de violeta dextrosa y 17. Agar tripticaseina 18. Agar entrico Hektoen 19. Agar S-110 20. Agar tergitol 7 21. Agar verde brillante 22. Agar Vogel Jhonson 23. Agar Baird-Parker

Figura 10. Crecimiento de Escherichia coli en Agar EMB

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4. Medios especiales
Son los medios que no pueden ser fcilmente agrupados bajo alguno de los anteriores grupos. La mayora de ellos sern medios empleados comprobar una o ms a caractersticas bioqumicas. Ejemplos: Pruebas bioqumicas 1. Fermentacin de carbohidratos 2. Prueba de citrato 3. Prueba de leche con tornasol 4. Reduccin de leche con azul de metileno 5. Prueba de oxidacin y fermentacin: Hugh-Leifson (O/F) 6. Prueba de ureasa 7. Prueba de Voges Proskauer 8. Prueba con rojo de metilo 9. Reduccin de nitratos 10. Prueba de fenilalanina 11. Prueba de Sulfuro, indol, movilidad: SIM 12. Agar hierro y triple azcar: TSI 13. Descarboxilacin de la arginina y lisina: LIA 14. Descarboxilacin de la ornitina: MIO para

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Otras clasificaciones de los medios de cultivo son las siguientes:

De acuerdo a la consistencia
1. Medios slidos. Son tiles para el crecimiento, aislamiento y obtencin de cultivos puros de bacterias y hongos. 2. Medios semislidos. tiles para la observacin de metabolismo, as como la propagacin y obtencin de cultivos de bacterias anaerbicas. 3. Medios lquidos. Permiten la difusin del microorganismo.

De acuerdo a la composicin
1. Medios sintticos Es aquel en el que se conoce la composicin qumica exacta de los ingredientes. 2. Medio no sinttico No se conoce de una manera definida la composicin precisa de alguna o de todas las sustancias nutritivas.
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El desarrollo o cosecha de microorganismos obtenido en algn medio se designa como un cultivo. Cuando las bacterias de un cultivo son todas de la misma especie, se dice que son cultivos puros; cundo dos o ms especies de bacterias s desarrollan en un medio como un cultivo mixto. Si un cultivo contiene accidentalmente ms de una especie de bacterias se habla de un cultivo contaminado. Las bacterias se cultivan en alguno de los siguientes tipos de material de vidrio, una vez limpios y esterilizados. 1. Tubos de ensayo 2. Cajas o placas de Petri 3. Matraces de Florencia y Erlenmeyer 4. Tubos de fermentacin Antes de su esterilizacin, un tubo que contiene medio de cultivo se tapa generalmente con algodn o con un tapn de caucho o plstico. As se evita la entrada de nuevos contaminantes a la vez que se permite el libre intercambio de aire o gases. Para sembrar un cultivo bacteriano en un medio estril, un cierto nmero de clulas: inculo, se transfieren (se inoculan) al medio con precauciones especiales para conservar la pureza del cultivo.
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En el procedimiento de inoculacin el asa de cultivo o aguja de siembra, debe calentarse al rojo sobre la llama inmediatamente antes y despus de hacer la transferencia. La flama destruye cualquier forma de vida sobre la superficie de la aguja o del asa. Se mantiene la aguja hacia abajo sobre la flama, para calentar la totalidad de la aguja y la parte inferior del mango. Durante la siembra, se mantiene el tubo en la mano izquierda y se sostiene el tapn o capuchn entre los dedos meique y anular de la mano derecha. NO DEBE NUNCA DEPOSITARSE EL TAPN sobre la mesa. Mantener el tubo lo ms cerca posible de la flama durante la siembra. Las bocas de los tubos de donde tomamos los cultivos y las de aquellos donde van a ser transferidos deben tambin flamearse inmediatamente antes y despus de que la aguja sea introducida y sacada. Adems de destruir cualquier organismo del borde del tubo, la flama tiende a crear corrientes de conveccin hacia fuera, decreciendo as el riesgo de contaminacin. Despus de inocular, un cultivo bacteriano se conserva o se incuba en un lugar apropiado para el crecimiento. En este caso crecimiento, significa el desarrollo de una poblacin de clulas a partir de una o pocas clulas. La masa de las clulas hijas llega a ser visible a simple vista, bien como una opacidad enturbamiento, en medio lquido; o como una poblacin aislada colonia en medio slido, donde el aspecto de stas ofrece un medio para diferenciar especies.
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La inoculacin primaria puede hacerse con un asa, hisopo u otros dispositivos adecuados. #" Diseminacin en placas: a) Estra 1 Cruzada 2 En Z 3 Simple (en ngulos rectos) 4 Masiva b) Vaciado en placa En el caso de la estra cruzada el inculo se disemina con un movimiento hacia atrs y hacia delante en cada cuadrante girando la placa a 90. El asa o alambre debe esterilizarse en cada diseminacin entre cada cuadrante. El propsito de esta tcnica consiste en diluir el inculo en forma suficiente en la superficie del agar para que sea posible obtener colonias. El mtodo de dilucin o vaciado en placa proporciona por lo general placas con un nmero apropiado de colonias, y se basa en una dilucin aproximadamente cuantitativa de la muestra original en un medio slido.

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Una tcnica muy comn en medicina consiste en obtener especies de microorganismos en un aplicador de algodn (hisopo). Si se utiliza el aplicador infectado para sembrar directamente en caja petri se obtiene una mezcla compleja de organismos sin ninguna colonia aislada, lo cual no reporta ningn beneficio. Para resolver esto existe una tcnica que permite aislar una colonia pura de un algodn infectado, para lo cual; debe trazar con el hisopo unas lneas, inoculando una pequea zona en el borde de una placa. Cubra la caja y queme el aplicador en el mechero. Esterilice el asa y psela en el sector inoculado con el algodn para recoger algunas bacterias, luego inocule con ellos la otra zona en la misma caja (estra cruzada). #" Inoculacin de medios semislidos en tubo Por picadura en forma vertical La inoculacin de este tipo de medios se describe en el Atlas interactivo. El agar inclinado es un tubo conteniendo un medio con agar que, durante su enfriamiento, se coloc inclinado. El contenido de un tubo as inclinado constituye un medio adecuado para el desarrollo de bacterias, especialmente de aerobias y anaerobias facultativas. Algunas caractersticas de los cultivos, como la formacin de pigmentos se observan ms fcilmente sobre cultivos inclinados.

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Cuando se inocula agar semislido en un tubo para pruebas de motilidad (aunque no sea la nica prueba que se valora), es importante que el asa de inoculacin sea retirada a lo largo del mismo camino que se us para atravesar inicialmente el medio. Solo se pica el agar con un movimiento uniforme y recto y para ello se utiliza el asa recta. #" Inoculacin de medios lquidos (tubo) El crecimiento bacteriano en medios lquidos se observa de la siguiente manera: 1. Enturbamiento, opacidad ms o menos densa. 2. Formacin de velo, pequea masa de clulas que flotan en la parte superior del cultivo. 3. Sedimento, depsito de clulas que permanece en la parte inferior del cultivo, pero que se pone nuevamente en suspensin si el tubo se sacude suavemente. Difusin Los medios lquidos pueden inocularse como en el mtodo ilustrado (Atlas interactivo); el tubo debe inclinarse aproximadamente 30, con un asa de inoculacin se toca la superficie interna del vidrio, exactamente por encima del punto donde la superficie del medio forma un ngulo agudo. Se debe utilizar el asa con arillo.

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Posteriormente se vuelve a colocar el tubo en posicin recta, as el rea de inoculacin queda sumergida en el medio. Agitar suavemente cada tubo. No dejar que el lquido salpique la tapa del tubo. Por lo comn es suficiente un solo inculo para inocular una batera de 8 a 10 tubos. Cuando se inocula una batera con una misma especie de bacteria no hay necesidad de pasar por la llama entre cada inoculacin. Cuando se utiliza una aguja o asa para inocular una batera con un solo inculo, el traspaso de azcares de un tubo a otro es tan infinito que no hay problema de que un tubo contenga una mezcla de carbohidratos. Cuando se inocula una batera no es necesario observar en forma apreciable el inculo en cada uno de los tubos. Un solo inculo espeso tomado de cultivo contiene millones de bacterias que son suficientes para inocular cada tubo con un nmero apreciable de bacterias necesarias para que se produzca el metabolismo. #" Inoculacin de medios slidos (tubo): Pico de flauta o cola de pescado a) Por puncin (picadura) b) Por estra c) Por puncin y estra
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Los picos de flauta (planos inclinados) de agar se inoculan de la siguiente forma: primero se atraviesa todo el fondo del agar con el asa recta de inoculacin, esto cuando sea necesario ya que no todos los medios lo requieren, posteriormente ste se retira con un movimiento en S a travs del agar que se disemina el inculo. Se utiliza el asa recta.

Las temperaturas ptimas de incubacin de las bacterias son diferentes. En laboratorios pequeos donde es probable que los recursos sean limitados, puede no ser posible proporcionar todas las temperaturas ptimas para el crecimiento de la totalidad de los aislamientos clnicos. La mayora de los microorganismos utilizados en el laboratorio as como los aislados de muestra clnicas crecen a una temperatura de 35 C, por ende se debe mantener la incubadora a 35 37 C. El crecimiento de muchas bacterias se incrementa con una atmsfera de 5-7 % de CO2. Si solo se dispone de una incubadora con aire ambiente sin CO2 los tubos y placas para cultivos pueden colocarse en una jarra con una vela encendida y cerrar lo mejor posible la jarra.

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La interpretacin de los cultivos primarios despus de 24 48 horas de la incubacin requiere de la observacin o anlisis de la morfologa colonial. La evaluacin debe ser de la siguiente forma: 1. Observar las caractersticas y el nmero relativo de cada tipo de colonia recuperado en medios de agar. 2. Determinar la pureza, coloracin de Gram y morfologa de las bacterias en cada tipo de colonia.

3. Observar cambios en el medio que rodea las colonias, que reflejan actividades metablicas especficas de las bacterias recuperadas.
Figura 11. Agar BCYE

La evaluacin de las caractersticas macroscpicas de las colonias habitualmente se lleva a cabo por medio de la inspeccin visual del crecimiento en la superficie de las placas de agar.

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La interpretacin de los cultivos primarios se lleva a cabo sosteniendo la placa en la mano y observando la superficie del agar en busca de crecimiento bacteriano. Colonias puntiformes de bacterias que crecen lentamente, pueden pasarse por alto entre colonias ms grandes en particular si el crecimiento tiene tendencia a diseminarse sobre la superficie de la placa. Durante el examen las placas deben inclinarse en diversas direcciones, con una iluminacin directa brillante, de modo que la luz se refleje desde varios ngulos. Las placas de agar sangre tambin deben examinarse con transiluminacin con una luz brillante desde detrs de la placa para detectar reacciones hemolticas en el agar. La morfologa de las colonias es una de las caractersticas bsicas de las bacterias y es indispensable para la identificacin preliminar. El tamao de las colonias bacterianas es asumiendo condiciones de cultivo favorables bastante uniforme de toda una especie. La forma de la colonia viene determinada por su borde y su espesor. El borde puede ser liso o irregular y aserrado. Cuando el grosor es mucho mayor en el centro, disminuyendo uniformemente hacia el borde, se dice que la colonia es elevada.
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La consistencia y textura de la masa celular tambin son rasgos distintivos de la morfologa de las colonias. Pueden tener una consistencia desde seca y frgil a grasienta y cremosa, o viscosa y pegajosa. La consistencia viscosa de la colonia es propia de las bacterias que tienen cpsulas. La superficie de la colonia puede ser uniforme, lisa y brillante, rugosa y granular, o estriada y dentada. Al examinarla con luz transmitida, la masa celular puede parecer de una textura amorfa o granular, y variar desde casi completamente translucida, quiz con un tinte azulado pasando por varios grados de opalescencia, hasta un color blanco o una opacidad amarillenta. No todas las colonias bacterianas son pigmentadas: la pigmentacin es ms frecuente entre las bacterias atrficas. Debido a que la mayor parte de los pigmentos son sustancias carotenoides, las clulas pueden aparecer de color rojo, naranja o amarillo. La diferenciacin con un criterio morfolgico de las colonias es slo orientativa, y para poder identificar una bacteria se necesita un estudio detallado de sus caractersticas fisiolgicas e inmunolgicas.

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Lectura de morfologa colonial

$" Tamao: dimetro en mm. $" Forma: puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide. $" Elevacin: plana, sobre elevada, convexa, pulvonada, umbonada, umbilicada. $" Margen (borde): entero, ondulante, lobulado, lacerado, filamentoso, rizado. $" Color: blanco, amarillo, negro, naranja, etc. $" Superficie: brillante, opaca, erizada, rugosa. $" Transmisin de luz: opaca, translucida, transparente. $" Consistencia: cremosa, seca, mucoide (viscosa), membranosa).

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La mayor parte de las pruebas usadas para evaluar la actividad bioqumica o metablica de bacterias (por medio de la cual puede hacerse una identificacin final de especie), se lleva a acabo mediante el subcultivo del aislamiento primario en una serie de medios diferenciales, cuyos resultados pueden interpretarse despus de uno o dos das de incubacin.

1. FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS
$" Medio de cultivo: Caldo bsico rojo de fenol Composicin: a) Peptona 10g. b) Extracto de carne 1g. c) Cloruro de sodio 5g d) Agua destilada 1000 ml. e) Indicador de pH: Rojo de fenol !" cido: Color amarillo (pH = 6.8) !" Alcalino : Color rojo ( pH = 8.4) !" Medio no inoculado: Rojo (pH = 7.4)

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$" Fundamento La fermentacin es un proceso metablico de oxido-reduccin que ocurre en un medio ambiente anaerobio y, en lugar de oxgeno, un sustrato orgnico sirve como el aceptor final de hidrgeno (electrones). En los sistemas de prueba bacteriolgicos, este proceso se detecta observando cambios de color en indicadores de pH a medida que se forman productos cidos. Las bacterias que fermentan un hidrato de carbono son por lo general anaerobios facultativos. Por medio del proceso de fermentacin un hidrato de carbono es degradado y descompuesto en dos molculas de carbono (triosas) que son nuevamente degradadas en un nmero de compuestos de 1, 2, 3 y 4 carbonos. Los productos finales varan con cada especie bacteriana y depende del sistema enzimtico existente en la especie y las condiciones del medio ambiente. El ms importante ciclo fermentativo de la degradacin de la glucosa es el ciclo de Embden - Meyerhof aun cuando ste tambin puede producirse por la derivacin de pentosa o el ciclo de Entner - Duodoroff. Pueden utilizarse diversos hidratos de carbono. La bacteria usada depende de las dificultades que se presenten para identificar un organismo determinado.

36

Utilizando un indicador de pH con un determinado hidrato de carbono puede determinarse si una bacteria ha degradado el mismo en varios productos terminales, observando un cambio de color visible en el medio.

Indicador de pH + CHO (aldehdos)

Bacteria gluclisis

H2CO2 + cambio de color

$" Consistencia del medio Lquido

$" Inoculacin Por difusin, inculo denso

$" Condiciones de incubacin Tiempo: 24 - 48 horas

Figura 12. Streptococcus

Temperatura: 35 - 37 C

37

$" Resultados

MEDIO NO INOCULADO

NEGATIVO

POSITIVO Figura 13. Pruebas bioqumicas de Fermentacin de Carbohidratos

$" Interpretacin Positiva = Color amarillo (cido) Negativa = Color rosa - rojizo (alcalina) Color naranja

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$" Observaciones Existen ocasiones que con algunas especies de bacterias es necesaria la incubacin ms prolongada, esto se recomienda cuando aparece un color naranja, se incuban bajo las mismas condiciones 24 horas ms. S aun as se presenta este color la prueba se reporta como negativa ya que lo ms probable es que el microorganismo est formando productos metablicos que no necesariamente son por fermentacin por ello no alcanza el color rojo esperado. El hecho de incubar por 24 horas ms es poco prctico ya que la mayor parte de las ocasiones se tiene el tiempo necesario para la incubacin de 24 horas, por ello en este manual se considera que la prueba se tome como negativa si presenta un color naranja.

$" Reporte de resultados A = cido K = alcalino G = gas

39

$" Aplicaciones

$" Microorganismos fermentadores de carbohidratos: Fermentadores de glucosa: Todos los miembros de las Enterobacteriaceae. Fermentadores de glucosa y lactosa: Escherichia coli, Klebsiella y grupos Enterobacter. Fermentadores de manitol: Staphylococcus aureus Fermentadores de inositol: Proteus rettgeri Fermentadores de lactosa: Neisseria lactamica Fermentadores de adonitol: Providencia alcaligenes. Fermentadores de inulina: Streptococcus salivarius y Streptococcus sanguis. Yersinia Fermentadores de sacarosa: enterocolitica. Listeria Fermentadores de salicina: monocytogenes.

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$" Microorganismos no fermentadores de Carbohidratos: No fermentadores de lactosa: Enterobacterias patgenas como Salmonella y Shigella. No fermentadores de manitol: Staphylococcus epidermidis. No fermentadores de salicina: Especies de Corynebacterium. No fermentadores de rafinosa: Otras especies de Aeromonas. No fermentadores de inositol: Proteus morganii. No fermentadores de adonitol: Providencia stuartii. No fermentadores de inulina: Streptococcus del grupo D. No fermentadores de sacarosa: Otras especies de Yersinia.

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2. PRUEBA DE CITRATO

$" Medio de cultivo: Citrato de Simmons

Composicin: a) Sulfato de magnesio b) Monofosfato de amonio c) Fosfato dipotsico d) Citrato de sodio e) Cloruro de sodio f) Agar g) Agua destilada h) Indicador de pH: Azul de bromotimol (pH= 6) Alcalino: color azul de Prusia intenso (pH = 7.6) Medio no inoculado: Color verde (pH = 6.9)

$" Fundamento Determina si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento, provocando alcalinidad. El medio incluye citrato de sodio, un anin como nica fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno.
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Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensacin de acetilo con la coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El desdoblamiento del citrato comprende un sistema enzimtico sin la intervencin de la coenzima A. Esta enzima se denomina citritasa o citrato desmolasa.

Citrato

Oxalacetato

acetato

Piruvato + CO2

Los productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del pH del medio: pH bsico: Citrato pH cido: 2 Piruvato 2 Piruvato acetato + CO2 + lactato acetona + 2CO2
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CO2 + cido frmico + 2 cido actico

$" Consistencia del medio Slido inclinado (pico de flauta)

$" Inoculacin Se toma una colonia bien aislada de la superficie del medio de aislamiento primario y se inocula como una estra nica en la superficie del pico de flauta.

$" Incubacin Tiempo = 24 - 48 horas Temperatura = 35 - 37 C

$" Precauciones El inculo debe ser liviano. S ste es demasiado grande, compuestos orgnicos preformados dentro de la pared celular de las bacterias que estn muriendo pueden liberar suficiente carbono y nitrgeno como para dar un resultado falso positivo.

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Cuando se inocula una serie de tubos de medios de cultivo diferenciales con un microorganismo desconocido, es importante sembrar primero el medio citratado para prevenir el arrastre de protenas o carbohidratos de los otros medios, aunque se supone se esteriliza el asa en cada inoculacin.

$" Resultados

MEDIO NO INOCULADO

NEGATIVO

POSITIVO

POSITIVO
Figura 14. Pruebas bioqumicas de citrato

POSITIVO

45

$" Interpretacin Positivo: Crecimiento aunque no exista cambio de color. Crecimiento y el medio de color azul intenso en pico de flauta. Negativo: No se observa crecimiento y medio de color verde. Si se utiliza carbono a partir de citrato de sodio, tambin se extrae nitrgeno del fosfato de amonio contenido en el medio, liberndose amoniaco. En ocasiones se detecta un crecimiento visible a lo largo de la lnea de siembra antes de la aparicin de color. Este crecimiento visible tambin indica resultado positivo.

$" Reporte de resultados Negativo Positivo (-) (+)

46

$" Aplicaciones $" Microorganismos positivos Especies de: Salmonella Arizona Citrobacter Enterobacter Klebsiella Serratia licuefaciens Pseudomonas cepacia

$" Microorganismos negativos

Edwarsiella Yersinia enterocoltica Escherichia coli Shigella Yersinia pseudotuberculosis Otras especies de Moraxella Proteus morganii

47

3. PRUEBA GELATINA

DE

LICUEFACCIN

DE

$" Medio de cultivo: Gelatina nutritiva Composicin: a) Extracto de carne b) Peptona c) Gelatina d) Agua destilada

$" Fundamento Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo proteoltico (gelatinasas) que licuan la gelatina. Las protenas que se producen naturalmente son demasiado grandes para entrar en una clula bacteriana; por lo tanto, para que una clula utilice las protenas, primero deben ser catabolizadas en componentes ms pequeos. Las enzimas exonucleares de tipo proteltico, gelatinasas, son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las protenas y esta capacidad ayuda a la identificacin bacteriana.

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gelatinasas Protena + H2O polipptidos Proteasas gelatinasas Polipptidos + H2O Peptidasas aminocidos individuales

$" Consistencia del medio Semislido

$" Inoculacin Picadura en posicin vertical hasta una profundidad de 2 2.5 cm, inculo denso.

$" Condiciones de incubacin Tiempo: 18 - 24 horas Temperatura: 35 - 37 C Al trmino de la incubacin se coloca el tubo en un refrigerador o bao de hielo durante dos horas para determinar si se ha producido o no la digestin de la gelatina (licuefaccin).
49

$" Resultados

MEDIO NO INOCULADO

NEGATIVO

POSITIVO

Figura 15. Pruebas bioqumicas de licuefaccin de gelatina

$" Interpretacin Positivo: Medio licuado (estado lquido) Negativo: Medio slido

El medio de gelatina nutritiva para puncin no es conveniente para las pruebas de rutina de la actividad de la gelatinasa, dado que muchas especies requieren una incubacin prolongada antes de que aparezcan muestras de licuefaccin. En los mtodos diagnsticos de rutina para identificar bacterias, la duracin de la incubacin deber alcanzar un periodo razonable.
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$" Reporte de resultados Positivo (+)

Negativo (-)

$" Aplicaciones $" Microorganismos positivos

Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis (lenta) Serratia liquefaciens Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa Especies de Flavobacteriumm

$" Microorganismos negativos Listeria monocytogenes

Figura 16. Micrococcus

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4. PRUEBA DE LA LECHE CON TORNASOL

$" Medio de cultivo: Medio de leche tornasolada Composicin: a) Leche descremada b) Agua destilada c) Indicador de pH: Tornasol !" cido: Color rojo (pH = 4.5) !" Alcalino: Color azul ( pH = 8.3) !" Medio no inoculado: Azul purpreo (pH = 6.8) $" Fundamento Permite diferenciar organismos sobre la base de sus mltiples reacciones metablicas en un medio lcteo como: fermentacin de lactosa, caselisis, y coagulacin de la casena. El tornasol incorporado a la leche es un indicador de pH y de oxidacin-reduccin que hace que el medio pueda indicar diversas funciones metablicas. La leche contiene lactosa, casena, lactalbmina y lactoglobulina, por lo tanto, un organismo puede mostrar una o varias propiedades metablicas en la leche tornasolada ayudando as a la identificacin bacteriana: 1. Fermentacin de lactosa 2. Reduccin del tornasol 3. Formacin de cogulo 4. Peptonizacin (digestin) 5. Formacin de gas
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1. Fermentacin de lactosa
Cuando un organismo es capaz de fermentar lactosa, produce principalmente cido lctico, con una condicin cida indicada por el cambio de color del medio que se vuelve rojo rosado. A veces el cido butrico es el producto final. Ciertas bacterias que forman lcalis no fermentan lactosa, pero actan sobre las sustancias nitrogenadas que se encuentran en la leche liberando amoniaco, y dando en consecuencia un pH alcalino que se manifiesta por un color prpura azulado.

Lactosa

glucosa + galactosa

Glucosa

cido pirvico

cido lctico cido butrico CO2 + H2

2. Reduccin del tornasol

El tornasol es un indicador de pH y un indicador de oxidacin reduccin; algunos organismos son capaces de reducir el tornasol a una leucobase.
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3. Formacin de cogulo
Las enzimas proteolticas provocan la hidrlisis de las protenas de la leche lo que da como resultado su coagulacin. La principal enzima responsable de la formacin de cogulo es la renina. La formacin del cogulo es causada por la precipitacin de la casena, por la formacin de cidos o por la conversin de la casena en paracasena por la enzima renina. La casena es una fosfoprotena compleja y es la protena ms importante de la leche. Formacin de un cogulo cido La precipitacin de la casena provocada por los cidos orgnicos a partir de lactosa en condiciones cidas produce un cogulo firme y gelatinoso que no se separa de las paredes del tubo. Lactosa cido lctico

caseinasa c. Lctico + casenato de Ca caseingeno (pp)

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Formacin del cogulo Otra forma de cogulo es el coajo, o sea el proceso de coajado de la leche por la conversin de la casena en paracasena por las enzimas renina, pepsina o quimiotripsina contenidas en la leche. La renina provoca el cuajado de la leche convirtiendo la sal de casena soluble en una paracasena insoluble que es el cuajo o requesn. renina Casena Ca paracasena (pp)

4. Peptonizacin (digestin)
La hidrlisis de la casena por la actividad enzimtica produce una conversin final del precipitado caseingeno en un lquido claro; el proceso se denomina peptonizacin y se manifiesta por una aclaracin acuosa del medio causada por una digestin del precipitado (cogulo) y las protenas de la leche por las enzimas proteolticas de las bacterias. Sin embargo, solo se produce una peptonizacin cuando la bacteria que se desarrolla en la leche tornasolada contiene la enzima proteoltica caseinasa.

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5. Formacin de gas
Los gases CO2 y H2 se forman como resultado final de la fermentacin de la lactosa.

$" Consistencia del medio Lquido

$" Inoculacin Difusin

$" Condiciones de incubacin Tiempo: 18-48 horas Temperatura: 35 - 37 C

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$" Resultados

Figura 17. Pruebas bioqumicas de leche con tornasol

Medio no inoculado

Fermentacin de lactosa

Digestin

Reduccin de tornasol

No fermentacin de lactosa

Cogulo

$" Interpretacin Rojo rosado: cido; fermentacin de lactosa Azul purpreo: No fermentacin de lactosa; sin cambio del indicador de pH. Azul: Alcalino; Ausencia fermentacin de lactosa. El organismo ataca las sustancias nitrogenadas que se encuentran en el medio. Blanco: Reduccin del tornasol a una leucobase. Formacin de cogulo: Coagulacin de la protena de la leche. Aclaracin del medio: Digestin; se a ingerido la protena de la leche. Gas: Produccin de burbujas en la campana de Durham.

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$" Reporte de resultados En la tabla de resultados solo se escribirn las letras que aparecen dentro del parntesis. Rojo rosado (A) Azul purpreo (SC) Azul (K) Blanco (Red) Cogulo (C) Digestin (D) Gas (G) $" Aplicaciones Ayuda a la diferenciacin de especies sobre todo del gnero Clostridium. Sin crecimiento: Clostridium cochlearium C. difficile C. putrefaciens C. tetanomorphum Streptococcus equinus Con crecimiento: Streptococcus bovis

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5. PRUEBA DE REDUCCIN DE LA LECHE CON AZUL DE METILENO

$" Medio de cultivo: Medio de leche con azul de metileno Composicin: a) Leche descremada deshidratada b) Agua destilada c) Indicador : Azul de metileno Incoloro : Estado reducido Azul : Estado oxidado; medio no inoculado (pH=6.4)

$" Fundamento Permite diferenciar organismos por su capacidad de reducir el azul de metileno en un medio con leche. El sistema citocromo oxidasa activa la oxidacin del citocromo reducido por el oxgeno molecular que a su vez acta como un aceptor de electrones en el periodo terminal del sistema de transferencia de electrones. Cuando existen condiciones aerbicas el oxgeno es el aceptor final del hidrgeno, produciendo agua o perxido de hidrgeno segn la especie bacteriana y su sistema enzimtico.

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Los sustratos artificiales como el azul de metileno, pueden sustituir a los aceptores de electrones naturales en cualquier lugar de la cadena de transporte de electrones, donde actan como reductores del sistema citocromo. Cuando se agrega el colorante sinttico reducible, azul de metileno a un medio que contenga organismos metabolizantes, los electrones producidos por un sustrato oxidable son desplazados de su ciclo normal, si se produce reductasa y son utilizados para reducir el colorante.
N
H N

(CH3)2N

N(CH3)2

(CH3)2N S

N(CH3)2

Azul de metileno (estado oxidado, color azul).

Azul de metileno (estado reducido, incoloro).

$" Consistencia del medio Lquido

$" Inoculacin Difusin, inculo denso

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$" Condiciones de incubacin Tiempo: 18-24 horas Temperatura: 35 - 37 C

$" Resultados

MEDIO NO INOCULADO

NEGATIVO

POSITIVO

Figura 18. Pruebas bioqumicas de leche con azul de metileno

$" Interpretacin Positiva: Incoloro; reduccin Negativa: Azul; no hay reduccin

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$" Reporte de resultados R = Reduccin (-) = Negativo, sin cambio de color

$" Aplicaciones Esta capacidad enzimtica se utiliza fundamentalmente para diferenciar los enterococos (especies de Streptococcus del grupo D) de otros miembros del gnero Streptococcus. $" Microorganismos positivos Enterococos (Streptococcus del grupo D) $" Microorganismos negativos Especies de Streptococcus que por lo general no son enterococos.

Figura 19. Salmonella

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6. PRUEBA DE OXIDACIN FERMENTACIN

$" Medio de cultivo: Medio bsico de Hugh Leifson, medio O/F. Componentes: a) Peptona b) Cloruro de sodio c) Fosfato de potasio d) Hidratos de carbono (glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa). e) Agar f) Agua destilada g) Indicador de pH: Azul de bromotimol cido : Color amarillo (pH = 6) Alcalino : Azul de Prusia intenso (pH = 7.6) Medio no inoculado: Verde (pH = 7.1) Se deben tener dos tubos para esta prueba uno sin sello y otro con sello de parafina.

$" Fundamento Determina el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono.

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La utilizacin que una bacteria hace de los hidratos de carbono tiene lugar por alguno de dos procesos: de fermentacin o de oxidacin. Algunas bacterias son capaces de metabolizar un carbohidrato solo en condiciones aerbicas, mientras que otras producen cido tanto aerbica como anaerbicamente. La diferencia principal entre el metabolismo fermentativo y oxidativo depende de los requerimientos de oxgeno atmosfrico y de la fosforilacin inicial. La fermentacin es un proceso anaerbico que requiere la fosforilacin inicial de la glucosa previamente a su degradacin, mientras que la oxidacin, en ausencia de compuestos inorgnicos como nitrato y sulfato, es un proceso estrictamente aerbico que comprende la oxidacin directa de una molcula de glucosa no fosforilada (inicialmente). La fermentacin produce una acidez ms elevada que el proceso metablico oxidativo. El medio OF contiene una elevada concentracin de carbohidratos con una baja concentracin de peptona, produciendo as una condicin alcalina que neutraliza la ms ligera acidez producida por un organismo oxidativo. El fosfato de potasio agregado al medio favorece la fermentacin y acta como buffer para controlar el pH. La concentracin de agar empleado permite tambin la determinacin de la movilidad y ayuda a la distribucin por todo el tubo del cido producido en la superficie del medio.
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Son necesarios dos tubos de cada medio de hidratos de carbono para la prueba. El medio en un tubo se expone al aire, el otro se cubre con aceite mineral o parafina lquida estriles. Las bacterias oxidativas producen cidos solo en el tubo abierto expuesto al oxgeno atmosfrico; los micoorganismos fermentadores producen cidos en ambos tubos; y las bacterias no sacarolticas son inertes en este medio, que permanece con un pH alcalino despus de la incubacin. La prueba OF tiene algunas limitaciones; los bacilos no fermentadores de crecimiento lento pueden no producir cambios de color durante varios das, y especies que son particularmente activas sobre aminocidos pueden hacer que reacciones cidas dbiles reviertan con el tiempo, confundiendo la interpretacin final.

$" Consistencia del medio Semislido (tambin permite la observacin de movilidad).

$" Inoculacin Picadura, inculo poco denso. Picar aproximadamente hasta 0.6 mm de fondo. ambos tubos

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$" Condiciones de incubacin: Tiempo: 18 - 24 horas Temperatura: 35-37 C

$" Resultados

MEDIO NO INOCULADO

OXIDANT E NO FERMENTADOR

FERMENTADOR

NO OXIDANT E NO FERMENTADOR

Figura 20. Pruebas bioqumicas de Oxidacin / Fermentacin

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$" Interpretacin Amarillo: cido Burbujas: Gas Verde: alcalino

Incubacin

Fermentador Oxidativo No fermentador

No oxidativo No fermentador

Figura 21. Diagrama de interpretacin de la prueba de Oxidacin / Fermentacin

$" Aplicaciones 1. Fundamentalmente para diferenciar gneros intestinales no entricos, Gram negativos de la Familia Enterobacteriaceae.

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2. Ayuda a la diferenciacin entre los gneros de la Familia Micrococcaceae. Micrococcus oxida glucosa Staphylococcus fermentan glucosa

3. Ayuda a la identificacin de Enterobacterias Fermentadoras de glucosa: Escherichia coli Oxidativas de glucosa: Pseudomonas aeruginosa No sacaroltico: Especies de Moraxella

$" Reporte de resultados

Metabolismo Oxidacin (O) Fermentacin (F) Fermentacin (F) Ni fermentacin ni oxidacin (-) Fermentacin y oxidacin (O+F)
Tabla 1. Reporte de resultados de O / F

Tubo c/reaccin Abierto Cubierto Cubierto Ninguno Ambos

Tubo sin sello

Tubo con sello

Amarillo (A) Amarillo (A) Amarillo (AG) Azul o verde (-)

Amarillo (A AG)

Verde (-) Amarillo (A) Amarillo (AG) Verde (-)

Amarillo (A AG)

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6. REACCIN DE LA UREASA
$" Medio de cultivo: Agar urea de Christensen Composicin: a) Peptona b) Cloruro de sodio c) Fosfato monopotsico c) Glucosa d) Urea e) Agar f) Agua destilada g) Indicador de pH: Rojo de fenol !" cido: Amarillo (pH = 6.8) !" Alcalino : Rojo rosado (pH = 8.4) !" Medio no inoculado: Amarillo (pH = 6.8)

$" Fundamento Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos molculas de amoniaco por la accin de la enzima ureasa produciendo un cambio de color rojo en el medio. La hidrlisis de la urea es catalizada por la ureasa, para dar dos molculas de amoniaco. La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la descomposicin de los compuestos orgnicos.

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H2N H2 N

C=O + 2 HOH

CO2 + H2O + 2 NH3

(XH4)2CO2

Urea

$" Consistencia del medio Slido en pico de flauta (cola de pescado)

$" Inoculacin Estra en pico de flauta (no hacer puncin).

$" Condiciones de incubacin Tiempo: 18-24 horas Temperatura: 35-37 C

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$" Resultados

MEDIO NO INOCULADO

NEGATIVO

POSITIVO
Figura 22. Pruebas bioqumicas: Urea

POSITIVO

$" Interpretacin Positivo: Rojo rosado intenso en el pico de flauta Negativo: Amarillo $" Reporte de resultados Positivo (+) Negativo (-)

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$" Observaciones En muchas especies, la reaccin positiva de ureasa se detecta primero por un cambio de color rojo en la parte de pico de flauta, el cual, al principio se vuelve rojo porque la accin alcalina, resultado de la degradacin de pequeas cantidades de urea, es aumentada por las aminas formadas a partir de la descarboxilacin oxidativa de los aminocidos en la parte del medio expuesta al aire.

$" Aplicaciones 1. Se usa para diferenciar los organismos Proteus rpidamente ureasa positivos de otros miembros de las enterobacterias, otros gneros pueden ser positivos retardados. Figura 23. Salmonella typhi

Klebsiella (+) Escherichia coli (-) Proteus (+ rpido) Providencia (-)

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8. REACCIN DE VOGES-PROSKAUER (VP)

$" Medio de cultivo: Medio RM/VP) Composicin: a) Polipeptona b) Dextrosa c) Fosfato de potasio d) Agua destilada de Clark y Lubs (caldo

$" Fundamento Determina la capacidad de algunos organismos de producir un producto final neutro, la acetona a partir de la fermentacin de glucosa. La reaccin de VP se basa en la deteccin de acetona como producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa. sta es metabolizada en cido pirvico, intermediario clave en la gluclisis. A partir del cido pirvico, una bacteria puede seguir muchas vas. La produccin de acetona (precursor de la produccin de 2,3butanediol) que es uno de los ciclos para la degradacin de la glucosa en las bacterias. La formacin de acetona y butilenglicol es una va alternativa del metabolismo del cido pirvico. Las bacterias que utilizan esta va producen solo pequeas cantidades de cidos mixtos que son insuficientes
73

para disminuir bastante como motivo muchas positivas, con viceversa.

el pH del medio de rojo de metilo, lo para producir un cambio de color. Por este de las especies de Enterobacterias son VP pocas excepciones son RM negativas y

El primer reactivo agregado a una alcuota incubada es el catalizador alfa-naftol porque ste acta como intensificador del color, lo que aumenta la sensibilidad de la reaccin sin prdida de su especificidad. El segundo reactivo es el KOH que cuando se agrega al medio de VP contribuye a la absorcin de CO2. No debe excederse de un volumen exacto. El KOH reaccionar con la peptona dando un color rosado salmn y con el agregado posterior de alfanaftol no habr alteracin del color.

O H

C H 3

C H 3

O2 OXIDADO
+ C O C O

KOH
C H O H

Alfa-naftol (catalizador)
C H 2 C H 2

Acetona
N H 2 C N H

Diacetilo
+

N H

condensacin Color rojo rosado Ncleo de guanidina

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$" Consistencia del medio Lquido

$" Inoculacin Difusin

$" Condiciones de incubacin Tiempo: 24 - 48 horas Temperatura: 35-37 C

$" Reactivos adicionales a) Alfa naftol al 5%, intensificador del color b) Hidrxido de potasio 40%, agente oxidante Agregar directamente los reactivos al tubo despus de la incubacin en el siguiente orden: 1) 0.6ml de alfa naftol 2) 0.2ml de KOH 3) Agitar el tubo suavemente, dejar reposar de 10 a 15 minutos antes de la interpretacin.

75

$" Precauciones El orden de adicin de los reactivos es importante, ya que la inversin de incorporacin dar como resultado un dbil positivo o falso negativo. No debe excederse un volumen exacto de KOH ya que el exceso puede ocultar una reaccin VP dbilmente positiva.

$" Resultados

POSITIVO

MEDIO NO INOCULADO

NEGATIVO

Figura 24. Prueba bioqumicas de la reaccin de Voges - Proskauer

$" Interpretacin Positivo: Rojo rosado en la superficie del medio (presencia de acetona). Negativo: Amarillo. Puede formarse un color cobrizo pero an as la reaccin es negativa.
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$" Reporte de resultados Positivo (+) Negativo (-)

$" Aplicaciones $" Microorganismos positivos - Klebsiella pneunoniae - Yersinia enterocolitica

$" Microorganismos negativos -Escherichia coli -K. ozaenae

Figura 25. Escherichia coli

77

9. REACCIN DE ROJO DE METILO (RM)

$" Medio de cultivo : Medio de Clark y Lubs (caldo RM/VP) Composicin: e) Polipeptona f) Dextrosa g) Fosfato de potasio h) Agua destilada i) Indicador: rojo de metilo PH inicial = 6.9, medio no inoculado, color rojo. cido: rojo (pH = 4.4) Alcalino: amarillo (pH = 6)

$" Fundamento Comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales cidos de la fermentacin de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. Es una prueba cualitativa de la produccin de cido (determinacin de pH). Las bacterias que principalmente siguen la va de fermentacin de cidos mixtos a menudo producen suficiente cido para mantener un pH menor de 4.4.

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La prueba de rojo de metilo se basa en el empleo de un indicador de pH para determinar la concentracin de iones hidrgeno presentes cuando un organismo fermenta glucosa. Las bacterias RM positivas producen cidos estables manteniendo una alta concentracin de iones hidrgeno hasta alcanzar cierta concentracin y entonces cesa toda actividad. Los organismos RM negativo tambin producen cidos pero tienen una menor concentracin de iones hidrgeno porque hay una reversin hacia la neutralidad debida a la nueva degradacin de los cidos orgnicos en carbonatos. La validez de la prueba de RM depende de un tiempo de incubacin suficiente como para permitir que se produzca la diferencia en el metabolismo de la glucosa. Los organismos en estudio se incubarn por lo menos 2 das, lo que permite que todos los organismos con baja proporcin gaseosa muestren su lmite en la concentracin de iones hidrgeno.

$" Consistencia del medio Lquido

$" Inoculacin Difusin

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$" Condiciones de incubacin Tiempo: 48 horas Temperatura: 35-37 C

$" Reactivos adicionales para Rojo de Metilo Rojo de metilo. Adicionar 5 gotas al tubo previamente incubado. Interpretar el resultado del color inmediatamente. Conservacin: Guardar el reactivo en refrigeracin (4 C) mientras no se usa.

$" Resultados

MEDIO NO INOCULADO

NEGATIVO

POSITIVO

Figura 26. Pruebas bioqumicas de la reaccin de Rojo de Metilo

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$" Interpretacin de rojo de metilo No debe intentarse interpretar un resultado con el rojo de metilo despus de menos de 48 horas de incubacin. Positiva: Rojo en la superficie del medio (pH = 4.4) Algunas bacterias pueden producir menores cantidades de cido a partir del sustrato por ello es posible que aparezca un color naranja. Esto indica una prueba positiva. Negativo: Amarillo (pH = 6) naranja $" Reporte de resultados Positivo (+) Negativo (-) $" Aplicaciones !" Microorganismos positivos - Escherichia coli - Especies de Yersinia
Figura 27.

!" Microorganismos negativos Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Klebsiella

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10. PRUEBA DE REDUCCIN DE NITRATOS

$" Medio de cultivo: Caldo con nitrato Ingredientes: a) Extracto de carne b) Peptona c) Nitrato de potasio d) Agar e) Agua destilada f) PH inicial = 7.0

$" Fundamento Determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos o en nitrgeno libre. La reduccin de nitrato en nitrito y en gas nitrgeno tiene lugar generalmente en condiciones anaerobias, en las cuales un organismo obtiene su oxgeno del nitrato. El oxgeno sirve como un aceptor de hidrgeno. Reduccin del nitrato en nitrito NO3 + 2 e 2 H+ Nitrato NO2 + H2O nitrito

82

Nitrato en nitrgeno molecular 2 NO3 + 10 e + 12 H+ N2 + 6 H2O

La reduccin de nitrato en nitrito est indicada por la aparicin de color cuando el nitrito reacciona con los dos reactivos. La reaccin de color resultante se debe a la formacin de un compuesto diazoico, p-sulfobenceno-azoalfa-naftilamina.

NH2

+ HNO2

SO2H

NH2 SO2H

NH2

cido sulfanilico (incoloro)

Alfa-naftilamina

P-sulfobenceno-azo-affa-naftilamina (rojo)

Zn + CH2COOH
cido actico

(C6H3NHNH3) OSO3H
Arilhidracina

SO2H

NH2

83

$" Consistencia del medio Lquido $" Inoculacin Difusin, inculo denso. $" Condiciones de incubacin Tiempo: 18-24 horas Temperatura 35 - 37 C Raramente es necesaria una incubacin prolongada de hasta 5 das. La mayora de los organismos capaces de reducir el nitrato, lo hacen dentro de las 24 horas.

$" Reactivos adicionales 1. Alfa - naftilamina 0.05 % 2. cido sulfanilico 0.8 % Adicionar directamente al tubo de reaccin en el siguiente orden: 1. Alfa - naftilamina 1 ml. 2. cido sulfanilico 1 ml.
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Conservacin: Guardar ambos reactivos en el refrigerador mientras no se usan. Por lo general se mantienen estables durante tres meses.

$" Resultados

MEDIO NO INOCULADO

POSITIVO

NEGATIVO

Figura 28. Pruebas bioqumicas de Reduccin de Nitritos

$" Interpretacin Se interpretan los resultados un minuto despus de adicionar los reactivos. Positivo: rosa a rojo intenso Negativo: Amarillo

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$" Precauciones Una prueba negativa indica que los nitratos, no han sido reducidos o que han sido reducidos a otros productos, como amoniaco, nitrgeno molecular, oxido ntrico u xido nitroso e hidroxilamina. Dado que los reactivos de prueba detectan solo nitritos, este ltimo proceso llevara a una lectura falsa negativa. Por ende es necesario agregar una pequea cantidad de polvo de zinc a todas las reacciones negativas. Los iones zinc reducen nitratos a nitritos y la aparicin de color rojo despus del agregado de zinc indica una reaccin positiva. $" Reporte de resultados Positivo (+) Negativo (-) $" Aplicaciones Ayuda a la identificacin de Enterobacterias que por lo general son positivas. Todas las Enterobacterias, con excepcin de ciertos tipos de Enterobacter agglomerans y especies de Erwinia, reducen nitratos a nitritos.
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11. PRUEBA DE FENILALANINA DESAMINASA

$" Medio de cultivo: agar fenilalanina Composicin: a) D-L-fenilalanina b) Extracto de levadura c) Cloruro de sodio d) Fosfato de sodio e) Agar f) Agua destilada g) PH inicial = 7.3

$" Fundamento Determina la capacidad de un organismo de desaminar la fenilalanina en cido fenilpirvico por su actividad enzimtica, con la consiguiente acidez resultante. El aminocido aromtico fenilalanina sufre una desaminacin oxidativa catalizada por un aminocido oxidasa para producir el cido cetnico. La desaminacin oxidativa da como resultado la extraccin del grupo amino del aminocido para formar un doble enlace alfa-cetocido y libre de amoniaco.

87

Este es un proceso en dos etapas: 1. La extraccin del hidrgeno dando un aminocido y el hidrgeno se combina con el oxgeno para formar agua. 2. El aminocido es hidrolizado en un cetocido

CH2

CH

COOH

- 2H NH2 + 1/2 O FLAVOPROTENA

FENILALANINA CH2 C COOH

NH2 AMONIACO

CIDO FENILPIRVICO

Qumica de la accin reactiva

Como la fenilalanina se encuentra desaminada, el color producido como consecuencia del agregado de cloruro frrico al 10 % se debe a la formacin de un cetocido el
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cido fenilpirvico. La reaccin positiva con este reactivo se debe a la formacin de una hidrazona. El cloruro frrico acta como agente quelante actuando con el cido fenilpirvico para formar un color verde. Cuando se expone al oxgeno atmosfrico un tubo de cultivo con fenilalanina despus del agregar el cloruro frrico aumenta la produccin y la intensidad de la reaccin positiva.
CH2 C COOH CH2 C COOH

N O + RNH NH2
Hidracina

NHR

cido fenilpirvico

Fenilhidrazona

$" Consistencia del medio Slido en pico de flauta

$" Inoculacin Estra en pico de flauta, inculo denso.

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$" Condiciones de incubacin Tiempo: 18-24 horas Temperatura 35 - 37 C

$" Reactivos adicionales Cloruro frrico 10% Adicionar de 4-5 gotas a un tubo incubado Hacer rotar suavemente el tubo para que el crecimiento se separe. Esperar de 1 a 5 minutos para leer la reaccin. Conservacin: Guardar los reactivos en refrigeracin y colocarlos en frascos oscuros para evitar la descomposicin.

$" Aplicaciones Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies de Proteus y del grupo Providencia, y se usa para separar estos dos gneros de otros miembros de las Enterobacterias.
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$" Resultados

MEDIO NO INOCULADO

POSITIVO

NEGATIVO

NEGATIVO

Figura 29. Pruebas bioqumicas de fenilalanina desaminasa

$" Interpretacin Positiva: Rojo claro a intenso en el pico de flauta. Negativo: Amarillo $" Reporte de resultados Positivo (+) Negativo (-)
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12. PRUEBA DE SULFURO INDOL MOVILIDAD (SIM)

$" Medio e cultivo: Medio SIM Composicin: a) Extracto de carne b) Peptona c) Hierro peptonizado (indicador de SH2) d) Tiosulfato de sodio (indicador de SH2) e) Agar f) Agua destilada g) pH = 7.3

$" Fundamento Determinar si un organismo es mvil o inmvil, si es capaz de liberar cido sulfhdrico por accin enzimtica de los aminocidos que contienen azufre produciendo una reaccin visible de color negro y por ltimo la capacidad de desdoblar el indol de la molcula triptfano, adems que la consistencia del medio permite la observacin de la movilidad de algunas bacterias. 1. Produccin de cido sulfhdrico 2. Produccin de indol 3. Movilidad
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1. Prueba de cido sulfhdrico

La proteolisis de las protenas en aminocidos (aa.) individuales, algunas especies bacterianas son capaces de liberar azufre enzimticamente de los diferentes aa. que las contienen, produciendo el gas cido sulfhdrico (SH2). La peptona, cistena y tiosulfato, todos son fuentes de azufre, pero las diferentes especies utilizan distintos compuestos o aa. que contienen azufre para producir SH2. La enzima responsable de sta actividad es la cisteinasa.

Primera etapa: La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio de una reaccin de reduccin que da un sulfito y un sulfato. Este es un proceso de respiracin anaerbica donde el tomo de azufre sirve como aceptor de electrones para la oxidacin de los sustratos orgnicos. El tiosulfato reemplaza al sulfato como aceptor de electrones y es una fuente de azufre para el organismo.

Segunda etapa: El gas incoloro SH2 reacciona con una sal pesada, citrato frrico de amonio para producir un precipitado negro insoluble, sulfuro ferroso.
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Bacteria (medio cido) + tiosulfato de sodio

gas SH2

SH2 + iones frricos

sulfuro ferroso (pp. negro)

Medios para la deteccin de H2S

$" Agar sulfito de bismuto $" Agar citrato sulfuro $" Agar desoxicolato - citrato $" Medio LIA $" Medio TSI $" Agar acetato de plomo $" Agar S-S $" Agar XLD $" Medio SIM

2. Prueba de la produccin de indol

El triptfano es un aminocido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e indolactico. Diversas enzimas intracelulares que intervienen en ste proceso reciben el
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nombre de triptofanasa, lo que implica el sistema completo de enzimas vinculadas con la produccin del indol. El principal intermediario en la degradacin del triptfano es el cido indolpirvico. La degradacin del triptfano libera indol, cido pirvico, amoniaco y energa. El cido pirvico puede ser nuevamente metabolizado por medio del ciclo glucoltico o entrar en el ciclo de Krebs para liberar CO2 y H2O y una gran produccin de energa. El NH3 puede ser utilizado para sintetizar nuevos aminocidos empleando la energa que se encuentra para la reaccin anablica. La prueba de indol se bas en la formacin de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo de p-dimetilaminobenzaldehdo (sustancia activa del reactivo de Kovacs). La formacin de indol se produce solamente en aquellos organismos capaces de fermentar los hidratos de carbono. La elevada acidez producida por la fermentacin de la glucosa puede impedir el crecimiento del organismo o inhibir la enzima. El agregado de triptfano estimula la produccin de indol mientras que la glucosa la inhibe.

95

COOH

NH N

T rip to fa n a s a H 2O D e s a m in a c i n

L - T r ip t f a n o

+
H N
3

+
C COOH

N H

H In d o l c id o P ir v ic o A m o n ia c o

3. Movilidad
Determina si un organismo es mvil o inmvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos, que se encuentran principalmente entre los bacilos; sin embargo algunas formas de cocos son inmviles. Las bacterias mviles pueden contener un solo flagelo o muchos; adems su localizacin vara con su especie bacteriana y las condiciones de cultivo. A veces, las bacterias con movilidad producen variantes no mviles que parecen ser estables y raramente se revierten en formas mviles.
Figura 30. Salmonella typhi

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Medios para la deteccin de movilidad 1. SIM 2. MIO

$" Consistencia del medio Semislido en forma vertical

$" Inoculacin Picadura en forma vertical

$" Condiciones de incubacin Tiempo: 24 - 48 horas Temperatura 35 - 37 C Los cultivos que van a someterse a pruebas de indol debern ser incubados aerbicamente el descenso de la tensin de oxgeno disminuye la produccin de indol.

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$" Reactivos adicionales Prueba de indol Reactivo de Kovacs Adicionar 5 gotas y agitar suavemente el tubo Interpretar inmediatamente. Conservacin: Los reactivos debern guardarse en el refrigerador (4 C) mientras no se usan, su estabilidad es variable, por lo tanto se har todas las semanas un control de calidad, desechndolos si muestran una reaccin dbil o negativa con un organismo positivo conocido.

$" Reporte de resultados

PRUEBA Sulfuro Indol Movilidad

Tabla 2. Reporte de resultados del medio SIM

POSITIVO + + +

NEGATIVO -

98

$" Resultados

INDOL NEGATIVO INDOL POSITIVO MEDIO SIN INOCULAR

GAS
Figura 31. Pruebas bioqumicas del medio SIM

H2S POSITIVO

H2S NEGATIVO

$" Interpretacin 1. cido sulfhdrico

Positivo: Ennegrecimiento del medio Negativo: Sin ennegrecimiento

99

2.

Indol

Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio. Negativa: No se produce color Negativa: Color naranja en la superficie del medio. Indica desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede ser el precursor de la formacin de indol. La reaccin positiva despus de 24 horas indica una prueba completa. Si el cultivo de 24 horas es negativo deber incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba.

3.

Movilidad

Positiva. Los organismos mviles migran de la lnea de siembra y se difunden en el medio provocando turbiedad. Negativa. Crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la lnea de siembra.

100

$" Aplicaciones

Bacterias

Produccin de H2 S +o+o+ -

Produccin de Movilidad indol + +o+o+ + +o+ + +o-

Salmonella typhi Salmonella E. coli Klebsiella Enterobacter Citrobacter Shigella

Tabla 3. Aplicaciones del medio SIM

Figura 32. Salmonella typhi

Figura 33. Escherichia coli

101

12.

AGAR TRIPLE AZUCAR HIERRO: TSI

$" Medio de cultivo: Agar hierro triple azcar (agar hierro de Kligler, AHK) Composicin: f) Extracto de carne g) Extracto de levadura h) Peptona i) Proteasa j) Lactosa k) Dextrosa l) Sulfato ferroso m) Cloruro de sodio n) Tiosulfato de sodio o) Agar p) Agua destilada q) Indicador: Rojo de fenol !" cido: amarillo !" Alcalino: rojo !" Medio no inoculado: naranja rojizo (pH =7.4)

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$" Fundamento Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono especfico incorporado en un medio de crecimiento bsico, con produccin o no de gases, junto con la determinacin de posible cido sulfhdrico. El agar AHK es un medio diferencial que determina tanto la fermentacin de los hidratos de carbono y la produccin de cido sulfhdrico. Las bacterias pueden utilizar cualquiera de los sustratos incorporados en el medio y ser metabolizados, caractersticas que son utilizadas para la diferenciacin de stas, principalmente para las Enterobacterias. Este medio contiene lactosa con una concentracin de 1% y glucosa 0.1%, lo cual permite la observacin de la fermentacin de uno o de ambos carbohidratos por parte de las bacterias, adems de la produccin de gas y de cido sulfhdrico. La fermentacin es un proceso que se lleva acabo en condiciones aerbicas (pico de flauta) y anaerbicamente (capa inferior). En el pico de flauta la glucosa (monosacrido) es catabolizada inicialmente por medio del ciclo anaerbico de Embden-Meyerhof, utilizado tanto por los aerobios como por los anaerobios para dar cido pirvico, y posteriormente ste ser degradado a travs del ciclo de Krebs para dar CO2, H2O y energa.

103

Por otra parte la lactosa (disacrido) ser primero degradada a sus monosacridos correspondientes (glucosa y galactosa).

Beta-galactosidasa Lactosa glucosa + galactosa

Ciclo de Krebs Glucosa o galactosa CO2 + H2O + energa anaerbico

El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y una concentracin 10 veces mayor de lactosa. Las Enterobacterias y los fermentadores de glucosa comienzan metabolizando este azcar, ya que las enzimas que utilizan la glucosa estn presentes como constituyentes de las bacterias, y stas pueden obtener mayor energa por utilizacin del azcar ms simple. Todos los otros carbohidratos deben ser convertidos en glucosa para entrar en el ciclo de Embden-Meyerhof. La utilizacin de la glucosa se realiza en forma aerobia sobre la estra, donde el oxgeno presente acta como aceptor terminal de electrones y en la parte terminal de la columna en condiciones de anaerobiosis. Una vez que una bacteria fermentadora de glucosa ha reducido toda la glucosa disponible a piruvato, comenzar a metabolizar el piruvato a travs del ciclo aerbico de Krebs (sobre la estra), formando
104

productos finales cidos. El cido en el medio hace virar el amarillo del indicador de pH, rojo de fenol. Entonces, luego de 6 horas de incubacin, la zona de la estra y el fondo del tubo inoculado con un fermentador de glucosa tendrn un color amarillo. Si el microorganismo no fermenta la glucosa, el fondo permanecer rojo (indicando que no hay variacin del pH) o se alcalinizar (lo que puede visualizarse por un color rojo algo ms intenso que del medio original), demostrando que la bacteria no es miembro de la familia Enterobacteriaceae. Despus de haber agotado la cantidad limitada de glucosa, una bacteria con capacidad para utilizar la lactosa o sacarosa comenzar a degradarlas. Como el medio contiene 10 veces ms lactosa que glucosa, las bacterias encontrarn sustrato suficiente para continuar la formacin de productos finales cidos. Luego 18 24 horas de incubacin todo el medio TSI permanecer de color amarillo. Esta reaccin se denomina cido sobre cido (A/A) y el organismo se identifica como un fermentador de lactosa. La produccin de gas provocar la ruptura de la columna de agar o la empujar hacia la parte superior, de modo que un fermentador de lactosa que produce gas dar una reaccin A/A ms gas. Si el organismo en estudio no es capaz de usar la lactosa del medio, debe producir energa en forma menos eficiente al utilizar las protenas y aminocidos del medio como fuentes nutritivas.

105

El metabolismo proteico se produce en la superficie de la zona inclinada donde el oxgeno es abundante. Los productos de la degradacin de la peptona (como el amoniaco) son alcalinos y provocan el viraje del indicador rojo de fenol a su color rojo original. Un TSI inoculado con una bacteria que no fermenta la lactosa al cabo de 18-24 horas de incubacin presentar la zona inclinada roja y el fondo del agar permanecer amarillo debido al metabolismo anaerobio de la glucosa durante la primera etapa. Esta reaccin se denomina alcalina sobre cido (K/A). Las bacterias que fermentan la glucosa tambin pueden formar productos alcalinos a partir de la utilizacin de la peptona, sobre la zona inclinada. Estas reacciones sern K/K. $" Consistencia del medio Slido en pico de flauta $" Inoculacin Picadura y estra en pico de flauta $" Condiciones de incubacin Tiempo: 18 - 24 horas Temperatura: 35 - 37 C

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$" Resultados

K/A K/A

K/K K/K

GAS GAS

MEDIO MEDIO NO INO CULADO NO INO CULADO

A/A A/A

H2S H2S

Figura 34. Pruebas bioqumicas del medio TSI

Figura 35. Salmonella

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$" Interpretacin 1. Rojo en pico de flauta: alcalino; degradacin aerbica de glucosa. Amarillo en capa profunda: cido; degradacin anaerbica de la glucosa. 2. Amarillo en pico: cido Amarillo en capa profunda: cido 3. Rojo en pico de flauta: alcalino Sin cambio de color en capa profunda: alcalina. 4. Produccin de H2S: precipitado negro 5. Produccin de gases: Produccin de burbujas, descomposicin del medio, ligera muesca del medio sobre el costado del tubo o desplazamiento del medio del fondo, dejando un espacio libre. $" Observaciones Una bacteria productora de H2S puede dar tal cantidad de precipitado negro de sulfuro ferroso que oculte completamente la acidez producida en la capa profunda. Sin embargo, si se forma H2S es que existe en la capa profunda una condicin cida, aun cuando no se observe, y debe ser registrada como tal. Es esencial que se interprete la fermentacin al trmino de 18 24 horas de incubacin, ya que una interpretacin prematura o demorada dar formas de fermentacin no vlidas que llevarn a errores en el agrupamiento del gnero o especie.
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$" Reporte de resultados 1. K / A (Fermentacin de glucosa solamente) 2. A / A (Fermentacin de glucosa y lactosa) 3. K / K (No fermentacin de glucosa y lactosa). Los resultados se escriben siempre siguiendo un patrn. Primero la reaccin del pico de flauta seguida por la reaccin de la capa profunda, separadas por una barra.

$" Reacciones de TSI Pico de flauta alcalino / profundidad alcalina (K/K). No fermentacin de hidratos de carbono. Caracterstico de bacterias no fermentadoras como Pseudomonas aeruginosa. Pico de flauta alcalino / profundidad cida (K/A). Glucosa fermentada, lactosa no fermentada. Caracterstico de bacterias no fermentadoras de lactosa como especies de Shigella. Pico de flauta alcalino / profundidad cida (negra) (K/A/H2S). Glucosa fermentada, lactosa no fermentada; produccin de H2S. Caracterstico de bacterias no fermentadoras de lactosa y productoras de H2S como: Salmonella, Arizona, Citrobacter y algunas especies de Proteus.

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Pico de flauta cido / profundidad cida (A/A). Glucosa y lactosa fermentadas. Caracterstico de coliformes que fermentan lactosa como: E. coli y grupo KlebsiellaEnterobacter.

No fermentador
No fermentacin pH = 7.4
Aminas Pptidos

O2

Pico de flauta alcalino/profundidad alcalina

No fermentador de lactosa Dextrosa cidos mixtos

Aminas Pptidos

O2

Pico de flauta cido/profundidad cida Reaccin inicial

Dextrosa cidos mixtos

Aminas

Pptidos

O2

Pico de flauta alcalino/profundidad cida Reaccin retardada

Fermentador de lactosa (sacarosa)

Dextrosa + lactosa cidos mixtos

O2
Aminas Pptidos

Pico de flauta cido/profundidad cida

Figura 36. Fundamento de la Prueba bioqumica TSI

$" Aplicaciones Este tipo de pruebas se utilizan principalmente para la identificacin primaria de los miembros de las Enterobacterias.

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Especie bacteriana

Superficie Fondo Gas H2S inclinada A K A A K K K K K K K K K K K K K K A A A A A A A A A A A A A A A A ++ + ++ + + + + + + + + +++ +++ +++ +++

Enterobacter Hafnia Klebsiella E. coli Shigella Salmonella typhi S. paratyphi S. choleraesuis Otras Salmonellas Citrobacter Edwarsiella Serratia Proteus vulgaris P. mirabilis P. morganii P. rettgeri Providencia

+ +++ +o-

Tabla 4. Aplicaciones de la Pruba con TSI

111

13. Agar lisina hierro: LIA

$" Medio de cultivo: Base de descarboxilasa de Moller Composicin: a) Peptona b) Extracto de carne c) Piridoxal d) L-lisina e) Citrato de amonio f) Tiosulfato de sodio g) Glucosa h) Agua destilada i) Agar j) Indicador de pH: Prpura de bromocresol !" cido: color amarillo (pH = 5.2) !" Alcalino: color prpura (pH = 6.8) !" Medio no inoculado: color prpura intenso brillante (pH = 6.0)

$" Fundamento Mide la capacidad enzimtica de un organismo para descarboxilar un aminocido (lisina y arginina) para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad.

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La descarboxilacin es el proceso mediante el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especficas son capaces de atacar a los aminocidos en su grupo carboxilo dando una amina o una diamina y anhdrido carbnico. La descomposicin de los aminocidos se produce anaerbicamente. El proceso de descarboxilacin es irreversible, no oxidativo y requiere una coenzima comn, el fosfato de piridoxal. El aminocido L-lisina sufre la descarboxilacin para dar cadaverina y CO2 por accin de la enzima especfica lisinadescarboxilasa.

$" Consistencia del medio Slido en pico de flauta $" Reporte resultados de

$" Inoculacin Por picadura y estra, inculo liviano.

$" Condiciones de incubacin Temperatura: 35 37 C Tiempo: 18 24 horas

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A = cido K = Alcalino N = Neutra R = Rojo (desaminacin oxidativa)

$" Resultados

K/K K/K

H2S H2S K/A K/A GAS GAS

MEDIO MEDIO NO INOCULADO NO INOCULADO

H2S H2S

K/K K/K

Figura 37. Pruebas bioqumicas con medio LIA

$" Interpretacin K/K = azul de Prusia /azul de Prusia Desaminacin oxidativa / descarboxilacin K/A= azul de prusia / lila No desaminacin Produccin de H2S = Ennegrecimiento del medio Produccin de gas = Burbujas o levantamiento del medio de cultivo de las paredes del tubo.

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$" Aplicaciones Especie bacteriana Superficie inclinada K K K K K K K K K K K K R R KoR R R Fondo KoN A K A KoN KoN A K KoN A KoN KoN A A A A A Gas -o+ +o-o+ -o+ +o+o+ -o+ H2S +o-o+ + + +o+ -

E. coli Shigella Salmonella typhi S. paratyphi Otras Salmonellas Arizona Citrobacter Edwarsiella Klebsiella Enterobacter cloacae E. aerogenes E. hafniae Proteus vulgaris P. mirabilis P. morgarnii P. rettgeri Providencia

Tabla 5. Aplicaciones de la Prueba Bioqumica LIA

115

13. Movilidad, indol y ornitina: MIO

$" Medio de cultivo Composicin: a) Extracto de levadura b) Peptona c) L-ornitina d) Dextrosa e) Agar f) Agua g) Indicador de pH: prpura de bromocresol !" cido: color amarillo (pH = 5.2) !" Alcalino: color prpura (pH = 6.8) !" Medio no inoculado: color prpura intenso brillante (pH = 6.0)

$" Fundamento El medio MIO se utiliza para la identificacin de Enterobacterias sobre la base de movilidad, la produccin de ornitina descarboxilasa y de indol. 1. Descarboxilacin de ornitina 2. Produccin de indol 3. Movilidad
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1. Descarboxilacin de ornitina Mide la capacidad enzimtica de un organismo para descarboxilar un aminocido (ornitina) para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad. La descarboxilacin es el proceso mediante el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especficas son capaces de atacar a los aminocidos en su grupo carboxilo dando una amina o una diamina y anhdrido carbnico. La descomposicin de los aminocidos se produce anaerbicamente. El proceso de descarboxilacin es irreversible, no oxidativo y requiere una coenzima comn, el fosfato de piridoxal. El aminocido L-lisina sufre la descarboxilacin para dar cadaverina y CO2 por accin de la enzima especfica lisinadescarboxilasa. El aminocido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina descarboxilasa para dar la diamina putrescina y CO2, producidos en condiciones anaerobias.

2. Prueba de la produccin de indol

El triptfano es un aminocido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e indolactico.

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Diversas enzimas intracelulares que intervienen en ste proceso reciben el nombre de triptofanasas, lo que implica el sistema completo de enzimas vinculadas con la produccin del indol. El principal intermediario en la degradacin del triptfano es el cido indolprvico. La degradacin del triptfano libera indol, cido pirvico, amoniaco y energa. El cido pirvico puede ser nuevamente metabolizado por medio del ciclo glucoltico o entrar en el ciclo de Krebs para liberar CO2 y H2O y una gran produccin de energa. El NH3 puede ser utilizado para sintetizar nuevos amiocidos empleando la energa que se encuentra para la reaccin anablica. La prueba de indol se basa en la formacin de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo de p-dimetilaminobenzaldehdo (sustancia activa del reactivo de Kovacs). La formacin de indol se produce solamente en aquellos organismos capaces de fermentar los hidratos de carbono. La elevada acidez producida por la fermentacin de la glucosa puede impedir el crecimiento del organismo o inhibir la enzima. El agregado de triptfano estimula la produccin de indol mientras que la glucosa la inhibe.

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3. Movilidad Determina si un organismo es mvil o inmvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos, que se encuentran principalmente entre los bacilos; sin embargo algunas formas de cocos son inmviles. Las bacterias mviles pueden contener un solo flagelo o muchos; adems su localizacin vara con su especie bacteriana y las condiciones de cultivo. A veces, las bacterias con movilidad producen variantes no mviles que parecen ser estables y raramente se revierten en formas mviles. Los organismos no mviles carecen de flagelos.

Medios para la deteccin de movilidad 3. SIM 4. MIO

$" Consistencia del medio Semislido en forma vertical

$" Inoculacin Por picadura, en forma vertical

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$" Condiciones de incubacin Tiempo: 24 48 horas Temperatura: 35 37 C

$" Reactivos adicionales Prueba de indol Reactivo de Kovacs Adicionar 5 gotas y agitar suavemente el tubo Interpretar inmediatamente. Conservacin: Los reactivos debern guardarse en el refrigerador (4 C) mientras no se usan su estabilidad es variable, por lo tanto se har todas las semanas un control de calidad, desechndolos si muestran una reaccin dbil o negativa con un organismo positivo conocido.

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$" Resultados

ORNITINA POSITIVO MOTILIDAD NEGATIVO

ORNITINA NEGATIVO MOTILIDAD POSITIVO

INDOL NEGATIVO MEDIO NO INOCULADO

INDOL POSITIVO

Figura 38. Pruebas bioqumicas del medio MIO

$" Interpretacin

1.

Ornitina descarboxilasa

Positivo: color prpura del medio Negativo: Color amarillo en el fondo del tubo que puede ser prpura al final.

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2.

Indol

Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio. Negativa: No se produce color Negativa: Color naranja en la superficie del medio. Indica desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede ser el precursor de la formacin de indol. La reaccin positiva despus de 24 horas indica una prueba completa. Si el cultivo de 24 horas es negativo deber incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba.

3.

Movilidad

Positiva. Los organismos mviles migran de la lnea de siembra y se difunden en el medio provocando turbiedad. Negativa. Crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la lnea de siembra. *Se leen las reacciones de movilidad y de ornitina descarboxilasa antes de agregar el reactivo de Kovacs para la prueba de indol.*

122

$" Reporte de resultados Prueba Positivo Negativo Movilidad + Indol + Ornitina + -

Tabla 6. Reporte de resultados del medio MIO

$" Aplicaciones $" Microorganismos ornitina positivos Especies de Enterobacter Proteus mirabilis Proteus morganii Yersinia enterocolitica $" Microorganismos ornitina negativos Especies de Klebsiella Enterobacter aglomerans Proteus vulgaris Proteus rettgeri Yersinia pestis Yersinia pseudotuberculosis

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Bacterias

Produccin de indol + +o+o-

Movilidad + + +o+ + +o-

Produccin de H2S +o+o+ -

Salmonella typhi Otras Salmonellas E. coli Klebsiella Enterobacter Citrobacter Shigella

Tabla 7. Aplicaciones de la Prueba bioqumica MIO

Figura 39. Shigella

124

El metabolismo se define como una serie de reacciones qumicas que se llevan acabo en el microorganismo de tipo fisiolgico para que se adapte al medio. Las funciones especficas del metabolismo son cuatro: Obtencin de energa qumica de las molculas combustibles. 2. La conversin de principios nutritivos exgenos en sillares de construccin o precursores de los componentes macromoleculares de la clula. 3. El ensamblaje de estos materiales para formar, protenas, cidos nucleicos, lpidos y otros componentes celulares. 4. La formacin y degradacin de las biomolculas necesarias para las funciones especializadas de las clulas. Anabolismo: Sntesis de membranas, protenas, etc). macromolculas (cpsulas, 1.

La biosntesis de las molculas orgnicas a partir de estos, precisa del consumo de energa qumica aportada por el ATP generado durante el catabolismo.

125

Catabolismo: Degradacin o rompimiento de molculas grandes (glcidos, lpidos y protenas), se degradan para producir molculas ms sencillas. El catabolismo va acompaado de la liberacin de la energa qumica inherente a la estructura de las molculas orgnicas o nutritivas y a su conservacin en forma de ATP. Las clulas pueden dividirse en dos grandes grupos segn la forma qumica del carbono que precisan tomar del entorno: $" Auttrofas: (auto alimentadas), pueden utilizar el CO2 como fuente nica de carbono y construir a partir de l los esqueletos carbonados de todas sus biomolculas orgnicas. $" Hetertrofas: (alimentadas de otros), que no pueden emplear el CO2 y tienen que obtener el carbono de su entorno en una forma reducida relativamente compleja, tal como la glucosa.

El segundo criterio por el que pueden clasificarse las clulas es la naturaleza de su fuente de energa: $" Fottrofas. Clulas que emplean la luz como fuente de energa. $" Quimiotrfas. Las que emplean energa de las reacciones de oxidacin-reduccin.
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 Quimiorgantrofos. Quimiotrfos que necesitan molculas orgnicas complejas como dadores electrnicos, tales como glucosa. Quimiolittrofos. Organismos que pueden emplear dadores electrnicos inorgnicos sencillos, tales como el hidrgeno, sulfuro de hidrgeno, amoniaco o azufre.

Los hetertrofos pueden dividirse en las siguientes clases: $" Aerobios. Emplean oxgeno molecular como ltimo aceptor de electrones en sus dadores electrnicos orgnicos. $" Anaerobios. Emplean como aceptor electrnico alguna otra molcula en lugar del oxgeno. $" Facultativos. Clulas que viven en condiciones ya sean aerbicas o anaerbicas. $" Anaerobios estrictos. Clulas que no pueden utilizar el oxgeno en ninguna circunstancia. Hay dos grupos principales de bacterias: las saprofitas, que viven sobre los cuerpos muertos de animales y vegetales, y las simbiontes, que viven en animales o plantas vivas. Las saprofitas son importantes porque descomponen los cuerpos de las plantas y animales muertos en sus componentes esenciales, hacindolos accesibles para ser utilizados como alimento por las plantas.

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Muchas bacterias simbiontes se encuentran, en condiciones normales, en los tejidos humanos, incluso en el tubo digestivo y la piel, donde pueden resultar indispensables para los procesos fisiolgicos. Este tipo de relacin recibe el nombre de mutualismo. En el comensalismo, las bacterias simbiontes obtienen los nutrientes de sus huspedes vivos causndoles un dao considerable. Los parsitos, el tercer tipo, pueden provocar la destruccin de las plantas o de los animales en los que viven. Por lo general las macromolculas son hidrolizadas en el exterior de la clula por la accin de exoenzimas y son introducidos en la clula en forma de monmeros o de dmeros. Las hexosas tras unos pasos previos de transformacin son hidrolizados en dos mitades; los productos de esta hidrlisis se convierten en cido pirvico; ste ltimo ocupa un lugar clave en el metabolismo intermediario y constituye el punto de partida de numerosas vas anablicas y catablicas.

PRODUCCIN DE ENERGA
Las clulas en crecimiento requieren una provisin constante de energa metablica, en una forma que pueda ser usada para la biosntesis. El mundo microbiano ha desarrollado modelos productores de energa extraordinariamente
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diversos. Algunos de ellos usan donantes de electrones inorgnicos y varios aceptores de electrones (oxgeno, nitratos, sulfatos) para proporcionar energa destinada a formar sus propios constituyentes orgnicos a partir del CO2. El fin primordial de la degradacin de los sustratos consiste en obtener energa (ATP). Las reacciones que van acompaadas de una obtencin de energa son reacciones oxidativas. Las clulas se liberan del carbono oxidado en forma de anhdrido carbnico, los distintos microorganismos utilizan diferentes caminos para eliminar el hidrgeno que se va formando de manera constante (NADH2), esto es, para regenerar el NAD. Segn sea el aceptor final de H+ se diferencian la respiracin, la fermentacin y la respiracin anaerbica.

VIAS DE DEGRADACIN DE LAS HEXOSAS

Rutas catablicas: - Gluclisis - Pentosa fosfato - Entner-Duodoroff

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I. Gluclisis
Se refiere a la degradacin de la glucosa hasta piruvato. La gluclisis puede ocurrir en condiciones aerobias o anaerobias. En aerobiosis generalmente funciona en conjunto con el ciclo de Krebs en el cual el piruvato se oxida hasta CO2 y agua. En anaerobiosis el piruvato se lleva a la fermentacin. En la gluclisis ocurren dos fosforilaciones a nivel del sustrato: 1) En el paso de 3-fosfoglicerato a 2-fosfoglicerato en donde se sintetiza un ATP. 2) En el ltimo paso de la va, en la transformacin de fosfoenilpiruvato a piruvato, en donde se forma otro ATP.

Secuencia de reacciones en la gluclisis En conjunto, la ecuacin de la gluclisis para producir lactato es la siguiente:

Glucosa + 2 ADP (adenosina difosfato) + 2 fosfato + 2 lactato + 2 ATP (adenosina trofosfato) + 2 H2O

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Aunque las etapas intermedias implicadas son muchas y complejas, una visin simplificada podra describir el proceso como: 1. La incorporacin inicial de dos grupos fosfato dentro de la molcula de glucosa de seis tomos de carbono. Los grupos fosfato los proporcionan dos molculas de ATP, mediante la utilizacin de energa. 2. El compuesto intermedio de seis tomos de carbono que se forma, fructosa 1,6-difosfato, se rompe en dos compuestos ms simples, con tres tomos de carbono cada uno. 3. Estos compuestos de tres tomos de carbono, fosfato de dihidroxiacetona y gliceraldehdo-3-fosfato, son cada uno metabolizados para dar piruvato, en una va con numerosos pasos intermedios. Durante este proceso, cada uno de los compuestos de tres tomos de carbono produce dos molculas de ATP que se utilizaron en la etapa 1. Adems se producen dos molculas del cofactor intermediario NADH, las cuales pueden ser oxidadas bajo condiciones aerobias, en una ruta separada que rinde seis molculas de ATP. De esta forma, la gluclisis puede producir seis molculas de ATP por cada molcula de glucosa cuando hay oxgeno disponible, pero slo dos molculas de ATP bajo condiciones con dficit de oxgeno. 4. Las dos molculas de piruvato resultantes pueden ser utilizadas por el ciclo mitocondrial del cido ctrico despus de convertirse en acetil-CoA produciendo
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otras 30 molculas de ATP. En resumen, se pueden producir un total de 36 molculas de ATP mediante el metabolismo completo de molcula de glucosa bajo condiciones aerobias, pero slo dos molculas de ATP bajo condiciones anaerobias. 5. Por ltimo, una de las molculas intermediarias de tres tomos de carbono, el gliceraldehdo-3-fosfato puede en una reaccin lateral, convertirse en 2,3difosfoglicerato. Todas las reacciones del sistema son fcilmente reversibles, con la excepcin de tres de ellas: la fosforilacin de la glucosa catalizada por la hexocinasa, la de la fructosa-6-fosfato catalizada por la fosfofructocinasa y la conversin de fosfoenolpiruvato en piruvato catalizada por la piruvato cinasa. La coenzima esencial NAD (dinucletido de adenina y nicotinamida) es necesaria para un proceso de conversin enzimtica en la formacin del piruvato. Cuando el oxgeno es deficiente, esta coenzima slo puede regenerarse por reoxidacin del NADH en presencia de oxgeno, produciendo NAD, energa y agua. La gluclisis puede continuar en condiciones anaerobias en la formacin de lactato y la regeneracin del NAD, pero a cambio de producir menos energa por molcula de glucosa metabolizada.

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GLUCLISIS

Glucosa
ATP ADP

2 A DP

2
2 A TP

fosfoenolpiruvato

piruvato H2O 2 2-fosfoglicerato

Glucosa-6-fosfato

Fructosa-6-fosfato
ATP ADP

2 3-fosfoglicerato
2 A DP

2 A TP

Fructosa-1,6-bifosfato

2 1,3-bifosfoglicerato
2 NA D 2 PO4

2 NA DH

Dihidroxiacetona fosfato

3-fosfogliceraldehdo

Esquema 1. Gluclisis

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II. Ruta de Entner-Duodoroff En esta va se produce slo una molcula de ATP por

cada molcula de glucosa. Sus productos finales son piruvato y gliceraldehdo-3fosfato. Esta va es mucho menos usada por los microorganismos que la ruta de la gluclisis. Es ms rpida que la gluclisis por la menor cantidad de reacciones que se llevan acabo. En esta va la glucosa 6-fosfato sufre en primer lugar una deshidrogenacin y se convierte en 6-fosfoglucnico. Por la accin de una 6-fosfogluconatodeshidrogenasa se pierde una molcula de agua y se forma cido 2-ceto-3-desoxi-6fosfoglucnico (KDPG), el cual se divide por accin de una aldosa especfica, en cido pirvico y 3-fosfogliceraldehdo.

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III. Hexosa monofosfato (ruta de pentosas- fosfato)

Aunque la gluclisis y el cido del ciclo tricarboxlico son las principales vas catablicas de la glucosa en la mayora de los tejidos, algunas clulas poseen vas alternativas para producir metabolitos tiles a partir de la glucosa. La va hexosa monofosfato es de gran inters por ser la principal fuente de NADP reducido en el organismo (el NADP reducido participa en muchas reacciones de sntesis, aportando sus hidrgenos). Esta va comprende una serie de reacciones estrechamente conectadas con la gluclisis, ya que ambos procesos forman intermediarios comunes. La va puede dividirse en dos fases: En la primera, la glucosa 6-fosfato sufre dos oxidaciones por deshidrogenacin y una descarboxilacin que la transforma en una pentosa fosfato. Se forma ribulosa-5-fosfato y se libera CO2 y con la formacin de la ribulosa 5-fosfato se pone fin al verdadero proceso oxidativo. En la segunda fase la ribulosa-5-fosfato da lugar a dos ismeros distintos. sta junto con la xilosa-5-fosfato se combina para formar una triosa-fosfato y una heptosafosfato, las cuales a su vez darn una hexosa-fosfato y una triosa fosfato.
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En un ciclo que permite la oxidacin completa de los carbohidratos no parece operar en su forma completa en sistemas microbianos anaerobios. En esta ruta se forman pentosas y luego estas se rompen en unidades de 3 y 2 carbonos, dando lugar a lactato y etanol. El rendimiento neto en la va de las HMP es de una molcula de ATP por cada molcula de glucosa catabolizada. Es la nica va o fuente de D-ribosa para la sntesis de nucletidos. Se lleva a cabo en el citoplasma; todas las enzimas que intervienen son solubles. Es una va energtica para microorganismos aerobios facultativos. Sus funciones metablicas son diversas pero se resumen en lo siguiente: 1. Es una va alternativa de degradacin de la glucosa para obtener ATP acoplada con la fosforilacin oxidativa. 2. Es la fuente principal, sino la nica, de NADPH citoplasmtico en clulas eucariticas como fuente de poder reductor, el cual es necesario para la biosntesis de cidos grasos y otros procesos como la reduccin del glutatin, la biosntesis de esteroides y las reacciones de hidroxilacin.

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3. Es la va que proporciona pentosas fosfato para la sntesis de ribosa y desoxirribosa necesarias para la biosntesis de cidos nucleicos en general; adems para la sntesis de histidina cuyo precursor es el fosforribosil pirofosfato, derivado de la pentosa. 4. Es la va de degradacin de la ribosa y la desoxirribosa, procedentes tanto de la digestin de cidos nucleicos como del recambio metablico de nucletidos. 5. Es la ruta que conecta el metabolismo de las hexosas con el de otros azcares, tales como arabinosa, y xilosa, componentes estructurales de glucoprotenas y paredes celulares de vegetales, as como principales fuentes carbonadas de muchas bacterias. Por otro lado la sntesis de ribulosa-5-fosfato, intermediario de la va de las pentosas, es fundamental en las plantas verdes para llevar acabo el ciclo de Calvin. 6. Es la fuente de un importante azcar de cuatro carbonos, la eritrosa-4-fosfato, precursor para la biosntesis de los compuestos aromticos en bacterias y plantas.

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VA HEXOSA FOSFATO

Glucosa

GL UC OL I S I S

Sedoheptulosa -7-P

Glucosa-6-fosfato
N ADP N ADPH

5-P-gluconato
N ADP N ADPH CO2

Fructosa -5-P

Ribulosa-5-P Ribosa -5-p

Gliceraldehdo -3-P

Esquema 2. Va Hexosa - fosfato

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Gliceraaldehdo

-3-P

Fructosa -5-P

Eritrosa -4-P

Xilusa -5-P

CICLO DE KREBS
Es el proceso de la respiracin mediante el cual, las clulas aerbicas obtienen energa a partir de la oxidacin de las molculas combustibles por el oxgeno molecular. El ciclo de los cidos tricarboxlicos es una secuencia de reacciones que tiene efecto en los organismos aerbicos. Esta catalizada por un sistema multienzimtico que acepta el grupo acetilo del acetil CoA como combustible degradndolo hasta CO2 y H+. Estos ltimos son conductores a travs de una secuencia de protenas transportadoras de electrones hasta el oxgeno molecular, que se reduce para formar agua. El piruvato ocupa una posicin clave en las diferentes rutas de degradacin de carbohidratos, es el principal producto de la gluclisis y puede sufrir una gran variedad de transformaciones, dependiendo de s el organismo se encuentra en un ambiente aerobio o anaerbico: 1. En aerobiosis el piruvato pasa al ciclo de Krebs. 2. En anaerobiosis puede ser transformado en alcoholes o cidos. Mediante la descarboxilacin del cido pirvico se forman compuestos con dos tomos de carbono que se unen a continuacin con la molcula aceptora adecuada (cido oxalactico) y entrar a formar parte del ciclo de los cidos tricarboxilicos (TCC) y mediante una serie de reacciones
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escalonadas son oxidados hasta anhdrido carbnico; los tomos de hidrgeno que se liberan en los pasos que suponen una deshidrogenacin entran a formar parte de la cadena respiratoria productora de ATP (fosforilacin oxidativa). Sin embargo, entre los compuestos intermediarios del TCC se encuentran diversos cidos orgnicos que constituyen los productos iniciales de varias cadenas biosintticas (cido alfa-cetoglutrico, cido frmico, cido oxalactico). El TCC no constituye nicamente una oxidacin terminal de las sustancias nutritivas sino que es tambin un gran <<pvot>> y como tal tambin suministra los productos iniciales para la sntesis de los compuestos elementales de la clula. Si estos cidos fuesen constantemente eliminados del ciclo, no podra regenerarse la molcula aceptora y el ciclo se detendra. Mediante las denominadas reacciones complementarias (secuencias anapletricas) se consigue que el nmero de compuestos intermediarios que se integran secundariamente al TCC iguale a la prdida que ocasionan los procesos biosintticos. Oxidacin completa Se le conoce tambin como ciclo de los cidos tricarboxilicos, sirve para la oxidacin completa del piruvato y constituye un eslabn clave del metabolismo, ya que muchos de sus compuestos intermediarios pueden alimentar
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rutas de biosntesis de aminocidos, piridinas, tetrapirroles y lpidos. Comprende la fase aerbica de la oxidacin de la glucosa y es donde se obtiene un mayor rendimiento de energa. Sus productos finales son: CO2 y H2O. En el patrn ms comn el piruvato de la ruta glucoltica se oxida para dar origen a una molcula de acetil-CoA y CO2 y la acetil-CoA se oxida en el ciclo de Krebs. El balanceo neto de una molcula de glucosa que se ha oxidado por gluclisis primero y luego por el ciclo de Krebs es de 38 ATP. Adems de tener funciones degradativas, en el ciclo de Krebs se sintetizan sustancias que actan como precursores de aminocidos, pirimidinas y porfirinas. CICLO DE KREBS Esquema 3
NADH NAD CoA

Piruvato

CoA

CO2

Acetil CoA

oxalacetato
NADH NAD

citrato

malato isocitrato
H2O NAD NADH CO2

fumarato
FADH2 FAD

Alf a-cetoglutarato
NAD NADH CO2 CoA

succinato
CoA

Succinil CoA

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GTP GDP

METABOLISMO AEROBIO Y ANAEROBIO

Las bacterias se integran en varios grupos segn el efecto del O2, sobre su crecimiento y metabolismo, estas propiedades son importantes para la patogenia y para el aislamiento e identificacin de las bacterias.

FERMENTACIONES
En sentido estricto se designan fermentaciones aquellos procesos de consecucin de energa en los que el hidrgeno pasa finalmente a un aceptor orgnico de electrones. El oxgeno no interviene en los procesos fermentativos. El trmino fermentacin hace referencia al metabolismo anaerobio de los hidratos de carbono. En la fermentacin el aceptor de electrones es un compuesto orgnico, mientras que en la respiracin suele ser el oxigeno (respiracin aerobia). Cierto nmero de fermentaciones estn basadas en la va glucoltica (Embden Meyerhof). Esta va genera ATP dos veces: primeramente a travs de la oxidacin del gliceraldehido-3-fosfato y de nuevo a travs de la conversin del fosfoenolpiruvato.

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1. Fermentacin lctica
Es la fementacin ms simple: Una reaccin en un solo paso catalizado por la lacticodeshidrogenasa ligada a ADN reduce el piruvato a lactato. No se forma gas. Dado que se consumen dos molculas de ATP en la formacin de hexosa difosfato a partir de glucosa y que se producen cuatro molculas de ATP, el rendimiento neto son dos ATP por hexosa. La fermentacin homolctica que forma solamente lactato.

Streptococcus lactis $" S. $" faecalis S. $" salivarius S. $" pyogenes S. $" cremoris S. $" thermophilus S. $" diacetilactis Lactobacillus lactis $" L. $" acidophilus L. $" bulgaricus L. $" casei L. $" plantarum L. $" inulinus

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Fermentacin heterolctica convierte solamente cada molcula de glucosa en lactato y producen adems cantidades considerables de etanol, acetato y CO2.

Leuconostoc mesenteroides $" Leuconostoc cirovorum $" Lactobacillus brevis $" Lactobacillus viridescens $"

C6H12O6

CH3-CHOH-COOH + CH3-CH2OH + CO2

Black J.G. 1996

Figura 40. Produccin de queso

2. Fermentacin alcohlica
El piruvato se convierte en CO2 ms acetaldehdo que despus se reduce a etanol en una reaccin ligada a NAD. Esta fermentacin es rara en las bacterias como va principal, es ms bien caracterstica en las levaduras.

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El etanol es uno de los productos ms extendidos entre los microorganismos resultantes de la fermentacin de los azcares. Los principales productores de etanol son las levaduras (Saccharomyces cerevisiae); el alcohol aparece tambin como producto secundario de la fermentacin de las hexosas y de las pentosas en diversas bacterias anaerobias y aerobias facultativas. La transformacin del piruvato en etanol abarca dos pasos. En el primero el piruvato es descarboxilado en una reaccin catalizada por la piruvatodescarboxilasa y en la que participa el tiaminpirofosfato dando acetaldhdo, el cual es reducido con NADH2 por la alcoholdeshidrogenasa convirtindose en etanol.

2 C6H12O6 + H2O

CH3-CH2OH + CH3-COOH + 2CO2 + 2 C3H8O3

Figura 41. Produccin de vino

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3. Fermentacin propinica
Esta va extrae energa adicional del substrato. El piruvato es carboxilado para producir oxalacetato, que es reducido para proporcionar succinato y despus es descarboxilado para proporcionar propionato. $" Gnero Propionibacterium Clostridium propionicum $" Selenomonas ruminantium $" La produccin de cido propinico a partir de cido lctico se efecta de acuerdo a la siguiente reaccin: 3CH3-CHOH-COOH 2CH3-CH2-COOH + CH3-COOH + CO2 +H2O

La reduccin del lactato o del piruvato a propionato se lleva acabo con un complejo biotina-CO2, el piruvato es carboxilado en primer lugar hasta oxalacetato y entonces es reducido hasta succinato pasando por malato y fumarato. El succinato es transformado en succinil-CoA de la forma habitual con la participacin de ATP y de la CoA, posteriormente es transformado en metil-malonil-CoA en una reaccin catlizada por la metil-malonil-CoA-isomerasa y en la que interviene tambin la vitamina B12. El succinil-CoA es descarboxilado y el propionil-CoA es hidrolizado dando propionato y CoA.
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La liberacin de una molcula de CO2 se lleva a cabo con ayuda de una transcarboxilasa que contiene biotina que lo transfiere nuevamente a piruvato.

4. Fermentacin cido mixta (frmica)

Es caracterstica de las Enterobacterias. Estos organismos utilizan su sustrato, parcialmente a travs de una fermentacin lctica, pero de modo principal a travs de una fermentacin caracterizada por el desdoblamiento del piruvato a formato y acetil CoA, a su vez ste ltimo genera un ATP. Produccin de gas: El formato producido en este tipo de fermentacin puede permanecer como tal siempre que el pH sea alcalino. Sin embargo en la mayora de las fermentaciones, el pH se acidifica: al alcanzarse un pH igual o menor a 6.0 las bacterias productoras de gas producen una enzima, llamada hidrogenasa frmica que convierte el cido frmico en CO2 y H2. Las enterobacterias que no forman esta enzima producen cido pero no gas. La fermentacin se lleva acabo con la formacin de gran nmero de compuestos en los que predominan los cidos orgnicos; los productos ms importantes de la fermentacin son el cido actico, frmico, mlico, lctico; etanol; glicerina; acetona; 2,3- butanodiol, CO2 e hidrgeno molecular.

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5. Fermentacin de metano: CO2 como aceptor de hidrgeno

Las bacterias metnicas (Methanobacterium) son tambin organismos anaerobios obligados. Transforman los alcoholes y cidos orgnicos en metano (CH4) y CO2, con lo que algunos cidos orgnicos son parcialmente oxidados: CO2 + 4 H2 CH4 + 2 H2O

Se oxidan los cidos grasos a hidratos de carbono a expensas del CO2 a CH4.

6. Fermentacin butilenglucolca (acetona)

El acetaldehdo activo resultante no es oxidado, si no que se condensa con un piruvato. El producto de esta reaccin es transformado en butilenglicol (butanodiol) en las reacciones siguientes, en las que los cuatro hidrgenos absorbidos equilibran los hidrgenos liberados en la produccin de las dos molculas de piruvato. Esta fermentacin al igual que la alcohlica, da solo productos neutros, formndose dos ATP por unidad de glucosa. Se denomina con frecuencia fermentacin acetonica debido a que con la exposicin al aire se oxida parte del butilenglicol que se transforma en acetona, la cual se reconoce con facilidad con una prueba especfica: VogesProskauer.
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El cido butirico, butanol, acetona, isopropanol, y otros cidos orgnicos son productos tpicos de la fermentacin de los hidratos de carbono que llevan acabo los productores Durante la anaerobios de esporas (Clostridium). fermentacin se forman cantidades variables de cidos, alcoholes, acetona y gas. Como sustratos se utilizan la glucosa y algunos polisacridos, cidos orgnicos y alcoholes. El cido butrico se forma por la condensacin de dos molculas de Acetil CoA, reaccin catalizada por la enzima tiolasa. El acetil CoA es reducido a continuacin con NADH2 reaccin catalizada por la beta-hidroxibutiril-CoAdeshidrogenasa, una flavoenzima, dando butiril-CoA. Mediante una desacilacin se libera cido butrico.

RESPIRACIN ANERBICA CON ACEPTORES INORGNICOS DE HIDRGENO FIJACIN DE NITRGENO

El nitrgeno atmosfrico se utiliza en primera instancia para la sntesis de biomolculas. Sin embargo slo un nmero relativamente pequeo de bacterias son capaces de utilizar el nitrgeno en esta forma. Las bacterias fijadoras de nitrgeno reducen nitrgeno molecular para sintetizar amoniaco.
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En cierta forma el sulfato y el nitrato actan como transportadores de oxgeno el hidrgeno procedente del sustrato los reduce. La capacidad de transferir electrones al sulfato o al nitrato permite a las bacterias oxidar el sustrato incluso en ausencia de oxgeno molecular y de esta forma obtener ms energa que por simple fermentacin. Reduccin de nitratos La reduccin de nitratos tiene en las bacterias dos destinos diferentes: asimilacin y desasimilacin. En el primer caso ocurren una serie de reducciones desde nitratos hasta nitritos y amoniaco. Este ltimo se utiliza para la sntesis de aminocidos, protenas y bases nitrogenadas, entre otros compuestos. En el segundo caso los nitratos se utilizan como aceptores de electrones; lo cual ocurre en la respiracin anaerobia.

NH2OH
HIDROXILAMINA

NH3
AMONIACO

NO3
NITRATO

NO2
NITRITO

NO
XIDO DE NITRGENO

N2O
XIDO NITRSO

N2
NITRGENO

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REDUCCIN DE SULFATOS
Varios Compuestos inorgnicos de azufre son aceptores de electrones en la respiracin anaerbica. El sulfato la forma ms oxidada del azufre, es uno de los aniones principales en el agua de mar y se utiliza por las bacterias reductoras de sulfato. El producto final de la reduccin del sulfato es el sulfito, un importante producto natural que participa en muchos procesos bioqumicos. La mayora de las plantas y los microorganismos utilizan el sulfato como fuente de azufre y obtienen el sulfuro necesario para la sntesis de los aminocidos sulfurados por reduccin asimilatoria de sulfato. Como producto secundario de esta reduccin del sulfato aparece el sulfuro de hidrgeno: 8 H+ + SO4 H2S + 2 H2O + 2 OH

Estas bacterias reductoras de sulfato, tambin llamadas desulfatizantes, son frente a los reductores de nitratos organismos anaerobios obligados y requieren condiciones estrictamente anaerobias.

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El metabolismo de los desulfatizantes es oxidativo. Obtienen la energa por fosforilacin oxidativa. La reduccin del sulfato se inicia en la clula mediante una activacin del sulfato; por una ATP-sulfurilasa se intercambia el resto pirofosfato del ATP con el sulfato. El pirofosfato es hidrolizado por la pirofosfatasa. El adenosin5-fosfosulfato (APS) es finalmente reducido con formacin de sulfito y liberacin de AMP. Ejemplos de microorganismos que reducen el sulfato:

Desulfovibrio desulfuricans $" D. $" vulgaris Desulfotomaculum nigrificans $" D. $" orientis D. $" ruminis

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ENTEROBACTERIAS
Las enterobacterias ms importantes se incluyen en la familia Enterobacteriaceae, la cual est constituida por bacilos Gram negativos. Hay especies mviles e inmviles. Todas fermentan glucosa con produccin de cido y gas, reducen los nitratos a nitritos y dan resultado negativo en la prueba de indofenol oxidasa. Esta familia comprende bacterias patgenas y no patgenas. Conviene recalcar que las caractersticas de patogenicidad relativa en las enterobacterias en su hbitat natural, que es el tracto gastrointestinal, se modifican radicalmente cuando estas bacterias alcanzan una localizacin extra intestinal, en sitios como el tracto genitourinario, lquido cefalorraqudeo, torrente sanguneo, mdula sea o la cavidad peritoneal. En vista de lo anterior, es posible aislar y cultivar miembros de la familia Enterobacteriaceae tanto a partir de muestras fecales y productos que pudieron haber sufrido una contaminacin fecal como el agua, alimentos, utensilios, etc.

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Es muy importante recordar que las muestras de cualquier tipo que se envan al laboratorio para investigar la presencia de estas bacterias, deben ser colectadas en condiciones aspticas transportadas y procesadas con la mayor rapidez, a fin de evitar alteraciones de muestras y prdida de viabilidad de las bacterias que se buscan, o crecimiento excesivo de grmenes banales que pudieran entorpecer el estudio.

BACTE RIA

O XIDASA

INDO L

VP

RM

CITRATO

SH2

U REA MOVILID G E LATI LIS INA AD NA DESC.

ARGIN I NA DESC. + + + -

E. Coli Shigella Edwardsiella Salmonella Arizona C itr obacter Klebsiella Enter obacter Serratia Pr oteus vulgar is Pr ovidencia

--

+ + + + +

+ + + -

+ + + + + + + +

+ + + + + +

+ + + + +

+ +

+ + + +

+ + + +

+ + + + + + -

Tabla 8. Caractersticas bioqumicas de bacilos Gram negativos

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COPROCULTIVO
En cualquier caso, es importante contar con procedimientos de laboratorio bien controlados que permitan detectar la presencia de agentes patgenos o bien dar alguna informacin sobre alteraciones en el equilibrio de la forma normal. El esquema que se propone en ste atlas para aislamiento e identificacin de enterobacterias patgenas figura entre numerosas variantes de trabajo utilizadas por diferentes autores. Se considera que este esquema es uno de los ms usuales y que puede dar resultados consistentes y satisfactorios.

COPROCULTIVO
MEDIOS
PARA AISLAMIENTO Agar entrico Hektoen Agar de eosina y azul de metileno Agar ENDO Agar XLD Agar Salmonella Shi gella Agar verde brillante PARA ENRIQUECIMIENTO Base de caldo tetrationato Caldo de selenito y cistina PARA IDENTIFIC ACIN Agar de hierro y triple azcar Caldo rojo de fenol y carbohidratos Medio urea Medio SIM Agar hierro y lisina Medio MIO Agar citrato de Simons

AISLAMIENTO
PLACAS: Agar S-S, ver de brillante, sulfito de bismuto. Agar sangre

ENRIQUECIMIENTO
TUBOS: Caldo tetrationato y/o caldo s elenit o PLACAS: Agar ver de brillante,s ulfito de bismuto, XLD,EMB, ENDO, Mac Conkey.

INCUBACIN 24 h 37 C PLACA: Agar EMB ENDO, XLD, Mac Conkey IDENTIFICACIN BIOQUMICA TSI, MIO, LI A, SIM, fenilalanina, RMVP,Citrato de Simmons , urea

Esquema 4. Coprocultivo

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Aislamiento de bacterias patgenas en heces

Salmonella, Shigella, E. coli, Y. enterocolitica

Materia fecal
Mac Conkey EMB o XLD Sulfito de bismuto Caldo de selenito

Seleccionar colonias lactosa (-)= Salmonella Lactantes: colonias lactosa (+)= E. coli y Shigella

Colonia negra = Salmonella

Sulfit de o

XLD, VB

Certifique Y. enterocolitica

Salmonella

Colonia negra Salmonella

Colonia lactosa (-) =

typhi

Esquema 5. Aislamiento de bacterias patgenas de heces

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FAMILIA MICROCOCACEAE
CARACTERSTICA MICROCOCCUS STOMATOCOCCUS PLANOCOCCUS STAPHYLOCOCCUS

Racimos irregulares Ttradas Cpsula Movilidad Crecimiento Gfurazolidona Fermentacin de glucosa Oxidasa Resistencia lisostafina de

+ + + + R -

+ + + R -

+ + No desarrolla R -

+ + S + +

Glicina de pptido-glicana cidos teicoicos en pared celular

Tabla 9. Caractersticas bioqumicas de la Familia Micrococaeeae

157

ESTAFILOCOCOS
El estafilococo es un microorganismo poco exigente y de fcil desarrollo. En los medios no selectivos sus colonias son grandes, opacas, lisas, circulares y enteras. A veces pueden presentar bordes ligeramente ondulados, coloracin amarilla o blanca. En agar sangre las colonias tienen los caracteres anteriormente mencionados y pueden adems presentar hemlisis. La mayor parte de las cepas virulentas son hemolticas, fermentan manitol, resisten altas concentraciones de cloruro de sodio y generalmente producen pigmento dorado, aunque otras cepas virulentas son blancas carecen de pigmento. La mejor prueba de virulencia es la facultad que tiene de coagular el plasma (estafilococos coagulasa positivos).

MEDIOS

PARA AISLAMIENTO Agar S-110 Agar sal y manitol Agar de Vogel Johnson

PARA IDENTIFICACIN Medio CTA Caldo rojo de fenol Caldo SF

1.Ex a me n dire cto 2. Sie m bra

Ti ncin de Gram 3. Froti s 4. Prue ba s bioqumica s Coagulasa Catalasa Fermentacin de manitol Susceptibilidad a novobicina

Agar S-110 Agar sal y manitol Agar de Vogel Johnson

Esquema 6. Aislamiento de Staphylococcus

158

PRUEBA

S. aureus

S. epidermidis

S. saprophyticus

Pigmento colonial Coagulasa Factor de agregacin Nucleasa termoestable Fosfatasa alcalina Ornitina descarboxilasa Ureasa Beta-galactosidasa Produccin de acetona Resistencia a novobiocina Resistencia a polimixina Trehalosa Manitol Manosa Xilosa Celulosa Maltosa Sacarosa

+ + + + + 10-90% cepas + + + + + + + +

+ 10-90% cepas + + + + + + +

10-90% cepas + + + + + + 10-90% cepas + + +

Tabla 10. Caractersticas bioqumicas de Staphylococcus

159

ESTREPTOCOCOS
El estreptococo puede estar presente en grandes nmeros como componentes de la flora normal, pero bajo ciertas circunstancias puede estar asociado con infecciones o ser el responsable principal de las mismas. Los estreptococos ms importantes generalmente pueden demostrarse por la produccin de hemlisis en los medios que contienen sangre. Los Streptococcus del grupo A son beta hemolticos y se aslan generalmente de exudados farngeos. Sin embargo, entre la flora existen diversos tipos de estreptococos, los cuales pueden ser alfa o beta hemolticos es necesario efectuar otras pruebas para identificarlos, tales como la composicin antignica y la prueba de sensibilidad de bacitracina. En agar sangre las colonias de esta bacteria son pequeas, elevadas, de color blanco a gris, duras y secas con un halo claro bien definido de hemlisis completa (hemlisis beta).

160

Especie

Susceptibilidad Susceptibilidad Hidrlisis Hidrlisis Crecimiento Crecimiento CAMP Fenmeno bacitracina optoquina hiprato esculina en bilis en NaCl satelitismo 6.5%

Estreptococos betahemolticos Grupo A Grupo B Enterococos No enterococos

S R R R R R

R R R R R R

+ + -

+ -

+ + -

+ + -

+ -

+ -

S. viridans S. pneumoniae

Tabla 11. Caractersticas bioqumicas de Streptococcus

161

UROCULTIVO

El urocultivo debe hacerse cuando hay signos o sntomas de infeccin urinaria, insuficiencia renal o hipertensin. Llevndolo a cabo siempre en personas en que se sospecha infeccin sistmica o que presenten fiebre de origen desconocido. Las infecciones agudas o crnicas pueden afectar en forma ascendente desde la uretra hasta los riones, especialmente cuando se trata de una invasin por la flora normal del tracto genitourinario que al actuar sobre el mismo provoca una accin patognica importante.

MEDIOS
PARA AISLAMIENTO Agar sangre Agar EMB Agar S-110 Agar sal y manitol Agar Biggy

PARA IDENTIFICACIN TSI, Caldo rojo de fenol Urea, SIM, MIO, LIA, Citrato de simmons

PARA SENSIBILIDAD A ANTIBITICOS Agar de Mueller Hinton Agra soya tripticasena

Orina AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

Tincin de Gram

Agar sangre, identificacin de: Estafilococos Estreptococos Neumococos Observacin de hemlisis

Agar EMB Identificacin de: Enterobacterias Pseudomonas Salmonella y Shigella

Agar S-110 sal y manitol Identificacin de Staphylococcus y otros Micrococos

Esquema 7. Urocultivo

162

HEMOCULTIVO
En el paciente con fiebre, con o sin signos o sntomas de localizacin el hemocultivo es la prueba ms til y ms usada para demostrar la frecuencia de infeccin sistmica. La demostracin de bacteremia es tambin esencial en las personas en que se sospecha endocarditis bacteriana. Es importante conocer las infecciones en las que se pueden aislar microorganismos de la sangre. Entre estos se encuentran la fiebre tifoidea, neumonas, meningitis, endocarditis bacteriana, osteomielitis, peritonitis, etc. La posibilidad de obtener cultivos positivos depende de la etapa de la enfermedad en que se tome la muestra y el grado de evolucin de la misma. En la mayora de los casos, por lo general es conveniente tomar varias muestras a intervalos apropiados ya que un solo cultivo puede ser insuficiente.

163

EXUDADO FARINGEO
MEDIOS
PARA AISLAMIENTO Agar sangre Agar eosina y azul de metileno Agar sal y manitol Agar S-110 Medio de transporte Stuart Agar BIGGY

Tincin de Gram
Hemoltico grupo A Disco de bacitracina

Agar sangre Agra eosina y azul de metileno Agra S-110, sal y manitol Agar BIGGY

Streptococcus Neumococos

Disco de optoquina Solubilidad de bilis TSI, LIA, MIO, citrato y urea

Enterobacterias Staphylococcus aureus y otros Micrococos Candida albicans

Catalasa y coagulasa

Tubos germinales y clamidiosporas

Esquema 8. Exudado faringeo

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